NUEVAS CEPAS DE LACTOBACILLUS HELVETICUS
Campo de la Invención La presente invención se refiere a nuevas cepas de Lactobacillus helveticus, así como sus aplicaciones en el ámbito agroalimenticio. Más concretamente, la presente invención propone cepas de Lactobacillus helveticus que poseen un fenotipo negativo para lactosa. La presente invención se refiere también a un método de obtención de tales cepas de Lactobacillus helveticus. Antecedentes de la Invención La hipertensión afecta una parte importante de la población. La utilización del péptido VPP (Val Pro Pro) y de péptidos que contiene la secuencia VPP como agentes capaces de reducir la presión arterial por inhibición de la enzima de conversión de la angiotensina (ACE) se describió en EP 0.583.074. Se describió también un efecto similar del tripéptido IP (lie Pro Pro) en la literatura. Estos péptidos inhiben el ACE bloqueando su lugar activo y le impiden así volver activa a la angiotensina. Se conoce que las dos secuencias VPP e IP están presentes en la caseína beta vacuna y que la hidrólisis adecuada de esta caseína (o más generalmente de la leche que la contiene) permite obtener esos tripéptidos. Numerosos estudios en animales y en el hombre puso de manifiesto que la ingestión diaria de algunos miligramos de estos tripéptidos permite reducir eficazmente la presión arterial, en particular en las personas hipertensas, reduciendo además el riesgo de accidente cardiovascular. Los péptidos provenientes de una leche fermentada por
Lactobacillus helveticus mostraron in vivo su efecto inhibidor de ACE (ACEI) y estos péptidos pudieron encontrarse en la aorta de las ratas que participan en el estudio (Masuda O. y AL, 1996. J. Nutr.
126,3063-8). Otros estudios también mostraron más específicamente una disminución de la presión arterial en ratas hipertensas a raíz de la ingestión de péptidos de una leche fermentada por L. helveticus (Yamamoto N. y AL, 1994. Biosci. Biotech. Biochem. 58,776-8). En el hombre, la misma leche fermentada también permitió disminuir la presión arterial sistólica (Hata y al; 1996. Am. J. Guiño.
Nutr., 64.767-71). Un estudio más reciente confirma que los péptidos presentes en el producto AMEAL S ® comercializado por la sociedad CALPIS reducen significativamente la presión arterial en temas que tienen una presión arterial superior a normal (Mizuno y AL, 2005.
British Diario apagado Nutrición; vuelo 94. salida 1,84-91). En otro reciente estudio (Jauhiainen y AL; 2005. Am. J. of
Hypertension, 18: 1600-1605) se presentó la hipótesis según la cual el mecanismo de acción antes citado (inhibición de ACE) para explicar el efecto antihipertensor de una leche fermentada por un L. helveticus podría sin embargo no ser el mecanismo de acción determinante en el hombre. Una gran mayoría de los Lactobacillus helveticus es capaz de producir los tripéptidos IP y VPP por fermentación de leche, pero las cantidades producidas pueden ser variables. El documento EP 1.016.709 describe un medio de producir los tripéptidos VPP e IP por fermentación de leche con la ayuda de cepas de bacterias lácticas específicas que pertenecen a la especie Lactobacillus helveticus. No obstante, el producto así fabricado (leche fermentada) contiene una enorme cantidad de ácido láctico, y pues está caracterizado por una acidez inaceptable desde el punto de vista sensorial y gustativo. Por otro lado se plantea el problema post acidificación: aunque la fermentación es decidida (clásicamente por enfriamiento) a pH organoleptiquement aceptables (pH > 4), la acidificación se continúa en frío a causa de las propiedades intrínsecas del Lactobacillus helveticus. Esto conduce a una caída del pH del producto, que se vuelve igualmente inaceptable para el consumo. Con el fin de evitar la post-acidificación, es posible detener la fermentación a un pH aceptable matando inmediatamente las cepas por tratamiento térmico (pasteurización, termízación): postacidificación es entonces nula (la acidez del producto no evoluciona más durante su conservación). Desgraciadamente, la cantidad de tripéptidos se reduce a causa de la detención precoz de la fermentación. Los productos así obtenidos solo tienen un contenido escaso en IP y VPP. Es también posible fermentar la leche con las mismas cepas hasta obtener una concentración máxima de tripéptidos. La gran cantidad de ácido láctico generada en paralelo debe entonces ser retirada por un método de múltiple etapas complejo y costoso. Además el método no es "natural", ya que intervienen las etapas de separación. Tal método así no es adecuado para la escala industrial. Breve Descripción de la Invención La presente invención propone soluciones a los inconvenientes del estado de la técnica. En particular, la presente invención propone cepas de Lactobacillus helveticus que permiten la preparación de productos alimenticios, en particular, de productos lácteos fermentados, poseedores de numerosas propiedades ventajosas: - Los productos lácteos según la invención tienen una acidez perfectamente controlada, no sólo al final de la fermentación, sino también al almacenamiento. En particular, no son propensos al fenómeno post-acidificación. Así pues, los productos lácteos según la invención son organolépticamente muy satisfactorios. - Los productos lácteos según la invención pueden consumirse directamente como probióticos, esto quiere decir que contienen una cantidad significativa de bacterias vivas, sin ningún impacto en sus calidades gustativas, y, en particular, sin ningún impacto en su acidez. - La preparación de los productos según la invención no requiere ninguna etapa de termización, ni ninguna etapa compleja de purificación. Los métodos según la invención pueden así aplicarse de manera simple, en instalaciones de industria láctea clásica, sin modificación importante del equipo. Por otra parte, los métodos según la invención son enteramente naturales. - Los productos alimenticios, en particular, lácteos, según la invención pueden contener muy fuerte contenido en tripéptidos VPP e IP, y esto, con elevadas proporciones (IP)/(ác¡do láctico). Estos resultados pueden obtenerse sin etapa de purificación o concentración previa. - Los productos alimenticios, en particular, lácteos, según la invención contienen ventajosamente una biomasa importante (esto es una concentración importante de microorganismos vivos). Con el término cepas, se entiende, en el sentido de la presente invención, cualquier cultivo, generalmente puro, de un microorganismo, obtenido a partir de una única célula o de una colonia aislada. Al variar o transferir una cepaX, se propone designar, en el sentido de la presente invención, todas las cepas obtenidas a partir de una cepa de referencia X. en el presente contexto, utilizará más concretamente los términos "variando" para designar una cepaobtenidas principalmente por mutación y selección a partir de una cepa de referencia X y "mutante" para designar más específicamente una cepaobtenidas por técnicas de mutagénesis aleatorias o dirigidas (por ejemplo transformación genética con la ayuda de vectores), aplicadas a las cepas X. Los mutantes o variables de las cepas según la presente invención se oirán bien afectados por la protección conferida por esta patente a partir del momento en que conservan los aspectos esenciales de la invención, en particular, el fenotipo negativo para lactosa. Por cepas a "fenotipo negativo para lactosa", se entienden todas las cepas que no tienen la capacidad de transformar la lactosa en ácido láctico. Por cepas a "fenotipo negativo para fructosa", se entienden todas las cepas que no tiene la capacidad de metabolizar la fructosa. Con el término medio lácteo, se entiende todo medio que contenga proteínas de leche, por ejemplo una leche vacuna estandarizada al 4% de proteínas con leche en polvo vacuna (descremada o no) o con leche concentrada. Con el término producto lácteo, en el sentido de la presente invención, se entiende, además de la leche, cualquier producto derivado de la leche, como la crema, el helado, la mantequilla, el queso, el yogur, la leche fermentada; los productos secundarios, como el suero lácteo, la caseína, así como distintos alimentos preparados que contenga como ingrediente principal de la leche o los constituyentes de la leche. Entre los productos lácteos, los productos lácteos fermentados incluyen entre otras cosas los yogures, las leches fermentadas, los requesones, el kéfir (o búlgaros), los quesos, los productos lácteos probióticos y más generalmente todo producto lácteo sometido cuando menos a una etapa de fermentación. Dicha leche es leche de vaca generalmente, pero puede también ser leche de otros mamíferos, como la cabra, la oveja, la yegua, la camella, la búfala. Con el término producto alimenticio, en el sentido de la presente invención, se entiende cualquier producto destinado a la nutrición humana o animal. En particular, los productos alimenticios incluyen productos destinados a la alimentación de los lactantes, de los niños, de los adolescentes, y de los adultos. Los productos alimenticios según la invención pueden contener total o parcialmente, cuando menos un producto lácteo fermentado según la invención. Los productos alimenticios según la invención pueden también contener otros ingredientes habitualmente utilizados en la industria agroalimenticia, como aditivos, conservadores, frutas o extractos de frutas, aromas, colorantes, agentes de textura, cereales, pedazos de chocolate, etc. Con el término fermento, se entiende, en el sentido de la presente invención, toda composición que contenga cuando menos una cepa viva de microorganismos susceptibles a fermentar un medio dado. Entre los fermentos, los fermentos lácticos son composiciones que contienen cuando menos una cepa viva de microorganismos susceptibles a fermentar un medio lácteo. Descripción Detallada de la Invención Según un método de realización, la presente invención se refiere a un cepas de Lactobacillus helveticus que no tiene la capacidad para transformar la lactosa en ácido láctico. La presente invención se refiere también a un cepas de Lactobacillus helveticus que no tiene la capacidad de transformar la lactosa en ácido láctico, y que poseen cuando menos una mutación en el operón lactosa. Según un método de realización, dicha mutación en el operón lactosa es una mutación puntual que introduce un codón de paro. Según un método de realización aún más preferido, dicha mutación puntual que introduce un codón de paro se sitúa en el gene lacL del operón lactosa. Por mutación puntual, se entiende toda sustitución de nucleótido interviniendo en la secuencia, en comparación con una secuencia "tipo nativo". El experto en la técnica sabe identificar un codón de paro (también llamado codón sin sentido), y que corresponde generalmente en términos de ARNm a uno de los tríos: UAA, UAG, UGA. Así pues, las cepas Lactobacillus helveticus según la invención no tienen la capacidad de degradar la lactosa (no hay transformación de la lactosa en ácido láctico). En efecto, las cepas según la invención tienen un fenotipo negativo para lactosa. En cambio, son capaces de crecer en presencia de glucosa como fuente de carbono (fermentación de la glucosa en ácido láctico), y de metabolizar algunos componentes de la leche, en particular, las proteínas. Así pues, las cepas según la invención permiten ventajosamente una fermentación a pH enteramente controlada: el pH final después de fermentación se controla perfectamente según la cantidad de glucosa inicialmente contenida en el medio de fermentación. Esto resulta del hecho que una cantidad dada de glucosa da como resultado de manera casi estequiométrica en la misma cantidad de ácido láctico. Por otra parte, el empleo de las cepas según la invención evita todo fenómeno post-acidificación. Así pues, gracias a las cepas según la invención, es posible obtener productos alimenticios especialmente satisfactorios a nivel organoléptico.
De manera ventajosa, según un método de realización, las cepas de Lactobacillus helveticus según la invención son tales que un medio lácteo al 4.0% de proteínas totales que contienen un 1.0% (p/p) de glucosa fermentada por dichas cepas de Lactobacillus helveticus durante un tiempo máximo de fermentación de 30h, a una temperatura entre 30 y 45°C, posee un pH superior o igual a 4.0; preferentemente superior o igual a 4.1; preferentemente superior o igual 4.2; preferentemente superior o igual a 4.3; preferentemente superior o igual a 4.5. Esta ventaja especialmente se señala pues en el caso de cepas de Lactobacillus helveticus hiperproductoras de tripéptidos IP y/o VPP: absolutamente no se requiere de elegir una relación entre una fuerte producción en tripéptidos en la fermentación (que requiere un tiempo de fermentación lo más largo posible), y las propiedades organolépticamente aceptables (requiriendo acidificación limitada, y en consecuencia, no solamente un tiempo de fermentación lo más corto posible, con el fin de limitar la producción de ácido láctico por fermentación, pero también un termización/pasteurización con el fin de evitar el fenómeno post-acidificación). En efecto, ventajosamente según la presente invención, la producción de tripéptidos VPP y/o IP, y la producción de ácido láctico se desacoplan parcialmente: la producción de ácido láctico es función de la cantidad de glucosa inicialmente presente en el medio de fermentación, y tampoco función del tiempo de fermentación. Un forma para expresar la concentración en tripéptidos de manera simple es la de expresar en concentración equivalente VPP [VPPeq]. Expresándose en mg/kg: [VPPeq] = [VPP] + (9/5 x [IP]) Así pues, según un método de realización, las cepas de Lactobacillus helveticus según la invención ventajosamente son capaces, de producir por fermentación los tripéptidos de secuencia IP y/o VPP en una cantidad de cuando menos 25 Mg, preferentemente cuando menos 30 Mg, preferentemente cuando menos 35 Mg, preferentemente cuando menos 40 Mg, preferentemente cuando menos 45 Mg, preferentemente cuando menos 50 Mg, preferentemente cuando menos 55 Mg, preferentemente cuando menos 60 Mg, preferentemente cuando menos 65 Mg, preferentemente cuando menos 70 Mg, preferentemente cuando menos 75 Mg, más preferentemente cuando menos 80 Mg de VPPeq por kg de producto fermentado. Tales cantidades de VPP y/o IP son obtenidas generalmente por fermentación por medio de una cepa según la invención a una temperatura entre 30 y 45°C, preferentemente entre 31 y 44°C, preferentemente entre 32 y 43°C, preferentemente entre 33 y 42°C, preferentemente entre 34 y 41 °C, preferentemente entre 35 y 40°C, y más preferentemente a 37°C, un medio lácteo que contiene una cantidad de glucosa superior al 3% (p/p) y con un contenido total en proteínas superiores o iguales al 2% (p/p), preferentemente entre 2 y 10% (p/p), más preferentemente entre 2,5 y 6% (p/p) y aún más preferentemente iguala al 4% (p/p), Según un método de realización, las cepas de Lactobacillus helveticus según la invención poseen por otro lado un fenotipo negativo para fructosa. La combinación de los fenotipos negativos para lactosa y negativos para fructosa es especialmente ventajosa. En efecto, la fructosa tiene un fuerte poder endulzante, y es un ingrediente útil en los productos alimenticios. Así pues, si la fructosa no puede ser degradada por las cepas de Lactobacillus helveticus, el producto alimenticio conserva excelentes propiedades organolépticas. Además, las cepas a la vez negativas para lactosa y negativas para fructosa no podrán contener más que un medio que contendrá la glucosa. Así pues, el pH final mejor se controlará ventajosamente cuando el producto alimenticio contenga una preparación de fruta(s), en particular, pedazos y/o jugo de fruta (s).
Según un método de realización, las cepas según la invención se seleccionan entre: 1-3504 depositada en la CNCM el 14/10/05; I-3505 depositada en la CNCM el 14/10/05; I-3508 depositada en la CNCM el 14/10/05; y las cepas variables o mutantes derivadas de las. Según otro método de realización; la presente invención se refiere a la utilización de una cepa de Lactobacillus helveticus según la invención, para la preparación de un producto alimenticio o farmacéutico, en particular, de un producto lácteo fermentado. De manera ventajosa, según un aspecto de la invención, dicho producto alimenticio o farmacéutico posee propiedades antihipertensoras. La presente invención se refiere también a un producto alimenticio, en particular, productos lácteos fermentados, incluyendo cuando menos una cepa de Lactobacillus helveticus según la invención. De manera ventajosa, según un método de realización, dicho producto alimenticio contiene cuando menos 106, preferentemente cuando menos 107, preferentemente cuando menos 108 UFC/mL de bacterias Lactobacillus helveticus vivas. Así pues, el producto alimenticio según la invención contiene una importante biomasa. Según un método de realización, dicho producto alimenticio contiene cuando menos 25 Mg, preferentemente cuando menos 30 Mg, preferentemente cuando menos 35 Mg, preferentemente cuando menos 40 Mg, preferentemente cuando menos 45 Mg, preferentemente cuando menos 50 Mg, preferentemente cuando menos 55 Mg, preferentemente cuando menos 60 Mg, preferentemente cuando menos 65 Mg, preferentemente cuando menos 70 Mg, preferentemente cuando menos 75 Mg, más preferentemente cuando menos 80 Mg de VPPeq por kg de producto alimenticio. Según un método de realización, el producto alimenticio según la invención incluye por otro lado preparaciones de fruta(s), en particular, de los pedazos de y/o del jugo de fruta(s). Según un método de realización, el producto alimenticio según la invención posee un pH superior o igual a 3.85; preferentemente superior o igual a 3.90; preferentemente superior o igual a 3.95; preferentemente superior o igual a 4.00; preferentemente superior o igual a 4.05; preferentemente superior o igual a 4.10; preferentemente superior o igual a 4.15; más preferentemente superior o igual a 4.20. Ventajosamente según un método de realización, el producto alimenticio según la invención posee propiedades antihipertensoras.
Según otro aspecto, la presente invención se refiere a un método de preparación de un producto alimenticio. Según un método de realización, dicho método incluye las siguientes etapas: • seleccionar una materia prima que contiene proteínas de leche, en particular, proteínas que contengan las secuencias peptídicas IP y/o VPP. Este puede por ejemplo ser la leche que contiene un 2-10% (p/p) de proteínas totales. • seleccionar cuando menos una cepa Lactobacillus helveticus según la invención, • inocular dicha materia prima con dichas cepas, • fermentar dicha materia prima en presencia de 1-3% (p/p) de glucosa durante las 12-30 horas a 30-45°C, y en presencia de dicha cepa. Según un método de realización, el método según la invención está ventajosamente desprovisto de cualquier etapa de termización después de fermentación. Esto permite conservar bacterias vivas en el producto alimenticio (probiótico). Según un método de realización, la presente invención se refiere a la utilización de estreptozotocina para la obtención de cepas Lactobacillus helveticus que poseen un fenotipo negativo para lactosa. La presente invención proporciona también un método de obtención de tales cepas de Lactobacillus helveticus. Según un método de realización, dicho método de obtención de cepas Lactobacillus helveticus que poseen un fenotipo negativo para lactosa, incluye las siguientes etapas: • proporcionar cuando menos una cepa de Lactobacillus helveticus; • poner en contacto dicha cuando menos una cepa con una cantidad eficaz de estreptozotocina en presencia de lactosa; • aislar las colonias de fenotipo negativo para lactosa. Ventajosamente la población de células de Lactobacillus helveticus capaz de sobrevivir en presencia de estreptozotocina en efecto, es extremadamente rica en células negativas en lactosa. Según un método de realización, una etapa de prueba colorimétrica sobre un medio que contiene del Xgal y/o el Sgal y/o cualquier otro compuesto vinculado por un enlace ß-galactosídico con galactosa y que se vuelve localizable a raíz de la ruptura de este enlace por el microorganismo, se añade al mencionado método de obtención de cepas según la invención. La IPTG puede también añadirse para realizar esta prueba puesto que este compuesto actuará como un inductor de la utilización de la lactosa por el microorganismo. A título de ejemplo, dicho método puede conducirse de la siguiente manera: - 1a replicación de las cepas Lactobacillus helveticus de partida (cepas madres), en caldo MRS. (Man Rogosa Sharp) neutra, durante la noche a 35-40°C; - 2a replicación en MRS. neutra. - Incubación hasta la obtención de una biomasa suficiente, por ejemplo 10-30 horas a 35-40°C. - Inoculación de MRS. que contiene una concentración de lactosa que permite obtener una biomasa suficiente, por ejemplo 2- 7% (p/p); incubación con seguimiento del DO a 580 nm. - La estreptozotocina es preparado extemporáneamente, se añade en el curso de la fermentación, de tal modo que tenga una concentración final que es bactericida para las cepas en cuestión. Esta concentración es dependiente de las cepas. - Después de incubación a 35-40°C, los cultivos se lavan dos veces con sal de triptona. - Las muestras se retoman en la sal de triptona, luego los caldos de MRS neutro se vuelven a poner en cultivo - Incubación a 35-40°C, hasta que haya un crecimiento de las cepas. - Se realizan aislamientos a continuación sobre MRSneutra + Xgal + IPTG, luego incubados a 35-40°C bajo C02. Esta etapa es una prueba colorimétrica que permite determinar si una cepa bacteriana es positiva o negativa para lactosa: Si las cepas son capaces de utilizar la lactosa como fuente de carbono, hay producción de una sustancia azul, la colonia será pues azul y en el caso contrario (cepas negativas en lactosa), será blanca. - Se las colonias blancas se replican de nuevo sobre MRS neutro y se incuban a 35-40°C. La invención se describirá más detalladamente con la ayuda de los ejemplos siguientes, que no son limitativos. EJEMPLOS DE REALIZACIÓN
EJEMPLO 1: obtención de cepas que poseen un fenotipo negativo para lactosa Material y métodos Cepas iniciales (cepas llamadas "madre") 1-3431 depositada en la CNCM el 25/05/05 1-3434 depositada en la CNCM el 25/05/05 1-3435 depositada en la CNCM el 25/05/05 Prueba de sensibilidad a la estreptozotocina Inicialmente, se comprueba que las cepas madres son sensibles al antibiótico utilizado, la estreptozotocina. La densidad óptica (DO) a 580nm continua sobre cultivos a 42°C en caldo MRS. (Man Rogosa Sharp) neutra. Cuando ésta alcanza 0.1, la estreptozotocina se añade a un tubo para tener 50 g/ml al final (por ejemplo 100µ I de una solución a 5mg/ml para 10ml de medio). Selección de cepas negativas en lactosa Las etapas siguientes se realizan con el fin de obtener cepas Lactobacillus helveticus negativas a lactosa: - 1a replicación de las cepas Lactobacillus helveticus de partida (cepas madres) a partir de las cúpulas de las cepas de trabajo, sobre caldo MRS neutro, durante la noche a 37°C; - 2a replicación al 1% en MRS. neutro. - Incubación 16 horas a 37°C. - Inoculación de 10ml de MRS. al 5% (p/p) de lactosa, al 1% e incubación a 40°C con seguimiento del DO a 580nm. - La estreptozotocina es preparada extemporáneamente, y añadido al cabo de 2h15 o 4 horas de fermentación, de tal modo que tenga una concentración final de 50 g/ml. - Después del 7:30 horas de incubación a 40°C, los cultivos se lavan dos veces con la sal de triptona. - Las muestras se retoman en 2 mi de sal de triptona, luego se inoculan en caldo de MRS neutro al 10%. - Incubación a 37°C, mientras haya crecimiento de las cepas. A continuación se realizan aislamientos sobre MRS neutro + Xgal + IPTG, luego son incubado a 37°C bajo C02. Esta etapa es una prueba colorimétrica que permite determinar si una cepa bacteriana es negativa o positiva en lactosa: Si las cepas son capaces de utilizar la lactosa como fuente de carbono, hay producción de una sustancia azul, la colonia será pues azul y en el caso contrario (cepas negativas en lactosa), será blanca. - Las colonias blancas se replican sobre MRS neutro y se incuban a 37°C. Resultados Esto permitió obtener las cepas siguientes, que poseen un fenotipo negativo para lactosa que posteriormente son el objeto de depósitos en la CNCM (Colección Nacional de Culturas de Microorganismos), 28 rué du Docteur Roux, 75724 París, Francia, de acuerdo con las disposiciones del Tratado de Budapest: 1-3504 depositada en la CNCM el 14/10/05; obtenida de las cepas madre 1-3431 I-3505 depositada en la CNCM el 14/10/05; obtenida de las cepas madre 1-3434 1-3508 depositada en la CNCM el 14/10/05; obtenida de las cepas madre 1-3435 El fenotipo negativo para lactosa de las cepas obtenidas de nuevo se confirma sobre un medio de gelosa MRS neutro + Xgal + IPTG (prueba de coloración llamada "blanca/azul") EJEMPLO 2: Cepas que poseen un fenotipo negativo para lactosa La cepas I-3504 depositada el 14/10/05 en la CNCM (Colección Nacional de Culturas de Microorganismos), 28 rué du Docteur Roux, 75724 Paris, Francia, de acuerdo con las disposiciones del Tratado de Budapest, es una cepa de Lactobacillus helveticus que poseen las siguientes propiedades: - Negativa en lactosa; Negativa en fructosa - producción de IP y VPP: ver Figuras 4 y 5 - propiedades de acidificación: ver Figura 1 - inhibición de ACE: ver Figura 6 La cepa I-350.5 depositada el 14/10/05 en la CNCM (Colección Nacional de Culturas de Microorganismos), 28 rué du Docteur Roux, 75724 París, Francia, de acuerdo con las disposiciones del Tratado de Budapest, es una cepa de Lactobacillus helveticus que poseen las siguientes propiedades: - Negativa en lactosa; Negativa en fructosa - producción de IP y VPP: ver Figura 5 - propiedades de acidificación: ver Figura 2 La cepa 1-3508, depositada el 14/10/05 ante la CNCM (Colección Nacional de Culturas de Microorganismos), 28 rué du Docteur Roux, 75724 París, Francia, de acuerdo con las disposiciones del Tratado de Budapest, es una cepa de Lactobacillus helveticus que poseen las siguientes propiedades: - Negativa en lactosa; Negativa en fructosa - producción de IP y VPP: ver Figura 5 - propiedades de acidificación: ver Figura 3 1. Medida de las propiedades de acidificación de las distintas cepas variables Las propiedades de acidificación se evalúan del siguiente modo:
Un medio que contiene 120g de leche en polvo descremada (PLE) en 930ml de agua se pasteuriza 10 minutos a 95°C. Este medio se Inocula al 0.5%, luego se somete a fermentación a 37°C en presencia de distintas concentraciones de glucosa. (La abreviatura Gx indica una concentración x de % (p/p) de glucosa en el medio antes de la fermentación). El pH se sigue entonces en función del tiempo, para distintas cepas. Se utilizará una muestra de medio fermentado efectuada a las 30 horas de fermentación para las medidas de producción de los tripéptidos IP y VPP así como para las medidas de la actividad ACEI cuyos resultados se darán adelante. Para 1-3504. se presentan también los resultados de las cepas madre (1-3431, cepas positivas en lactosa), (véase figura 1) Para I-3505, se presentan también los resultados de las cepas madre (1-3434. cepas positivas en lactosa), (véase figura 2) Para 1-3508, se presentan también los resultados de las cepas madre (1-3435, cepas positivas en lactosa), (véase Figura 3) Los resultados presentados sobre las figuras 1-3 ponen de manifiesto que las cepas según la invención permiten ventajosamente controlar sutilmente el pH en final de fermentación según la cantidad de glucosa inicialmente presente en el medio. Por otra parte, la fermentación por cepas negativas en lactosa se realizo ventajosamente a elevados valores de pH, que darán productos alimenticios organolépticamente aceptables. 2. Medida de la producción de los tripéptidos IP y VPP Material y método Se utiliza una muestra de medio lácteo tomada después de 30 horas de fermentación, como se describe anteriormente en el apartado 1 para hacer esta medida. El análisis del contenido en péptidos, en particular, el contenido en tripéptidos IP y VPP, se conduce con un método de cromatografía líquido CLHP acoplado a un detector de tipo MS/MS como se describe a continuación - A causa de las interferencias inherentes al análisis de muestras complejas, el uso de patrones internos deuterizados añadidos en cantidades conocidas y controladas en el momento de la preparación de la muestra se aconseja ampliamente. - La preparación de la muestra se hace por dilución del medio fermentado en una mezcla de agua, metanol y ácido trifluoroacético (50/50/0.1%), que contiene 25 ppm de patrón interno VPP deuterizado (considerado para el siguiente VPPd, de fórmula H-Val [D8] - Pro-Pro-OH, MM = 319,45 g/mol, disponible de la sociedad Bachem Chemicals, Francia) y 10 ppm de patrón interno IP deuterizado (considerado posteriormente para IPPd, de fórmula H-lle [DIO N15] - Pro-Pro-OH, MM = 336,2 g/mol, disponible de la sociedad NEOMPS, Grupo SNPE, 7 rué de Boulogne, 67100 Estrasburgo, Francia) en un informe de 1 a 3 (por ejemplo, pesada precisa en un matraz Eppendorf de 600 Mg de muestra en 1200 Mg de mezcla agua-metanol-TFA que contiene los patrones internos). - Esta muestra diluida se centrifuga a continuación a 14000 g durante 15 minutos. La nata clara obtenida, que contiene los péptidos generados durante la fermentación, se diluye a continuación precisamente al 1/50 en una mezcla de agua-metanol (50/50. v/v) que contiene un 0.1% de ácido trifluoroacético. - La solución diluida así obtenida se analiza a continuación en un sistema cromatográfico CLHP de tipo Agilent 1100 (sociedad Agilent Tecnologías Francia, 1 rué Galvani 91745 Massy cedex, Francia), equipado con una columna adaptada para el análisis de los péptidos, de tipo Waters Biosuite® (3 mm. 2.1 x 150 mm., CL 8 PA-a, WATI 86002427, Waters Francia, 5, Rué Jacques Monod, 78280 Guyancourt) a la temperatura de 50°C, producción de 0.25 ml/min. Los péptidos se eligen de manera clásica con un gradiente creciente de solvente B (acetonitrilo + 0.100% de ácido fórmico) en el solvente A (Agua + 0.106% ácidos fórmicos), sobre una duración de 35 minutos a 2 horas en función de la resolución cromatográfica deseada. El método adaptado a la dosificación de los péptidos IP y VPP utiliza el siguiente gradiente:
La detección se hace con la ayuda de un detector específico de tipo MS/MS, por ejemplo con un aparato a trampilla iónico como el Esquire 3000+ (Bruker Daltonique, rué de Industria, 67166 Wissembourg Cedex), con parámetros en ionización de electroaspersión en método positivo, ya sea para el análisis global del contenido peptídico (método MS-MS), o para la cuantificación precisa y específica de un péptido a partir de sus fragmentos característicos (método MRM). En el caso de la dosificación de los péptidos IP y VPP, y también de los patrones internos IPPd y VPPd, estos péptidos se aislan a partir de su masa específica (iones monocargados 312,2 DA para VPP; 326,2 DA para IP; 320.2 DA para VPPd; 337,3 DA para IPPd) y cuantificados a partir de la intensidad de sus iones específicos después de la fragmentación (fragmentos > = 85 DA). La integración de los picos cromatográficos de cada uno de los péptidos IP, VPP y la comparación a las superficies de pico de los patrones internos de concentraciones conocidas IPPd y VPPd permite a continuación calcular, por regresión lineal simple, el contenido inicial de la muestra en VPP e IP (generalmente expresada en mg/kg o ppm). Resultados
VPPeq (mg/kg de medio fermentado) Caipis CM4 51 CNRZ 244 57
1-3504 (con 2% (p/p) de glucosa) 80 La figura 4 muestra una comparación de la producción en tripéptidos IP y VPP de las cepas 1-3504 (2% (p/p) de glucosa se añaden al medio) con relación a dos cepas de la técnica anterior. La cepa C 4 de la sociedad CALPIS se describe en la patente EP 1.016.709 mientras que la cepa CRNZ 244 se describe en la solicitud de patente WO 2004/060073. Queda claro sobre esta figura que la cepa I-3504 (cepa según la invención) tiene una producción de tripéptidos IP y VPP muy superior a estas dos anteriores cepas en las mismas condiciones. La figura 5 muestra una comparación de la producción en tripéptidos IP y VPP de las cepas según la invención entre ellas. 3. Medida de la actividad ACEI (Inhibición de la Enzima de Conversión de la Angiotensina) Material y método Se utiliza una muestra de medio lácteo tomada después de 30 horas de fermentación, como describe anteriormente en el apartado 1 para hacer esta medida. El presente método tiene como base el método de Cushman y Cheng (Cushman y AL Biochem. Pharmacol. 1971. de 20: 1637), adaptada para volverlo compatible con muestras del tipo de productos lácteos fermentados. 1. Preparación los reactivos y soluciones 1.1 Amortiguador de borato de sodio 0.1M pH8.3. añadido de 0.3M de NaCI Pesar 6.1843g de H3B03 (Cario Erba Ref.: 402 766). Disolver en aproximadamente de 800 mi de agua desmineralizada, ajustar a un pH 8.3 con una solución de NaOH luego añadir 12.0 g de NaCI (concentración final 0.3 M) y completar a 1 litro con agua desmineralizada. 1.2 Preparación del substrato HHL: solución de Hip-His-Leu a 5mm en amortiguador de borato de sodio 0.1M pH8.3 con 0.3M de NaCI Pesar exactamente 42.95 g de péptido HHL anhidro (N-Hipuril-Histidil-Leucina tetrahidratada PM: 501.5g, Sigma-Aldrich ref: 53285-250 Mg) y disolver en aproximadamente 15 mi de amortiguador de borato de sodio 0.1 M pH 8.3 con 0.3M de NaCI luego completar a 20ml_ con este mismo amortiguador. 1.3 Preparación de la solución de ACE a O.IU/mL La enzima de conversión de la angiotensina en forma de polvo liofilizada (origen: pulmones de conejo, Sigma-Aldrich Ref. A6778, 0.25 unidades) se solubiliza en 2.5ml_ de amortiguador de borato de sodio 0.1M pH 8,3 para obtener una solución a 0.1 LVmL La solución así preparada debe utilizarse, almacenada a 4°C, como máximo 2 semanas después para preservar una actividad enzimática suficiente. 2. Preparación de las muestras de leche fermentada Es necesario condicionar la muestra a un pH incluido entre 8.0 y 8.5 de tal modo que sea cercano al pH óptimo de ACE. La leche fermentada es centrifugada por completo, el pH de la nata se ajusta a continuación a entre 8.0 y 8.5 (idealmente un pH 8.3) luego es ultrafiltrada con la ayuda de una unidad de filtración Vivaspin con un límite máximo de corte de 10.000 Daltons (Vivascience, Francia) con el fin de eliminar los elementos interferentes (proteínas enteras, sales de calcio). El protocolo completo es el siguiente: - Depositar aproximadamente 6mL de leche fermentada en un tubo Falcon de 15ml_ después de previamente de haber pesado el tubo vacío. Pesar la cantidad de leche fermentada depositada en el tubo. - Centrifugar a 14.000g durante 10 minutos a 10°C. - Recuperar la nata - Cuantificar la proporción muestra/nata lo que permite en caso necesario determinar el IC50 equivalente al producto de origen y no solo a su nata. Tomar 2.0ml_ de nata en un tubo de ensayo y medir el pH. - Añadir el volumen necesario de NaOH 2M para obtener un pH incluido entre 8.0 y 8.5 (objetivo: 8.3) después de la adición del amortiguador de borato, luego agitar - Añadir el volumen necesario de amortiguador de borato para diluir la nata de salida ½ teniendo en cuenta el volumen exacto de NaOH añadido (por ejemplo: toma de prueba de la nata = 2ml_ + 250µ?_ NaOH +1.75mL amortiguador de borato) - Verificar que el pH final esté incluido entre 8.0 y 8.5. Después, reiniciar añadiendo más o menos NaOH. Un precipitado se forma: se debe a las sales de calcio. - Ultracentrifugar la muestra a 12.000 g durante 15 minutos a 10°C con la ayuda de unidades de filtración Vivaspin 10.000 Daltons
(capacidad 4-6mL) con el fin de obtener una muestra límpida. 3. Medición de la inhibición de ACE para las muestras de leches fermentadas En cada serie analizada, deben ser preparados algunos controles (0 y 100% actividad ACE). Para cada muestra, se realizan dos pruebas independientes y una muestra en blanco para cada dilución. En efecto es necesario ajustar (diluyendo) la cantidad de muestra necesaria para disminuir en un 50% la actividad de ACE. Para eso: Depositar 80µ?_ de la muestra condicionada a pH 8.3 en el tubo blanco y en los tubos de ensayo - Depositar 80pL de agua desmineralizada en los tubos controlados 0 y 100% - añadir 200µ? de la solución de substrato HHL a 5mm en todos los tubos. Agitar. - Colocar los tubos en un baño de agua a 37°C, dejar que la temperatura se equilibre - Desencadenar la reacción enzimática por adición en cada tubo de 20 L de la solución ACE a O.l U/mL, excepto por la muestras en blanco y el control 0% para lo que es necesario depositar 20µ?_ de amortiguador de borato pH 8.3. - Dejar hidrolizar exactamente durante 1 hora a 37°C. - Detener la reacción añadiendo en cada tubo 250µ?_ de la solución de HCI 1M. Tabla recapitulativa de la composición de los distintos medios de reacción:
La lectura se hace por extracción del substrato hidroliza (ácido hipúrico) y su cuantificacion con la ayuda de un espectrofotometro, con el siguiente protocolo: Añadir en cada tubo 1.7mL acetato de etilo, agitar. Centrifugar a 2000g durante 5 minutos a 10°C Tomar a 1 mL exactamente de nata en un microtubo de Eppendorf Evaporar el acetato de etilo a 120°C durante 10 minutos en un bloque de calentamiento Añadir exactamente a 1 mL de agua desmineralizada luego agitar 10 gegundos para retomar el ácido hipúrico. Leer la absorbencia a 228 nm en recipientes adaptados para la lectura de UV.
Expresión de los resultados: El porcentaje de inhibición de ACE se calcula del siguiente modo: (Abs 100% ctl - Abs 0% ctl) - (Abs mués - Abs mués blanca) x 100 (Abs 100% ctl - Abs 0% ctl) Siendo Abs = absorbencia a 228 nm después de extracción del ácido hipúrico ctl = control mués = muestra Para una leche fermentada, expresamos IC50 como la cantidad de nata de esta leche fermentada que inhibe un 50% de la actividad enzimática de ACE en el medio de reacción, o sea en microlitros de nata de leche fermentada por mililitro de medio de reacción. Resultados La figura 6 muestra una comparación de la actividad inhibidora de la enzima de conversión de la angiotensina de las distintas cepas según la presente invención comparadas con otras cepas de la técnica anterior. En la ordenada se expresa la concentración equivalente de leche fermentada por mi de medio de reacción necesario para inhibir un 50% de la actividad de la enzima de conversión de la angiotensina (IC50). Cuanto más es elevada esta concentración, menos tienen las cepas la capacidad para inhibir la enzima de conversión de la angiotensina. EJEMPLO 3: Preparación de un producto lácteo (probiótico) según la invención Se obtiene un producto lácteo fermentado como se indica adelante. La leche de gran mezcla, previamente descremada, prepasteurizada y enfriada a 4°C se estandariza en proteínas (4.0%) con leche en polvo descremada y añadida de glucosa en razón de un 1.8% (p/p). El medio lácteo asi preparado se somete a una pasteurización (95°C-8 min). Después del enfriamiento a 37°C se mantiene el medio lácteo se inocula con una cepa según la presente invención a alrededor de 107 UFC/mL y a 37°C durante toda la duración de la fermentación. Cuando el pH 3.8 se alcanza, la cuajada se golpea ligeramente de el recipiente de fermentación para sufrir un alisado (al pasar a través de de un filtro) y enfriada a 10°C en un intercambiador de placa. A la cuajada alisada y enfriada se le añade a continuación una preparación de frutas (que tienen un pH entre 4 y 4.1) en razón de un 15% del producto terminado, acondicionado en frascos de 110 mi y almacenado a 4°C durante 28 días. El producto así preparado contiene tripéptidos de secuencia IPP/VPP alrededor a 65 el mg/kg de equivalente VPP. El contenido en péptidos del producto es estable ventajosamente a lo largo de vida del producto. La disminución de pH durante el almacenamiento refrigerado es despreciable (inferior ventajosamente a 0.1 unidad) y la población de las cepas según la presente invención, permanece ventajosamente comprendida entre I07 y I08 UFC/mL. EJEMPLO 4: Definición de mutaciones puntuales sin sentido en el operón lactosa de cepas según la invención A partir de las secuencias de operones de lactosa de las cepas DPC4571 y ATCC15009 disponibles en el genbank, se eligieron algunos oligonucléotidos (iniciadores) en genes que parecían los más conservados. Estos oligonucléotidos permitieron realizar una PCR "de largo rango", luego de comenzar la secuenciación del operón lactosa de cepas según la invención. La secuenciación se practica a continuación paso a paso, esto es en función de las secuencias obtenidas, de otros iniciadores sirvieron a las nuevas reacciones de secuencia. Se definió una mutación sin sentido en las cepas 1-3504 con relación a las cepas madre 1-3431: en el sentido 5 ' - 3' , una base citosina es sustituida por una timina, lo que evidencia un codón de paro a 1320 pares de bases del codón de iniciación del gene lacL (de aproximadamente 1900 pbs) que codifica a la ß-galactosidasa. Además de esta mutación, los operones lactosa de las dos cepas 1-3431 y I-3504 son idénticos. Secuencia del operón lactosa de las cepas 1-3431 (la mutación se encuentra encuadrada) aaatgaaaattcatgatctaactctggattaatgtgataagcgctttcaacatcagtgccccagctgtcaattcctccaacgccgcg aactgcacctgcaattactaacacggttctgcgaacaagtggtagttcttcaatgttagtagcgttctcaagctcctcagcagtata aggcaaacaactgaaattaaatggtttttctgcttgttgaattgagagactgaacttttcatttgtacgatctacattattttgtgtggtttc acgattaatggttaacttcttagtttgcatgtgcattccattttcctgcggaaccaaatactcggtaactggcaaaccatcgatatgga atttaccttctttagctccagccattctatcaggataagtttcaccggataaaccttcataatcaaatcctgtagcagccgttggcata atcaatcgaataccaattacaggcaggggtggtaatcccttcttaccataataacgcattgtaaccttaatgtgaccgacatcatc aatattatagatgatttttgcatttgttgcaggagtagttaaagtttgataggtaaatgaaatttcagcactttttgcatactcgtgattgct aaatttgttgttaaagggtgcaataggcagttcggcaaagtcatgtctgtctacttttaaatggatatcagtacatttagtaaacatat cagctccgagccattgagctgcctttagattaaatccactgcctcggtcgttatctgtagttgctcgccaaaaagtaggagtaggta cacgataaagccattccttgccgtgtacttttaacgattcaagtccgccgcgttcataactaaagatgtattgaaaatctttgccatta 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1-3435: En la cepa I-3508, una base adenosina sustituye a una base guanina que causa la aparición de un codón de paro, a 183 pares de bases del principio del gene lacL que codifica a la betagalactosidasa.