JP5184378B2 - ヘルベティカス乳酸桿菌の新規株 - Google Patents
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Description
- 本発明による乳製品は、発酵の最後のみならず貯蔵の間も、完全に制御された酸性度を有する。特に、それらは、ポスト酸性化現象を受けない。したがって、本発明による乳製品は、官能的にきわめて満足を与えるものである。
- 本発明による乳製品は、プロバイオティクスとして直接消費できる。すなわち、それらは、それらの味覚的性質に対する影響なしに、特に、それらの酸味に対する影響なしに、かなり多くの量の生菌を含有する。
- 本発明による製品の調製は、サーマイゼーション段階を必要とせず、また、複雑な精製段階も必要としない。したがって、本発明による方法は、装置の改変をそれほど行わずに、標準的な乳業設備において簡便に実施できる。さらに、本発明による方法は、完全に自然である。
- 本発明による食品、特に乳製品は、高い(IPP+VPP)/(乳酸)比で、きわめて高レベルのトリペプチドVPPおよびIPPを含有できる。これらの結果は、先行の精製段階または濃縮段階なしで得ることができる。
- 本発明による食品、特に乳製品は、有利なことに、かなり多くののバイオマス(すなわち、かなり高い濃度の生存微生物)を含有する。
- 発酵中にトリペプチドの高レベルの産生(できる限り長い発酵時間を必要とする)と、
- 官能的に許容できる特性(制限された酸性化、したがって、発酵による乳酸の産生を制限するために、できる限り短い発酵時間のみならず、ポスト酸性化現象を避けるためのサーマイゼーション/低温殺菌を必要とする)
との間で妥協することを全く必要としない。
2005年10月14日にCNCMに寄託されたI-3504;
2005年10月14日にCNCMに寄託されたI-3505;
2005年10月14日にCNCMに寄託されたI-3508;
およびこれらの株に由来するバリアント株またはミュータント株から選択される。
乳タンパク質、特にペプチド配列IPPおよび/またはVPPを含有するタンパク質を含有する原料を選択する段階。これは例えば、2重量%〜10重量%の総タンパク質を含有する乳であり得る。
本発明による少なくとも1種のヘルベティカス乳酸桿菌株を選択する段階。
前記原料に前記株を接種する段階。
30℃〜45℃で12時間〜30時間、1重量%〜3重量%のグルコースの存在下、および前記株の存在下、前記原料を発酵させる段階。
少なくとも1種のヘルベティカス乳酸桿菌株を準備する段階;
前記少なくとも1種の株を、ラクトースの存在下、有効量のストレプトゾトシンと接触させる段階;
ラクトース陰性表現型の1つまたは複数のコロニーを単離する段階。
- 中性MRS (Man Rogosa Sharp)ブロス上での、35℃〜40℃で一晩にわたる開始ヘルベティカス乳酸桿菌株(母株)の第1の継代培養;
- 中性MRSにおける、第2の継代培養。
- 十分なバイオマスが得られるまでの、例えば、35℃〜40℃で10時間〜30時間のインキュベーション。
- 十分なバイオマスを得ることを可能にする濃度、例えば、2重量%〜7重量%のラクトースを含有するMRSの接種;580nmにおけるODのモニタリングを伴うインキュベーション。
- 考慮されている株に対して殺菌的な最終濃度を有するように、ストレプトゾトシンを即時調製し、発酵の間に加える。この濃度は株に依存的である。
- 35℃〜40℃でのインキュベーション後、培養物をトリプトン塩により2回洗浄する。
- 該ペレットをトリプトン塩に吸収させ、次いで中性MRSを再培養する。
- 該株が増殖するまでの、35℃〜40℃でのインキュベーション。
- 次いで、中性MRS + Xgal + IPTGで単離を行った後、CO2下、35℃〜40℃でインキュベーションを行う。この段階は、菌株がラクトース陽性かラクトース陰性か判定することを可能にする比色試験である:該株が炭素源としてラクトースを用いることができる場合、青色の物質が産生され、したがって、該コロニーは青色であり、逆の場合(ラクトース陰性株)では、該コロニーは白色である。
- 白色コロニーを、中性MRSで継代培養し、35℃〜40℃でインキュベートする。
(実施例1)
ラクトース陰性表現型を有する株の獲得
材料および方法
開始株(いわゆる「母株」)
I-3431 2005年5月25日に、CNCMへ寄託
I-3434 2005年5月25日に、CNCMへ寄託
I-3435 2005年5月25日に、CNCMへ寄託
第1段階で、使用される抗生物質、ストレプトゾトシンに対して母株が感受性であることを検証する。中性MRS (Man Rogosa Sharp)ブロス中、42℃で、580nmにおける吸光度(OD)をモニターする。後者が0.1に達したら、最終的に50μg/mlを有するように(例えば、10mlの培地に対して、5mg/mlの100μl)、ストレプトゾトシンを管に加える。
ラクトース陰性ヘルベティカス乳酸桿菌株を得るために、以下の段階を実施する:
- 中性MRS培地上での、37℃で一晩にわたる、使用原液のウェルからの開始ヘルベティカス乳酸桿菌株(母株)の第1の継代培養;
- 中性MRS培地中、1%での第2の継代培養。
- 37℃で16時間のインキュベーション。
- 10mlのMRSを、1%で、5重量%ラクトースで接種し、580nmにおけるODのモニタリングを伴う、40℃でのインキュベーションを行う。
- ストレプトゾトシンを即時調製し、2時間15分または4時間の発酵後、50μg/mlの最終濃度を有するように加える。
- 40℃で7時間30分のインキュベーション後、培養物を、トリプトン塩で2回洗浄する。
- 該ペレットを2mlのトリプトン塩に吸収させ、次いで中性MRSを10%で接種する。
- 該株が増殖するまでの、37℃でのインキュベーション。
- 次いで、中性MRS + Xgal + IPTGで単離を行った後、CO2下、37℃でインキュベーションを行う。この段階は、菌株がラクトース陽性かラクトース陰性か判定することを可能にする比色試験である:該株が炭素源としてラクトースを用いることができる場合、青色の物質が産生され、したがって、該コロニーは青色であり、逆の場合(ラクトース陰性株)では、該コロニーは白色である。
- 白色コロニーを、中性MRSで継代培養し、37℃でインキュベートする。
これによって、ラクトース陰性の表現型を有する以下の株を得ることが可能になり、次いでこれらを、ブダペスト条約の条項に従い、28 rue du Docteur Roux、75724、パリ、フランス国のCNCM(微生物培養物の国立コレクション)における寄託に供した。
I-3504 2005年10月14日に、CNCMへ寄託;母株I-3431に由来
I-3505 2005年10月14日に、CNCMへ寄託;母株I-3434に由来
I-3508 2005年10月14日に、CNCMへ寄託;母株I-3435に由来
ラクトース陰性表現型を有する株
ブダペスト条約の条項に従い、2005年10月14日に、28 rue du Docteur Roux、75724、パリ、フランス国のCNCM(微生物培養物の国立コレクション)へ寄託されたI-3504株は、以下の特性:
- ラクトース陰性;フルクトース陰性
- IPPおよびVPPの産生:図4および5を参照
- 酸性化特性:図1を参照
- ACE阻害:図6を参照
を有するヘルベティカス乳酸桿菌株である。
- ラクトース陰性;フルクトース陰性
- IPPおよびVPPの産生:図5を参照
- 酸性化特性:図2を参照
を有するヘルベティカス乳酸桿菌株である。
- ラクトース陰性;フルクトース陰性
- IPPおよびVPPの産生:図5を参照
- 酸性化特性:図3を参照
を有するヘルベティカス乳酸桿菌株である。
酸性化特性は、以下のとおりに評価する:
930mlの水中、120gの脱脂乳粉末(SMP)を含有する培地を、95℃で10分間低温殺菌する。この培地に、0.5%で接種してから、種々の濃度のグルコースの存在下、37℃で発酵に供する。(略語Gxは、発酵前の培地中におけるグルコースのx重量%濃度を示す)。次いで、種々の株に関して、pHを時間の関数としてモニターする。30時間の発酵で採取された発酵培地のサンプルを、トリペプチドIPPおよびVPP産生の測定、ならびにACEI活性の測定に用い、その結果は、下記に示されている。
材料および方法
この測定を実施するために、先の第1項で記述したとおり、発酵30時間目に採取した乳培地のサンプルを用いる。
- 複雑なサンプルの分析に固有の干渉により、知られた量で加えられ、該サンプルの調製時に制御された重水素化内部標準物質の使用が強く勧められる。
- サンプルの調製は、25ppmの重水素化VPP内部標準物質(以下、式H-Val[D8]-Pro-Pro-OHのVPPdと表す、MM = 319.45g/mol、Bachem Chemicals社、フランス国から入手可能)および10ppmの重水素化IPP内部標準物質(以下、式H-lleVal[D10 N15]-Pro-Pro-OHのIPPdと表す、MM = 336.2g/mol、NEOMPS社、Group SNPE、7 rue de Boulogne、67100、ストラスブルグ、フランス国から入手可能)を含有する水、メタノールおよびトリフルオロ酢酸の混合物(50/50/0.1%)中に、発酵培地を1対3の割合で希釈すること(例えば、内部標準物質を含有する水-メタノール-TFA混合物1200mg中、600mgのサンプルをエッペンドルフ内で正確に秤量)によって実施する。
- 次いで、この希釈サンプルを、14000gで15分間遠心分離する。次いで、発酵時に産生された該ペプチドを含有する、得られた明澄な上清を、0.1%のトリフルオロ酢酸を含有する水-メタノールの混合物(50/50、v/v)中、1/50倍に正確に希釈する。
- 次いで、このようにして得られた希釈液を、該ペプチドの分析に適した、Waters Biosuite(登録商標)タイプのカラム(3mm 2.1×150mm、C18 PA-A、WAT186002427、Waters France、5、Rue Jacques Monod、78280 Guyancourt)を備えたAgilent 1100タイプのHPLCクロマトグラフィーシステム(Agilent Technologies France社、1 rue Galvani 91745 Massy Cedex、フランス国)において、50℃の温度、0.25ml/分の流速で分析する。該ペプチドは、所望のクロマトグラフィー分解能に依存して、35分から2時間の時間にわたって、溶媒A(水 + 0.106%のギ酸)中、溶媒B(アセトニトリル + 0.100%のギ酸)の勾配増加で、標準的な様式で溶出させる。ペプチドIPPおよびVPPのアッセイに好適な方法は、以下の勾配を用いる:
材料および方法
この測定を実施するために、先の第1項で記述したとおり、発酵30時間目に採取した乳培地のサンプルを用いる。当該方法は、発酵乳産物タイプのサンプルに適合させるために適応させた、CushmanとChengの方法(Cushmanら、Biochem.Pharmacol.1971年、20:1637頁)に基づいている。
1.1 0.3MのNaClを添加したホウ酸ナトリウム緩衝液、0.1M、pH8.3
6.1843gのH3BO3(Carlo Erba 参照番号:402 766)を秤量する。およそ800mlの脱イオン水に溶解させ、NaOH溶液でpH8.3に調整してから、12.0gのNaClを加え(0.3Mの最終濃度)、脱イオン水で1リットルにする。
42.95mgの無水HHLペプチド(N-ヒプリル-ヒスチジル-ロイシンテトラハイドレート、分子量:501.5g、Sigma-Aldrich参照番号:53285-250mg)を正確に秤量し、0.3MのNaClを有するおよそ15mLの0.1Mホウ酸ナトリウム緩衝液、pH8.3中に溶解させてから、この同じ緩衝液で20mLにする。
凍結乾燥粉末の形態におけるアンギオテンシン変換酵素(由来:ウサギ肺、Sigma-Aldrich 参照番号:A6778、0.25単位)を、0.1U/mLの溶液を得るために、2.5mLの0.1Mホウ酸ナトリウム緩衝液、pH8.3中に溶解させる。このようにして調製された溶液は、十分な酵素活性を保つために、4℃で保存し、2週間以内に使用しなければならない。
ACEの最適pHに近づけるために、サンプルを、8.0と8.5との間に含まれるpHに調整することが必要である。先ず、発酵乳を遠心分離してから、上清のpHを、8.0と8.5との間(理想的にはpH8.3)に調整し、次いで、妨害要素(全タンパク質、カルシウム塩)を除去するために、10,000ダルトンのカットオフ閾値を有するVivaspinろ過装置(Vivascience、フランス国)を用いて限外ろ過する。
- 予め空の15mLのFalcon管を秤量した後に、その管に、およそ6mLの発酵乳を入れる。該管に入れた発酵乳の量を量る。
- 10℃で10分間、14,000gで遠心分離する。
- 上清を回収する。
- 必要な場合は、単にその上清ではなく、元の産物に相当するIC50を決定することを可能にするペレット/上清の比率を定量化する。
- 2.0mLの上清サンプルを試験管に入れ、pHを測定する。
- ホウ酸塩緩衝液を加えた後、8.0と8.5との間に含まれるpH(目標:pH8.3)を得るために、必要容量のNaOH、2Mを加え、攪拌する。
- 加えたNaOHの正確な容量を考慮に入れて、開始上清を1/2に希釈するために、必要容量のホウ酸塩緩衝液を加える(例えば、上清の試験サンプル= 2mL + 250μLのNaOH + 1.75mLのホウ酸塩緩衝液)。
- 最終pHが8.0と8.5との間に含まれることを確認する。さらに、多少のNaOHの添加を開始する。沈殿が形成し、これはカルシウム塩によるものである。
- 明澄なサンプルを得るために、10,000ダルトンのVivaspinろ過装置(4〜6mLの容量)を用いて、10℃で15分間、12,000gでサンプルを超遠心分離する。
一連の分析各々に関して、対照(0%および100%のACE活性)を調製する必要がある。各サンプルに関して、2つの独立した試験およびブランクサンプルを、各希釈に関して作製する。実際、ACEの活性を50%低下させるのに必要なサンプルの量をできるだけ厳密に(希釈により)調整することが必要である。
- pH8.3に調整した80μLのサンプルを、ブランク管および試験管に入れる。
- 0%および100%の対照管に、80μLの脱イオン水を入れる。
- 5mMのHHL基質の溶液200μlを、全ての管に加える。攪拌する。
- 該管を、37℃に恒温制御した水浴に入れ、温度が平衡に達するまで放置する。
- 20μLのホウ酸塩緩衝液、pH8.3を導入しなければならないブランクサンプルおよび0%対照以外の各管に、0.1U/mLでACE溶液20μLを加えることによって酵素反応を開始させる。
- 37℃で正確に1時間、加水分解させる。
- 各管に、1M HCl溶液250μLを加えることによって、該反応を停止させる。
1.7mLの酢酸エチルを各管に加え、攪拌する。
10℃で5分間、2000gで遠心分離する。
正確に1mLの上清を、エッペンドルフマイクロチューブに入れる。
加熱ブロック内で、120℃で10分間、酢酸エチルを蒸発させる。
馬尿酸を吸収させるために、正確に1mLの脱イオン水を加えてから10秒間攪拌する。
UV読取りに好適なセル内で228nmにおける吸光度を読取る。
ACE阻害のパーセンテージは、以下のとおり算出する:
ctl = 対照
sam. = サンプル
図6は、先行技術の他の株と比較した、本発明による種々の株のアンギオテンシン変換酵素に対する阻害活性の比較を示す。
本発明による(プロバイオティック)乳製品の調製
発酵乳製品は、下記に示されるとおり得られる。
本発明による株のラクトースオペロンにおけるナンセンス点突然変異の同定
GenBankから入手できるDPC4571株およびATCC15009株のラクトースオペロンの配列により開始して、オリゴヌクレオチド(プライマー)を、最良に保存されているように思われる遺伝子から選択した。これらのオリゴヌクレオチドは、「長領域」PCRを生じさせること、次いで、本発明による株のラクトースオペロンの配列決定の開始を可能にした。次に、得られた配列、新たな配列決定反応のために働く他のプライマーに依存して、配列決定が段階的に実施された。
- I-3434株との比較によるI-3505株:I-3505株では、アデノシン塩基がグアニン塩基を置換し、そのことにより、ベータガラクトシダーゼをコードするlacL遺伝子の開始から1713塩基対に、停止コドンが出現する。
- I-3435株との比較によるI-3508株:I-3508株では、アデノシン塩基がグアニン塩基を置換し、そのことにより、ベータガラクトシダーゼをコードするlacL遺伝子の開始から183塩基対に、停止コドンが出現する。
Claims (32)
- ラクトースを乳酸に変換する能力を有さないヘルベティカス乳酸桿菌株であって、
3重量%より多い量のグルコースを含有し、2重量%以上の総タンパク質含量を有する乳培地を、30℃と45℃との間の温度で発酵することにより、発酵産物1kg当たり少なくとも25mgのVPP当量で配列IPPおよび/またはVPPのトリペプチドを産生することができ、
2005年10月14日にCNCMに寄託されたI-3504;
2005年10月14日にCNCMに寄託されたI-3505;
2005年10月14日にCNCMに寄託されたI-3508;
およびこれらの株に由来するバリアント株またはミュータント株から選択される、
ヘルベティカス乳酸桿菌株。 - 32℃と43℃との間の温度で発酵する、請求項1に記載のヘルベティカス乳酸桿菌株。
- 37℃の温度で発酵する、請求項1または2に記載のヘルベティカス乳酸桿菌株。
- 総タンパク質含量が2重量%と10重量%との間である、請求項1から3のいずれか一項に記載のヘルベティカス乳酸桿菌株。
- 総タンパク質含量が2.5重量%と6重量%との間である、請求項1から4のいずれか一項に記載のヘルベティカス乳酸桿菌株。
- 総タンパク質含量が4重量%に等しい、請求項1から5のいずれか一項に記載のヘルベティカス乳酸桿菌株。
- 発酵産物1kg当たり少なくとも50mgのVPP当量で配列IPPおよび/またはVPPのトリペプチドを産生する、請求項1から6のいずれか一項に記載のヘルベティカス乳酸桿菌株。
- 発酵産物1kg当たり少なくとも75mgのVPP当量で配列IPPおよび/またはVPPのトリペプチドを産生する、請求項1から7のいずれか一項に記載のヘルベティカス乳酸桿菌株。
- ラクトースオペロンに少なくとも1つの突然変異を有する、請求項1から8のいずれか一項に記載のヘルベティカス乳酸桿菌株。
- ラクトースオペロンに停止コドンを導入する少なくとも1つの点突然変異を有する、請求項9に記載のヘルベティカス乳酸桿菌株。
- 30℃と45℃との間の温度で最長30時間の発酵時間の間、前記ヘルベティカス乳酸桿菌株により発酵させた1.0重量%のグルコースを含有する4.0%の総タンパク質を有する乳培地が、4.0以上のpHを有する、請求項1から10のいずれか一項に記載のヘルベティカス乳酸桿菌株。
- pHが4.1以上である、請求項11に記載のヘルベティカス乳酸桿菌株。
- フルクトース陰性の表現型を有する、請求項1から12のいずれか一項に記載の乳酸菌ヘルベティカス株。
- 食品または医薬品、特に発酵乳製品を調製するための、請求項1から13のいずれか一項に記載のヘルベティカス乳酸桿菌株の使用。
- 前記食品または医薬品が降圧性を有する、請求項14に記載の使用。
- 請求項1から13のいずれか一項に記載の少なくとも1つのヘルベティカス乳酸桿菌株を含む食品、特に発酵乳製品。
- 少なくとも106 CFU/mLの生存ヘルベティカス乳酸桿菌を含有する、請求項16に記載の食品。
- 少なくとも107 CFU/mLの生存ヘルベティカス乳酸桿菌を含有する、請求項17に記載の食品。
- 少なくとも108 CFU/mLの生存ヘルベティカス乳酸桿菌を含有する、請求項18に記載の食品。
- 前記食品1kg当たり少なくとも25mgのVPP当量を含有する、請求項16から19のいずれか一項に記載の食品。
- 前記食品1kg当たり少なくとも50mgのVPP当量を含有する、請求項20に記載の食品。
- 前記食品1kg当たり少なくとも75mgのVPP当量を含有する、請求項21に記載の食品。
- 果実の調製物、特に果実片および/または果汁をも含む、請求項16から22のいずれか一項に記載の食品。
- 3.85以上のpHを有する、請求項16から23のいずれか一項に記載の食品。
- 4.00以上のpHを有する、請求項24に記載の食品。
- 4.20以上のpHを有する、請求項25に記載の食品。
- 降圧性を有する、請求項16から26のいずれか一項に記載の食品。
- 食品を調製する方法であって、
乳タンパク質、特にペプチド配列IPPおよび/またはVPPを含有するタンパク質を含有する原料を選択する段階と、
請求項1から13のいずれか一項に記載の少なくとも1種のヘルベティカス乳酸桿菌株を選択する段階と、
前記原料に前記株を接種する段階と、
30℃〜45℃で12時間〜30時間、1重量%〜3重量%のグルコース存在下、および前記株の存在下、前記原料を発酵させる段階と
を含む方法。 - 発酵後にサーマイゼーション段階を有さない、請求項28に記載の方法。
- 請求項1に記載のヘルベティカス乳酸桿菌株を得るためのストレプトゾトシンの使用。
- 請求項1に記載のヘルベティカス乳酸桿菌株を得る方法であって、
少なくとも1種のヘルベティカス乳酸桿菌株を準備する段階と;
前記少なくとも1種の株を、ラクトースの存在下、有効量のストレプトゾトシンと接触させる段階と;
ラクトース陰性表現型の1つまたは複数のコロニーを単離する段階と
を含む方法。 - β-ガラクトシド結合によりガラクトースに結合しており、前記ヘルベティカス乳酸桿菌株によるこの結合の切断後にタグ化されることができるXgalおよび/またはSgalおよび/または他の任意の化合物を含有する培地上での比色試験段階を含む、請求項31に記載の方法。
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