CN114807288B - 一种含有特定序列的抗糖化胶原四肽（pgxr）及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种胶原蛋白肽的制备方法，所述的制备方法中包括使用组合酶进行酶解，所述的组合酶中包括碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶和风味酶；所述的方法中还包括组合菌种生物发酵，所述的组合菌种中包括植物乳杆菌、副干酪乳杆菌和肉糖葡萄球菌。本发明提供的混合胶原蛋白肽中包含多种小分子多肽，具有抗糖化的作用，且相较于市售产品具有更好的抗糖化能力，具有很好的市场前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗糖化的胶原蛋白肽及其制备方法。
背景技术
糖基化终产物(Advanced Glycation End-products，AGEs)为肌体内糖和蛋白质之间发生美拉德(Maillard)反应中产生的棕黄色产物。研究表明，AGEs与糖尿病慢性并发症、动脉粥样硬化、心血管疾病、阿尔茨海默病等疾病的发生和发展均有关系。
由于皮肤组织真皮细胞外基质中的胶原蛋白、弹力蛋白、纤维粘连蛋白等半衰期长达数年，可逆转性低，更容易与葡萄糖等代谢分子发生非酶促反应生成AGEs，对组织产生一系列不良影响。胶原蛋白肽是将大分子胶原蛋白经酶解后制成的小分子肽类产品。目前胶原蛋白肽应用于改善皮肤，骨骼、关节等功能性食品中。
胶原蛋白肽的来源多样，主要是动物的新鲜组织，包括皮、骨、筋、腱、鳞等，因此，现有技术中也多以这些材料为原料进行胶原蛋白肽的制备。
中国专利201310128867.0中公开了一种用鱼皮或鱼骨生产高品质胶原蛋白低聚肽的方法。具体步骤如下：将原料鱼皮或鱼骨经过清洗、破碎后与水按重量比1∶5-20混合并细化处理后杀菌、冷却，同时加入蛋白水解酶和乳酸菌进行第一次水解后经过离心、过滤后分离出未水解的固相部分和水解液，将水解液采用超滤膜进行超滤，将非透过的大分子肽液和一次水解完成后分离的未水解的固相部分混合后，同时加入蛋白酶和乳酸菌进行第二次水解，并经离心分离、过滤后进行超滤，将超滤膜透过的小分子低聚肽液和一次水解后收集的小分子低聚肽一起依次经过纯化，杀菌，浓缩，干燥得到分子量小的蛋白质低聚肽产品。该技术可以有效提高原料蛋白的利用率和产品得率，大幅提高产品质量。但其仅仅是提高了低聚肽比例，产品功效并未有明显改进。
中国专利201911039435.6中公开了一种鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法及其提取物和应用，涉及蛋白多肽生产技术领域。该提取方法包括使用微生物水解经过预处理的鱼皮，然后使用酶膜耦合法纯化经微生物水解的鱼皮；所述预处理包括使用酶制剂酶解鱼皮。该提取方法无需酸性或碱性条件便可完成水解鱼皮，减少了酶的用量和整体的水解时间，能够使鱼皮水解彻底，提高胶原蛋白多肽的提取率，提取得到的提取物中小分子鱼皮胶原蛋白多肽含量高，分子量均一，经济价值高。但其进行微生物水解时，微生物种类数量多达16种，对于工业生产多有影响。
对于抗糖化效果较好的胶原蛋白肽的生产方法，目前并未有较好的技术公开。
发明内容
为了解决上述问题，本发明旨在制备一种对机体抗糖化起作用的胶原蛋白肽，使之能延缓组织老化，起到抗衰老的作用。
一方面，本发明提供了一种胶原蛋白肽的制备方法。
所述的制备方法中包括使用组合酶进行酶解。
所述的组合酶中包括碱性蛋白酶，菠萝蛋白酶，风味酶。
所述的碱性蛋白酶，菠萝蛋白酶，风味酶的比例为3-5：1-3：1-3。
优选地，所述的碱性蛋白酶，菠萝蛋白酶，风味酶的比例为5：3：2。
优选地，所述的酶的用量与原料的用量比为0-2：100，且酶的用量不为0。
在一些实施例中，所述的用量比是指质量比，即每100g原料在制备胶原蛋白肽时，需要加入0-2g的组合酶；当加入的酶为酶液时，保证酶活一致。
优选地，所述的酶解条件为pH8.0，温度为60℃，优选反应时间6h。
所述的制备方法中还包括生物发酵。
所述的生物发酵依靠组合菌种完成，所述的组合菌种中包括植物乳杆菌、副干酪乳杆菌和肉糖葡萄球菌。
所述的组合菌种中植物乳杆菌、副干酪乳杆菌和肉糖葡萄球菌的用量比为1-2:1-2:1-2，优选为1：1.5：1.5。
优选地，所述的组合菌种的应用浓度为5×108-5×109CFU/mL；优选为4×109CFU/mL。
优选地，所述的生物发酵的条件为pH6.5，温度35℃，优选发酵时长6h。
优选地，所用的制备方法采用的制备原料为罗非鱼鱼皮。
在一些实施例中，所述的制备方法包括以下步骤：
原料加入碳酸氢钠溶液浸泡；研磨后加热保温提胶；酶解；酶解液生物发酵；超滤膜过滤；纳滤；碱性阴离子交换树脂吸附洗脱。
在一些实施例中，所述的制备方法包括以下步骤：
（1）罗非鱼鱼皮切小块，加入5%的碳酸氢钠溶液浸泡4小时；
（2）浸泡后的鱼皮清洗后研磨至糊状，调pH后加热保温提胶；
（3）提胶产物筛网过滤，调pH和温度后加入组合酶酶解；
（4）调酶解液pH，加入组合菌种发酵；
（5）发酵液超滤膜过滤后，纳滤；
（6）纳滤后的胶原蛋白肽采用阴离子交换树脂吸附后洗脱；
（7）洗脱液喷雾干燥得粉末状产品。
在一些实施例中，所述的制备方法包括以下步骤：
（1）称取罗非鱼鱼皮100g切成小块，加入2000mL 5%的碳酸氢钠溶液浸泡4小时；
（2）清洗3次，加入适量软化水，在研磨机中匀浆至糊状；调整pH2.5，加热至90℃，保温提胶6h；
（3）筛网过滤后调整pH8.0，温度为60℃，加入组合酶（0.5g碱性蛋白酶，0.3克菠萝蛋白酶，0.2g风味酶），酶解时间为6h，灭酶，得到1600mL酶解液；
（4）调整酶解液pH为6.5，加入组合菌种（植物乳杆菌、副干酪乳杆菌和肉糖葡萄球菌用量比为1：1.5：1.5），温度35℃，发酵6小时；
（5）将上述发酵酶解液采用1KD超滤膜过滤，再通过纳滤去除无机盐和水溶性游离氨基酸；
（6）将上述胶原蛋白肽用双蒸水，稀释到为20mg/mL的溶液，通过201×7强碱性阴离子交换树脂，吸附6h，用1MNaCl洗脱液流速洗脱，流速1ML/min；
（7）收集洗脱液检测糖化抑制率，得到抗糖化胶原蛋白肽，喷雾干燥后得到粉末状产品。
另一方面，本发明提供了一种混合胶原蛋白肽。
所述的混合胶原蛋白肽通过前述的制备方法进行制备。
所述的混合胶原蛋白肽中富含 Pro-Gly-X-Arg序列，分子量范围在300-700道尔顿之间。
所述的胶原蛋白肽中至少包括以下多肽：
| 多肽序列 | 分子量 |
| Pro-Gly-His-Arg | 466 |
| Pro-Gly-Asn-Arg | 443 |
| Pro-Gly-Ala-Arg | 400 |
| Pro-Gly-Leu-Arg | 442 |
| Pro-Gly-Phe-Arg | 476 |
| Pro-Gly-Ser-Arg | 416 |
| Pro-Gly-Glu-Arg | 458 |
| Pro-Gly-Lys-Arg | 457 |
| Pro-Gly-Val-Arg | 428 |
| Pro-Gly-His-Arg | 466 |
| Hyp-Gly-His-Arg | 482 |
| Hyp-Gly-Val-Arg | 444 |
| Hyp-Gly-Tyr-Arg | 508 |
| Hyp-Gly-Met-Arg | 476 |
| Hyp-Gly-Phe-Arg | 492 |
| Hyp-Gly-Gln-Arg | 473 |
优选地，所述的混合胶原蛋白肽的pH为2-3，优选为2.5。
再一方面，本发明提供了前述混合胶原蛋白肽在制备食品或保健品中的应用。
所述的食品或保健品中包括前述的混合胶原蛋白肽。
又一方面，本发明提供了一种酸性饮品。
所述的酸性饮品中包括前述的混合胶原蛋白肽。
所述的胶原蛋白肽在制备完成后在加入饮品前经过以下处理步骤：调整pH2.5，121℃，加热30min，至溶液澄清透明，无任何絮凝和沉淀。
本发明的有益效果：
本发明提供的混合胶原蛋白肽中包含多种小分子多肽，具有抗糖化的作用，且相较于市售产品具有更好的抗糖化能力，具有很好的市场前景。
附图说明
图1为实施例1的抗糖化胶原蛋白肽与市售产品的抗糖化能力比较。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1抗糖化血管胶原蛋白肽的制备
本实施例中，碱性蛋白酶（地衣芽胞杆菌蛋白酶），菠萝蛋白酶，风味酶，均购于南宁东恒华道生物科技有限责任公司。
本实施例中，植物乳杆菌购自宁波泰斯拓生物技术有限责任公司，编号:TS279068；副干酪乳杆菌购自崇辉（北京）生物科技有限公司，货号CHCC345679；肉糖葡萄球菌购自上海一研生物科技有限公司，货号EY09738J。
称取罗非鱼鱼皮100g切成小块，加入2000mL 5%的碳酸氢钠溶液浸泡4小时，清洗3次，加入适量软化水，在研磨机中匀浆至糊状；调整pH2.5，加热至90℃，保温提胶6h。筛网过滤后调整pH8.0，温度为60℃，加入组合酶（0.5g碱性蛋白酶，0.3克菠萝蛋白酶，0.2g风味酶，均购于南宁东恒华道生物科技有限责任公司），酶解时间为6h，灭酶，得到1600mL酶解液。调整酶解液pH为6.5，加入组合菌种（植物乳杆菌、副干酪乳杆菌和肉糖葡萄球菌用量为109cfu/mL，1.5×109cfu/mL，1.5×109cfu/mL），温度35℃，发酵6小时。将上述发酵酶解液采用1KD超滤膜过滤，再通过纳滤去除无机盐和水溶性游离氨基酸。将上述胶原蛋白肽用双蒸水，稀释到为20mg/mL的溶液，通过201×7强碱性阴离子交换树脂，吸附6h，用1MNaCl洗脱液流速洗脱，流速1ML/min，收集洗脱液检测糖化抑制率，得到抗糖化胶原蛋白肽，喷雾干燥后得到粉末状产品。HPLC-MS检测该类肽富含Pro-Gly-X-Arg序列，具体如下表：
| 多肽序列 | 分子量 |
| Pro-Gly-His-Arg | 466 |
| Pro-Gly-Asn-Arg | 443 |
| Pro-Gly-Ala-Arg | 400 |
| Pro-Gly-Leu-Arg | 442 |
| Pro-Gly-Phe-Arg | 476 |
| Pro-Gly-Ser-Arg | 416 |
| Pro-Gly-Glu-Arg | 458 |
| Pro-Gly-Lys-Arg | 457 |
| Pro-Gly-Val-Arg | 428 |
| Pro-Gly-His-Arg | 466 |
| Hyp-Gly-His-Arg | 482 |
| Hyp-Gly-Val-Arg | 444 |
| Hyp-Gly-Tyr-Arg | 508 |
| Hyp-Gly-Met-Arg | 476 |
| Hyp-Gly-Phe-Arg | 492 |
| Hyp-Gly-Gln-Arg | 473 |
得到的抗糖化胶原蛋白肽粉溶解，溶液浓度10%，调整pH2.5，在121℃，加热30min，溶液澄清透明，无任何絮凝和沉淀，适用于酸性饮料。
实施例2胶原蛋白肽抗糖化能力评价
本实施例针对实施例1中得到抗糖化胶原蛋白肽，按照抗糖化能力评价方法进行实验，并以市购胶原蛋白肽为对照，市购胶原蛋白肽由北京盛美诺生物技术有限公司提供。
具体的抗糖化能力评价方法为：采用BSA-果糖模拟反应体系，将1mL果糖溶液（1.5mol/L）与1mL胶原蛋白肽组分溶液混合，37℃孵育2h后，加入1mL30mg/mLBSA溶液，以上反应物均用50mmol/LpH7.4磷酸盐缓冲液（含有0.1%叠氮化钠）溶解，用同质量浓度的氨基胍溶液代胶原蛋白肽各组分溶液作为阳性对照组，用磷酸盐缓冲液代替胶原蛋白肽各组分溶液作为空白组，用磷酸盐缓冲液代替果糖溶液作为BSA、胶原蛋白肽共孵育组，将各样品于生化培养箱中37℃孵育6d后，在激发波长370nm、发射波长440nm条件下测定各样品的荧光强度，胶原蛋白肽对荧光性AGEs生成的抑制率R通过以下公式进行计算：
R/%=（1-FA/FB）*100；
式中：FA为各样品组的荧光强度；FB代表空白组的荧光强度。
结果如图1所示。
实施例3
参照实施例1的方法进行实验，区别在于组合酶中包括0.4g碱性蛋白酶，0.3克菠萝蛋白酶，0.3g风味酶，终产物抗糖化能力检测结果为83%。
实施例4
参照实施例1的方法进行实验，区别在于组合菌种中植物乳杆菌、副干酪乳杆菌和肉糖葡萄球菌的用量比为1：2：1，终产物抗糖化能力检测结果为87%。
对比例
针对实施例1设置对比例，具体条件和检测结果如下：
| 与实施例1的区别 | 产物抗糖化能力 | |
| 对比例1 | 组合酶中包括0.2g碱性蛋白酶，0.4克菠萝蛋白酶，0.4g风味酶 | 51% |
| 对比例2 | 组合酶中仅包括1g碱性蛋白酶，0.6克菠萝蛋白酶 | 48% |
| 对比例3 | 仅包括植物乳杆菌、副干酪乳杆菌的用量比为1：1 | 46% |
| 对比例4 | 仅包括植物乳杆菌、肉糖葡萄球菌的用量比为1：1 | 47% |
| 对比例5 | 植物乳杆菌、副干酪乳杆菌和肉糖葡萄球菌的用量比为1：2：3 | 63% |
| 对比例6 | 植物乳杆菌、副干酪乳杆菌和肉糖葡萄球菌的用量比为4：1：2 | 54% |
Claims (16)
1.一种胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述的制备方法中包括先使用组合酶进行酶解，再使用组合菌种生物发酵；所述的组合酶中包括碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶和风味酶；所述的组合菌种中包括植物乳杆菌、副干酪乳杆菌和肉糖葡萄球菌；
所述的碱性蛋白酶为地衣芽胞杆菌蛋白酶；
所述的组合菌种中植物乳杆菌、副干酪乳杆菌和肉糖葡萄球菌的用量比为1-2：1-2：1-2；
所述的制备方法采用的制备原料为罗非鱼鱼皮。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的碱性蛋白酶，菠萝蛋白酶，风味酶的比例为3-5：1-3：1-3。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的碱性蛋白酶，菠萝蛋白酶，风味酶的比例为5：3：2。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的酶的用量与原料的用量比为0-2：100，且酶的用量不为0。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的酶解条件为pH8.0，温度60℃。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的组合菌种中植物乳杆菌、副干酪乳杆菌和肉糖葡萄球菌的用量比为1：1.5：1.5。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的组合菌种的应用浓度为5×108-5×109CFU/mL。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的组合菌种的应用浓度为4×109CFU/mL。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的生物发酵的条件为pH6.5，温度35℃。
10.根据权利要求1-9任一项所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：原料加入碳酸氢钠溶液浸泡；研磨后加热保温提胶；酶解；酶解液生物发酵；超滤膜过滤；纳滤；碱性阴离子交换树脂吸附洗脱。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）罗非鱼鱼皮切小块，加入5%的碳酸氢钠溶液浸泡4小时；
（2）浸泡后的鱼皮清洗后研磨至糊状，调pH后加热保温提胶；
（3）提胶产物筛网过滤，调pH和温度后加入组合酶酶解；
（4）调酶解液pH，加入组合菌种发酵；
（5）发酵液超滤膜过滤后，纳滤；
（6）纳滤后的胶原蛋白肽采用阴离子交换树脂吸附后洗脱；
（7）洗脱液喷雾干燥得粉末状产品。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）称取罗非鱼鱼皮100g切成小块，加入2000mL 5%的碳酸氢钠溶液浸泡4小时；
（2）清洗3次，加入适量软化水，在研磨机中匀浆至糊状；调整pH2.5，加热至90℃，保温提胶6h；
（3）筛网过滤后调整pH8.0，温度为60℃，加入组合酶：0.5g碱性蛋白酶、0.3克菠萝蛋白酶、0.2g风味酶，酶解时间为6h，灭酶，得到1600mL酶解液；
（4）调整酶解液pH为6.5，按照109CFU/mL加入组合菌种：植物乳杆菌、副干酪乳杆菌和肉糖葡萄球菌用量比为1-2：1-2：1-2，温度35℃，发酵6小时；
（5）将上述发酵液采用1KD超滤膜过滤，再通过纳滤去除无机盐和水溶性游离氨基酸；
（6）将上述胶原蛋白肽用双蒸水，稀释到为20mg/mL的溶液，通过201×7强碱性阴离子交换树脂，吸附6h，用1MNaCl洗脱液流速洗脱，流速1ML/min；
（7）收集洗脱液检测糖化抑制率，得到抗糖化胶原蛋白肽，喷雾干燥后得到粉末状产品。
13.一种混合胶原蛋白肽，其特征在于，通过权利要求1-12任一项所述的制备方法制备，所述的混合胶原蛋白肽由以下多肽序列组成：
Pro-Gly-His-Arg、Pro-Gly-Asn-Arg、Pro-Gly-Ala-Arg、Pro-Gly-Leu-Arg、Pro-Gly-Phe-Arg、Pro-Gly-Ser-Arg、Pro-Gly-Glu-Arg、Pro-Gly-Lys-Arg、Pro-Gly-Val-Arg、Hyp-Gly-His-Arg、Hyp-Gly-Val-Arg、Hyp-Gly-Tyr-Arg、Hyp-Gly-Met-Arg、Hyp-Gly-Phe-Arg、Hyp-Gly-Gln-Arg。
14.权利要求13所述的混合胶原蛋白肽在制备食品或保健品中的应用。
15.包括权利要求13所述的混合胶原蛋白肽的酸性饮品。
16.根据权利要求15所述的酸性饮品，其特征在于，所述的胶原蛋白肽在制备完成后在加入饮品前经过以下处理步骤：调整pH2.5，121℃，加热30min，至溶液澄清透明，无任何絮凝和沉淀。
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