CN111979286B - 一种发酵法与酶法联合制备贝类高f值寡肽的方法 - Google Patents

一种发酵法与酶法联合制备贝类高f值寡肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种发酵法与酶法联合制备贝类高F值寡肽的方法，包括内切酶酶解与外切酶酶解，在外切酶酶解的过程中使用瑞士乳杆菌。本发明将瑞士乳杆菌应用于贝类高F值寡肽的生产，将发酵产酶和酶解合成一步，有效脱除了芳香族氨基酸，不需单独使用吸附剂进行脱芳；同时有效脱除了产品的苦味。本发明简化了高F值寡肽的生产工序，大幅度降低了生产成本。

Description

一种发酵法与酶法联合制备贝类高F值寡肽的方法
技术领域
本发明属于活性肽制备领域，具体涉及一种发酵法与酶法联合制备贝类高F值寡肽的方法。
背景技术
高F值寡肽是由2-9个氨基酸残基组成的寡肽混合物，其中支链氨基酸（缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸）与芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸）的摩尔比值一般大于20，此比值比人体模式中的比值高，该肽可以应用于改善肝病患者的营养状况和肝损伤、辅助肝性脑病及苯丙酮尿症的治疗等多个方面，且具有抗疲劳、抗衰老、解酒等生理功能，可用以开发肝病全营养配方食品、功能性食品、药物等，市场前景巨大。
目前，高F值寡肽的生产主要通过内切酶和外切酶两步酶解法来实现芳香族氨基酸的游离，再通过活性炭、超滤等方法去除芳香族氨基酸，这种生产方法要求酶具有与底物的特异性识别位点，酶的使用量大，不能重复利用，易引起产品出现苦味，需要进行脱芳、脱苦等分离纯化步骤，工序复杂，从而导致生产成本较高。为了降低酶的使用量，可以利用固定化酶进行酶解，但其他的问题依然存在。
发明内容
本发明针对上述现有技术存在的不足，解决酶解体系中酶解方法的局限性、简化工序、降低成本等问题，提供一种发酵法与酶法联合制备贝类高F值寡肽的方法。
本发明利用瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）生长过程中产生的强大酶系，通过发酵法与酶法联合在发酵体系中一次性获得无苦味的贝类高F值寡肽，开发了一种新型的高F值寡肽生产方法。该方法将产酶和酶解合成一步，省去了分离纯化过程，大幅度降低了生产成本。
具体技术方案如下：
一种发酵法与酶法联合制备贝类高F值寡肽的方法，包括内切酶酶解与外切酶酶解，在外切酶酶解的过程中使用瑞士乳杆菌。
本发明包括如下步骤：
（1）将去壳贝肉破碎，并与水混合，得料浆；
（2）将内切酶加入步骤（1）获得的料浆中，进行酶解；
（3）调节步骤（2）获得的体系的pH值为6-8，加入外切酶、培养基和瑞士乳杆菌，在35-45℃条件下培养20-30 h；灭菌灭酶，离心分离，得发酵液；
（4）对发酵液进行超滤去除大分子蛋白。
本发明在外切酶酶解的同时使用瑞士乳杆菌进行发酵，利用生长过程中产生的强大酶系，发酵法与酶法联合在发酵体系中一次性获得无苦味的贝类高F值寡肽，其机理应为瑞士乳杆菌在生长代谢过程中产生的酶系能起到内外双切芳香族氨基酸的作用，在外源蛋白酶的作用下，共同将芳香族氨基酸游离出来，又在生长过程中将芳香族氨基酸和苦味氨基酸作为底物进行消化吸收利用，从而实现芳香族氨基酸和苦味氨基酸的脱除。本发明方法得到的寡肽其F值在22以上，不需使用活性炭等吸附剂或纳滤方法进行芳香族氨基酸的脱除。
进一步，步骤（2）中，所述的内切酶为胃蛋白酶，其用量为以去壳贝肉计500-800U/g。
再进一步，步骤（2）的酶解条件为调节pH值为2-3.5，在35-45℃条件下酶解6-9 h。
进一步，步骤（3）中所述的外切酶为风味蛋白酶，其用量为以去壳贝肉计300-500U/g。
进一步，步骤（3）中，所述的培养基料包括以料浆计：15-20g/L葡萄糖、16-22 g/L牛肉浸膏、6-10 g/L MnSO4、2.5-4 g/L SDS（十二烷基硫酸钠）、10-14 g/L CaCO3。
进一步，步骤（3）中，所述的瑞士乳杆菌的用量为以料浆体积计5×107-9×107cfu/mL。
步骤（3）中，通过高温处理来灭菌灭酶。
进一步，步骤（1）中，去壳贝肉与水的质量比为1：（3-5）。
进一步，步骤（4）中，超滤使用的滤膜优选为10 KD。有序超滤操作条件优选在温度20-40℃，操作压力 0.10-0.30 MPa下，采用截留分子量为10 KD超滤膜超滤2-3 h去除大分子蛋白。
进一步，超滤去除大分子蛋白后，使用大孔树脂进行脱色。
本发明的有益效果如下：
本发明将瑞士乳杆菌应用于贝类高F值寡肽的生产，将发酵产酶和酶解合成一步，有效脱除了芳香族氨基酸，不需单独使用吸附剂进行脱芳；同时有效脱除了产品的苦味。本发明简化了高F值寡肽的生产工序，大幅度降低了生产成本。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
具体实施方式中使用的贝类原料为栉孔扇贝。
具体实施方式中的胃蛋白酶购买自生工生物工程(上海)股份有限公司，酶活1.5万U/g；风味酶蛋白酶购买自北京索莱宝科技有限公司，酶活1.5万U/g。
具体实施方式中的瑞士乳杆菌Lactobacillus helveticus购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CICC 22536，其收藏时间为2008-03-11。
瑞士乳杆菌的种子液培养方法如下：
在超净工作台上用接种环挑取瑞士乳杆菌 CICC 22536 接于 MRS 培养基中。在37℃生化培养箱中培养 18 h 后，将种子液稀释至 OD600值为 0.600。
MRS培养基（g/L）：蛋白胨 10.0，牛肉浸粉 5.0，酵母浸粉 4.0，葡萄糖 20.0，磷酸氢二钾 2.0，柠檬酸三铵 2.0，醋酸钠 5.0，硫酸镁 0.2，硫酸锰 0.05，琼脂 15.0，吐温-801.0，蒸馏水 1 L，pH6.2±0.2。
实施例1
一种发酵法与酶法联合制备贝类高F值寡肽的方法，包括如下步骤：
（1）将去壳贝肉使用匀浆机破碎匀浆，并与水按照质量比1:3混合，得料浆；
（2）将料浆投入发酵罐，加入以去壳贝肉计560 U/g的胃蛋白酶，调节pH值为2.5，在37℃条件下酶解7 h；
（3）调节步骤（2）获得的体系pH值为7，加入以去壳贝肉计320 U/g的风味蛋白酶、以料浆体积计5.8×107 cfu/mL的瑞士乳杆菌种子液和培养基料，所述的培养基料以步骤（1）获得的料浆计由以下成分组成：16 g/L葡萄糖、18 g/L牛肉浸膏、8 g/L MnSO4、3.5 g/LSDS、12 g/L CaCO3；在37℃条件下搅拌培养25 h；发酵结束后 100 ℃灭酶灭菌 15 min，5000 r/min 离心 15 min，得到发酵液；
（4）发酵液在室温条件下，操作压力 0.20 MPa，采用截留分子量为10 KD超滤膜超滤2 h去除大分子蛋白。
（5）大孔树脂脱色：超滤后的发酵液中加入以其质量计4wt%的 DA201-C型大孔树脂，调整pH值为6, 在温度25℃下保温2 h脱除发酵液中的色素。
（6）采用冷冻干燥制备寡肽粉，在-30℃下冷冻12 h，置于冷冻干燥机中按照5 ℃/h的速度梯度升温至40 ℃，直至冷冻干燥成寡肽粉。
实施例2
一种发酵法与酶法联合制备贝类高F值寡肽的方法，包括如下步骤：
（1）将去壳贝肉使用匀浆机破碎匀浆，并与水按照质量比1:5混合，得料浆；
（2）将料浆投入发酵罐，加入以去壳贝肉计700 U/g的胃蛋白酶，调节pH值为3，在42℃条件下酶解6 h；
（3）调节步骤（2）获得的体系pH值为6，加入以去壳贝肉计450 U/g的风味蛋白酶、以料浆体积计7.4×107cfu/mL的瑞士乳杆菌种子液和培养基料，所述的培养基料以步骤（1）获得的料浆计由以下成分组成：20 g/L葡萄糖、20 g/L牛肉浸膏、10 g/L MnSO4、2.5 g/L SDS、14 g/L CaCO3；在35℃条件下搅拌培养20 h；发酵结束后 100 ℃灭酶灭菌 15 min，5000 r/min 离心 15 min，得到发酵液；
（4）发酵液在室温条件下，操作压力 0.20 MPa，采用截留分子量为10 KD超滤膜超滤2 h去除大分子蛋白。
（5）大孔树脂脱色：超滤后的发酵液中加入以其质量计4wt%的 DA201-C型大孔树脂，调整pH值为6, 在温度25℃下保温2 h脱除发酵液中的色素。
（6）采用冷冻干燥制备寡肽粉，在-30℃下冷冻12 h，置于冷冻干燥机中按照5℃/h的速度梯度升温至40℃，直至冷冻干燥成寡肽粉。
实施例3
一种发酵法与酶法联合制备贝类高F值寡肽的方法，包括如下步骤：
（1）将去壳贝肉使用匀浆机破碎匀浆，并与水按照质量比1:4混合，得料浆；
（2）将料浆投入发酵罐，加入以去壳贝肉计800U/g的胃蛋白酶，调节pH值为3.5，在45℃条件下酶解8 h；
（3）调节步骤（2）获得的体系pH值为8，加入以去壳贝肉计400U/g的风味蛋白酶、以料浆体积计8.2×107cfu/mL瑞士乳杆菌种子液；向发酵罐中加入培养基料，所述的培养基料以步骤（1）获得的料浆计由以下成分组成：16 g/L葡萄糖、18 g/L牛肉浸膏、8 g/LMnSO4、3.5 g/L SDS、12 g/L CaCO3；在42℃条件下搅拌培养28 h；发酵结束后 100℃灭酶灭菌 15 min，5000 r/min 离心 15 min，得到发酵液；
（4）发酵液在室温条件下，操作压力 0.20 MPa，采用截留分子量为10 KD超滤膜超滤2 h去除大分子蛋白。
（5）大孔树脂脱色：超滤后的发酵液中加入以其质量计4wt%的 DA201-C型大孔树脂，调整pH值为6, 在温度25 ℃下保温2 h脱除发酵液中的色素。
（6）采用冷冻干燥制备寡肽粉，在-30℃下冷冻12 h，置于冷冻干燥机中按照5℃/h的速度梯度升温至40℃，直至冷冻干燥成寡肽粉。
对比例1
与实施例1的区别在于，步骤（3）中，未添加瑞士乳杆菌与培养基料；其余技术特征与实施例1相同。
对比例2
与对比例1的区别在于，在超滤去除大分子蛋白之后、大孔树脂脱色之前使用活性炭进行芳香族氨基酸脱除。
具体操作方法为：
向步骤（4）获得的料液中添加活性炭，活性炭与料液的质量比为1:10；在pH值为6，温度25℃，搅拌反应时间3 h，然后采用板框过滤机过滤。
其余技术特征与对比例1相同。
对比例2的方法为现有技术中贝类高F值寡肽制备的常规方法。
实验1
对比实施例1-3与对比例1-2最终获得的产品的F值，结果见表1。
F值=支链氨基酸摩尔数/芳香族氨基酸摩尔数
表1 F值对比表
实施例1 实施例2 实施例3 对比例1 对比例2
F值 23.16 23.45 22.28 3.21 13.57
由表1可见仅进行酶解而未脱除芳香族氨基酸的对比例1的F值显著低于对比例2，更显著低于实施例1、2、3，说明在相同酶添加量下，通过发酵法与酶法联合制备的高F值寡肽的F值显著高于酶法的，联合法生产的寡肽F值能达到F值大于20的高F值寡肽生产要求，是一种适宜工业化生产高F值寡肽的高效方法。
实验2
选取30人（15男15女）组成感官鉴定小组，根据感官评分标准（表2）对实施例1-3与对比例1-2进行感官鉴定实验，苦味按照1-5等级进行评分，取平均值作为最终得分，测试对苦味的脱除效果，评分结果见表3。
表2评分标准
苦味描述 苦味突出 苦味较突出 有苦味，且明显 有轻微苦味 无苦味
评分 1 2 3 4 5
表3 评分结果
实施例1 实施例2 实施例3 对比例1 对比例2
苦味评分 4.78 4.92 4.86 3.21 3.54
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种发酵法与酶法联合制备贝类高F值寡肽的方法，包括内切酶酶解与外切酶酶解，其特征在于，在外切酶酶解的过程中使用瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)；
所述的内切酶为胃蛋白酶；
所述的外切酶为风味蛋白酶；
所述的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)保藏编号为CICC 22536，获得自中国工业微生物菌种保藏管理中心；
所述的方法包括如下步骤：
(1)将去壳贝肉破碎，并与水混合，得料浆；
(2)将内切酶加入步骤(1)获得的料浆中，进行酶解；
(3)调节步骤(2)获得的体系的pH值为6-8，加入外切酶、培养基和瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)，在35-45℃条件下培养20-30h；灭菌灭酶，离心分离，得发酵液；所述的培养基料包括以料浆计：15-20g/L葡萄糖、16-22g/L牛肉浸膏、6-10g/L MnSO4、2.5-4g/L十二烷基硫酸钠、10-14g/L CaCO3；
(4)对发酵液进行超滤去除大分子蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，内切酶的用量为以去壳贝肉计500-800U/g。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)的酶解条件为：调节pH值为2-3.5，在35-45℃条件下酶解6-9h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，外切酶的用量为以去壳贝肉计300-500U/g。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)的用量为以料浆体积计5×107-9×107cfu/mL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，去壳贝肉与水的质量比为1：(3-5)。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，超滤使用的滤膜的截留分子量为10KD。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，超滤去除大分子蛋白后，使用大孔树脂进行脱色。
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