CN101421390B - 不发酵乳糖的瑞士乳杆菌菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及瑞士乳杆菌的新菌株。更特别的，本发明涉及具有乳糖阴性表型的瑞士乳杆菌菌株及其在农业食品领域内的用途。本发明还涉及得到所述瑞士乳杆菌的菌株的方法。

Description

不发酵乳糖的瑞士乳杆菌菌株
本发明涉及瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)的新菌株，以及其在农业食品领域内的用途。更特别的，本发明提供具有乳糖阴性表型的瑞士乳杆菌的菌株。本发明还涉及得到所述瑞士乳杆菌的菌株的方法。
高血压影响显著比例的人群。作为能够通过抑制血管紧缩素转化酶(ACE)降低血压的试剂，肽VPP(Val Pro Pro)和含有序列VPP的肽的应用已经在EP 0 583 074中说明。三肽IPP(Ile Pro Pro)的类似作用也已经在此文献中说明。这些肽通过阻塞ACE的活性点并从而阻止其活化血管紧缩素而抑制ACE。
众所周知的，两种序列VPP和IPP存在于牛β酪蛋白中，并且此酪蛋白(或更通常的是含有其的牛奶)的适合的水解使得到所述三肽成为可能。大量动物和人类研究已经显示，这些三肽的数毫克的日摄取能有效降低血压，特别在高血压个体中，更加降低心血管意外的风险。
源于被瑞士乳杆菌发酵的牛奶的肽已经显示了其在体内的ACE抑制(ACEI)作用，这些肽已在用于研究的鼠的主动脉中被发现(Masuda O.等人，1996.J.Nutr.126，3063-8)。其他研究也显示，在源于被瑞士乳杆菌发酵的牛奶中的肽被摄入后，高血压鼠的血压更特别的降低(Yamamoto N.等人，1994.Biosci.Biotech.Biochem.58，776-8)。
在人体中，相同的发酵牛奶也已经能够降低动脉收缩压(Hata等人；1996.Am.J.Clin.Nutr.，64，767-71)。更近的研究确定，存在于CALPIS公司的商标为AMEAL 
Figure G200780013463XD0001080413QIETU
的产品中的肽显著降低具有高于正常血压的个体的血压(Mizuno等人，2005.British Joumal of Nutrition；vol94，issue1，84-91)。
然而，另一个最近的研究(Jauhiainen等人；2005.Am.J.ofHypertension，18：1600-1605)提出如下假设，上述用于解释被瑞士乳杆菌发酵的牛奶的抗高血压作用的作用机理(ACE抑制)不能成为人体中的确定的作用机理。
大部分瑞士乳杆菌能够通过牛奶发酵产生三肽IPP和VPP，但是产生的量不同。EP 1 016 709说明了通过用特定的属于瑞士乳杆菌种的乳酸菌的菌株发酵牛奶而产生三肽IPP和VPP的方法。然而，如此产生的产物(发酵牛奶)含有非常大量的乳酸，因而具有酸性的特征，这是感官和味觉观点上不能接受的。而且，后酸化的问题产生：甚至如果发酵在器官感觉上可接受的pH(pH>4)下被停止(以标准形式通过冷却)时，酸化由于瑞士乳杆菌的固有特性而在低温下继续。这导致产物的pH下降，这对消费来说也变得非常不能接受。
为了避免后酸化，通过加热处理而立即杀灭菌株(巴氏杀菌法、热杀菌)而在可接受的pH下停止发酵是可能的：而后后酸化为零(产物的酸性在储存期间不再发展)。不幸的是，三肽的量由于发酵的早期停止而降低。如此得到的产物仅具有低的IPP和VPP含量。用相同菌株发酵牛奶直到得到最大三肽浓度也是可能的。平行产生的大量的乳酸而后必须通过复杂和昂贵的多阶段过程移除。而且，过程不在是“天然的”，其包含分离的阶段。此过程因而不适于工业规模。
本发明提出本领域所述情形的缺陷的解决方法。特别的，本发明提出能制备食品特别是发酵乳制品的瑞士乳杆菌的菌株，其拥有众多优势特性：
-本发明的乳制品具有完全受控的酸性，不仅在发酵的最后，而且在储存期间。特别的，其不会出现后酸化现象。因此，本发明的乳制品在器官感觉上是非常令人满意的。
-本发明的乳制品能直接作为益生菌被消费，也就是，其含有显著量的活细菌，对其味觉品质无任何影响，特别是，对其酸性无任何影响。
-本发明的产物的制备不需要热杀菌阶段，也不需要任何复杂的纯化阶段。因而本发明的方法能被简单地实施，在标准奶制品设备中，无需显著修改设备。而且，本发明的方法是完全天然的。
-本发明的食品，特别是乳制品，能含有非常高水平的三肽VPP和IPP，具有高的(IPP+VPP)/(乳酸)比。这些结果能无需在先的纯化或浓缩阶段而得到。
-本发明的食品，特别是乳制品，有利地含有显著的生物量(即显著浓度的活体微生物)。
在本发明的内涵之中，菌株指任何从单个细胞或单独的菌落得到的微生物的培养菌，通常是纯的。
在本发明的内涵之中，菌株X的变异体或突变体指任何从涉及的菌株X得到的菌株。在本发明的上下文中，术语“变异体”更特别地用于指主要通过从涉及的菌株X突变和选择而得到的菌株，而术语“突变体”更特别的指通过随机或定向诱变技术(例如应用载体进行遗传转化)应用于菌株X上得到的菌株。
一旦本发明的菌株的突变体或变异体保持本发明的基本方面，特别是乳糖阴性表型，其当然被包括在本专利的保护中。
“乳糖阴性表型”菌株指任何不具有将乳糖转化成乳酸的能力的菌株。
“果糖阴性表型”菌株指任何不具有代谢果糖的能力的菌株。
奶制品介质指任何含有乳蛋白质的介质，例如以牛奶粉(脱脂或非脱脂)或炼乳中的4％蛋白质为标准化的牛奶。
在本发明的内涵之中，乳制品指，除了奶，任何奶衍生的产物，如乳酪、冰淇淋、黄油、干酪、酸奶酪、发酵牛奶；副产物，如抗乳血清和干酪素以及各种制备的含有奶或奶成分作为主要成分的食品。在乳制品中，发酵乳制品除了其他之外，还包括酸奶酪、发酵奶、白软干酪、克非儿、干酪、益生菌乳制品和更通常的是任何经历至少一个发酵阶段的乳制品。所述奶通常是奶牛的奶，但是也能是其他哺乳动物的奶，如山羊、母羊、母马、骆驼或水牛。
在本发明的内涵之中，食品指任何用于人类或动物营养的产物。特别的，食品包括用于给食婴儿、儿童、青少年和成人的产物。全部或部分的本发明的食品能含有至少一种本发明的发酵乳制品。本发明的食品也能含有其他通常用于农业食品工业的成分，如添加剂、防腐剂、果类或果类提取物、调味剂、着色剂、增稠剂、谷类、巧克力片等。
在本发明的内涵之中，酵素指任何含有至少一种能使给定的介质发酵的活体微生物菌株的组合物。在酵素中，乳酵素是含有至少一种能使奶制品介质发酵的活体微生物的组合物。
依据实施方案，本发明涉及一种不能将乳糖转化成乳酸的瑞士乳杆菌的菌株。本发明还涉及一种不能将乳糖转化成乳酸，并在乳糖操纵子中具有至少一个突变的瑞士乳杆菌的菌株。
依据实施方案，所述乳糖操纵子中的突变是引入终止密码子的点突变。还依据更优选的实施方案，所述引入终止密码子的点突变位于乳糖操纵子的lacL基因内。点突变指与所谓的“野生型”序列相比，任何包含在序列中的核苷酸置换。本领域内的技术人员知道如何识别终止密码子(也被称为无义密码子)，其在mRNA术语中通常相应于三联体之一：UAA、UAG、UGA。
因此，本发明的瑞士乳杆菌菌株不能降解乳糖(没有乳糖转化成乳酸)。实际上，本发明的菌株具有乳糖阴性表型。另一方面，其能在作为碳源的葡萄糖存在下生长(将葡萄糖发酵成乳酸)，并能代谢奶的特定成分，特别是蛋白质。
因此，本发明的菌株有利地允许在完全受控的pH下发酵：发酵后的最终pH依据发酵介质中最初含有的葡萄糖的量而被完全控制。这是在实际计量学方式下，给定的葡萄糖的量导致相同量的乳酸的事实的结果。而且，本发明的菌株的应用避免了任何后酸化现象。因此，由于本发明的菌株，得到在器官感觉上特别满意的食品是可能的。
有利地，依据实施方案，本发明的瑞士乳杆菌的菌株是这样的，在30-45℃的温度下，通过所述瑞士乳杆菌的菌株发酵30小时的最大发酵时间的具有4.0％总蛋白质并含有1.0％(w/w)的葡萄糖的奶制品介质，具有大于或等于4.0的pH；优选大于或等于4.1；优选大于或等于4.2；优选大于或等于4.3；优选大于或等于4.5。
所述优势因此在三肽IPP和/或VPP的高产的瑞士乳杆菌的菌株的情况下特别显著：其绝对无需在下述情况间妥协
-发酵期间三肽的高水平生产(需要尽可能长的发酵时间)，和
-器官感觉上可接受的特性(需要有限的酸性，因此，不仅发酵时间尽可能短以限制由发酵产生的乳酸，而且热杀菌/巴氏杀菌以避免后酸化现象)。
实际上，有利地，依据本发明，三肽VPP和/或IPP的产生与乳酸的产生被部分地分离：乳酸的产生仅是起初存在于发酵介质中的葡萄糖量的函数，而不再是发酵时间的函数。
仅表示三肽的浓度的方法是将其表示为VPP当量[VPPeq]浓度。
这以mg/kg表示：[VPPeq]＝[VPP]+(9/5x[IPP])
因此，依据实施方案，本发明的瑞士乳杆菌的菌株通过发酵能有利地产生至少25mg，优选至少30mg，优选至少35mg，优选至少40mg，优选至少45mg，优选至少50mg，优选至少55mg，优选至少60mg，优选至少65mg，优选至少70mg，优选至少75mg，更优选至少80mg的VPPeq每公斤发酵产物的量的序列IPP和/或VPP的三肽。如此的VPP和/或IPP的量通常通过用本发明的菌株在30-45℃，优选31-44℃，优选32-43℃，优选33-42℃，优选34-41℃，优选35-40℃，和更优选37℃的温度下的奶制品介质中发酵得到，所述奶制品介质含有高于3％(w/w)的量的葡萄糖并且总蛋白质含量大于或等于2％(w/w)，优选2-10％(w/w)，更优选2.5-6％(w/w)和还更优选等于4％(w/w)。
依据实施方案，本发明的瑞士乳杆菌的菌株还具有果糖阴性表型。乳糖阴性和果糖阴性表型的组合是特别有优势的。实际上，果糖具有强的增甜能力，可用作食品中的成分。因此，如果果糖不能被瑞士乳杆菌的菌株降解，食品保持优越的器官感觉特性。而且，既是乳糖阴性又是果糖阴性的菌株只能在含有葡萄糖的介质中生长。因此，在食品含有果类制备物特别是水果片和/或果汁的情况下，最终的pH有利地被良好控制。
依据实施方案，本发明的菌株选自：
I-3504  于2005年10月14日在CNCM保藏；
I-3505  于2005年10月14日在CNCM保藏；
I-3508  于2005年10月14日在CNCM保藏；
和源自这些菌株的变异体或突变体菌株。
依据另一个实施方案，本发明涉及本发明的瑞士乳杆菌的菌株在食品或药品特别是发酵乳制品的制备中的用途。
有利地，依据本发明的一个方面，所述食品或药品具有抗高血压性质。
本发明也涉及一种食品，特别是发酵乳制品，其包含至少一种本发明的瑞士乳杆菌的菌株。
有利地，依据实施方案，所述食品含有至少106，优选至少107，优选至少108CFU/mL的活体瑞士乳杆菌细菌。因此，本发明的食品含有显著的生物量。
依据实施方案，所述食品含有至少25mg，优选至少30mg，优选至少35mg，优选至少40mg，优选至少45mg，优选至少50mg，优选至少55mg，优选至少60mg，优选至少65mg，优选至少70mg，优选至少75mg，更优选至少80mg的VPPeq每公斤发酵产物。
依据实施方案，本发明的食品也包含果类制备物，特别是水果片和/或果汁。
依据实施方案，本发明的食品的pH大于或等于3.85；优选大于或等于3.90；优选大于或等于3.95；优选大于或等于4.00；优选大于或等于4.05；优选大于或等于4.10；优选大于或等于4.15；更优选大于或等于4.20。
有利地，依据实施方案，本发明的食品具有抗高血压性质。
依据另一个方面，本发明涉及用于制备食品的方法。
依据实施方案，所述方法包含下述阶段：
■选择一种含有奶蛋白质、特别是含有肽序列IPP和/或VPP的蛋白
质的原材料。这能是例如含有2-10％(w/w)总蛋白质的奶。
■选择至少一个本发明的瑞士乳杆菌菌株，
■将所述菌株接种于所述原材料上，
■在30-45℃下，和在所述菌株存在下，在1-3％(w/w)葡萄糖存在下
发酵所述原材料12-30小时。
依据实施方案，本发明的方法有利地在发酵后没有热杀菌阶段。这使在(益生菌)食品中保持活体细菌成为可能。
依据实施方案，本发明涉及链脲霉素的应用，以得到乳糖阴性表型的瑞士乳杆菌菌株。
本发明还提供一种用于得到所述瑞士乳杆菌的菌株的方法。
依据实施方案，所述用于得到乳糖阴性表型的瑞士乳杆菌菌株的方法包括如下阶段：
■提供至少一个瑞士乳杆菌的菌株；
■在乳糖存在下，将所述至少一个菌株与有效量的链脲霉素接触；
■分离出乳糖阴性表型的菌落或菌群。
能够在链脲霉素存在下存活的瑞士乳杆菌的细胞群的确有利地极度富集乳糖阴性细胞。
依据实施方案，包括在介质上的比色试验的阶段，所述介质含有Xgal和/或Sgal和/或通过β-半乳糖苷键与半乳糖连接并能够随后通过微生物破坏所述键的任何其他化合物，所述阶段被加入所述方法中以得到本发明的菌株。由于所述化合物作为乳糖转运子的诱导因子或作为通过微生物的乳糖的应用的诱导因子，IPTG也能被添加以进行所述试验。
例如，所述方法能照如下进行：
-起始瑞士乳杆菌菌株(母体菌株)的第一次传代培养，在中性MRS(Man Rogosa Sharp)肉汤，在35-40℃下过夜；
-在中性MRS中第二次传代培养。
-孵育直到得到足够的生物量，例如在35-40℃下10-30小时。
-含有使得到足够的生物量成为可能的乳糖浓度例如2-7％(w/w)的MRS的接种；在580nm处的OD监测下孵育。
-链脲霉素被现用现制，并在发酵期间被添加，以具有杀灭被考虑的菌株的最终浓度。此浓度是菌株依赖的。
-在35-40℃孵育后，所述培养物用胰蛋白胨盐洗两次。
-沉淀被带进胰蛋白胨盐中，而后中性MRS肉汤被再培养。
-在35-40℃下孵育，直到所述菌株生长。
-而后在中性MRS+Xgal+IPTG上进行分离，随后在35-40℃下在CO2中孵育。此阶段进行比色试验以能够确定细菌菌株是乳糖阳性还是乳糖阴性：如果所述菌株能用乳糖作为碳源，有蓝色物质产生，菌落因而是蓝色的，而在相反情况下(乳糖阴性菌株)，其为白色。
-白色菌落在中性MRS上传代培养，并在35-40℃下孵育。
本发明用如下实施例进一步说明，其为非限制性的。
具体实施例
实施例1：得到乳糖阴性表型的菌株
材料和方法
起始菌株(所谓的“母体菌株”)
I-3431    于2005年5月25日在CNCM保藏
I-3434    于2005年5月25日在CNCM保藏
I-3435    于2005年5月25日在CNCM保藏
链脲霉素敏感度试验
在第一阶段，经证实，母体菌株对所用的抗生素链脲霉素是敏感的。在42℃的中性MRS(Man Rogosa Sharp)肉汤中培养下，在580nm处的光密度(OD)被监测。当OD达到0.1时，链脲霉素被添加至管中以使最终含有50μg/ml(例如100μl的5mg/ml溶液至10ml介质中)。
乳糖阴性菌株的选择
为了得到乳糖阴性瑞士乳杆菌菌株，下述阶段被进行：
-从工作储液的孔中的起始瑞士乳杆菌菌株(母体菌株)的第一次传代培养，在中性MRS培养基上，在37℃下过夜；
-在中性MRS中以1％进行第二次传代培养。
-在37℃下孵育16小时。
-5％(w/w)乳糖的10ml MRS以1％进行接种，并在40℃在580nm处的OD监测下孵育。
-链脲霉素被现用现制，并在发酵后2小时15分钟或4小时被添加，以具有50μg/ml的最终浓度。
-在40℃孵育7小时30分钟后，所述培养物用胰蛋白胨盐洗两次。
-沉淀被带进2ml胰蛋白胨盐中，而后中性MRS培养基被以10％接种。
-在37℃下孵育，直到所述菌株生长。
-而后在中性MRS+Xgal+IPTG上进行分离，随后在37℃下在CO2中孵育。此阶段进行比色试验以能够确定细菌菌株是乳糖阳性还是乳糖阴性：如果菌株能用乳糖作为碳源，有蓝色物质产生，菌群因而是蓝色的，而在相反情况下(乳糖阴性菌株)，其为白色。
-白色菌群在中性MRS上传代培养，并在37℃下孵育。
结果
这使得得到下述乳糖阴性表型的菌株成为可能，所述菌株而后依照布达佩斯条约(Budapest Treaty)的规定，保藏于CNCM(CollectionNationale de Cultures de Micro-organismes(法国微生物保藏中心))，28ruedu Docteur Roux，75724Paris，France：
I-3504  于2005年10月14日在CNCM保藏；源于母体菌株I-3431
I-3505  于2005年10月14日在CNCM保藏；源于母体菌株I-3434
I-3508  于2005年10月14日在CNCM保藏；源于母体菌株I-3435
得到的菌株的乳糖阴性表型在MRS+Xgal+IPTG中性半乳聚糖介质上被再次确认(所谓的“白/蓝”着色试验)。
实施例2：具有乳糖阴性表型的菌株
依照布达佩斯条约的规定，在2005年10月14日保藏于CNCM(法国微生物保藏中心)，28rue du Docteur Roux，75724Paris，France的菌株I-3504，是具有下述性质的瑞士乳杆菌的菌株：
-乳糖阴性；果糖阴性
-产生IPP和VPP：见图4和5
-酸化性质：见图1
-ACE抑制：见图6
依照布达佩斯条约的规定，在2005年10月14日保藏于CNCM(法国微生物保藏中心)，28rue du Docteur Roux，75724Paris，France的菌株I-3505，是具有下述性质的瑞士乳杆菌的菌株：
-乳糖阴性；果糖阴性
-产生IPP和VPP：见图5
-酸化性质：见图2
依照布达佩斯条约的规定，在2005年10月14日保藏于CNCM(法国微生物保藏中心)，28rue du Docteur Roux，75724Paris，France的菌株I-3508，是具有下述性质的瑞士乳杆菌的菌株：
-乳糖阴性；果糖阴性
-产生IPP和VPP：见图5
-酸化性质：见图3
1.不同变异体菌株的酸化性质的测量
酸化性质依照下述评估：
在930ml水中含有120g脱脂奶粉(SMP)的介质在95℃下巴氏杀菌10分钟。此介质以0.5％接种，而后在37℃下，在不同浓度的葡萄糖存在下经受发酵。(简写Gx表示在发酵前的介质中，葡萄糖的浓度x％(w/w))。而后，对于不同的菌株，pH作为时间的函数被监测。在30小时的发酵下得到的发酵介质的样品被用于测定三肽IPP和VPP的产生，以及用于测定ACEI活性，其结果如下。
对于I-3504，母体菌株的结果也被显示(I-3431，乳糖阳性菌株)，(见图1)
对于I-3505，母体菌株的结果也被显示(I-3434，乳糖阳性菌株)，(见图2)
对于I-3508，母体菌株的结果也被显示(I-3435，乳糖阳性菌株)，(见图3)
图1-3显示的结果表明，在发酵的结尾，本发明的菌株能有利地依据最初存在于介质中的葡萄糖的量使得精细地控制pH成为可能。而且，通过乳糖阴性菌株的发酵有利地导致高pH值，这将给出器官感觉上可接受的食品。
2.三肽IPP和VPP的产生的测定
材料和方法
在30小时的发酵后得到的奶制品介质的样品，如前面1.所述，被用以进行此测定。
肽含量的分析，特别是三肽IPP和VPP的含量，用在后说明的HPLC液相色谱法结合MS/MS型检测器进行：
-由于复杂样品的分析中固有的干扰，添加已知量并在样品的制备时间上控制的氘化内标的应用被强烈推荐。
-样品的制备通过稀释在水、甲醇和三氟乙酸的混合物(50/50/0.1％)中的发酵介质进行，其含有25ppm的氘化VPP内标(此后用VPPd表示，通式为H-Val[D8]-Pro-Pro-OH，MM＝319.45g/mol，购自法国Bachem Chemicals公司)和10ppm的氘化IPP内标(此后用IPPd表示，通式为H-IIe[D10N15]-Pro-Pro-OH，MM＝336.2g/mol，购自NEOMPS，Group SNPE，7rue de Boulogne，67100Strasbourg，France)，以1:3的比例(例如，用Eppendorf精确称量600mg样品于1200mg含有内标的水-甲醇-TFA混合物中)。
-此稀释的样品而后以14000g离心15分钟。得到的含有发酵期间产生的肽的澄清上清液，而后用含有0.1％三氟乙酸的水-甲醇(50/50，v/v)混合物精确稀释50倍。
-如此得到的稀溶液而后用配备了适合肽分析的Waters 型柱(3mm2.1×150mm，C18PA-A，WAT186002427，Waters France，5，Rue Jacques Monod，78280Guyancourt)的Agilent1100型HPLC色谱系统(法国Agilent Technologies公司，1rue Galvani91745Massy Cédex，France)在50℃以0.25ml/min的流速分析。用标准方式以溶剂B(乙腈+0.100％的甲酸)在溶剂A(水+0.106％的甲酸)中依据期望的色谱分离度而在35分钟到2小时期间增加的梯度洗脱肽。适于肽IPP和VPP的分析的方法用如下梯度：
 
时间 ％缓冲液A ％缓冲液B
0 100 0
3 96 4
6 89 11
15 60 40
18 0 100
21 100 0
24 0 100
27.5 100 0
35 100 0
-用特定的MS/MS型检测器，例如用具有诸如Esquire3000+(BrukerDaltonique，rue de1’Industrie，67166Wissembourg Cédex)、正型电喷雾电离参数的离子阱的装置，进行检测以对肽含量进行全分析(MS-MS形式)，或者对肽的特征碎片进行精确和详细定量(MRM形式)。在肽IPP和VPP以及内标IPPd和VPPd的分析的情况下，这些肽由其特定的质量而分离(单电荷离子对于VPP为312.2Da、对于IPP为326.2Da、对于VPPd为320.2Da、对于IPPd为337.3Da)，并通过其碎裂后的特征离子的强度被定量(碎片≥85Da)。
而后，每个肽IPP、VPP的色谱峰的积分和已知IPPd和VPPd浓度的内标的峰面积的比较使通过简单线性回归计算样品的初始VPP和IPP含量(通常表示为mg/kg或ppm)成为可能。
结果
 
VPPeq.(mg/kg发酵介质)
Calpis CM4 51
CNRZ244 57
I-3504(含2％(w/w)葡萄糖) 80
图4显示了菌株I-3504(2％(w/w)的葡萄糖被添加至介质中)的三肽IPP和VPP的产生与现有技术的两个菌株的比较。
源于CALPIS公司的菌株CM4在专利EP1016709中被说明，而菌株CRNZ244在专利申请WO2004/060073中被说明。
在此图中明显得出，在相同条件下，菌株I-3504(本发明的菌株)具有大大高于这两个在先菌株的三肽IPP和VPP的产生。
图5显示了本发明的菌株的三肽IPP和VPP的产生的彼此间的对比。
3.ACEI(血管紧缩素转化酶抑制)活性的测定
材料和方法
在30小时的发酵后得到的奶制品介质的样品，如前面1.所述，被用以进行此测定。本方法基于Cushman和Cheng的方法(Cushman等人Biochem.Pharmacol.1971.20：1637)，适于使其与发酵乳制品类型的样品兼容。
1.试剂和溶液的制备
1.10.1M硼酸钠缓冲液，pH8.3，添加了0.3M的NaCl
称量6.1843g H3BO3(Carlo Erba ref：402766)。溶解于约800ml软化水中，用NaOH溶液调节pH至8.3，而后添加12.0g NaCl(最终浓度为0.3M)，用软化水定容至1升。
1.2HHL底物的制备：在含有0.3M NaCl的pH8.3的0.1M硼酸钠缓冲液中的5mM Hip-His-Leu溶液
精确称量42.95mg无水HHL肽(N-马尿酰-组氨酰-亮氨酸四水合物，摩尔分子量：501.5g，Sigma-Aldrich ref：53285-250mg)，溶于约15mL含有0.3M NaCl的pH8.3的0.1M硼酸钠缓冲液中，而后用此缓冲液定容至20mL。
1.30.1U/mL的ACE溶液的制备
冻干粉末形式的血管紧缩素转化酶(来源：兔肺，Sigma-Aldrich refA6778，0.25单位)被溶解在2.5mL pH8.3的0.1M硼酸钠缓冲液中，以得到0.1U/mL的溶液。如此制备的溶液必须在4℃下储存不超过2周应用，以保持足够的酶活性。
2.发酵奶的样品制备
有必要使样品处于8.0-8.5的pH条件下，以接近ACE的最适pH。发酵奶首先被离心，而后上清液的pH被调节至8.0-8.5(理想的为pH8.3)，而后用具有10,000道尔顿的截止阈值的Vivaspin过滤单元(Vivascience，法国)超滤以消除干扰因素(全部蛋白质、钙盐)。
完整的步骤如下：
-在事先称量空管后，将约6mL的发酵奶置于15mL Falcon管中。
称量一定量的发酵奶置于管中。
-在10℃下以14,000g离心10分钟。
-回收上清液。
-定量沉淀/上清液的比例，这使得如果必要，确定初产物而不是其单独的上清液IC50当量成为可能。
-将2.0mL上清液的样品置于管中并测定pH。
-在添加硼酸盐缓冲液后，添加必要量的2M的NaOH以得到8.0-8.5(目标：8.3)的pH，而后搅拌
-添加必要量的硼酸盐缓冲液以稀释起始的上清液至添加的NaOH的准确体积的1/2(例如上清液的测试样品＝2mL+250μL NaOH+1.75mL硼酸盐缓冲液)
-验证最终的pH为8.0-8.5。超过的话，重新开始，添加或多或少的NaOH。沉淀形成：这是由于钙盐的原因。
-在10℃下，用10,000道尔顿Vivaspin过滤单元(容量4-6mL)以12,000g超高速离心样品15分钟，以得到澄清样品。
3.通过发酵奶的样品的ACE抑制的测定
对于每个分析系列，对照(0％和100％ACE活性)必须被制备。对于每个样品，产生两个独立的试验和一个空白样品用于每个稀释液。实际上，尽可能接近地(通过稀释)调节必须的样品的量以降低50％的ACE的活性是必要的。
为此：
-将调节至pH8.3的80μL样品置于空白管和测试管中
-将80μL软化水置于0％和100％对照管中
-添加200μL的5mM HHL底物溶液至全部管中。搅拌。
-将管置于37℃的温度可调控的水浴中，使其达到温度平衡
-通过添加20μL的0.1U/mL的ACE溶液至每个管中开始酶反应，除了空白样品和0％对照，其须添加20μL的pH8.3的硼酸盐缓冲液。
-在37℃下精确地水解1小时。
-通过添加250μL的1M HCl溶液至每个管中而停止反应。
不同反应介质的组合物的总结表：
 
测试部分 添加的底物 开始水解
100％对照 80μL的软化水 200μL HHL 20μLACE
0％对照 80μL的软化水 200μL HHL 20μL的硼酸盐缓冲液
(测试)样品 80μL的样品 200μL HHL 20μLACE
空白样品 80μL的样品 200μL HHL 20μL的硼酸盐缓冲液
通过萃取水解的底物(马尿酸)进行读取，其定量用分光光度计，步骤如下：
添加1.7mL的乙酸乙酯于每个管中，搅拌。
在10℃下以2000g离心5分钟
精确取1mL上清液置于Eppendorf微管中。
在120℃下用加热块蒸发乙酸乙酯10秒
精确添加1mL软化水，而后搅拌10秒以吸收马尿酸。
在适于UV读取的细胞中，在228nm处读取吸光度。
结果的表达
ACE抑制的百分比被计算如下：
Figure G200780013463XD00151
其中Abs＝萃取马尿酸后在228nm处的吸光度
ctl＝对照
sam.＝样品
对于发酵奶，IC50被作为此发酵奶的上清液的量表达，其抑制50％的反应介质中的ACE的酶活性，也就是，微升发酵奶上清液每毫升反应介质。
结果
图6显示本发明的不同菌株对血管紧缩素转化酶的抑制活性与现有技术的其他菌株的比较。
抑制50％的血管紧缩素转化酶活性(IC50)必须的发酵奶每毫升反应介质的当量浓度沿y-轴表达。此浓度越高，菌株抑制血管紧缩素转化酶的能力越低。
实施例3：本发明的(益生菌)乳制品的制备
发酵乳制品由如下所示得到。
先已脱脂、预巴氏杀菌和冷却至4℃的散装奶依照脱脂奶粉的蛋白质(4.0％)被标准化，葡萄糖以总计1.8％(w/w)被添加于其中。如此得到的奶制品介质经受巴氏杀菌(95℃-8分钟)。当冷却至37℃后，奶制品介质用本发明的菌株以总计107CFU/mL被接种，并在整个发酵期间保持37℃。当pH达到3.8时，凝乳被从发酵罐中移出以经历平滑过程(通过过滤器)并在板式换热器中冷却至10℃。而后向平滑和冷却的凝乳中以总计为终产物的15％添加果类的制备物(pH4-4.1)，包装于110mL的瓶中并在4℃下保存28天。
如此制备的产物含有总计为65mg/kg的VPP当量的序列IPP/VPP的三肽。产物的肽含量在产物的整个有效期内是有利地稳定的。在冷冻储存期间pH的降低可有利地忽略(小于0.1单位)，本发明的菌株的总数有利地保持在107-108CFU/mL。
实施例4：在本发明菌株的乳糖操纵子中无义点突变的鉴定
购自GenBank的菌株DPC4571和ATCC15009的乳糖操纵子的序列的起始，寡核苷酸(引物)选自看起来被最佳保存的基因。这些寡核苷酸使产生“大范围”PCR、而后开始测序本发明菌株的乳糖操纵子的序列成为可能。而后逐步进行测序，也就是，依据得到的序列，其他引物充当新的序列反应。
无义突变在涉及母体菌株I-3431的菌株I-3504中被鉴定：在5′-3′方向，胞嘧啶碱基被胸腺嘧啶替换，这导致在编码β-半乳糖苷酶的lacL基因(其产生约1900bps)起始密码子的1320碱基对上出现终止密码子。
除了此突变，两个菌株I-3431和I-3504的乳糖操纵子是一致的。
菌株I-3431的乳糖操纵子的序列(框内突变)
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类似的，测序分析显示本发明菌株的乳糖操纵子中的下列突变：
-与菌株I-3434比较的菌株I-3505：
在菌株I-3505中，在编码β-半乳糖苷酶的lacL基因的起始的1713碱基对上，腺苷碱基替换了鸟嘌呤碱基，导致终止密码子的出现。
-与菌株I-3435比较的菌株I-3508：
在菌株I-3508中，在编码β-半乳糖苷酶的lacL基因的起始的183碱基对上，腺苷碱基替换了鸟嘌呤碱基，导致终止密码子的出现。

Claims (20)

1.瑞士乳杆菌的菌株，其不具有将乳糖转化成乳酸的能力，能产生至少25mg的VPPeq每公斤发酵产物的量的序列IPP和/或VPP的三肽，
所述瑞士乳杆菌的菌株选自2005年10月14日保藏于法国微生物保藏中心(CNCM)的保藏号为I-3504、I-3505和I-3508的菌株，
其中以mg/kg表示：[VPPeq]＝[VPP]+(9/5×[IPP])。
2.如权利要求1所述的瑞士乳杆菌的菌株，其中所述序列IPP和/或VPP的三肽的量为至少50mg的VPPeq每公斤发酵产物。
3.如权利要求2所述的瑞士乳杆菌的菌株，其中所述序列IPP和/或VPP的三肽的量为至少75mg的VPPeq每公斤发酵产物。
4.如权利要求1-3中的任一权利要求所述的瑞士乳杆菌的菌株，其还具有果糖阴性表型。
5.如权利要求1-4中的任一权利要求所述的瑞士乳杆菌的菌株在食品或药品的制备中的用途。
6.如权利要求1-4中的任一权利要求所述的瑞士乳杆菌的菌株在发酵的乳制品的制备中的用途。
7.如权利要求5或6所述的用途，使得所述食品或药品或发酵的乳制品具有抗高血压性质。
8.食品，含有至少一个如权利要求1-4中任一权利要求所述的瑞士乳杆菌的菌株。
9.如权利要求8所述的食品，含有至少106CFU/mL的活体瑞士乳杆菌。
10.如权利要求8所述的食品，含有至少25mg的序列IPP和/或VPP的三肽每公斤所述食品。
11.如权利要求10所述的食品，含有至少50mg的序列IPP和/或VPP的三肽每公斤所述食品。
12.如权利要求11所述的食品，含有至少75mg的序列IPP和/或VPP的三肽每公斤所述食品。
13.如权利要求8-12中的任一权利要求所述的食品，也包含果类制备物。
14.如权利要求13所述的食品，其中所述果类制备物是水果片和/或果汁。
15.如权利要求8-12中的任一权利要求所述的食品，具有大于或等于3.85的pH。
16.如权利要求15所述的食品，具有大于或等于4.00的pH。
17.如权利要求16所述的食品，具有大于或等于4.20的pH。
18.如权利要求8-12中的任一权利要求所述的食品，其具有抗高血压性质。
19.食品的制备方法，包括下述阶段：
-选择一种含有包含肽序列IPP和/或VPP的蛋白质的原材料，
-选择至少一个如权利要求1-4中任一权利要求所述的瑞士乳杆菌菌株，
-将所述菌株接种于所述原材料上，
-在30-45℃下，和在所述菌株存在下，在1-3％(w/w)葡萄糖存在下发酵所述原材料12-30小时。
20.如权利要求19所述的方法，在发酵后无需任何热杀菌阶段。 
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL2334191T3 (pl) * 2008-08-29 2019-04-30 Chr Hansen As Zastosowanie l. helveticus w sposobie wytwarzania sera
AU2011327288B2 (en) * 2010-11-09 2015-05-07 Asahi Group Holdings, Ltd. Lactobacillus helveticus having high proteolysis activity
WO2015193459A1 (en) * 2014-06-19 2015-12-23 Chr. Hansen A/S Method of producing a fermented milk product with improved control of post acidification
CN105309972A (zh) * 2014-08-01 2016-02-10 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 一种充气的褐色活性乳酸菌饮料及其制备方法
RU2577112C1 (ru) * 2014-12-25 2016-03-10 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Горский государственный аграрный университет" Штамм lactobacillus helveticus вкпм в-11175, полученный на доступных питательных средах
FI3821712T3 (fi) * 2017-01-13 2023-01-13 Parannetulla menetelmällä saatu hapatettu maitotuote
CN109517763B (zh) * 2018-12-27 2022-03-22 内蒙古农业大学 瑞士乳杆菌h11及其应用
CN111206003B (zh) * 2020-02-20 2021-09-10 扬州大学 弱后酸化瑞士乳杆菌sh2-5-66及其应用
CN116762858A (zh) * 2022-03-07 2023-09-19 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 一种常温活菌发酵乳的制备方法

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS52151761A (en) * 1976-06-09 1977-12-16 Snow Brand Milk Products Co Ltd Method of producing fermented milk
JPS5747429A (en) 1980-09-02 1982-03-18 Sanyo Kokusaku Pulp Co Sheet for baking and cooking tray
US4452895A (en) * 1982-03-17 1984-06-05 Microlife Genetics Non-lactose fermenting Pediococcus pentosaceus
US4599313A (en) * 1982-04-15 1986-07-08 Microlife Technics, Inc. Preservation of foods with non-lactose fermenting Streptococcus lactis subspecies diacetilactis
JP2589553B2 (ja) * 1988-08-18 1997-03-12 雪印乳業株式会社 発酵乳の製造方法
JPH02268644A (ja) * 1989-04-12 1990-11-02 Sankyo Nyugyo Kk 発酵乳の製造方法
JP2782142B2 (ja) 1992-07-23 1998-07-30 カルピス株式会社 アンジオテンシン変換酵素阻害剤及びその製造法
JP2824821B2 (ja) * 1993-11-04 1998-11-18 カルピス株式会社 乳酸菌及び発酵乳製品
JP3028411B2 (ja) 1997-09-26 2000-04-04 カルピス株式会社 トリペプチド高生産性ラクトバチルス・ヘルベチカス乳酸菌
FR2778921B1 (fr) * 1998-05-22 2001-05-11 Gervais Danone Sa Souches mutantes de lactobacillus bulgaricus depourvues d'activite beta-galactosidase
EP0965643B1 (en) * 1998-06-17 2003-11-05 Societe Des Produits Nestle S.A. Mobile genetic elements as tools for genetic modification of L. delbrueckii or L. helveticus
NL1010096C2 (nl) * 1998-09-15 2000-03-17 Agronomique Inst Nat Rech Zuivelproduct alsmede werkwijze ter bereiding daarvan.
FI113741B (fi) * 1999-11-01 2004-06-15 Valio Oy Menetelmä verenpainetta alentavia peptidejä sisältävän tuotteen valmistamiseksi
AU2001262250A1 (en) * 2000-05-15 2001-11-26 Societe Des Produits Nestle S.A. Probiotic lactic acid bacteria, unable to utilize lactose
FI112031B (fi) * 2002-02-25 2003-10-31 Valio Oy Biologisesti aktiivisen tuotteen uusi käyttö
CA2509627A1 (en) 2003-01-06 2004-07-22 Unilever Plc Fermented milk product comprising tripeptide vpp and/or ipp
WO2006004105A1 (ja) * 2004-07-05 2006-01-12 Calpis Co., Ltd. ペプチド混合物の製造法、抗高血圧ペプチド含有発酵乳の製造法及び抗高血圧ペプチド製剤の製造法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Fram et al.Mutagenesis and repair of DNA damage caused by nitrogen mustard, N, N-bis(2-chloroethyl)-N-nitrosourea(BCNU), streptozotocin and mitomycin C in E.coli.《Mutation Research》.1996,第166卷(第3期),229-242. *

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