CZ291067B6 - Bakterie Lactobacillus helveticus produkující kyselinu mléčnou, fermentovaný mléčný výrobek a způsob jeho výroby - Google Patents

Bakterie Lactobacillus helveticus produkující kyselinu mléčnou, fermentovaný mléčný výrobek a způsob jeho výroby Download PDF

Info

Publication number
CZ291067B6
CZ291067B6 CZ20001082A CZ20001082A CZ291067B6 CZ 291067 B6 CZ291067 B6 CZ 291067B6 CZ 20001082 A CZ20001082 A CZ 20001082A CZ 20001082 A CZ20001082 A CZ 20001082A CZ 291067 B6 CZ291067 B6 CZ 291067B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
pro
lactic acid
milk
bacteria
fermented
Prior art date
Application number
CZ20001082A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ20001082A3 (cs
Inventor
Naoyuki Yamamoto
Natsue Kawakami
Yuu Ishida
Hirokazu Yada
Original Assignee
Calpis Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Calpis Co., Ltd. filed Critical Calpis Co., Ltd.
Publication of CZ20001082A3 publication Critical patent/CZ20001082A3/cs
Publication of CZ291067B6 publication Critical patent/CZ291067B6/cs

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205Bacterial isolates
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23CDAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/123Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt
    • A23C9/1234Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt characterised by using a Lactobacillus sp. other than Lactobacillus Bulgaricus, including Bificlobacterium sp.
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23CDAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/13Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using additives
    • A23C9/137Thickening substances
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20Bacteria; Culture media therefor
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23VINDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11Lactobacillus
    • A23V2400/147Helveticus
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12RINDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225Lactobacillus

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Dairy Products (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Je pops na bakterie Lactobacillus helveticus produkuj c kyselinu ml nou, kter m specifick bakteriologick vlastnosti, a kter to bakterie, kultivuje-li se v m diu ivo i n ho ml ka obsahuj c m 9 % hmot. su iny netu n ho ml ka, vytv ° tripeptidy Val-Pro-Pro a Ile-Pro-Pro v mno stv 60 .mi.g ve smyslu obsahu Val-Pro-Pro na ml m dia. Bakterie projevuje aktivitu extracelul rn prote zy ne ni ne 400 U/OD.sub.590.n.. Kmen Lactobacillus helveticus CM4 je ulo en pod p° r stkov²m slem FERM BP-6060. Tak je pops n fermentovan² ml n² v²robek, kter² obsahuje bakterie produkuj c kyselinu ml nou a tripeptid zvolen² ze skupiny zahrnuj c Val-Pro-Pro, Ile-Pro-Pro a jejich sm si. Fermentovan² ml n² v²robek se z sk fermentac ivo i n ho ml ka t mito bakteriemi produkuj c mi kyselinu ml nou.\

Description

Oblast techniky
Tento vynález se týká nových bakterií Lactobacillus helveticus produkujících kyselinu mléčnou, fermentovaného mléčného výrobku obsahujícího bakterie produkující kyselinu mléčnou a způsobu výroby tohoto výrobku.
Dosavadní stav techniky
Lactobacillus helveticus se pro mléčné výrobky dlouho používá k výrobě fermentovaného mléka jako iniciátor bakterií produkujících kyselinu mléčnou. Lactobacillus helveticus má vysokou proteolytickou aktivitu a zejména jeho vysoká aktivita extracelulámí proteázy hraje důležitou roli při fermentaci živočišného mléka. To znamená, že extracelulámí proteáza tráví proteiny živočišného mléka za vytvoření různých fragmentů peptidů. Vytvořené peptidy jsou dále podrobeny působení peptidáz, aby se vytvořily peptidy o nižší molekulové hmotnosti. Je známo, že část peptidů vytvořených v médiu je díky působení proteázových enzymů přijata buňkami bakterií produkujících kyselinu mléčnou a utilizována jako zdroj dusíku. Dále bylo publikováno, že některé z peptidů produkovaných v médiu mají inhibiční aktivitu k angiotenzin konvertujícímu enzymu (ACE), který způsobuje hypertenzi /J. Daiiy Sci., 78, 777-783 (1995)/.
Jako peptidy k inhibici aktivity ACE a potlačení zvýšení krevního tlaku byly publikovány různé účinné peptidy, jako například takové, které byly odvozeny od produktů degradace mléčných proteinů, sójových proteinů nebo proteinů rybího masa. Například Val-Pro-Pro alle-Pro-Pro (zkrácené dále jako VPP a IPP, tyto peptidy jsou společně dále uváděny jako laktotripeptidy) jsou známy jako peptidy s ACE inhibiční aktivitou přítomné v mléce fermentovaném Lactobacillus helveticus. Pokusy s použitím spontánně hypertenzních krys (SHR) potvrdily, že tyto laktotripeptidy mají silný hypotenzivní účinek /J. Dairy Sci., 78, 12531257 (1995)/.
Avšak fermentované mléko obsahující laktotripeptid produkovaný živočišným mlékem fermentovaným běžnými kmeny Lactobacillus helveticus se může těžko použít tak, jak je, neboť díky velkému množství kyseliny mléčné vytvořené v průběhu fermentace projevuje vysokou aciditu. Zředění fermentovaného mléka má za následek výrazné snížení obsahu laktotripeptidů.
Tudíž je žádoucí vyrobit fermentované mléko s vyšším obsahem laktotripeptidů v porovnání s obsahem kyseliny mléčné vytvořené ve fermentovaném mléce. Výrobky s funkcí laktotripeptidů by mohly být snadno připraveny a poskytnuty spotřebitelům v přijatelné formě k podávání přidáním malého množství takového framentovaného mléka k různým potravinám a nápojům. Avšak žádné ze známých kmenů bakterií produkujících kyselinu mléčnou nevytvářejí laktotripeptid s vysokou účinností.
Podstata vynálezu
Předmětem tohoto vynálezu jsou bakterie Lactobacillus helveticus produkující kyselinu mléčnou, které kultivují-li se v médiu živočišného mléka obsahujícího 9% hmotn. sušiny netučného mléka, vytvářejí tripeptidy Val-Pro-Pro a Ile-Pro-Pro v množství ne menším než 60 pg ve smyslu obsahu Val-Pro-Pro na ml média, přičemž tyto bakterie projevují aktivitu extracelulámí proteázy ne menší než 400 U/OD590 a mají dále uvedené tyto vlastnosti:
morfologické vlastnosti
1. tvar buňky: tyčinka
2. pohyblivost: žádná
3. tvorba spor: žádná
4. gramovo barvení: pozitivní fyziologické vlastnosti
1. produkce katalázy: negativní
2. produkce indolu: negativní
3. redukce nitrátu: negativní
4. aerobní růst: fakultativně anaerobní
5. tvorba DL-kyseliny mléčné z glukózy homolaktickou fermentací bez tvorby plynů
6. degradace uhlovodíků
-glukóza: + -laktóza: + -mannóza: + -fruktóza: + -galaktóza: +
-sacharóza: -maltóza: -xylóza: -rhamnóza: -cellobióza: -trehalóza: -melibióza: -rafmóza: -stachyóza: -mannitol: -sorbitol: -eskulin: -salicin: -.
Předmětem tohoto vynálezu také je fermentovaný mléčný výrobek, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje bakterie produkující kyselinu mléčnou vymezené výše a tripeptid zvolený ze skupiny zahrnující Val-Pro-Pro. Ile-Pro-Pro a jejich směsi.
Předmětem tohoto vynálezu konečně je také způsob výroby svrchu uvedeného fermentovaného mléčného výrobku, jehož podstata spočívá vtom, že zahrnuje fermentaci média bakteriemi produkujícími kyselinu mléčnou vymezenými výše, které obsahuje výživnou látku zvolenou ze skupiny zahrnující peptid, protein a jejich směsi obsahující sekvence Val-ProPro a Ile-Pro-Pro.
Dále se uvádějí některé podrobnější údaje k předmětnému vynálezu.
Tento vynález poskytuje bakterie produkující kyselinu mléčnou Lactobacillus helveticus, kde řečenými bakteriemi produkujícími kyselinu mléčnou je kmen Lactobacillus helveticus CM4 (uložen v Národním institutu biologických věd a Agentuře pro humánní technologie průmyslových věd a technologie 15.srpna 1997 pod číslem uložení FERM BP 6060).
Podle tohoto vynálezu se dále poskytují bakterie produkující kyselinu mléčnou Lactobacillus helveticus s chromozomální DNA, kdy uvedená chromozomální DNA při trávení restrikčními enzymy Pstl a EcORI poskytuje DNA fragment o velikosti 15 až 17 kb.
-2CZ 291067 B6
Stručný popis k obrázkům
Obrázek 1 je fotografie ukazující způsobem elektroforézy na agarózovém gelu fragmenty chromozomální DNA různých kmenů Lactobacillus helveticus z příkladu 2.
Upřednostňovaná ztělesnění vy nálezu
Bakterie produkující kyselinu mléčnou podle tohoto vynálezu patří k Lactobacillus helveticus, a vyznačují se tím, že bakterie produkující kyselinu mléčnou při kultivaci v médiu živočišného mléka obsahujícího 9 % hmotn. sušiny netučného mléka vytvářejí tripeptidy Val-Pro-Pro a Ile-ProPro v množství ne menším než 60 gg, a výhodně ne menším než 70 gg ve smyslu obsahu Val-Pro-Pro na ml média, a projevují aktivitu extracelulámí proteázy ne nižší než 400 U/OD590, a výhodně ne nižší než 430 U/OD590. Produktivita definovaného laktotripeptidu je ukazatelem k rozlišení těchto bakterií produkujících kyselinu mléčnou od běžných bakterií produkujících kyselinu mléčnou Lactobacillus helveticus. Tímto ukazatelem se například definuje vlastnost těchto bakterií produkujících kyselinu mléčnou vytvářet při kultivaci v médiu živočišného mléka obsahujícím 9 % hmotn. sušiny netučného mléka laktotripeptidy v množství ne menším než 60 pg ve smyslu obsahu VPP na ml m, dia, která se nemohla uskutečnit běžnými bakteriemi produkujícími kyselinu mléčnou. Obvykle se snížením obsahu sušiny netučného mléka v médiu pro kultivaci vytvoří menší množství laktotripeptidů. Zvýšením obsahu sušiny netučného mléka se vytvoří větší množství laktotripeptidu.
Produktivita laktotripeptidů jako ukazatel se měří kroky inokulace živočišného mléka, jako například kravského mléka, kozího mléka, koňského mléka a z nich odstředěného mléka obsahujícího 9% hmotn. sušiny netučného mléka, bakteriemi produkujícími kyselinu mléčnou, kultivace těchto bakterií k přípravě fermentovaného mléka 24 h při teplotě 37 °C, odstřeďování 1 ml fermentovaného mléka při frekvenci otáček 15 000 za min po dobu 10 min, podrobení supematantu měření množství VPP a IPP a převedení těchto množství na množství VPP. Protože ACE inhibiční aktivita IPP na jednotku hmotnosti je 1, 7násobná než VPP, vypočítá se převedené množství laktotripeptidu ve smyslu obsahu VPP tímto vztahem:
převedené množství laktotripeptidu (pg ve smyslu obsahu VPP na ml) - množství IPP (gg/ml) x
I, 7 + množství VPP (gg/ml).
Maximální produktivita laktotripeptidu není zvláště omezena, ale může být dosažena, jestliže všechny ze sekvencí Val-Pro-Pro a Ile-Pro-Pro začleněné v proteinu média se trávením odštěpí jako tripeptidy.
Aktivita extracelulámí proteázy se měří způsobem podle Yamamoto a kol. /Yamamoto N. a kol.,
J. Biochem., 114, 740 (1993)/ založeném na způsobu podle Twininga a kol. /Twining S., Anal. Biochem., 143, 3410 (1984)/ a vyjádří se definováním, že množství enzymu projevující 1 % intenzitu fluorescence má aktivitu 1 U/OD590. Výše uvedený limit aktivity extracelulámí proteázy také není omezen, ale obvykle je 800 U/OD590.
Tyto bakterie produkující kyselinu mléčnou mohou vytvářet velké množství laktotripeptidu vzhledem k množství kyseliny mléčné vytvořené během fermentace. Tudíž fermentace s použitím těchto bakterií produkujících kyselinu mléčnou má za následek fermentované mléko obsahující větší množství laktotripeptidu v porovnání s fermentovaným mlékem obsahujícím podobné množství kyseliny mléčné vytvořeným běžnými bakteriemi produkujícími kyselinu mléčnou. V důsledku takové fermentace je tato kyselina mléčná kyselina DL-mléčná. Výhodně množství laktotripeptidu produkovaného fermentací těmito bakteriemi produkujícími kyselinu mléčnou není nižší než 30 gg ve smyslu obsahu VPP na 1 ml výsledného fermentovaného mléka obsahujícího 0,01 g/ml kyseliny DL-mléčné vytvořené během fermentace. Horní limitní
-3CZ 291067 B6 množství laktotripeptidu není zvláště omezeno, ale tyto bakterie jsou schopny vytvářet až přibližně 50 pg ve smyslu obsahu VPP na 1 ml fermentovaného mléka obsahujícího 0,01 g kyseliny DL-mléčné. Množství kyseliny DL-mléčné je přibližně úměrné množství laktotripeptidu. Tudíž jestliže se v fermentovaném mléce vytvoří například 0,02 g kyseliny DL-mléčné, množství vytvořeného laktotripeptidu výhodně není menší než 60 pg, ve smyslu obsahu VPP. Naproti tomu fermentací běžnými bakteriemi produkujícími kyselinu mléčnou je množství laktotripeptidu (maximálně) nižší než 30 pg ve smyslu obsahu VPP na 0,01 g kyseliny DLmléčné v 1 ml fermentovaného mléka.
Příkladem těchto bakterií produkujících kyselinu mléčnou je kmen Lactobacillus helveticus CM4, který je uložen jako FERM BP-6060 v Národním institutu biologických věd a Agentuře pro humánní technologie průmyslových věd a technologie (uložen 15.srpna 1997). Kmen Lactobacillus helveticus CM4 má tyto biologické vlastnosti:
morfologické vlastnosti
1. tvar buňky: tyčinka
2. pohyblivost: žádná
3. tvorba spor: žádná
4. gramovo barvení: pozitivní fyziologické vlastnosti
1. produkce katalázy: negativní
2. produkce indolu: negativní
3. redukce nitrátu: negativní
4. aerobní růst: fakultativně anaerobní
5. tvorba DL-kyseliny mléčné z glukózy homolaktickou fermentací bez tvorby plynů
6. degradace uhlovodíků
-glukóza: +
-laktóza: +
-mannóza: +
-fruktóza: +
-galaktóza: + -sacharóza: -maltóza: -xylóza: -rhamnóza: -cellobióza: -trehalóza: -melibióza: -rafinóza: -stachyóza: -mannitol: -sorbitol: -eskulin: -salicin: Jestliže se hodnotí způsobem podle Mitsuoka a kol. /Rinshoukensa 18, 1163 (1974)/, jsou výše uvedené bakteriologické vlastnosti kmene CM4 stejné, jako veřejně známého kmene Lactobacillus helveticus NCDO-099. Nicméně podle těchto vlastností, které Mitsuoka a kol. nepopsal, se kmen CM4 jasně odlišuje od kmene NCDO-099:
-4CZ 291067 B6
7. aktivita extracelulámí proteázy: ne méně než 400 U/OD590
8. produktivita laktotripeptidu, tvorba dvou druhů tripeptidů (VPP a IPP) v množství 60 pg nebo vyšším ve smyslu obsahu VPP na 1 ml fermentované tekutiny při kultivaci v médiu obsahujícím 9 % hmotn. odstředěného mléka 24 h při teplotě 37 °C.
Produktivita laktotripeptidu v bodě 8. se měří s použitím odstředěného mléka jako sušiny netučného mléka.
Kmen bakterií produkujících kyselinu mléčnou podle tohoto vynálezu se může získat tímto screeningem a měřením aktivity extracelulámí proteázy.
1. Primární screening
Selekce kmene měřením výše ACE inhibiční aktivity ve fermentovaném mléce
Kmeny pro screening se při teplotě 37 °C 24 h kultivují v médiu s obsahem 9 % hmotn. odstředěného mléka. Po skončení kultivace se měří počet bakterií produkujících kyselinu mléčnou, acidita kyseliny mléčné a ACE inhibiční aktivita. Vyberou se kmeny bakterií produkujících kyselinu mléčnou produkující 1 x 108 buněk/ml nebo více a projevující aciditu kyseliny mléčné 1,6% hmotn. nebo více a ACE inhibiční aktivitu 40 U/ml. ACE inhibiční aktivita se měří způsobem podle Cushmana aCheunga /Cushman D. W. aCheung H. S., Pharmacol., 20, 1637(1971)/.
2. Sekundární screening
Selekce kmene s vysokou produktivitou laktotripeptidu
Kultivované tekutiny kmenů vybraných primárním screeningem se 10 min odstřeďují při frekvenci otáček 15 000 za min ajejich supematanty se podrobí HPLC ke kvantifikaci laktotripeptidu. Vyberou se kmeny, které vytvořily ne méně než 50 pg ve smyslu obsahu VPP na 1 ml.
3. Měření aktivity extracelulámí proteázy
Každý z kmenů vybraných sekundárním screeningem se kultivuje v médiu obsahujícím 9% hmotn. odstředěného mléka, přičemž jeho pH se udržuje na hodnotě 6. Vzorek se odebere uprostřed logaritmické fáze růstu a smísí se s 1 % hmotn. citrátu sodného, odstřeďuje se 10 min při frekvenci otáček 15 000 za min k získání buněk. Získané buňky se promyjí 50mM kyselinou β-glycerolfosforečnou a suspendují v 50mM Tris-HCI pufru (pH = 7,8), aby se turbidita (OD39o) upravila na hodnotu 1. Potom se měří aktivita proteázy na buněčném povrchu. Bude ověřeno, že výsledek je korelativní s produktivitou laktotripeptidu kmenů měřených sekundárním screeningem.
Kmen bakterií produkujících kyselinu mléčnou Lactobacillus helveticus vybraný výše uvedeným způsobem se může identifikovat a rozlišit od ostatních kmenů bakterií produkujících kyselinu mléčnou například výše uvedenou produktivitou tripeptidů a aktivitou extracelulámí proteázy.
Bakterie produkující kyselinu mléčnou podle tohoto vynálezu mají výhodně vedle výše uvedené produktivity laktotripeptidu a aktivity extracelulámí proteázy chromozomální DNA, a tato chromozomální DNA, je-li trávena restrikčními enzymy Pstl a EcoRI, poskytuje fragment DNA o velikosti 15 až 17 kb. Tudíž mohou být bakterie produkující kyselinu mléčnou podle tohoto
-5CZ 291067 B6 vynálezu jasně odlišeny od jiných kmenů stejného druhu zkoušením, zda tento kmen má chromozomální DNA, která poskytuje takový fragment DNA.
Existence fragmentu DNA o velikosti 15 až 17 kb může být potvrzena extrakcí chromozomální DNA z bakterií produkujících kyselinu mléčnou způsobem podle Leenhoutse a kol. /Leenhouts
K., Appl. Environ. Microbiol., 56, 2726 (1990)/, trávením chromozomální DNA Ecol aPstl, provedením elektroforézy odštěpených fragmentů na 0,8 % agarózovém gelu a analýzou výsledku elektroforézy. Po provedení elektroforézy se přítomnost DNA fragmentu jasně potvrdí tak, že se jako ukazatel velikosti podrobí 1 fágová DNA trávená restrikčním enzymem Hind lil paralelní elektroforéze.
Fermentovaný mléčný výrobek podle tohoto vynálezu obsahuje jako nepostradatelnou složku fermentované mléko obsahující bakterie produkující kyselinu mléčnou atripeptid zvolený ze skupiny zahrnující VPP, IPP a jejich směsi. To znamená, že fermentovaný mléčný výrobek podle tohoto vynálezu obsahuje fermentované mléko obsahující laktotripeptid a bakterie produkující kyselinu mléčnou a připraví se fermentací média obsahujícího výživnou látku složenou z peptidů a/nebo proteinů, které zahrnují sekvenci VPP a/nebo IPP bakteriemi produkujícími kyselinu mléčnou podle tohoto vynálezu. Tudíž se mohou obsahy bakterií produkujících kyselinu mléčnou a tripeptidu vhodně zvolit v závislosti na druhu připravovaného fermentovaného mléčného výrobku. Tento fermentovaný mléčný výrobek může obsahovat získaný fermentovaný výrobek samotný, nebo čištěný fermentovaný výrobek.
Fermentovaný mléčný výrobek podle tohoto vynálezu obsahuje kyselinu DL-mléčnou vytvořenou během fermentace. Fermentovaný mléčný výrobek podle tohoto vynálezu výhodně obsahuje laktotripeptid v množství 30 až 50 pg ve smyslu obsahu VPP vzhledem k 0,01 g kyseliny DL-mléčné. Množství kyseliny DL-mléčné je přibližně úměrné množství laktotripeptidu. Tudíž jestliže fermentovaný mléčný výrobek obsahuje koncentrované fermentované mléko a obsahuje např. 0,02 g kyseliny DL-mléčné, množství laktotripeptidu je výhodně v rozmezí 60 až 100 pg ve smyslu obsahu VPP. Jestliže fermentovaný mléčný výrobek obsahuje zředěné fermentované mléko a obsahuje např. 0,005 g kyseliny DL-mléčné, množství laktotripeptidu je výhodně v rozmezí 15 až 25 pg ve smyslu obsahu VPP. Ačkoliv může fermentovaný mléčný výrobek podle tohoto vynálezu obsahovat kyselinu L-mléčnou, která je potravinovým doplňkem k úpravě acidity, je tato kyselina L-mléčná odlišná od kyseliny DL-mléčné vytvořené během fermentace.
Bakterie produkující kyselinu mléčnou ve fermentovaném mléčném výrobku podle tohoto vynálezu se mohou buďto sterilizovat po fermentací, nebo udržovat živé bez sterilizace.
Fermentovaný mléčný výrobek podle tohoto vynálezu může být jogurt, zakysané nápoje obsahující mléko, sýr, připravené potraviny obsahující fermentované kyselé mléko a zdraví prospěšné potraviny obsahující fermentované kyselé mléko. Tudíž fermentovaný mléčný výrobek podle tohoto vynálezu může obsahovat vedle fermentovaného mléka jako nepostradatelné složky různé látky, které se obvykle přidávají k výrobě takové škály výrobků. Fermentovaný mléčný výrobek podle tohoto vynálezu může být ve formě pevné, jako například prášků, granulátů a tablet, nebo tekuté, jako například pasty, gelu a kapaliny.
Způsob výroby fermentovaného mléčného výrobku podle tohoto vynálezu zahrnuje fermentací média obsahujícího výživnou látku zvolenou ze skupiny, která zahrnuje peptid, protein a jejich směsi obsahující jako součást své sekvence Val-Pro-Pro a/nebo Ile-Pro-Pro, bakteriemi produkujícími kyselinu mléčnou.
Výživná látka v médiu může být některého z typů podle toho, jak dlouhé obsahuje peptidy a/nebo proteiny, které jako součást své sekvence obsahují VPP a/nebo IPP. Výživnou látkou
-6CZ 291067 B6 může být například živočišné mléko, mléčný kasein, kukuřice, kukuřičný protein, pšenice, pšeničný protein, sójové boby, sójové mléko, odtučněné sójové boby, sójový protein nebo jejich směsi. Zvláště je výhodné použít výživnou látku obsahující živočišné mléko, jako například kravské mléko, kozí mléko, koňské mléko, nebo z nich odstředěná mléka. Obsah sušiny netučného mléka v živočišném mléce není zvláště omezen, ale obvykle je v rozmezí 5 až 20 % hmotn.
Není žádné zvláštní omezení množství bakterií produkujících kyselinu mléčnou, kterými se médium inokuluje. Množství k inokulaci je obvykle přibližně IO5 až 107 buněk bakterií produkujících kyselinu mléčnou na 1 g výše uvedené určité výživné látky v médiu.
Fermentace se může provádět při teplotě v rozmezí 25 až 50 °C, a výhodně při teplotě v rozmezí 30 až 45 °C po dobu 6 až 30 h, a výhodně po dobu 10 až 24 h, v rozmezí hodnot pH výhodně 3,0 až 4,0, a výhodněji v rozmezí 3,0 až 3,5.
Fermentace se výhodně provede tak, že množství laktotripeptidu není menší než 60 pg ve smyslu obsahu VPP na ml výsledného fermentovaného mléka. Zejména jestliže se jako médium použije kravské mléko obsahující 9 % hmotn. sušiny netučného mléka, má fermentace při teplotě 25 až 40 °C po dobu 12 až 48 h za následek fermentované mléko obsahující laktotripeptid v množství ne menším než 70 pg, ve smyslu obsahu VPP na ml. Obsah sušiny netučného mléka v médiu je přibližně úměrný vytvořenému laktotripeptidu. Například obsahuje-li výživná látka 5 % hmotn. sušiny netučného mléka, fermentace podle výše uvedených podmínek by měla mít za následek produkci laktotripeptidu v množství přibližně 33,3 pg ve smyslu VPP obsahu na ml.
Fermentované mléko získané výše uvedenou fermentací se může smísit s výrobkem tak, jak je. Je-li to nutné, může se fermentované mléko před smísením podrobit ředění nebo čištění. Fermentované mléko se může ochladit a skladovat při teplotě 5 °C, a potom smísit s ostatními složkami, aby se připravil výrobek, jako například mražený výrobek. Alternativně se může fermentované mléko podrobit tepelné sterilizaci aje-li to nutné, práškovat sušením rozprašováním, aby se připravil výrobek k distribuci při teplotě místnosti.
Protože fermentovaný mléčný výrobek podle tohoto vynálezu obsahuje fermentované mléko získané fermentací bakteriemi produkujícími kyselinu mléčnou, může se použít ke snadné přípravě výrobků s vysokým obsahem laktotripeptidu vzhledem k obsahu kyseliny mléčné v přijatelné formě k podávání. Očekává se, že podává-li se člověku fermentovaný mléčný výrobek, projeví se hypotenzivní účinek a protistresový účinek laktotripeptidu.
Protože bakterie produkující kyselinu mléčnou podle tohoto vynálezu mohou svou kultivací v určité výživné látce vytvářet velké množství laktotripeptidu, jsou bakterie a látky z nich užitečné k výrobě široké škály fermentovaných mléčných výrobků, funkčních potravin, zdraví prospěšných potravin, potravin pro určené zdravotní použití, potravin pro určené použití staršími lidi, s hypotenzivním účinkem a stres zmírňujícím účinkem laktotripeptidu.
Příklady provedení vynálezu
Tento vynález bude podrobněji popsán dále s odkazem na příklady, ale tento vynález se na ně neomezuje.
Mezi kmeny Lactobacillus helveticus použitými v příkladech, je kmen CM4 uložen v Národním institutu biologických věd a Agentuře pro humánní technologie průmyslových věd a technologie a bylo mu uděleno přírůstkové číslo FERM BP-6060. Veřejně dostupné kmeny jsou ATCC15009, NCDO-099, JCM1006, ATCC10797, JCM1062, JCM1103, JCM1120 a JCM1004.
-7CZ 291067 B6
Jiné kmeny, než výše uvedené kmeny použité v příkladech jsou zvoleny ze sbírky kmenů přihlašovatele.
Příklad 1
Selekce kmenů poskytujících fermentované mléko s vysokou ACE inhibiční aktivitou
Screenovalo se 36 kmenů Lactobacillus helveticus izolovaných z různých mléčných výrobků. ACE inhibiční aktivita mléka fermentovaného každým z kmenů se měřila tímto způsobem. Každý z kmenů Lactobacillus helveticus se kultivoval při teplotě 37 °C po dobu 24 h v médiu s 9 % hmotn. sušiny netučného mléka. Kultivační médium se přidalo do čerstvého média stejného typu v takovém množství, aby nové médium obsahovalo 3 % hmotn. kultivačního média. Fermentace dále probíhala 24 h při teplotě 37 °C. Po ukončení fermentace se měřila acidita kyseliny mléčné (% hmotn.), množství peptidu v syrovátce (mg/ml), počet buněk a ACE inhibiční aktivita (U/ml). Výsledky ukazuje tabulka 1,7 kmenů z 36 kmenů mělo velmi slabou schopnost fermentace. 15 kmenů vytvořilo fermentované mléko s aciditou vytvořené kyseliny mléčné ne menší než 1,6 % hmotn. Z 15 kmenů bylo vybráno 8 kmenů s ACE inhibiční aktivitou ne menší než 40 U/ml syrovátky ve svém fermentovaném mléce.
Měření ACE inhibiční aktivity fermentovaného mléka
ACE inhibiční aktivita se měřila způsobem podle Cushmana aCheunga /Cushman D. W. aCheung H. S., Pharmacol., 20, 1637 (1971) /. To znamená, že každé fermentované mléko se odstřeďovalo při frekvenci otáček 15 000 za min po dobu 5 min, aby se dostal supematant (syrovátka). Syrovátka se k měření vhodně zředila. Do zkumavky se vpravilo 80 μΐ zředěné syrovátky, smísilo se s 0,2 ml 0,1 M kyseliny borité jako pufru (obsahujícího 0,3 M NaCl, pH = 7,3) obsahujícím jako substrát 5 mM hippurylhistidinleucinu (Hip-His-Leu, vyrobený společností Sigma Chemicals Co.), a dále se smísilo s 20 μΐ roztoku enzymu (0,1 U/ml, vyrobený společností Sigma Chemicals Co.). Výsledná směs se nechala reagovat 30 min při teplotě 37 °C a potom se k ukončení reakce smísila s 250 μΐ 1 N kyseliny chorovodíkové. Následně se směs smísila s 1,7 ml ethylacetátu, 20 smísila a potom odstřeďovala 10 min při frekvenci otáček 3 000 za min, aby se znovu získalo 1,4 ml ethylacetátové fáze (vrchní fáze). Vrchní fáze se zahřívala 40 min při teplotě 120 °C, aby se odstranilo rozpouštědlo, smísila se s 1 ml destilované vody a mísila přibližně 20 s. U extrahované kyseliny hippurové se měřila absorbance při 228 nm. Aktivita enzymu v jednotkách se vypočítala podle dále uvedeného vztahu stím, že jako jedna jednotka se definuje množství, které poskytne 50 % inhibici ACE aktivity.
množství enzymu (jednotka) = (A-B) / (A-C) x 100 x 1/50 kde
A představuje absorbanci při 228 nm bez vzorku, B představuje absorbanci při 228 nm se vzorkem a C představuje absorbanci při 228 nm jak bez enzymu, tak bez vzorku. Kvantitativní analýza množství peptidů ve fermentovaném mléce
Kvantitativní analýza peptidů se uskutečnila způsobem OPA /Charch F. C. a kol., J. Dairy Sci., 66, 1219 (1883)/. Jako standardní látka k vytvoření kalibrační křivky se použil kasein trávený trypsinem.
-8CZ 291067 B6
Tabulka 1
Kmeny Acidita (% hmotn.) Množství peptidů (mg/ml) Počet buněk (xlO8 buněk/ml) ACE inhibiční aktivita (U/ml)
Kmen 1 - -
Kmen 2 - -
Kmen 3 -
Kmen 4 - -
Kmen 5 - -
Kmen 6 - -
Kmen 7 - -
Kmen 8 0,498 1,59 0,29 26.4
Kmen 9 2,022 1,99 9,53 34,5
Kmen 10 1,709 2,10 8,53 24.5
Kmen 11 0,615 1,76 1,28 29,1
Kmen 12 0,411 1,35 0,38 17.6
Kmen 13 0,917 1,57 3,63 19,9
Kmen 14 1,026 1,71 5,78 9.4
Kmen 15 0,517 1,59 0,56 26,9
Kmen 16 1,532 4,69 5,97 102,5
Kmen 17 2,101 2,01 6,09 98,9
Kmen 18 1,783 1,94 5,38 21,9
Kmen 19 1,955 1,69 5,31 100,6
Kmen 20 2,095 1,74 7,16 61,4
Kmen 21 1,963 2,03 6,05 125,3
Kmen 22 1,798 2,85 6,19 54,2
Kmen 23 1,604 2,32 6,81 36,6
Kmen 24 1,932 1,77 7,97 47,7
Kmen 25 1,885 1,51 4,91 18,3
Kmen 26 1,862 1,46 5,69 26,2
Kmen 27 1,063 3,01 2,78 76,9
Kmen 28 0,457 1,98 0,50 52,4
Kmen 29 0,516 2,55 1,13 92,6
JCM1006 1,872 2,35 6,97 48,5
JCM1062 1,109 2,60 8,50 78,4
JCM1103 1,244 1,36 3,69 31,0
ATCC 10797 1,359 2,11 8,56 13,8
ATCC 15009 1,454 1,81 5,16 16,6
NCDO-099 1,769 2,76 6,59 25,5
CM4 1,635 3,12 4,44 130,0
Selekce kmenů s vysokou produktivitou laktotripeptidu
Následně se u 8 výše vybraných kmenů s vysokou ACE inhibiční aktivitou, které poskytly fermentované mléko, měřil obsah VPP a IPP v jimi fermentovaném mléce, ml fermentovaného mléka se odstřeďoval 10 min při frekvenci otáček 15 000 za min.
Nashromáždil se jeho supematant, to znamená syrovátka. 0,3 ml syrovátky se podrobilo adsorpci na Sep-Pak Cartridge (vyrobeno Waters lne.), promyla se destilovanou vodou a potom eluovala 5 ml methanolu. Eluát se vysušil odstřeďováním a za sníženého tlaku. Vysušený produkt se
-9CZ 291067 B6 rozpustil v 0,3 ml 0,05 % vodného roztoku kyseliny trifluoroctové, a podrobil HPLC analýze (vysokoúčinná kapalinová chromatografie) za těchto podmínek: Výsledky ukazuje tabulka 2.
Použitý přístroj:
Hitachi L4000 UV detektor (při 215 nm) programovatelná pumpa L6200 vyhřívaná kolona L5030 (35 °C)
Podmínky eluce: rychlost proudění 0,5 ml/min
Eluent: vodný roztok obsahující 0,3M NaCl a 0,05 % kyselinu trifluoroctovou
Kolona: Asahipak GS320 (Φ 3,9 x 600 mm)
Protože ACE inhibiční aktivita IPP na jednotku hmotnosti je l,7násobná než VPP, vypočítal se obsah laktotripeptidů ve smyslu obsahu VPP změřených množství IPP aVPP podle dále 20 uvedeného vztahu.
Výsledky ukazuje tabulka 2.
převedené množství laktotripeptidů (pg ve smyslu obsahu VPP na ml) = množství IPP (pg/ml) 25 x 1,7 + množství VPP (pg/ml)
Tabulka 2
Kmeny Množství peptidu pg/ml syrovátky Acidita (% hmotn.)
VPP IPP Množství laktotripeptidů ve smyslu obsahu VPP
Kmen 17 15,2 11,1 34,0 1,5
Kmen 19 11,2 7,3 23,7 1,4
Kmen 20 13,0 8,1 26,8 1,6
kmen 21 16,6 11,4 36,0 1,6
kmen 22 15,8 12,1 36,3 1,5
kmen 24 12,6 8,7 27,4 1,6
JCM1006 12,9 9,3 28,6 1,3
CM4 38,5 23,5 78,5 1,9
Mléko fermentované kmenem CM4 obsahovalo největší množství laktotripeptidů ve smyslu obsahu VPP, to znamená 78,5 pg/ml syrovátky. Ostatních sedm kmenů poskytlo průměrné množství 34,2 pg/ml syrovátky.
Měření aktivity extracelulámí proteázy
Aktivita extracelulámí proteázy se měřila u 16 kmenů, které poskytly relativně dobré výsledky schopnosti fermentace ukázané v tabulce 1. Měření se provádělo způsobem podle Yamamoto a kol. /Yamamoto N. a kol., J. Biochem. 114, 740 (1993)/, založeného na způsobu Twininga a kol. /Twining S., Anal. Biochem. 143. 3410 (1984)/. To znamená, že každý kmen se kultivival 40 v médiu s obsahem 9 % hmotn. sušiny mléka, jehož pH se udržovalo na hodnotě 6,0. Vzorek se
-10CZ 291067 B6 odebral uprostřed logaritmické fáze růstu a k vyjasnění mléčného média se smísil s citrátem sodným tak, že konečná koncentrace byla 1 % hmotn. Směs se odstřeďovala 10 min při frekvenci otáček 5 000 za min, aby se shromáždily buňky. Buňky se promyly 50mM roztokem kyseliny βglycerolfosforečné a suspendovaly v 50mM Tris-HCI pufru (s hodnotou pH = 7,8), aby se upravila turbidita (OD59o, to znamená, že se měřila absorbance při 590 nm) na hodnotu 1,30 μΐ suspenze se smísilo s 20 μΐ 0,4 % fluorescein-kaseinu (vyroben společností Sigma Chemicals Co.) a inkubovalo se 1 h při teplotě 42 °C. Směs se dále smísila se 120 μΐ 5 % roztoku kyseliny trichloroctové, nechala se 20 min stát a 10 min se odstřeďovala při frekvenci otáček 15 000 za min. 60 μΐ supematantu se přidalo ke 3 ml 500mM Tris-HCI pufru (s hodnotou pH = 8,3) a měřila se jeho intenzita fluorescence detekcí fluorescence při 525 nm vytvořené při excitační vlnové délce 490 nm. Vypočítala se aktivita extracelulámí proteázy v jednotce stím, že jedna jednotka se definuje jako množství enzymu, které za výše uvedených podmínek projevuje 1 % intenzitu fluorescence. Výsledky ukazuje tabulka 3.
Tabulka 3
Kmeny u/od590
kmen 17 136,7
Kmen 18 102,8
kmen 19 103,2
kmen 20 89,9
kmen 21 80,1
kmen 22 243,3
kmen 23 116,6
kmen 24 116,6
kmen 25 192,6
kmen 26 108,4
JCM1006 185,7
JCM1062 96,5
JCM1103 176,3
ATCC15009 168,1
ATCC10797 106,5
NCDO-099 229,7
CM4 452,6
Aktivita kmene CM4 Lactobacillus helveticus byla nejvyšší, to znamená 450 U/OD590. Průměrná aktivita ostatních 16 kmenů byla 141 U/OD590, která je přibližně třetinou aktivity kmene CM4.
Příklad 2
Z 11 kmenů vybraných v příkladu 1 ze 36 kmenů Lactobacillus helveticus se extrahovala chromozomální DNA způsobem podle Leenhoutse a kol. /Leenhouts K., Appl. Environ. Microbiol. 56. 2726 (1990) /, byla trávena různými restrikčními enzymy a podrobila se elektroforéze v 0,8 % agarózovém gelu k analýze způsobem elektroforézy.
Jako výsledek byl mezi fragmenty DNA chromozomu kmene CM4 pozorován charakteristický fragment trávený EcoRI aPstl (ukazuje šipka 1 na obr. 1). Takový fragment u fragmentů chromozomů jiných kmenů než CM4 nebyl pozorován, a u většiny jiných kmenů byly pozorovány kratší fragmenty než charakteristický fragment kmene CM4 (ukazuje šipka 2 na obr. 1). Molekulová hmotnost charakteristického fragmentu se měřila srovnávací elektroforézou
-11 CZ 291067 B6 tak, že ukazateli velikosti byly produkty 1 fágové DNA trávené Hind III (23,1 kb, 9,4 kb, 6,6 kb, 4,4 kb, 2,3 kb a 2,0 kb ve smyslu rostoucí pohyblivosti) a byla nalezena přibližně 16 kb. Tudíž bylo ověřeno, že kmen CM4 má chromozomální DNA, která trávením EcoRI a Pstl poskytuje DNA fragment s molekulovou hmotností asi 16 kb. Také bylo ověřeno, že jiné kmeny než CM4 mají chromozomální DNA, která poskytuje běžný fragment DNA s molekulovou hmotností okolo 13 kb.
Příklad 3
Fermentované mléko bylo vytvořeno kmenem CM4 Lactobacillus helveticus vybraným v příkladu 1. Kmen CM4 se kultivoval 12 h při teplotě 37 °C ve 100 g 9 % hmotn. odstředěného mléka. Následně se 3 kg čerstvého média inokulovaly kultivovaným odstředěným mlékem a kultivovaly 12 h při teplotě 37 °C. Po ukončení fermentace se všechno fermentované mléko (počet buněk kmene CM4:6,3 x 108 buněk/ml) použilo jako iniciátor fermentace 100 kg 9% hmotn. odstředěného mléka po dobu 20 h při teplotě 32 °C. Po ukončení fermentace bylo ve fermentovaném mléce obsaženo 74,8 pg/ml laktotripeptidu. Obsah kyseliny mléčné byl 1,9 % hmotn.
kg získaného fermentovaného mléka se smísilo se 4 kg krystalového cukru, 3 kg vody a 0,15 kg silného methoxypektinu a homogenizovalo se, aby se dostalo 50 kg jogurtového nápoje. Jogurtový nápoj měl výhodnou jemnou chuť, hodnotu pH = 3,6 a obsahoval živé buňky kmene CM4 v množství 4,6 x 108 buněk/g.
Příklad 4
26,5 kg fermentovaného mléka získaného v příkladu 3 se smísilo se 45,0 kg krystalového cukru, 4,7 kg silného maltózového sirupu a 13,8 kg vody. 10 kg 3% hmotn. silného roztoku methoxypektinu se za míšení přidalo ke směsi. Výsledná směs se homogenizovala použitím laboratorního homogenizátoru (vyroben ATV Gaulin. Inc., model 15M-BBA) za podrobení tlaku 150 kg/cm1 2 a rychlosti proudění 2500 ml/min. Homogenizovaná tekutina se smísila s vanilkovou příchutí a sterilizovala zahřátím na 85 °C. Tímto způsobem sterilizované fermentované mléko se za horka nalilo do 200 ml skleněných lahví. Zjišťoval se obsah laktotripeptidu ve sterilizovaném fermentovaném mléčném výrobku. Bylo nalezeno, že obsah laktotripeptidu odpovídal takovému, jaký byl ve fermentovaném mléce před sterilizací. Také bylo nalezeno, že obsah kyseliny mléčné byl 0,5 % hmotn.
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (10)

1. Bakterie Lactobacillus helveticus produkující kyselinu mléčnou, které kultivují-li se v médiu živočišného mléka obsahujícího 9 % hmotn. sušiny netučného mléka vytvářejí tripeptidy Val-Pro-Pro a Ile-Pro-Pro v množství ne menším než 60 pg ve smyslu obsahu Val-Pro-Pro na ml média, přičemž tyto bakterie projevují aktivitu extracelulámí proteázy ne menší než 400 U/OD59o a mají dále uvedené bakteriologické vlastnosti:
morfologické vlastnosti
1. tvar buňky; tyčinka
2. pohyblivost: žádná
-12CZ 291067 B6
3. tvorba spor: žádná
4. gramovo barvení: pozitivní fyziologické vlastnosti
1. produkce katalázy: negativní
2. produkce indolu: negativní
3. redukce nitrátu: negativní
4. aerobní růst: fakultativně anaerobní
5. tvorba DL-kyseliny mléčné z glukózy homolaktickou fermentací bez tvorby plynů
6. degradace uhlovodíků
-glukóza: +
-laktóza: +
-mannóza: +
-fruktóza: +
-galaktóza: +
-sacharóza: -maltóza: -xylóza: -rhamnóza: -cellobióza: -trehalóza: -melibióza: -rafinóza: -stachyóza: -mannitol: -sorbitol: -eskulin: -salicin: -.
2. Bakterie Lactobacillus helveticus produkující kyselinu mléčnou podle nároku 1, kde tyto bakterie produkující kyselinu mléčnou jsou Lactobacillus helveticus kmene CM4, přírůstkového čísla FERM BP-6060.
3. Bakterie Lactobacillus helveticus produkující kyselinu mléčnou podle nároku 1, kde uvedené bakterie produkující kyselinu mléčnou mají chromozomální DNA, které jsou-li tráveny restrikčními enzymy Pstl a EcoRI, poskytují fragment DNA o velikosti 15 až 17 kb.
4. Fermentovaný mléčný výrobek, vyznačující se tím, že obsahuje bakterie produkující kyselinu mléčnou podle nároku 1 atripeptid zvolený ze skupiny zahrnující Val-Pro-Pro. Ile-Pro-Pro a jejich směsi.
5. Fermentovaný mléčný výrobek podle nároku 4, vyznačující se tím, že dále obsahuje kyselinu DL-mléčnou, kdy tento výrobek obsahuje 30 až 50 pg řečeného tripeptidu ve smyslu obsahu Val-Pro-Pro na 0,01 g uvedené kyseliny DL-mléčné.
6. Fermentovaný mléčný výrobek podle nároku 4, vyznačující se tím, že bakterie produkující kyselinu mléčnou podle nároku 1 jsou živé.
7. Fermentovaný mléčný výrobek podle nároku 4, vyznačující se tím, že uvedený fermentovaný mléčný výrobek je zvolený ze skupiny zahrnující jogurt, zakysané mléčné nápoje,
-13 CZ 291067 B6 sýr, upravené potraviny obsahující fermentované kyselé mléko a zdraví prospěšné potraviny obsahující fermentované kyselé mléko.
8. Způsob výroby fermentovaného mléčného výrobku podle nároku 4, vyznačující se
5 t í m, že zahrnuje fermentaci média bakteriemi produkujícími kyselinu mléčnou podle nároku 1, které obsahuje výživnou látku zvolenou ze skupiny zahrnující peptid, protein a jejich směsi obsahující sekvence Val-ProPro a Ile-Pro-Pro.
9. Způsob podle nároku 8, v y z n a č u j í c í se tím, že uvedená výživná látka je zvolena
10 ze skupiny zahrnující živočišné mléko, mléčný kasein, kukuřici, kukuřičný protein, pšenici, pšeničný protein, sójové boby, sójové mléko, odtučněné sójové boby, sójový protein ajejich směsi.
10. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že fermentace se provádí 6 až 60 h 15 při teplotě 25 až 50 °C.
CZ20001082A 1997-09-26 1998-02-05 Bakterie Lactobacillus helveticus produkující kyselinu mléčnou, fermentovaný mléčný výrobek a způsob jeho výroby CZ291067B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP9277949A JP3028411B2 (ja) 1997-09-26 1997-09-26 トリペプチド高生産性ラクトバチルス・ヘルベチカス乳酸菌

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20001082A3 CZ20001082A3 (cs) 2001-01-17
CZ291067B6 true CZ291067B6 (cs) 2002-12-11

Family

ID=17590526

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20001082A CZ291067B6 (cs) 1997-09-26 1998-02-05 Bakterie Lactobacillus helveticus produkující kyselinu mléčnou, fermentovaný mléčný výrobek a způsob jeho výroby

Country Status (24)

Country Link
US (2) US6534304B1 (cs)
EP (1) EP1016709B1 (cs)
JP (1) JP3028411B2 (cs)
KR (1) KR100404154B1 (cs)
CN (1) CN1149279C (cs)
AR (1) AR017153A1 (cs)
AT (1) ATE294230T1 (cs)
AU (1) AU734422B2 (cs)
BG (1) BG64422B1 (cs)
BR (1) BR9813218A (cs)
CA (1) CA2304985C (cs)
CZ (1) CZ291067B6 (cs)
DE (1) DE69829983T2 (cs)
ES (1) ES2237834T3 (cs)
HU (1) HU225980B1 (cs)
IN (1) IN188418B (cs)
MY (1) MY118157A (cs)
PL (1) PL188675B1 (cs)
PT (1) PT1016709E (cs)
SK (1) SK284755B6 (cs)
TR (1) TR200000854T2 (cs)
TW (1) TW526268B (cs)
WO (1) WO1999016862A1 (cs)
ZA (1) ZA988659B (cs)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE305224T1 (de) * 1999-01-11 2005-10-15 Calpis Co Ltd Verfahren zur herstellung von sauermilch enthaltend ein inhibitionspeptid fuer ein angiotensin konvertierendes enzym sowie ein verfahren zur herstellung von milchserum
FR2793257B1 (fr) * 1999-05-06 2001-07-27 Gervais Danone Sa Bacteries lactiques a proprietes anxiolytiques, et leurs utilisations
FI113741B (fi) * 1999-11-01 2004-06-15 Valio Oy Menetelmä verenpainetta alentavia peptidejä sisältävän tuotteen valmistamiseksi
JP4633876B2 (ja) * 1999-11-11 2011-02-16 カルピス株式会社 トリペプチドの製造方法
FI112031B (fi) 2002-02-25 2003-10-31 Valio Oy Biologisesti aktiivisen tuotteen uusi käyttö
WO2003082019A2 (en) * 2002-04-03 2003-10-09 Chr. Hansen A/S Peptides with anti-hypertensive properties
JP4499564B2 (ja) * 2002-08-09 2010-07-07 セーホーエル.ハンセン アクティーゼルスカブ 抗高血圧特性を有するペプチドの製造方法
CA2509627A1 (en) 2003-01-06 2004-07-22 Unilever Plc Fermented milk product comprising tripeptide vpp and/or ipp
TWI344371B (en) * 2003-03-18 2011-07-01 Suntory Holdings Ltd Angiotensin-converting enzyme inhibitory peptides
US7718171B2 (en) 2003-04-07 2010-05-18 Chr. Hansen A/S Reducing heart rate in mammals using milk derived fermentation products produced using Lactobacillus helveticus
JP2006525003A (ja) * 2003-05-05 2006-11-09 ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ Ippおよび/またはvppを含む加水分解カゼイン製品
JP4680571B2 (ja) * 2003-12-25 2011-05-11 カルピス株式会社 経口摂取用保湿剤
US20070224285A1 (en) * 2004-03-31 2007-09-27 Calpis Co., Ltd Agent for Preventing or Suppressing Hepatopathy and Functional Food for Preventing or Suppressing Hepatopathy
EP1741437A4 (en) * 2004-03-31 2009-06-24 Calpis Co Ltd FUNCTIONAL FOOD FOR ENHANCING THE ENDOGENOUS MELATONIN SECRETION RHYTHM AND FUNCTIONAL FOOD FOR IMPROVING CIRCADIAN RHYTHM
WO2006004105A1 (ja) * 2004-07-05 2006-01-12 Calpis Co., Ltd. ペプチド混合物の製造法、抗高血圧ペプチド含有発酵乳の製造法及び抗高血圧ペプチド製剤の製造法
BRPI0514903A (pt) 2004-09-03 2008-06-24 Hansens Lab proteìnas vegetais ou leite fermentado compreendendo ligando de receptor e uso dos mesmos
JPWO2006095764A1 (ja) * 2005-03-09 2008-08-14 カルピス株式会社 皮膚における紫外線感受性抑制剤及び機能性飲食品
JP5160889B2 (ja) * 2005-06-24 2013-03-13 カルピス株式会社 表皮細胞分化及び角化促進剤
CA2616789A1 (en) * 2005-07-26 2007-02-01 Calpis Co., Ltd. Process for production of fermented milk and fermented milk beverage/food
CN1903052B (zh) * 2005-07-26 2010-04-28 天津科技大学 具有酪蛋白磷酸肽、抗血管紧张素转化酶肽和低聚半乳糖乳清粉的制备方法
CN101420968B (zh) 2006-02-14 2011-12-21 卡尔皮斯株式会社 血管扩张药
DK1992352T3 (da) * 2006-02-14 2014-06-10 Calpis Co Ltd Middel til anvendelse i forbyggelsen af aterosklerosis
PL1820851T3 (pl) 2006-02-20 2012-07-31 Gervais Danone Sa Szczepy Lactobacillus helveticus nie fermentujące laktozy
EP1820405B1 (fr) * 2006-02-20 2011-03-30 Compagnie Gervais Danone Nouvelles souches de Lactobacillus Helveticus
DE602006005330D1 (de) * 2006-02-20 2009-04-09 Gervais Danone Sa Neue Stämme von Lactobacillus helveticus
DK1820849T3 (da) * 2006-02-20 2009-04-27 Gervais Danone Sa Nye stammer af Lactobacillus helveticus
JP2009537492A (ja) * 2006-05-15 2009-10-29 ヴァリオ・リミテッド 治療上有用なペプチドの新規用途
CN101505607B (zh) 2006-06-16 2013-06-26 杜邦营养生物科学有限公司 细菌
NZ597178A (en) * 2006-09-04 2012-08-31 Megmilk Snow Brand Co Ltd Agent comprising Lactobacillus helveticus for accelerating the increase in and/or preventing the decrease in blood adiponectin level, and visceral fat accumulation inhibitor
JP2008214253A (ja) 2007-03-02 2008-09-18 Snow Brand Milk Prod Co Ltd 内臓脂肪減少剤
TWI414305B (zh) * 2007-03-27 2013-11-11 Calpis Co Ltd 腎衰竭預防劑
CN101678071A (zh) * 2007-03-27 2010-03-24 卡尔皮斯株式会社 肾衰竭预防剂
EP2303030A1 (en) * 2008-06-12 2011-04-06 Nestec S.A. Lactobacillus helveticus strains for producing hypotensive peptides
ATE544350T1 (de) * 2008-12-29 2012-02-15 Unilever Nv GEFRORENE SÜßWARENPRODUKTE UND GETRÄNKE, DIE THEOBROMIN UND KOFFEIN ENTHALTEN
WO2011095389A1 (en) * 2010-02-04 2011-08-11 Unilever Nv Use of theobromine for lowering central blood pressure
CA2798911C (en) 2010-05-19 2018-07-03 Unilever Plc Theobromine for increasing hdl-cholesterol
JP2010183918A (ja) * 2010-06-01 2010-08-26 Calpis Co Ltd トリペプチドの製造方法
JP5797891B2 (ja) * 2010-11-09 2015-10-21 カルピス株式会社 Non−dipper型血圧日内変動による疾病発症リスク軽減剤
AU2011327288B2 (en) * 2010-11-09 2015-05-07 Asahi Group Holdings, Ltd. Lactobacillus helveticus having high proteolysis activity
RU2453593C1 (ru) * 2011-04-21 2012-06-20 Общество с ограниченной ответственностью "Бифилюкс" Штамм lactobacillus helveticus, используемый для получения продукции, содержащей лактобактерии
US20120328735A1 (en) * 2011-06-24 2012-12-27 Naoto Uchida Process for preparing casein-derived peptides by fermentation of lactic acid bacteria
DE102012016127A1 (de) 2011-08-31 2013-02-28 Daniel Elias Bioaktive, regenerative Mischung zur Herstellung eines Ergänzungsnahrungsmittels
MX369465B (es) 2012-08-22 2019-11-08 Kraft Foods Group Brands Llc Queso procesado con componentes lácteos cultivados y método de fabricación.
CN102960444A (zh) * 2012-11-19 2013-03-13 陕西科技大学 一种基于瑞士乳杆菌发酵的含ace抑制肽的羊奶的制备方法
CN104450574B (zh) * 2014-12-10 2017-05-10 生合生物科技(南京)有限公司 一种瑞士乳杆菌lh43及其制作乳酸菌饮料的方法
RU2577112C1 (ru) * 2014-12-25 2016-03-10 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Горский государственный аграрный университет" Штамм lactobacillus helveticus вкпм в-11175, полученный на доступных питательных средах
CN107674848A (zh) * 2017-09-20 2018-02-09 云南乍甸乳业有限责任公司 一种酸奶发酵菌种的制备方法
CN111227049B (zh) * 2018-11-29 2022-08-12 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 一种维持褐色植物基酸奶货架期内组织状态稳定性的方法
CN109517763B (zh) * 2018-12-27 2022-03-22 内蒙古农业大学 瑞士乳杆菌h11及其应用
CN110226687A (zh) * 2019-06-12 2019-09-13 宁波依萃健生物科技有限公司 一种解酒护肝组合物及制备方法
DK3845069T3 (da) * 2019-12-30 2022-11-28 Gervais Danone Sa Saccharosenegativ streptococcus thermophilus til anvendelse i fremstilling af fermenterede produkter
CN111979286B (zh) * 2020-08-31 2021-11-26 鲁东大学 一种发酵法与酶法联合制备贝类高f值寡肽的方法
CN112616925A (zh) * 2020-12-30 2021-04-09 光明乳业股份有限公司 一种双蛋白发酵乳及其制备方法

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3846560A (en) 1971-07-22 1974-11-05 Quaker Oats Co Process of making a base for protein beverages
US3876806A (en) 1971-10-14 1975-04-08 Quaker Oats Co Process for the preparation of acid soluble polypeptides and carbonated beverages containing same
US4107334A (en) 1976-10-13 1978-08-15 Pfizer Inc. Modified protein
CH636248A5 (fr) 1979-03-09 1983-05-31 Nestle Sa Procede de preparation d'un hydrolysat de proteines purifie.
JPS60262561A (ja) 1984-06-08 1985-12-25 House Food Ind Co Ltd 大豆蛋白質水溶液の処理方法
US4585757A (en) 1984-07-27 1986-04-29 Texas Tech University Health Sciences Center Hypotensive active peptides
US4687840A (en) 1986-02-11 1987-08-18 Texas Tech University Health Sciences Center Hypotensive active peptides
GB8823429D0 (en) * 1988-10-05 1988-11-09 Agricultural Genetics Co Method for accelerated ripening of cheddar & related hard type cheese
MY109493A (en) 1989-07-07 1997-02-28 Nestle Sa Protein hydrolysis.
NL9000422A (nl) 1990-02-21 1991-09-16 Nl Zuivelonderzoek Inst Werkwijze voor de bereiding van een gefermenteerd melkprodukt.
DE69124274T2 (de) 1990-02-27 1997-08-14 Agency Ind Science Techn Oligopeptide, sie enthaltende pharmazeutische und Futterzusammensetzung und Benützung von Oligopeptiden
DE69127020T2 (de) 1990-05-18 1998-01-29 Morinaga Milk Industry Co Ltd Milchproteinhydrolysate und Zusammensetzungen zur Verwendung als Haar- und Hautbehandlungsmittel
JP2571734B2 (ja) 1991-08-23 1997-01-16 株式会社ヤクルト本社 乳酸菌飲料
US5486461A (en) 1991-11-08 1996-01-23 Novo Nordisk A/S Casein hydrolyzate and method for production of such casein hydrolyzate
FI94088C (fi) 1992-03-13 1995-07-25 Valio Oy Menetelmä fenyylialaniinin poistamiseksi proteiinipitoisista koostumuksista
US5418218A (en) 1992-07-10 1995-05-23 The University Of Maryland At Baltimore Histidyl-proline diketopiperazine (cyclo his-pro) a cns-active pharmacologic agent
JP2782142B2 (ja) 1992-07-23 1998-07-30 カルピス株式会社 アンジオテンシン変換酵素阻害剤及びその製造法
JP2782153B2 (ja) * 1992-11-09 1998-07-30 カルピス株式会社 アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドの製造法
US5656268A (en) 1995-04-21 1997-08-12 Sorodsky; Michael Biological product
US5618689A (en) 1995-05-25 1997-04-08 Nestec S.A. Enhanced procedures for preparing food hydrolysates
US6372282B1 (en) 1996-12-23 2002-04-16 Dsm N.V. Method for producing a protein hydrolysate
US6221423B1 (en) 1998-04-13 2001-04-24 Protein Technologies Int'l Inc. Short-chained peptide material
AU2001247334A1 (en) 2000-03-10 2001-09-24 Monsanto Company Novel peptides with anti-hypertensive activity
WO2001068113A1 (en) 2000-03-10 2001-09-20 Monsanto Technology Llc Anti-hypertensive peptides
CA2391063A1 (en) 2000-03-13 2001-09-20 Hiroshi Miyakawa Protein hydrolyzate, manufacuring method therefor, and foods and drinks containing the protein hydrolyzate
US20030040475A1 (en) 2001-01-16 2003-02-27 Yasuhiro Toba Agents for improving lipid metabolism and reducing high blood pressure
US6815426B2 (en) 2001-02-16 2004-11-09 E. I. Du Pont De Nemours And Company Angiogenesis-inhibitory tripeptides, compositions and their methods of use
AU2002302385B2 (en) 2001-03-09 2005-10-06 Unilever Plc Fermented milk product
US6589574B2 (en) 2001-03-19 2003-07-08 Council Of Scientific & Industrial Research Process for preparation of protein-hydrolysate from milk protein

Also Published As

Publication number Publication date
PT1016709E (pt) 2005-08-31
HUP0003744A2 (en) 2001-03-28
WO1999016862A1 (fr) 1999-04-08
BG64422B1 (bg) 2005-01-31
JP3028411B2 (ja) 2000-04-04
EP1016709B1 (en) 2005-04-27
TW526268B (en) 2003-04-01
US6534304B1 (en) 2003-03-18
CN1149279C (zh) 2004-05-12
MY118157A (en) 2004-09-30
ATE294230T1 (de) 2005-05-15
CA2304985C (en) 2007-05-08
EP1016709A1 (en) 2000-07-05
AU5780298A (en) 1999-04-23
IN188418B (cs) 2002-09-21
AU734422B2 (en) 2001-06-14
PL339343A1 (en) 2000-12-18
SK284755B6 (sk) 2005-11-03
SK4352000A3 (en) 2001-05-10
TR200000854T2 (tr) 2000-07-21
KR20010024311A (ko) 2001-03-26
ZA988659B (en) 1999-03-31
AR017153A1 (es) 2001-08-22
PL188675B1 (pl) 2005-03-31
JPH1198978A (ja) 1999-04-13
DE69829983D1 (de) 2005-06-02
HU225980B1 (en) 2008-02-28
KR100404154B1 (ko) 2003-11-01
CN1279712A (zh) 2001-01-10
CZ20001082A3 (cs) 2001-01-17
HUP0003744A3 (en) 2001-11-28
US7282354B2 (en) 2007-10-16
BG104382A (en) 2000-12-29
US20030064501A1 (en) 2003-04-03
EP1016709A4 (en) 2002-09-11
CA2304985A1 (en) 1999-04-08
ES2237834T3 (es) 2005-08-01
BR9813218A (pt) 2000-08-29
DE69829983T2 (de) 2006-05-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ291067B6 (cs) Bakterie Lactobacillus helveticus produkující kyselinu mléčnou, fermentovaný mléčný výrobek a způsob jeho výroby
JP3695648B2 (ja) 抗高血圧性ジペプチドおよびトリペプチドを産生するLactobacillus helveticus
Hati et al. Comparative growth behaviour and biofunctionality of lactic acid bacteria during fermentation of soy milk and bovine milk
CN110129243B (zh) 豆酸奶适制性菌株、菌剂及其应用
EP1189517B1 (fr) Procede de preparation d'un produit lacte immunostimulant et ses applications
JP2013534142A (ja) ビタミンk2高生産性ラクトコッカス・ラクティス株
JP2013537427A (ja) ビタミンk2高生産性ラクトコッカス・ラクティス株
JP2004357535A (ja) 免疫賦活活性及びγ−アミノ酪酸産生能を有する新規乳酸菌、及びその利用。
CN109266572B (zh) 生产谷氨酰胺转氨酶的干酪乳杆菌诱变菌及其用途
WO2022180071A2 (en) Lactic acid bacteria composition for preparing fermented products
KR100831420B1 (ko) 혈전용해능을 갖는 바실러스 속 mk―15
PL241893B1 (pl) Sposób przeprowadzenia selekcji mikroorganizmów proteolitycznych, sposób wytwarzania hydrolizatu białek serwatkowych, zawierającego bioaktywne peptydy i hydrolizat białek serwatkowych
MXPA00002575A (en) Lactobacillus helveticus bacterium having high capability of producing tripeptide, fermented milk product, and process for preparing the same
JP3783187B2 (ja) 新規なラクトバチラス属乳酸菌およびその培養物
CN116828988A (zh) 用于制备发酵产品的乳酸菌组合物
CN116724114A (zh) 具有改善的质构化特性的乳酸菌菌株
KR20070107342A (ko) 동치미 발효세균을 함유하는 청국장
Smith The optimisation of accelerated yogurt production
KR20070009626A (ko) 안지오텐신-i-전환 효소를 억제하는 성질을 갖는 식품원료 및 식품을 제조하는 방법 및 그로부터 수득된 제품

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20130205