CN109497531B - 一种发酵胶原蛋白肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物应用技术领域，特别涉及一种发酵胶原蛋白肽及其制备方法。制备方法包括以下步骤：以罗非鱼皮为原料，经植物提取液浸泡、沥干后，经打浆、胶体磨处理；经打浆、胶体磨处理的物料再经高压脉冲电场处理；将得到的高压脉冲电场处理液进行灭菌；灭菌后，将压脉冲电场处理液采用枯草芽孢杆菌进行发酵，得到发酵液；将发酵液超滤、浓缩、喷雾干燥，即制得发酵胶原蛋白肽。本发明提供的胶原蛋白肽的制备方法，通过植物提取液浸泡、高压脉冲电场提取、枯草芽孢杆菌发酵，可制得没有腥味，且具有发酵风味、适口性好的发酵胶原蛋白肽产品，还具有一定养颜润肤效果，制得的胶原蛋白肽可以以原液及胶原蛋白粉的形式可作为食品原料。
Description
技术领域
本发明涉及生物应用技术领域，特别涉及一种发酵胶原蛋白肽及其制备方法。
背景技术
胶原蛋白是一种高分子功能蛋白质，广泛分布于人体结缔组织、皮肤、骨骼等，占据人体蛋白质总量的25～30％。胶原蛋白肽是由胶原蛋白或者明胶经蛋白酶降解处理得到的一种胶原蛋白前体物质。其分子量远小于胶原蛋白，更易于被人体消化吸收，因其良好的吸收性、溶解性等优点，在生物医学、美容、功能性产品中具有广泛的应用。
现阶段，采用传统工艺生产的胶原蛋白肽苦味及鱼腥味较重，适口性差，消费者比较难以接受。
发明内容
为解决上述背景技术中的问题，本发明提供一种发酵胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤a、以罗非鱼皮为原料，经植物提取液浸泡、沥干后，经打浆、胶体磨处理；
步骤b、经打浆、胶体磨处理的物料再经高压脉冲电场处理；
步骤c、将得到的高压脉冲电场处理液进行灭菌；
步骤d、灭菌后，将压脉冲电场处理液采用枯草芽孢杆菌进行发酵，得到发酵液；
步骤e、将发酵液超滤、浓缩、喷雾干燥，即制得发酵胶原蛋白肽。
在上述技术方案的基础上，进一步地，所述植物提取液浸泡的制备方法为：将红茶粉和紫苏粉加入水，煮沸处理20-30min后，过滤，即得所述植物提取液。
在上述技术方案的基础上，进一步地，所述罗非鱼皮与植物提取液的比例为1：5-1：15，浸泡时间为0.5h-2h；优选比例为1：10，浸泡时间优选为1h；所述红茶粉和紫苏粉的比例为1：1。
在上述技术方案的基础上，进一步地，所述高压脉冲电场处理方式为：以5～10mL/min流速经蠕动泵泵送至高压脉冲电场处理室，电场强度15～30KV/cm、脉冲频率20～40Hz、脉冲时间1s～3s，得到高压脉冲电场处理液。
在上述技术方案的基础上，进一步地，灭菌方式为将得到的高压脉冲电场处理液于100℃～121℃下处理30min进行杀灭病原菌后，冷却至30℃～40℃。
在上述技术方案的基础上，进一步地，采用枯草芽孢杆菌进行发酵具体方法为：将活化好的斜面菌株接种到种子培养基中，在30～40℃、pH6.0～8.0、150r/min～200r/min条件下发酵培养20h～36h，并使孢子浓度达到108个/mL,然后以5％～8％的菌悬液接种到已冷却的高压脉冲电场处理液中，35℃保温发酵培养36h～80h后，于121℃下灭活处理15-30min，待自然冷却后，6000r/min离心20分钟，收集上清液。
在上述技术方案的基础上，进一步地，所述种子培养基成分为：酪蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L。
在上述技术方案的基础上，进一步地，所述超滤处理的方法为：采用规格为Φ1.0×150cm的层析柱，装入处理好的大孔吸附树脂HPD400A，对上述清液抽滤，再用截留分子量3Ka的超滤膜对上清液除杂，收集滤液。
在上述技术方案的基础上，进一步地，所述产品的浓缩、喷雾干燥方法包括：将制得的滤液经真空浓缩至固形物含量35％～40％，制得胶原蛋白肽浓缩液；将胶原蛋白浓缩液进行喷雾干燥成粉，所述喷雾干燥条件为：进风温度180～200℃，出风温度85～95℃，雾化压力45～60bar。
本发明还提供一种如上任意所述制备方法所制备的发酵胶原蛋白肽。
本发明提供的技术方案通过植物提取液浸泡、高压脉冲电场结合枯草芽孢杆菌发酵生产制备胶原蛋白肽，去除了胶原蛋白肽的鱼腥味，提高了胶原蛋白肽的提取率，同时利用了发酵法的优势，将微生物产酶和酶解合成一步，省去了酶的分离和提纯步骤，通过微生物代谢产生的端肽酶对小肽的末端进行修饰、重组，使氨基酸重排、转移，制得没有苦味且具有发酵风味的肽产品，适口性很好，且具有一定养颜润肤效果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明还提供如下表所示实施例：
实施例1
称取红茶粉2g、紫苏粉2g,加水1000mL，煮沸提取25min，过滤，制得植物提取液；
将罗非鱼鱼皮与植物提取液按1:10浸泡1h，沥干备用；
按料液重量比1:8加入蒸馏水，用打浆机打浆；
将打浆后的浆液置于胶体磨中均质，得到均匀的罗非鱼鱼皮浆液，以8mL/min流速经蠕动泵泵送至高压脉冲电场处理室，电场强度15KV/cm、脉冲频率20Hz、脉冲时间1s进行处理，得到高压脉冲电场(Pulsed Electric Fields,检查PEF)处理液；
将得到的PEF处理液于121℃下处理30min进行杀灭病原菌后冷却至35℃,得液体培养基；
将活化好的斜面菌株接种到种子培养基中，35℃、pH7.0、180r/min中发酵培养24h，并使孢子浓度达到108个/mL,然后以3％的菌悬液接种到已冷却的PEF处理液中，35℃保温发酵培养72h；
发酵结束后，于121℃下灭活处理15min，待自然冷却后，6000r/min离心20分钟，收集的上清液备用；
应用规格为Φ1.0×150cm的层析柱，装入处理好的大孔吸附树脂HPD400A，对上述清液抽滤，再用截留分子量3Ka的超滤膜对上清液除杂，收集滤液。
将制得的滤液经真空浓缩至固形物含量35％，制得胶原蛋白肽浓缩液，将胶原蛋白浓缩液进行喷雾干燥成粉,得胶原蛋白肽粉；其中，所述喷雾干燥条件为：进风温度185℃，出风温度90℃，雾化压力50bar。
实施例2
称取红茶粉2g、紫苏粉2g,加水1000mL，煮沸提取25min，过滤，制得植物提取液；
将罗非鱼鱼皮与植物提取液按1:10浸泡1h，沥干备用；
按料液重量比1:8加入蒸馏水，用打浆机打浆；
将打浆后的浆液置于胶体磨中均质，得到均匀的罗非鱼鱼皮浆液。以8mL/min流速经蠕动泵泵送至高压脉冲电场处理室，电场强度20KV/cm、脉冲频率20Hz、脉冲时间1S进行处理，得到PEF处理液；
将得到的PEF处理液于121℃下处理30min进行杀灭病原菌后冷却至35℃,得液体培养基；
将活化好的斜面菌株接种到种子培养基中，35℃、pH7.0、180r/min中发酵培养24h，并使孢子浓度达到108个/mL,然后以5％的菌悬液接种到已冷却的PEF处理液中，35℃保温发酵培养72h；
发酵结束后，于121℃下灭活处理15min，待自然冷却后，6000r/min离心20分钟，收集的上清液备用；
应用规格为Φ1.0×150cm的层析柱，装入处理好的大孔吸附树脂HPD400A，对上述清液抽滤，再用截留分子量3Ka的超滤膜对上清液除杂，收集滤液；
将制得的滤液经真空浓缩至固形物含量35％，制得胶原蛋白肽浓缩液，将胶原蛋白浓缩液进行喷雾干燥成粉,得胶原蛋白肽粉；其中，所述喷雾干燥条件为：进风温度185℃，出风温度90℃，雾化压力50bar。
实施例3
称取红茶粉2g、紫苏粉2g,加水1000mL，煮沸提取25min，过滤，制得植物提取液；
将罗非鱼鱼皮与植物提取液按1:10浸泡1h，沥干备用；
按料液重量比1:10加入蒸馏水，用打浆机打浆；
将打浆后的浆液置于胶体磨中均质，得到均匀的罗非鱼鱼皮浆液，以8mL/min流速经蠕动泵泵送至高压脉冲电场处理室，电场强度25KV/cm、脉冲频率30Hz、脉冲时间1s进行处理，得到PEF处理液；
将得到的PEF处理液于121℃下处理30min进行杀灭病原菌后冷却至35℃,得液体培养基；
将活化好的斜面菌株接种到种子培养基中，35℃、pH7.0、180r/min中发酵培养24h，并使孢子浓度达到108个/mL,然后以8％的菌悬液接种到已冷却的PEF处理液中，35℃保温发酵培养72h；
发酵结束后，于121℃下灭活处理15min，待自然冷却后，6000r/min离心20分钟，收集的上清液备用；
应用规格为Φ1.0×150cm的层析柱，装入处理好的大孔吸附树脂HPD400A，对上述清液抽滤，再用截留分子量3Ka的超滤膜对上清液除杂，收集滤液；
将制得的滤液经真空浓缩至固形物含量35％，制得胶原蛋白肽浓缩液，将胶原蛋白浓缩液进行喷雾干燥成粉,得胶原蛋白肽粉；其中，所述喷雾干燥条件为：进风温度185℃，出风温度90℃，雾化压力50bar。
实施例4
称取红茶粉2g、紫苏粉2g,加水1000mL，煮沸提取25min，过滤，制得植物提取液；
将罗非鱼鱼皮与植物提取液按1:10浸泡1h，沥干备用；
按料液重量比1:10加入蒸馏水，用打浆机打浆；
将打浆后的浆液置于胶体磨中均质，得到均匀的罗非鱼鱼皮浆液。以8mL/min流速经蠕动泵泵送至高压脉冲电场处理室，电场强度30KV/cm、脉冲频率40Hz、脉冲时间1s进行处理，得到PEF处理液；
将得到的PEF处理液于121℃下处理30min进行杀灭病原菌后冷却至35℃,得液体培养基；
将活化好的斜面菌株接种到种子培养基中，35℃、pH7.0、180r/min中发酵培养24h，并使孢子浓度达到108个/mL,然后以8％的菌悬液接种到已冷却的PEF处理液中，35℃保温发酵培养72h；
发酵结束后，于121℃下灭活处理15min，待自然冷却后，6000r/min离心20分钟，收集的上清液备用；
应用规格为Φ1.0×150cm的层析柱，装入处理好的大孔吸附树脂HPD400A，对上述清液抽滤，再用截留分子量3Ka的超滤膜对上清液除杂，收集滤液。
将制得的滤液经真空浓缩至固形物含量35％，制得胶原蛋白肽浓缩液。将胶原蛋白浓缩液进行喷雾干燥成粉,得胶原蛋白肽粉。所述喷雾干燥条件为：进风温度185℃，出风温度90℃，雾化压力50bar。
对比例1
将罗非鱼鱼皮与水按重量比1:8加入蒸馏水，用打浆机打浆；将打浆后的浆液置于胶体磨中均质，得到均匀的罗非鱼鱼皮浆液；以8mL/min流速经蠕动泵泵送至高压脉冲电场处理室，电场强度20KV/cm、脉冲频率20Hz、脉冲时间1s进行处理，得到PEF处理液。
将得到的PEF处理液于121℃下处理30min进行杀灭病原菌后冷却至35℃,得液体培养基。
将活化好的斜面菌株接种到种子培养基中，35℃、pH7.0、180r/min中发酵培养24h，并使孢子浓度达到108个/mL,然后以5％的菌悬液接种到已冷却的PEF处理液中，35℃保温发酵培养72h；发酵结束后，于121℃下灭活处理15min，待自然冷却后，6000r/min离心20分钟，收集的上清液备用。
应用规格为Φ1.0×150cm的层析柱，装入处理好的大孔吸附树脂HPD400A，对上述清液抽滤，再用截留分子量3Ka的超滤膜对上清液除杂，收集滤液。
将制得的滤液经真空浓缩至固形物含量35％，制得胶原蛋白肽浓缩液。将胶原蛋白浓缩液进行喷雾干燥成粉,得胶原蛋白肽粉；其中，所述喷雾干燥条件为：进风温度185℃，出风温度90℃，雾化压力50bar。
对比例2
称取红茶粉2g、紫苏粉2g,加水1000mL，煮沸提取25min，过滤，制得植物提取液。将罗非鱼鱼皮与植物提取液按1:10浸泡1h，沥干备用，按料液重量比1:8加入蒸馏水，用打浆机打浆，将打浆后的浆液置于胶体磨中均质，得到均匀的罗非鱼鱼皮浆液。
将活化好的斜面菌株接种到种子培养基中，35℃、pH7.0、180r/min中发酵培养24h，并使孢子浓度达到108个/mL,然后以5％的菌悬液接种到已冷却的PEF处理液中，35℃保温发酵培养72h；发酵结束后，于121℃下灭活处理15min，待自然冷却后，6000r/min离心20分钟，收集的上清液备用。
应用规格为Φ1.0×150cm的层析柱，装入处理好的大孔吸附树脂HPD400A，对上述清液抽滤，再用截留分子量3Ka的超滤膜对上清液除杂，收集滤液。
将制得的滤液经真空浓缩至固形物含量35％，制得胶原蛋白肽浓缩液。将胶原蛋白浓缩液进行喷雾干燥成粉,得胶原蛋白肽粉；其中，所述喷雾干燥条件为：进风温度185℃，出风温度90℃，雾化压力50bar。
对比例3，采用传统工艺生产的胶原蛋白肽
将鱼皮与0.5％氢氧化钠按照重量比1:3浸泡1h脱脂，将脱脂后的鱼皮调节pH至7.0，加入10倍重量的水，于95℃加热1h,冷却至45～55℃，加入蛋白酶进行酶解2h，酶解结束后，进行过滤除渣，加入鱼皮重量2％活性炭脱色，过滤除去活性炭，将胶原蛋白肽液浓缩至固形物为35％，进行喷雾干燥成粉。
将上述实施例和对比例制备的样品进行检测和理化性质分析，结果如表1所示：
表1
由表1可知，对比例1未经植物提取液浸泡处理，产品有明显鱼腥味，而经过植物提取液浸泡后得到的产品没有鱼腥味。且采用实施例3制备的胶原蛋白肽产品氧化三甲胺值为5.1mg/kg，与对比例3传统工艺生产的鱼胶原蛋白肽中氧化三甲胺值45.3相比，腥臭味降低，说明植物提取液具有去腥作用，这可能是因为植物浸泡液中的黄酮类物质和萜烯类化合物具有吸附异味和去除腥味的功能。
由表1还可知，采用实施例1～4制备的胶原蛋白肽产品蛋白质水溶性良好、无腥味、蛋白质及肽含量高，羟脯氨酸含量高，灰分低。
采用本发明提供的制备方法较大提高了胶原蛋白的纯度，有效去除了鱼腥味，改善了产品的口感。另外，根据对比例2的产品检测表明，本发明的高压脉冲电场提取条件提高了胶原蛋白的提取效果，提高了产品品质。
将本发明实施例和对比例制备的样品进行养颜润肤效果实验测试
每组观察对象：60名临床观察病例，症状表现为皮肤松弛、油腻、颜色暗淡、出现雀斑、痘印，其中男性30名，女性30名，年龄25-60岁。
测试过程：早上9点饮用，每组分别使用实施例1-4、对比例1、对比例2、对比例3制备的胶原蛋白肽粉5克，用200毫升35℃水冲泡后服用，测试时长30天；在测试期间，测试者不得服用近似功效的产品。
疗效评判标准：(1)显著：皮肤更水润，出油量明显减少，白皙度明显提高，皮肤细纹减少(2)有效：皮肤水润，出油量减少，白皙度提高(3)无效：治疗前后，皮肤无明显症状改善，或加重。
测试结果如表2所示：
表2
通过上述实验表明，本发明制备的蛋白肽能有效改善皮肤松弛、油腻性、肤色暗沉、细纹等症状，有美容护肤的功效，可作为生物活性物质应用于保健食品和食品工业。比较实施例3与实施例1、实施例2、实施例4，实施例3(料水比1:10，电场强度25KV/cm、脉冲频率30Hz、脉冲时间1s，接种量8％)的治疗效果优于实施例1(料水比1:8，电场强度15KV/cm、脉冲频率20Hz、脉冲时间1s，接种量3％)、实施例2(料水比1:8，电场强度20KV/cm、脉冲频率20Hz、脉冲时间1s，接种量5％)、实施例4(料水比1:10，电场强度30KV/cm、脉冲频率40Hz、脉冲时间1s，接种量8％)。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (6)
1.一种发酵胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤a、以罗非鱼皮为原料，经植物提取液浸泡、沥干后，经打浆、胶体磨处理；
步骤b、经打浆、胶体磨处理的物料再经高压脉冲电场处理；
步骤c、将得到的高压脉冲电场处理液进行灭菌；
步骤d、灭菌后，将高压脉冲电场处理液采用枯草芽孢杆菌进行发酵，得到发酵液；
步骤e、将发酵液超滤、浓缩、喷雾干燥，即制得发酵胶原蛋白肽；
所述植物提取液的制备方法为：将红茶粉和紫苏粉加入水，煮沸处理20-30min后，过滤，即得所述植物提取液；所述罗非鱼皮与植物提取液的比例为1：5-15，浸泡时间为0.5h-2h；所述红茶粉和紫苏粉的比例为1：1；
所述高压脉冲电场处理方式为：以5～10mL/min流速经蠕动泵泵送至高压脉冲电场处理室，电场强度15～30KV/cm、脉冲频率20～40Hz、脉冲时间1s～3s，得到高压脉冲电场处理液；
采用枯草芽孢杆菌进行发酵具体方法为：将活化好的斜面菌株接种到种子培养基中，在30～40℃、pH6.0～8.0、150r/min～200r/min条件下发酵培养20h～36h，并使孢子浓度达到108个/mL,然后以5％～8％的菌悬液接种到已冷却的高压脉冲电场处理液中，35℃保温发酵培养36h～80h后，于121℃下灭活处理15-30min，待自然冷却后，6000r/min离心20分钟，收集上清液。
2.根据权利要求1所述发酵胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：灭菌方式为将得到的高压脉冲电场处理液于100℃～121℃下处理30min进行杀灭病原菌后，冷却至30℃～40℃。
3.根据权利要求1所述发酵胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述种子培养基成分为：酪蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L。
4.根据权利要求1所述发酵胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述超滤处理的方法为：采用规格为Φ1.0×150cm的层析柱，装入处理好的大孔吸附树脂HPD400A，对所述上清液抽滤，再用截留分子量3KDa的超滤膜对上清液除杂，收集滤液。
5.根据权利要求1所述发酵胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述浓缩、喷雾干燥方法包括：将制得的滤液经真空浓缩至固形物含量35％～40％，制得胶原蛋白肽浓缩液；将胶原蛋白浓缩液进行喷雾干燥成粉，所述喷雾干燥条件为：进风温度180～200℃，出风温度85～95℃，雾化压力45～60bar。
6.根据权利要求1-5任一项所述制备方法所制备的发酵胶原蛋白肽。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A kind of fermented collagen peptide and preparation method thereof Effective date of registration: 20220831 Granted publication date: 20220311 Pledgee: China Everbright Bank Limited by Share Ltd. Xiamen branch Pledgor: XIAMEN YUANZHIDAO BIOTECH CO.,LTD. Registration number: Y2022980014201 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |