CN111909978B - 一种利用发酵法从玉米蛋白粉中定向制备富含lpp水解物的方法 - Google Patents

一种利用发酵法从玉米蛋白粉中定向制备富含lpp水解物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用发酵法从玉米蛋白粉中定向制备富含LPP水解物的方法，包括以下步骤：（1）将研磨过筛的玉米蛋白粉配制发酵培养基后，接入活化且扩大培养后的瑞士乳杆菌发酵，得到发酵液；（2）所述发酵液高温灭菌后冷却至室温，并高速离心，收集上清液；（3）所述上清液经超滤膜超滤，待透过液中无蛋白质检出时收集透过液；（4）所述透过液使用树脂进行脱苦和脱色处理，得到脱色液；（5）将脱色液进行冷冻干燥或喷雾干燥，得到富含LPP的玉米蛋白粉水解物粉末。本发明明显提高了玉米蛋白粉的水解度和蛋白质回收率，对玉米蛋白粉资源的利用更加充分。

Description

一种利用发酵法从玉米蛋白粉中定向制备富含LPP水解物的 方法
技术领域
本发明属于蛋白质水解技术领域，具体涉及一种利用发酵法从玉米蛋白粉中定向制备富含LPP水解物的方法。
背景技术
高血压被公认为是冠心病、心力衰竭、肾功能不全和视力障碍等疾病的主要危险因素，是世界范围内重要的公共卫生挑战。目前常用的降血压药物多为化学合成，患者在使用过程中容易发生多种不良反应。由于高血压患者需要长期服药，这使得人们对安全性好、对高血压有预防和治疗作用的替代品产生了需求。
血管紧张素转化酶抑制肽（ACEIP）又称降血压肽，是由水解天然蛋白质而获得的一类具有血管紧张素转化酶（ACE）抑制活性和降血压作用的小肽。与现有的ACE抑制剂类合成降血压药物如哌哚普利、群多普利等相比，ACEIP可以通过日常膳食摄入，具有安全性好、无毒副作用、对正常血压无影响、对高血压既有治疗作用又有预防功效等显著特点。目前研究得到了许多具有体外降血压活性的ACEIP，但是这些ACEIP需要通过口服的方式摄入，其在经过胃肠道时极易被各种蛋白酶及强酸性环境水解而失去原先的结构和活性；而且ACEIP只有进入血液循环才能发挥降血压作用，但很多ACEIP不能被人体直接吸收。因此，虽有大量ACEIP被分离鉴定出来，但是经临床证实具有明确体内降血压功效的ACEIP仅有Ile-Pro-Pro（IPP）、Val-Pro-Pro（VPP）和Leu-Pro-Pro（LPP）三种三肽。
IPP、VPP和LPP主要来源于牛奶中的酪蛋白，因此被合称为乳三肽。这三种三肽对ACE具有很强的抑制活性，而且对胃肠道和血液中的蛋白酶和肽酶具有很强的抗性，因而能被完整吸收进入血液循环；还可有效降低高血压患者的血压，并且不影响正常血压，具有很高的安全性。但目前以乳蛋白为原料生产含IPP和VPP的水解物的方法不能满足素食主义者的需求。
玉米蛋白粉是玉米湿磨工艺加工淀粉的副产品，主要成分为玉米醇溶蛋白（α、β、 γ、δ）。其中，对γ-醇溶蛋白的测序结果表明其中的三个组分均含有至少由6个Pro-Pro-Pro-Val-His-Leu（PPPVHL）重复单位组成的串联重复序列，该段序列与其后续氨基酸残基共形成了至少6个LPP片段，其序列分别为-CQP PPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPP-、-QP PPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPP-和-QP PPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPP-，远高于LPP、VPP和IPP在β-酪蛋白和κ-酪蛋白中的出现频率；另外，LPP也存在于α-玉米醇溶蛋白及其它蛋白组分中，因此玉米蛋白粉是LPP的良好来源。如果能够将LPP从玉米蛋白粉中定向水解释放出来，这对于拓展LPP除酪蛋白之外的新来源、开发新型的基于乳三肽的降血压功能食品及功能食品组件具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种利用发酵法从玉米蛋白粉中定向制备富含LPP水解物的方法，本发明以瑞士乳杆菌菌株作为发酵剂对玉米蛋白粉进行发酵，经过超滤、脱色、干燥制得富含LPP水解物的粉末。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种利用发酵法从玉米蛋白粉中定向制备富含LPP水解物的方法，包括以下步骤：
（1）将研磨过筛的玉米蛋白粉配制发酵培养基后，接入活化且扩大培养后的瑞士乳杆菌发酵，得到发酵液；
（2）所述发酵液高温灭菌后冷却至室温，并高速离心，收集上清液；
（3）所述上清液经超滤膜超滤，待透过液中无蛋白质检出时收集透过液；
（4）所述透过液使用树脂进行脱苦和脱色处理，得到脱色液；
（5）将脱色液进行冷冻或喷雾干燥，得到富含LPP水解物的粉末。
进一步的，所述步骤（1）中玉米蛋白粉的蛋白质含量在60~70%之间、脯氨酸含量在4.0~5.0%之间、亮氨酸含量在9.0~10.0%之间，且研磨后过200目筛。
进一步的，所述步骤（1）中瑞士乳杆菌的活化方法为：用无菌吸管吸取0.5mL MRS肉汤于冻干管中将冻干菌粉溶解，将溶解后的菌悬液转移至盛有4~5mL MRS肉汤的试管中混匀，于37℃培养箱下静置培养24 h，转接2-3代恢复活力后转接到MRS斜面上保存。
进一步的，所述步骤（1）中瑞士乳杆菌的扩大培养条件为：用接种环从MRS斜面挑取菌株于基础培养基中，在37℃生化培养箱中培养18h，将其稀释至OD600值0.600。
进一步的，所述步骤（1）中发酵培养基的组分为葡萄糖1~3%（w/v）、牛肉浸粉1~2%（w/v）、MnSO4 0.4~0.8%（w/v）、十二烷基磺酸钠0.1~0.3%（w/v）、碳酸钙0.5~1.5%（w/v）、玉米蛋白粉4~8%（w/v）。
最优的，所述发酵培养基的组成为葡萄糖2%、牛肉浸粉1.5%、MnSO4 0.6%、十二烷基磺酸钠0.2%、碳酸钙1%、玉米蛋白粉6%。
进一步的，所述步骤（1）中瑞士乳杆菌的接种量为4~8%（w/v），发酵温度为37℃，发酵时间为36~72h。
最优的，所述瑞士乳杆菌的接种量5%、250mL三角瓶中的装液量100mL、发酵温度37℃、发酵时间60h。
进一步的，所述步骤（1）中在发酵前使用玉米蛋白粉重量1~4%的风味蛋白酶水解发酵培养基1~4h，或者在发酵同时添加玉米蛋白粉重量1~4%的风味蛋白酶，或者在发酵结束后加入玉米蛋白粉重量1~4%的风味蛋白酶水解1~4h以提高蛋白质回收率和LPP含量。
最优的，在发酵同时加入玉米蛋白粉重量3%的风味蛋白酶。
进一步的，所述步骤（2）中离心速度为10000rpm，离心时间为15min。
进一步的，所述步骤（3）中超滤膜为分子截留量为5kDa的Biomax膜，发酵液的pH值为4.5，料液的入口压力≤25psi。
进一步的，所述步骤（4）中的树脂为XAD-16大孔树脂，其添加量大于20%（w/v）、料液pH值为3.0~7.0、脱色温度为5~35℃、脱色时间0.5-2.5h。
最优的，所述料液pH值为5.0、脱色温度为25℃、脱色时间为2.0h。
进一步的，所述步骤（5）中所述的干燥方法为冷冻干燥法或喷雾干燥法来得到淡黄色的富含LPP的水解物粉末。在冷冻干燥法中，先将脱色液在-20℃下预冷冻24h，随后真空冷冻干燥3天；在喷雾干燥法中，脱色液直接用于干燥，进风温度为160℃、出口温度为60℃。
上述质量单位均为g，体积单位均为L。
本发明还提供了由所述的利用发酵法从玉米蛋白粉中定向制备富含LPP水解物的方法制得的富含LPP水解物。
本发明还提供了所述的富含LPP水解物在制备用于降血压食品的补充剂中的应用。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
本发明以具有明确体内降血压功效的LPP为目标，水解产物降血压功效有保障。目前虽然已从不同来源的蛋白质获得了大量的ACEIP，但是这些报导绝大多数都是以体外的ACE抑制活性为指标对水解工艺进行优化，水解过程的目的性不强、水解产物的体内降血压功效不明确。本发明以经过临床验证的、具有明确体内降血压功效的LPP为目标对蛋白质原料进行筛选和对发酵工艺进行优化，水解产物的降血压功效有保障，应用和市场前景更好。
本发明以发酵法结合酶解法对玉米蛋白粉进行水解，玉米蛋白粉的水解度和蛋白质回收率更高。目前已有大量对玉米蛋白粉进行酶法水解的报导，但是由于玉米蛋白粉中的蛋白质组分富含脯氨酸，单一的蛋白酶或复合酶难以将玉米蛋白粉充分水解。本发明利用具有强蛋白质水解活性的瑞士乳杆菌菌株对玉米蛋白粉进行发酵，玉米蛋白粉的水解度大大提高、水解产物中的脯氨酸含量显著提升。因此本发明对玉米蛋白粉资源的利用更加充分。
本发明利用大孔树脂对玉米蛋白粉水解液进行脱苦和脱色，精制效果和重复利用性好。玉米蛋白富含疏水性氨基酸，水解过程中会暴露出疏水性氨基酸残基而使水解产物具有很强的苦味，同时玉米蛋白粉中的黄色素也会随着水解的进行颜色逐渐加深，这将严重影响玉米蛋白粉水解物的外观与口感。现有报导主要采用活性炭对水解产物进行脱色脱苦，活性炭无法重复利用、废物排放较严重。本发明利用大孔吸附树脂对玉米蛋白粉水解液进行脱苦脱色处理，效果好、运行成本低、树脂易于再生且对LPP无吸附，因此应用价值更大。
附图说明
图1为富含LPP水解物的制备流程示意图。
图2为定向检测LPP的GC-MS/MS谱图。
图3为实施例1-5中不同发酵培养条件对蛋白回收率的影响图。
图4为实施例1-5中不同发酵培养条件对LPP含量的影响图。
图5为实施例5-8中不同发酵时间对蛋白回收率的影响图。
图6为实施例5-8中不同发酵时间对LPP含量的影响图。
图7为实施例9-11中酶的不同添加顺序对蛋白回收率的影响图，其中A为实施例9的结果，B为实施例10的结果，C为实施例11的结果。
图8为实施例9-11中酶的不同添加顺序对LPP含量的影响图，其中A为实施例9的结果，B为实施例10的结果，C为实施例11的结果。
图9为不同pH对脱色效果的影响图。
图10为不同时间对脱色效果的影响图。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件，未注明详细来源的材料，均为市售材料。
一种利用发酵法从玉米蛋白粉中定向制备富含LPP水解物的方法，其制备流程图如图1所示，包括以下步骤：
1、玉米蛋白粉的研磨过筛：玉米蛋白粉原料粉碎之后，过200目筛，收集筛下粉末待用。其中，玉米蛋白粉的蛋白质含量在60~70%之间、脯氨酸含量在4.0~5.0%之间、亮氨酸含量在9.0~10.0%之间。
2、发酵菌株的活化和扩大培养：选择瑞士乳杆菌作为发酵菌株。用无菌吸管吸取0.5 mL MRS肉汤于冻干管中将瑞士乳杆菌的冻干菌粉溶解，将溶解后的菌悬液转移至盛有4~5 mL MRS肉汤的试管中混匀，于37℃培养箱下静置培养24 h，转接2-3代，待菌株恢复活力后再转接到MRS斜面上保存。
本发明使用的瑞士乳杆菌购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），编号为22536，拉丁名为Lactobacillus helveticus，该菌株也可以使用市售的同种菌株替代。瑞士乳杆菌的扩大培养条件为：用接种环从MRS斜面挑取菌株于基础培养基中，在37℃生化培养箱中培养18h，将其稀释至OD600值为0.600，得到种子液待用。
其中，各培养基的组成如下：
（1）MRS肉汤（g/L）：蛋白胨10.0，牛肉浸粉8.0，酵母浸粉4.0，葡萄糖20.0，磷酸氢二钾2.0，柠檬酸二铵2.0，乙酸钠5.0，硫酸镁0.2，硫酸锰0.05，吐温-80 1.0，蒸馏水1 L，pH5.7±0.2。
（2）MRS斜面（g/L）：蛋白胨10.0，牛肉浸粉5.0，酵母浸粉4.0，葡萄糖20.0，磷酸氢二钾2.0，柠檬酸二铵2.0，乙酸钠5.0，硫酸镁0.2，硫酸锰0.05，琼脂15.0，吐温-80 1.0，蒸馏水1 L，pH6.2±0.2。
（3）基础发酵培养基（g/L）：葡萄糖20.0，蛋白胨10.0，玉米蛋白粉40.0，氯化钠0.5，蒸馏水1 L，pH6.2±0.2。
由于玉米蛋白粉中的LPP序列附近含有大量脯氨酸残基，这使得必须使用具有强水解能力的多酶体系方可将LPP从原料中定向释放出来。瑞士乳杆菌具有强大的蛋白水解活性和高效的蛋白水解系统，能够产生多种对蛋白特异的氨肽酶（包括PepN、PepC、PepX、Pepl、PepR等）及羧肽酶（包括PepD、脯氨酰羧肽酶等），因此非常适合富含Pro蛋白质的水解。
3、玉米蛋白粉的发酵：使用过筛的玉米蛋白粉配制发酵培养基，发酵培养基的组成为：葡萄糖1~3%（w/v）、牛肉浸粉1~2%（w/v）、MnSO4 0.4~0.8%（w/v）、十二烷基磺酸钠0.1~0.3%（w/v）、碳酸钙0.5~1.5%（w/v）、玉米蛋白粉4~8% （w/v）。在250mL三角瓶中装入100mL发酵培养基，并按4~8%（w/v）的接种量接入瑞士乳杆菌，于37℃条件下发酵36~72 h，得到发酵液。
可以在发酵之前用1~4%的风味蛋白酶水解发酵培养基1~4 h、或者发酵同时添加1~4%的风味蛋白酶，以提高蛋白质回收率和LPP含量。
4、发酵液的灭菌与离心：将发酵液于100℃水浴中灭菌10-15min，冷却至室温后于10000 rpm高速离心15 min，收集上清液。
5、上清液的超滤：调节上清液的pH值至4.5，采用分子截留量为5kDa的Biomax膜进行超滤，调节料液的入口压力≤25psi，待透过液中无蛋白质检出时停止超滤，收集透过液。
6、透过液的脱苦和脱色：采用XAD-16大孔树脂对透过液进行脱苦与脱色，调节透过液的pH值至3.0~7.0，XAD-16大孔树脂的添加量为20%（w/v）及以上，在5~35℃下脱色0.5-2.5h，得到脱色液。
7、脱色液的干燥：采用冷冻干燥法或喷雾干燥法对脱色液进行干燥，即可得到富含LPP的淡黄色且苦味低的水解物的粉末，其质谱图如图2所示。
在冷冻干燥法中，先将脱色液在-20℃下预冷冻24h，随后真空冷冻干燥3天；在喷雾干燥法中，脱色液直接用于干燥，进风温度为160℃、出口温度为60℃。
实施例1
用无菌吸管吸取瑞士乳杆菌CICC 22536种子液5mL，接种到装有100 mL玉米蛋白粉发酵培养基的250 mL三角瓶中，玉米蛋白发酵培养基的组成为：葡萄糖1%（w/v）、牛肉浸粉1.5%（w/v）、MnSO4 0.6%（w/v）、十二烷基磺酸钠0.3%（w/v）、碳酸钙1%（w/v）、玉米蛋白粉6%（w/v）。在恒温振荡器中（37℃，140 r/min）培养60h，然后取发酵液在100℃灭菌10min。
将灭菌后的发酵液在10000r/min下离心15min，收集上清液，将其pH值调节至4.5，然后采用分子截留量为5kDal的Biomax超滤膜在入口压力为20PSI的条件下超滤2h；收集透过液，调节其pH值至5，然后用20%（w/v）的XAD-16型大孔树脂在25℃下吸附脱色脱苦2h。与原料玉米蛋白粉相比，该过程的蛋白质回收率为14.76%。
脱色液真空冷冻干燥3天即得到富含LPP的淡黄色水解物，其LPP含量为0.031%（w/w）。
实施例2
用无菌吸管吸取瑞士乳杆菌CICC 22536种子液5mL，接种到装有100 mL玉米蛋白粉发酵培养基的250 mL三角瓶中，玉米蛋白发酵培养基的组成为：葡萄糖2%（w/v）、牛肉浸粉1.5%（w/v）、MnSO4 0.4%（w/v）、十二烷基磺酸钠0.2%（w/v）、碳酸钙1%（w/v）、玉米蛋白粉6%（w/v）。在恒温振荡器中（37℃，140 r/min）培养60h，然后取发酵液在100℃灭菌10min。
将灭菌后的发酵液在10000r/min下离心15min，收集上清液，将其pH值调节至4.5，然后采用分子截留量为5kDa的Biomax超滤膜在入口压力为20PSI的条件下超滤2h；收集透过液，调节其pH值至5，然后用20%（w/v）的XAD-16型大孔树脂在25℃下吸附脱色脱苦2h。与原料玉米蛋白粉相比，该过程的蛋白质回收率为13.43%。
脱色液真空冷冻干燥3天即得到富含LPP的淡黄色水解物，其LPP含量为0.028%（w/w）。
实施例3
用无菌吸管吸取瑞士乳杆菌CICC 22536种子液4mL，接种到装有100 mL玉米蛋白粉发酵培养基的250 mL三角瓶中，玉米蛋白发酵培养基的组成为：葡萄糖2%（w/v）、牛肉浸粉1.5%（w/v）、MnSO4 0.6%（w/v）、十二烷基磺酸钠0.2%（w/v）、碳酸钙1.5%（w/v）、玉米蛋白粉8%（w/v）。在恒温振荡器中（37℃，140 r/min）培养60h，然后取发酵液在100℃灭菌10min。
将灭菌后的发酵液在10000r/min下离心15min，收集上清液，将其pH值调节至4.5，然后采用分子截留量为5kDa的Biomax超滤膜在入口压力为20PSI的条件下超滤2h；收集透过液，调节其pH值至5，然后用20%（w/v）的XAD-16型大孔树脂在25℃下吸附脱色脱苦2h。与原料玉米蛋白粉相比，该过程的蛋白质回收率为16.32%。
脱色液料液真空冷冻干燥3天即得到富含LPP的淡黄色水解物，其LPP含量为0.042%（w/w）。
实施例4
用无菌吸管吸取瑞士乳杆菌CICC 22536种子液4mL，接种到装有100 mL玉米蛋白粉发酵培养基的250 mL三角瓶中，玉米蛋白发酵培养基的组成为：葡萄糖2%（w/v）、牛肉浸粉1.5%（w/v）、MnSO4 0.6%（w/v）、十二烷基磺酸钠0.2%（w/v）、碳酸钙1.5%（w/v）、玉米蛋白粉6%（w/v）。在恒温振荡器中（37℃，140 r/min）培养60h，然后取发酵液在100℃灭菌10min。
将灭菌后的发酵液在10000r/min下离心15min，收集上清液，将其pH值调节至4.5，然后采用分子截留量为5kDa的Biomax超滤膜在入口压力为20PSI的条件下超滤2h；收集透过液，调节其pH值至5，然后用20%（w/v）的XAD-16型大孔树脂在25℃下吸附脱色脱苦2h。与原料玉米蛋白粉相比，该过程的蛋白质回收率为15.09%。
脱色液真空冷冻干燥3天即得到富含LPP的淡黄色水解物，其LPP含量为0.035%（w/w）。
实施例5
用无菌吸管吸取瑞士乳杆菌CICC 22536种子液5mL，接种到装有100 mL玉米蛋白粉发酵培养基的250 mL三角瓶中，玉米蛋白发酵培养基的组成为：葡萄糖2%（w/v）、牛肉浸粉1.5%（w/v）、MnSO4 0.6%（w/v）、十二烷基磺酸钠0.2%（w/v）、碳酸钙1%（w/v）、玉米蛋白粉6%（w/v）。在恒温振荡器中（37℃，140 r/min）培养60h，然后取发酵液在100℃灭菌10min。
将灭菌后的发酵液在10000r/min下离心15min，收集上清液，将其pH值调节至4.5，然后采用分子截留量为5kDa的Biomax超滤膜在入口压力为20PSI的条件下超滤2h；收集透过液，调节其pH值至5，然后用20%（w/v）的XAD-16型大孔树脂在25℃下吸附脱色脱苦2h。与原料玉米蛋白粉相比，该过程的蛋白质回收率为18.26%。
脱色液真空冷冻干燥3天即得到富含LPP的淡黄色水解物，其LPP含量为0.046%（w/w）。
实施例1-5的蛋白回收率和LPP含量结果如图3和图4显示，按照实施例5的接种量以及培养基组成进行发酵水解玉米蛋白粉，得到的蛋白回收率和LPP含量最高，因此最优的玉米蛋白发酵培养基的组成为：葡萄糖2%（w/v）、牛肉浸粉1.5%（w/v）、MnSO4 0.6%（w/v）、十二烷基磺酸钠0.2%（w/v）、碳酸钙1%（w/v）、玉米蛋白粉6%（w/v），种子液为5mL。
实施例6
用无菌吸管吸取瑞士乳杆菌CICC 22536种子液5mL，接种到装有100 mL玉米蛋白粉发酵培养基的250 mL三角瓶中，玉米蛋白发酵培养基的组成为：葡萄糖2%（w/v）、牛肉浸粉1.5%（w/v）、MnSO4 0.6%（w/v）、十二烷基磺酸钠0.2%（w/v）、碳酸钙1%（w/v）、玉米蛋白粉6%（w/v）。在恒温振荡器中（37℃，140 r/min）培养36h，然后取发酵液在100℃灭菌10min。
将灭菌后的发酵液在10000r/min下离心15min，收集上清液，将其pH值调节至4.5，然后采用分子截留量为5kDa的Biomax超滤膜在入口压力为20PSI的条件下超滤2h；收集透过液，调节其pH值至5，然后用20%（w/v）的XAD-16型大孔树脂在25℃下吸附脱色脱苦2h。与原料玉米蛋白粉相比，该过程的蛋白质回收率为17.09%。
脱色液真空冷冻干燥3天即得到富含LPP的淡黄色水解物，其LPP含量为0.043%（w/w）。
实施例7
用无菌吸管吸取瑞士乳杆菌CICC 22536种子液5mL，接种到装有100 mL玉米蛋白粉发酵培养基的250 mL三角瓶中，玉米蛋白发酵培养基的组成为：葡萄糖2%（w/v）、牛肉浸粉1.5%（w/v）、MnSO4 0.6%（w/v）、十二烷基磺酸钠0.2%（w/v）、碳酸钙1%（w/v）、玉米蛋白粉6%（w/v）。在恒温振荡器中（37℃，140 r/min）培养48h，然后取发酵液在100℃灭菌10min。
将灭菌后的发酵液在10000r/min下离心15min，收集上清液，将其pH值调节至4.5，然后采用分子截留量为5kDa的Biomax超滤膜在入口压力为20PSI的条件下超滤2h；收集透过液，调节其pH值至5，然后用20%（w/v）的XAD-16型大孔树脂在25℃下吸附脱色脱苦2h。与原料玉米蛋白粉相比，该过程的蛋白质回收率为17.48%。
脱色液真空冷冻干燥3天即得到富含LPP的淡黄色水解物，其LPP含量为0.044%（w/w）。
实施例8
用无菌吸管吸取瑞士乳杆菌CICC 22536种子液5mL，接种到装有100 mL玉米蛋白粉发酵培养基的250 mL三角瓶中，玉米蛋白发酵培养基的组成为：葡萄糖2%（w/v）、牛肉浸粉1.5%（w/v）、MnSO4 0.6%（w/v）、十二烷基磺酸钠0.2%（w/v）、碳酸钙1%（w/v）、玉米蛋白粉6%（w/v）。在恒温振荡器中（37℃，140 r/min）培养72h，然后取发酵液在100℃灭菌10min。
将上述发酵液在10000r/min下离心15min，收集上清液，将其pH值调节至4.5，然后采用分子截留量为5kDa的Biomax超滤膜在入口压力为20PSI的条件下超滤2h；收集透过液，调节其pH值至5，然后用20%（w/v）的XAD-16型大孔树脂在25℃下吸附脱色脱苦2h。与原料玉米蛋白粉相比，该过程的蛋白质回收率为17.22%。
脱色液真空冷冻干燥3天即得到富含LPP的淡黄色水解物，其LPP含量为0.022%（w/w）。
结果图5-6显示瑞士乳杆菌在培养36-60h时的蛋白回收率和LPP含量较高。
实施例9
将风味蛋白酶按照3%（v/w）的添加量加入装在250 mL三角瓶中的100 mL玉米蛋白粉发酵培养基中酶解4 h，玉米蛋白发酵培养基的组成为：葡萄糖1.4%、牛肉浸粉1.6%、MnSO4 0.59%、十二烷基磺酸钠0.24%、碳酸钙1%、玉米蛋白粉5.8%。然后121℃灭菌15 min。待培养基冷却至室温后，添加5 mL的瑞士乳杆菌CCC 22536种子液，接种后在恒温振荡器中（37℃，140 r/min）培养60h，发酵结束后100℃灭菌15 min。
将上述发酵液在10000r/min下离心15min，收集上清液，将其pH值调节至4.5，然后采用分子截留量为5kDa的Biomax超滤膜在入口压力为20PSI的条件下超滤2h；收集透过液，调节其pH值至5，然后用20%（w/v）的XAD-16型大孔树脂在25℃下吸附脱色脱苦2h。与原料玉米蛋白粉相比，该过程的蛋白质回收率为31.46%。
脱色液真空冷冻干燥3天即得到富含LPP的淡黄色水解物，其LPP含量为0.051%（w/w）。
实施例10
在发酵开始时，向装有100 mL优化后的玉米蛋白粉发酵培养基的250 mL三角瓶中添加3%（v/w）风味蛋白酶和5 mL瑞士乳杆菌CCC 22536种子液，玉米蛋白发酵培养基的组成为：葡萄糖1.4%、牛肉浸粉1.6%、MnSO4 0.59%、十二烷基磺酸钠0.24%、碳酸钙1%、玉米蛋白粉5.8%。然后在恒温振荡器中（37℃，140 r/min）培养72 h，发酵结束后100℃灭菌15 min。
将上述发酵液在10000r/min下离心15min，收集上清液，将其pH值调节至4.5，然后采用分子截留量为5kDa的Biomax超滤膜在入口压力为20PSI的条件下超滤2h；收集透过液，调节其pH值至5，然后用20%（w/v）的XAD-16型大孔树脂在25℃下吸附脱色脱苦2h。与原料玉米蛋白粉相比，该过程的蛋白质回收率为34.96%。
脱色液真空冷冻干燥3天即得到富含LPP的淡黄色水解物，其LPP含量为0.066%（w/w）。
实施例11
向装有100 mL优化后的玉米蛋白粉发酵培养基的250 mL三角瓶中加入5mL的瑞士乳杆菌CCC 22536种子液发酵72 h，玉米蛋白发酵培养基的组成为：葡萄糖1.4%、牛肉浸粉1.6%、MnSO4 0.59%、十二烷基磺酸钠0.24%、碳酸钙1%、玉米蛋白粉5.8%。100℃灭菌15 min，待发酵液冷却至室温，添加3%（v/w）风味蛋白酶酶解4 h。酶解结束后于100℃沸水中灭酶15min。
将上述水解液在10000r/min下离心15min，收集上清液，将其pH值调节至4.5，然后采用分子截留量为5kDa的Biomax超滤膜在入口压力为20PSI的条件下超滤2h；收集透过液，调节其pH值至5，然后用20%（w/v）的XAD-16型大孔树脂在25℃下吸附脱色脱苦2h。与原料玉米蛋白粉相比，该过程的蛋白质回收率为20.98%。
脱色液真空冷冻干燥3天即得到富含LPP的淡黄色水解物，其LPP含量为0.049%（w/w）。
结果如图7-8显示，在发酵前用风味蛋白酶酶解发酵培养基或者在发酵同时添加风味蛋白酶均可以明显提高蛋白回收率和LPP含量，这是因为风味蛋白酶可以与瑞士乳杆菌的菌株产生协同效果，从而显著提高玉米蛋白粉的水解度、蛋白质回收率及LPP的含量。
实施例12
将实施例10中得到的透过液用XAD-16型大孔树脂进行脱色，分别调节其pH值至3.0~7.0，然后用20%（w/v）的XAD-16型大孔树脂在25℃下吸附脱色2h。结果如图9显示，当pH3.0时脱色率最高为80.75%，多肽损失率为24.93%；pH5.0时，水解液的脱色率轻微降低至78.73%，但多肽损失率仅为5.60%；当pH值继续升高时，XAD-16对多肽的吸附率随之增加，但脱色率仅略微增加。
将实施例10中得到的透过液用XAD-16型大孔树脂进行脱色。调节其pH值至5.0，然后用20%（w/v）的XAD-16型大孔树脂在25℃下分别吸附脱色0.5~3.0h。结果如图10所示，当吸附时间为0.5h时料液的脱色率为77.46%，当吸附时间为2h脱色率达到80.75%，此后随着时间的延长不再显著增加；多肽损失率在第0.5h时为13.03%，在第2h时为13.37%，与第0.5h时相比无显著差异，因此最好的脱色条件为料液pH值5.0、脱色温度25℃、脱色时间2.0h。
综上，培养基组成及接种量对蛋白回收率和水解物中LPP含量有至关重要的影响。在发酵过程中随着玉米蛋白粉的水解，部分多肽包括LPP会被菌株吸收而损失，因此发酵培养基中应提供充足且易于被瑞士乳杆菌菌株优先利用的碳源和氮源。同时，必须严格控制发酵时间，当发酵时间过短时玉米蛋白粉水解不完全及LPP含量低；但是当发酵时间过长时，由于菌体的大量增殖以及培养基中营养成分的大量消耗，水解液中的多肽会被菌体吸收而导致蛋白质和LPP损失。另外，在发酵的同时添加风味蛋白酶可以与瑞士乳杆菌的菌株产生协同效果，进而显著提高玉米蛋白粉的水解度、蛋白质回收率及LPP的含量。
脱色工艺条件对脱色效果及LPP含量也有重要影响。在确定脱色工艺时，除了考虑脱色效果之外，还必须保证LPP及其它多肽尽可能不被脱色剂吸附。影响这种非特异性吸附的主要影响因素是料液pH值和接触时间，其中前者会影响多肽的荷电性质进而影响其在树脂上的吸附性能，而后者会对脱色效果产生重要影响，当吸附时间过短时会导致脱色不完全。因此，在本发明中必须正常的选择脱色树脂并确定合理的脱色工艺条件。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (5)

1.一种利用发酵法从玉米蛋白粉中定向制备富含LPP水解物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将研磨过筛的玉米蛋白粉配制发酵培养基后，接入活化且扩大培养后的瑞士乳杆菌发酵，得到发酵液；
所述玉米蛋白粉的蛋白质含量在60~70%之间、脯氨酸含量在4.0~5.0%之间、亮氨酸含量在9.0~10.0%之间，且研磨后过200目筛；
所述发酵培养基的组成为葡萄糖1~3%（w/v）、牛肉浸粉1~2%（w/v）、MnSO4 0.4~0.8%（w/v）、十二烷基磺酸钠0.1~0.3%（w/v）、碳酸钙0.5~1.5%（w/v）、玉米蛋白粉4~8%（w/v）；
所述瑞士乳杆菌的接种量为4~8%（w/v），发酵温度为37℃，发酵时间为36~72h；所述瑞士乳杆菌为瑞士乳杆菌CICC 22536；
（2）所述发酵液高温灭菌后冷却至室温，并高速离心，收集上清液；
（3）所述上清液经超滤膜超滤，待透过液中无蛋白质检出时收集透过液；
（4）所述透过液使用树脂进行脱苦和脱色处理，得到脱色液；
（5）将脱色液进行冷冻干燥或喷雾干燥，得到富含LPP水解物的粉末。
2.根据权利要求1所述的利用发酵法从玉米蛋白粉中定向制备富含LPP水解物的方法，其特征在于，所述步骤（1）中在发酵同时向发酵培养基中加入玉米蛋白粉重量3%的风味蛋白酶。
3.根据权利要求1所述的利用发酵法从玉米蛋白粉中定向制备富含LPP水解物的方法，其特征在于，所述步骤（2）中离心速度为10000rpm，离心时间为15min。
4.根据权利要求1所述的利用发酵法从玉米蛋白粉中定向制备富含LPP水解物的方法，其特征在于，所述步骤（3）中超滤膜为分子截留量5kDa的Biomax膜，发酵液的pH值为4.5，料液的入口压力≤25psi。
5.根据权利要求1所述的利用发酵法从玉米蛋白粉中定向制备富含LPP水解物的方法，其特征在于，所述步骤（4）中的树脂为XAD-16大孔树脂，其添加量大于20% （w/v）、料液pH值为3.0~7.0、脱色温度为5~35℃、脱色时间0.5-2.5h。
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