BRPI0707985B1

BRPI0707985B1 - processo de preparação de um produto alimentício ou farmacêutico e processo de preparação de um produto lácteo fermentado utilizando cepas de lactobacillus helveticus

Info

Publication number: BRPI0707985B1
Application number: BRPI0707985A
Authority: BR
Inventors: Druesne Anne; Queguiner Claire; Faurie Jean-Michel; Garault Peggy; Smokvina Tamara; Saint Denis Thierry
Original assignee: Gervais Danone Sa
Priority date: 2006-02-20
Filing date: 2007-02-19
Publication date: 2019-01-02
Also published as: EP1820851B9; JP5184378B2; RU2422509C2; CN101421390A; KR20080108247A; WO2007096510A2; BRPI0707985A2; RU2008137627A; ZA200807147B; CN101421390B; JP2009532018A; EP1991661B1; US8323951B2; PL1820851T3; EP1820851A1; CA2642891A1; AU2007217318A1; ES2380595T3; US20090088391A1; ES2384096T3

Abstract

novas cepas de lactobacillus helveticus. a presente invenção refere-se a novas cepas de lactobacilius helveticus. mais particularmente, a presente invenção propõe cepas de lactobacillus helveticus possuindo um fenótipo lactose negativa, e suas aplicações na indústria agro-alimentar. a presente invenção refere-se igualmente a um processo de obtenção de tais cepas de lactobacilius helveticus.

Description

PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE UM PRODUTO ALIMENTÍCIO OU

FARMACÊUTICO E PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE UM PRODUTO LÁCTEO

FERMENTADO UTILIZANDO CEPAS DE LACTOBACILLUS HELVETICUS

A presente invenção refere-se a novas cepas de Lactobacillus helveticus, assim como a suas aplicações no campo agro-alimentar. Mais particularmente, a presente invenção propõe cepas de Lactobacillus helveticus possuindo um fenótipo lactose negativa. A presente invenção referese, igualmente, a um processo de obtenção de tais cepas de Lactobacillus helveticus.

A hipertensão atinge uma grande parte da população. A utilização do peptídeo VPP (Vai Pro Pro) e de peptídeos contendo a seqüência VPP como agentes capazes de reduzir a pressão arterial por inibição da enzima de conversão da angiotensina (ACE) foi descrita na EP 0 583 074. Um efeito similar do tripeptídeo IPP (Ile Pro Pro) foi igualmente descrito na literatura. Esses peptídeos inibem a ACE bloqueando seu sítio ativo e impedindo, assim, tornar ativa a angiotensina.

É sabido que as duas seqüências VPP e IPP estão presentes na caseína Beta bovina e que a hidrólise adequada desta caseína (ou, mais geralmente, do leite que a contém) permite obter os referidos tripeptídeos. Numerosos estudos no animal e no homem mostraram que a ingestão diária de alguns miligramas destes tripeptídeos permite reduzir eficazmente a pressão arterial, em particular nos sujeitos hipertensos, reduzindo, desta forma, o risco de acidente cardiovascular.

Peptídeos obtidos de um leite fermentado por Lactobacillus helveticus mostraram in vivo seu efeito inibidor do ACE (ACEI) e esses peptídeos puderam ser encontrados no nível da aorta dos ratos que participaram no

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2/29 estudo (Masuda O. e outros, 1996. J. Nutr. 126, 3063-8) . Outros estudos também mostraram especificamente uma diminuição da pressão arterial em ratos hipertensos em resposta à ingestão de peptídeos obtidos de um leite fermentado por L. helveticus (Yamamoto N. e outros, 1994. Biosci. Biotech. Biochem. 58, 776-8).

No homem, o mesmo leite fermentado também permitiu diminuir a pressão arterial sistólica (Hata e outros; 1996. Am. J. Clin. Nutr., 64, 767-71). Um estudo mais recente confirma que os peptídeos presentes no produto AMEAL S® comercializado pela sociedade CALPIS reduzem, de maneira significativa, a pressão arterial em sujeitos que têm uma pressão arterial superior à normal (Mizuno e outros, 2005. British Journal of Nutrition; vol 94, edição 1, 84-91).

Em um outro estudo recente (Jauhiainen e outros; 2005. Am. J. of Hypertension, 18: 1600-1605) é anunciada a hipótese de acordo com a qual o mecanismo de ação acima citado (inibição do ACE) para explicar o efeito antihipertensivo de um leite fermentado por um L. helveticus poderia, no entanto, não ser o mecanismo de ação determinante no homem.

Uma grande maioria dos Lactobacillus helveticus é capaz de produzir os tripeptídeos IPP e VPP por fermentação

de leite,	mas	as	quantidades	produzidas	podem ser
variáveis. EP 1	016	709	descreve	um meio de	produzir os
tripeptídeos	VPP	e	IPP	por fermentação de	leite com o
auxílio de	cepas	de	bactérias	lácticas	específicas
pertencentes	à	espécie	Lactobacillus hei	veticus. No
entanto, o	produto	assim fabricado (leite	fermentado)

contém uma quantidade muito grande de ácido láctico e é então caracterizado por uma acidez inaceitável do ponto de vista sensorial e gustativo. Além disso, surge o problema

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3/29 da pós-acidificação: mesmo se a fermentação é interrompida (classicamente por resfriamento) em pH organolepticamente aceitáveis (pH > 4), a acidif icação prossegue no frio devido às propriedades intrínsecas dos Lactobacillus helveticus. Isto leva a uma queda do pH do produto, que se torna igualmente inaceitável ao consumo.

A fim de evitar a pós-acidificação, é possível interromper a fermentação em um pH aceitável matando imediatamente a cepa por tratamento térmico (pasteurização, termização): a pós-acidificação é então nula (a acidez do produto não evolui durante sua conservação). Infelízmente, a quantidade de tripeptídeos é reduzida devido à interrupção precoce da fermentação. Os produtos assim obtidos só possuem, então, baixos teores de IPP e VPP. É igualmente possível fermentar o leite pela mesma cepa até se obter uma concentração máxima de tripeptídeos. A grande quantidade de ácido láctico gerada em paralelo deve então ser retirada por um processo de múltiplas etapas complexo e caro. Além disso, o processo não é natural, pois ele menciona etapas de separação. Um processo desse tipo não é, assim, adaptado à escala industrial.

A presente invenção propõe soluções aos inconvenientes do estado da técnica. Em particular, a presente invenção propõe cepas de Lactobacillus helveticus que permitem a preparação de produtos alimentares, notadamente produtos lácteos fermentados, possuindo numerosas propriedades vantajosas:

- Os produtos lácteos de acordo com a invenção possuem uma acidez perfeitamente controlada, não somente ao final da fermentação, mas igualmente ao armazenamento. Em particular, eles não estão sujeitos ao fenômeno de pósacidif icação . Assim, os produtos lácteos de acordo com a invenção são organolepticamente muito satisfatórios.

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- Os produtos lácteos de acordo coma invenção são diretamente consumiveis como probióticos, quer dizer que eles contêm uma quantidade significativa de bactérias vivas, sem nenhum impacto sobre suas qualidades gustativas e, notadamente, sem nenhum impacto sobre sua acidez.

- A preparação dos produtos de acordo com a invenção não necessita de nenhuma etapa de termização, nem nenhuma etapa complexa de purificação. Os processos de acordo com a invenção podem, assim, ser implementados de maneira simples, em instalações de fábricas de laticínios clássicas, sem grande modificação do equipamento. Por outro lado, os processos de acordo com a invenção são inteiramente naturais.

- Os produtos alimentares, notadamente lácteos, de acordo com a invenção podem conter teores muito altos de tripeptideos VPP e IPP, e isto, com razões elevadas de (IPP + VPP) / (ácido láctico). Esses resultados podem ser obtidos sem etapa de purificação ou de concentração prévia.

- Os produtos alimentares, notadamente lácteos, de acordo com a invenção, contêm, vantajosamente, uma biomassa grande (i.e., uma grande concentração de microorganismos vivos).

Por cepa, entende-se, no sentido da presente invenção, qualquer cultura, geralmente pura, de um microorganismo, obtida a partir de uma única célula ou de uma colônia isolada.

Por variante ou mutante de uma cepa X, entende-se designar, no sentido da presente invenção, qualquer cepa obtida a partir de uma cepa de referência X. No presente contexto, serão utilizados mais particularmente os termos variante para designar uma cepa obtida principalmente por mutação e seleção a partir de uma cepa de referência X e mutante para designar, mais especificamente, uma cepa

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5/29 obtida por técnicas de mutagênese aleatória ou dirigida (por exemplo, transformação genética com o auxílio de vetores), aplicadas à cepa X.

Os mutantes ou as variantes das cepas de acordo com a presente invenção serão afetados pela proteção conferida por esta patente a partir do momento em que eles passam a conservar os aspectos essenciais da invenção, notadamente o fenótipo lactose negativa.

Por cepa com fenótipo lactose negativa, entende-se qualquer cepa que não tenha a capacidade de transformar a lactose em ácido láctico.

Por cepa com fenótipo frutose negativa, entende-se qualquer cepa que não possua a capacidade de metabolizar a frutose.

Por meio lácteo, entende-se qualquer meio contendo proteínas de leite, por exemplo, um leite bovino padronizado com 4% de proteínas com leite em pó bovino (desnatado ou não) ou com leite concentrado.

Por produto lácteo, no sentido da presente invenção, entende-se além do leite, qualquer produto derivado do leite, tal como a nata, o sorvete, a manteiga, o queijo, o iogurte, o leite fermentado; os produtos secundários, como o soro de leite, a caseína, assim como diversos alimentos preparados contendo como ingrediente principal o leite ou constituintes do leite. Dentre os produtos lácteos, os produtos lácteos fermentados compreendem entre outros os iogurtes, os leites fermentados, os queijos brancos, os kefirs, os queijos, os produtos lácteos probióticos e, mais geralmente, qualquer produto lácteo que tenha sofrido pelo menos uma etapa de fermentação. O referido leite é, geralmente, leite de vaca, mas pode, igualmente, ser leite de outros mamíferos, como a cabra, a ovelha, a égua, o camelo fêmea, a búfala.

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Por produto alimentar, no sentido da presente invenção, entende-se qualquer produto destinado à nutrição humana ou animal. Em particular, os produtos alimentares compreendem produtos destinados à alimentação dos lactentes, das crianças, dos adolescentes e dos adultos. Os produtos alimentares de acordo com a invenção podem conter, no todo ou em parte, pelo menos um produto lácteo fermentado de acordo com a invenção. Os produtos alimentares de acordo com a invenção podem igualmente conter outros ingredientes habitualmente utilizados na indústria agro-alimentar, tais como aditivos, conservantes, frutas ou extratos de frutas, aromatizantes, corantes, agentes de textura, cereais, pedaços de chocolate, etc.

Por fermento, entende-se, no sentido da presente invenção, qualquer composição contendo pelo menos uma cepa viva de microorganismo suscetível de fermentar um meio dado. Dentre os fermentos, os fermentos lácteos são composições contendo pelo menos uma cepa viva de microorganismo suscetível de fermentar um meio lácteo.

De acordo com um modo de realização, a presente invenção refere-se a uma cepa de Lactobacillus helveticus que não tem a capacidade de transformar a lactose em ácido láctico. A presente invenção refere-se igualmente a uma cepa de Lactobacillus helveticus que não tem a capacidade de transformar a lactose em ácido láctico, e que possui pelo menos uma mutação no operão lactose.

De acordo com um modo de realização, a referida mutação no operão lactose é uma mutação pontual introduzindo um códon de terminação (codon stop). De acordo com um modo de realização ainda mais preferencial, a referida mutação pontual introduzindo um códon de terminação está situada no gene lacL do operão lactose. Por mutação pontual, entende-se qualquer substituição de

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7/29 nucleotídeo intervindo na seqüência, em comparação com uma seqüência dita do tipo selvagem. O versado na técnica sabe identificar um códon de terminação (igualmente chamado de códon sem sentido), e que corresponde geralmente em termos de ARNm a um dos tripletos: UAA, UAG, UGA.

Assim, as cepas Lactobacillus helveticus de acordo com a invenção não têm a capacidade de degradar a lactose (não há transformação da lactose em ácido láctico). De fato, as cepas de acordo com a invenção possuem um fenótipo lactose negativa. Por outro lado, elas são capazes de crescer na presença de glicose como fonte de carbono (fermentação da glicose em ácido láctico) e de metabolizar certos componentes do leite, notadamente as proteínas.

Assim, as cepas de acordo com a invenção permitem, vantajosamente, uma fermentação com pH totalmente controlado: o pH final após fermentação é perfeitamente controlado de acordo com a quantidade de glicose inicialmente contida no meio de fermentação. Isto resulta do fato que uma quantidade dada de glicose resulta de maneira quase estequiométrica na mesma quantidade de ácido láctico. Além disso, o emprego das cepas de acordo com a invenção evita qualquer fenômeno de pós-acidificação. Assim, graças às cepas de acordo com a invenção, é possível obter produtos alimentares particularmente satisfatórios no plano organoléptico.

De maneira vantajosa, de acordo com um modo de realização, as cepas de Lactobacillus helveticus de acordo com a invenção são tais que um meio lácteo a 4,0% de proteínas totais contendo 1,0% (p/p) de glicose fermentado pelas referidas cepas de Lactobacillus helveticus durante um tempo máximo de fermentação de 30h, a uma temperatura entre 30 e 45°C, possua um pH superior ou igual a 4,0; preferencialmente superior ou igual a 4,1;

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8/29 preferencialmente superior ou igual a 4,2;

preferencialmente superior ou igual a 4,3;

preferencialmente superior ou igual a 4,5.

Esta vantagem é então particularmente marcada no caso das cepas de Lactobacillus helveticus hiperprodutoras em tripeptideos IPP e/ou VPP: não é, de forma alguma, exigida a escolha de um compromisso entre:

- uma grande produção em tripeptideos no momento da fermentação (necessitando de um tempo de fermentação tão longo quanto possível), e propriedades organolepticamente aceitáveis (necessitando de uma acidificação limitada e, consequentemente, não apenas um tempo de fermentação tão curto quanto possível, a fim de limitar a produção de ácido láctico por fermentação, mas igualmente uma termização/pasteurização a fim de evitar o fenômeno de pósacidificação).

De fato, vantajosamente de acordo com a presente invenção, a produção de tripeptideos VPP e/ou IPP e a produção de ácido láctico são parcialmente desassociadas: a produção de ácido láctico é apenas função da quantidade de glicose inicialmente presente no meio de fermentação, e não mais função do tempo de fermentação.

Um meio de expressar a concentração em tripeptideos de maneira simples consiste em expressar em concentração equivalente VPP [VPPeq].

Ela é expressa em mg/kg: [VPPeq]=[VPP]+(9/5x[IPP])

Assim, de acordo com um modo de realização, as cepas de Lactobacillus helveticus de acordo com a invenção são vantajosamente capazes, por fermentação, de produzir os tripeptideos de seqüência IPP e/ou VPP em uma quantidade de pelo menos 25 mg, preferencialmente pelo menos 30 mg,

Petição 870180138968, de 08/10/2018, pág. 13/48 preferencialmente pelo menos 35 mg, preferencialmente pelo

9/29 menos 4 0 mg, preferencialmente pelo menos 45 mg, preferencialmente pelo menos 50 mg, preferencialmente pelo menos 55 mg, preferencialmente pelo menos 60 mg, preferencialmente pelo menos 65 mg, preferencialmente pelo menos 7 0 mg, preferencialmente pelo menos mg, mais preferencialmente pelo menos 80 mg de VPP produto fermentado. Tais quantidades de VPP eq por kg de e/ou IPP são geralmente obtidas por fermentação por uma cepa de acordo com a invenção a uma temperatura entre 30 e 45°C, preferencialmente entre 31 e 44°C, preferencialmente entre 32 e 43°C, preferencialmente entre 33 e 42°C, preferencialmente entre 34 e 41°C, preferencialmente entre 35 e 40°C, e mais preferencialmente a 37 °C, de um meio lácteo contendo uma quantidade de glicose superior a 3% (p/p) e com um teor total em proteínas superior ou igual a 2% (p/p), preferencialmente entre 2 e 10% (p/p)_r mais preferencialmente entre 2,5 e 6% (p/p) e ainda mais preferencialmente igual a 4% (p/p).

De acordo com um modo de realização, as cepas de Lactobacillus helveticus de acordo com a invenção possuem adicionalmente um fenótipo frutose negativa. A combinação dos fenótipos lactose negativa e frutose negativa é particularmente vantajosa.

De fato, a frutose tem um grande poder adoçante, e é um ingrediente útil nos produtos alimentares. Assim, se a frutose não pode ser degradada pela cepa de Lactobacillus helveticus, o produto alimentar conserva excelentes propriedades organolépticas. Além disso, uma cepa ao mesmo tempo lactose negativa e frutose negativa só poderá germinar em um meio contendo glicose. Assim, o pH final será vantajosamente melhor controlado no caso onde o

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10/29 produto alimentar contém uma preparação de fruta (s), notadamente pedaços e/ou sucos de fruta(s).

De acordo com um modo de realização, a cepa de acordo com a invenção é escolhida dentre:

1-3504 depositada na CNCM em 14/10/05;

1-3505 depositada na CNCM em 14/10/05;

1-3508 depositada na CNCM em 14/10/05;

e as cepas variantes ou mutantes destas.

De acordo com um outro modo de realização, a presente invenção refere-se à utilização de uma cepa de Lactobacillus helveticus de acordo com a invenção, para a preparação de um produto alimentar ou farmacêutico, notadamente de um produto lácteo fermentado.

De maneira vantajosa, de acordo com um aspecto da invenção, o referido produto alimentar ou farmacêutico possui propriedades anti-hipertensivas.

A presente invenção refere-se igualmente a um produto alimentar, notadamente produto lácteo fermentado, compreendendo pelo menos uma cepa de Lactobacillus helveticus de acordo com a invenção.

De maneira vantajosa, de acordo com um modo de realização, o referido produto alimentar contém pelo menos 10⁶, preferencialmente pelo menos 10⁷, preferencialmente pelo menos 10⁸ UFC/mL de bactérias Lactobacillus helveticus vivas. Assim, o produto alimentar de acordo com a invenção contém uma grande biomassa.

De acordo com um modo de realização, o referido produto alimentar contém pelo menos 25 mg, preferencialmente pelo menos 30 mg, preferencialmente pelo menos 35 mg, preferencialmente pelo menos 40 mg, preferencialmente pelo menos 45 mg, preferencialmente pelo menos 50 mg, preferencialmente pelo menos 55 mg, preferencialmente pelo menos 60 mg, preferencialmente pelo

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11/29 menos 65 mg, preferencialmente pelo menos 7 0 mg, preferencialmente pelo menos 75 mg, mais preferencialmente pelo menos 80 mg de VPPeq por kg de produto alimentar.

De acordo com um modo de realização, o produto alimentício de acordo com a invenção compreende adicionalmente preparações de fruta(s), notadamente pedaços e/ou sucos de fruta(s).

De acordo com um modo de realização, o produto alimentício de acordo com a invenção possui um pH superior ou igual a 3,85; preferencialmente superior ou igual a

3,90; preferencialmente superior	ou igual	a	3,95;
preferencialmente	superior	ou	igual	a	4,00;
preferencialmente	superior	ou	igual	a	4,05;
preferencialmente	superior	ou	igual	a	4,10;
preferencialmente	superior	ou igual a 4	,15;	mais
preferencialmente	superior ou	igual a	4,20.
Vantajosamente de	acordo	com um	modo de

realização, o produto alimentício de acordo com a invenção possui propriedades anti-hipertensivas.

De acordo com um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um processo de preparação de um produto alimentício.

De acordo com um modo de realização, o referido processo compreende as seguintes etapas:

- selecionar uma matéria-prima contendo proteínas de leite, notadamente proteínas contendo as seqüências peptidicas IPP e/ou VPP. Isto pode, por exemplo, ser do leite contendo 2-10% (p/p) de proteínas totais.

- selecionar pelo menos uma cepa de Lactobacillus helveticus de acordo com a invenção, inocular a referida matéria-prima com a referida cepa;

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- fermentar a referida matéria-prima em presença de 1-3% (p/p) de glicose durante 12-30 horas a 30-45°C, e em presença da referida cepa.

De acordo com um modo de realização, o processo de acordo com a invenção é vantajosamente desprovido de qualquer etapa de termização após a fermentação. Isto permite conservar bactérias vivas no produto alimentício (probiótico).

De acordo com um modo de realização, a presente invenção refere-se a uma utilização de estreptozotocina para a obtenção de cepas Lactobacillus helveticus possuindo um fenótipo lactose negativa.

A presente invenção fornece igualmente um processo de obtenção de tais cepas de Lactobacillus helveticus.

De acordo com um modo de realização, o referido processo de obtenção de cepas Lactobacillus helveticus possuindo um fenótipo lactose negativa, compreende as seguintes etapas:

- fornecer pelo menos uma cepa de Lactobacillus helveticus;

- colocar em contato a referida pelo menos uma cepa com uma quantidade eficaz de estreptozotocina em presença de lactose;

- isolar a ou as colônias de fenótipo lactose negativa.

A população de células de Lactobacillus helveticus capaz de sobreviver em presença de estreptozotocina é, de fato, vantajosamente extremamente enriquecida em células lactose negativa.

De acordo com um modo de realização, uma etapa de teste colorimétrico em um meio contendo Xgal e/ou Sgal e/ou qualquer outro composto ligado por uma ligação BPetição 870180138968, de 08/10/2018, pág. 17/48

13/29 galactosídica à galactose e que se torna localizável após a ruptura desta ligação pelo microorganismo, é acrescentada ao referido processo de obtenção das cepas de acordo com a invenção. O IPTG pode ser igualmente acrescentado para realizar este teste uma vez que este composto agirá como um indutor do transportador da lactose ou como um indutor da utilização da lactose pelo microorganismo.

A título de exemplo, o referido processo pode ser conduzido da seguinte maneira:

Primeira repicagem das cepas Lactobacillus helveticus iniciais (cepas mães), em caldo MRS (Man Rogosa Sharp) neutro, à noite, a 35-40°C;

Segunda repicagem em MRS neutro.

Incubação até a obtenção de uma biomassa suficiente, por exemplo, 10-30h, a 35-40°C.

Inoculação de MRS contendo uma concentração de lactose permitindo obter uma biomassa suficiente, por exemplo, 2-7% (p/p); incubação com acompanhamento da DO a

580 nm.

A estreptozotocina é preparada extemporaneamente, e é acrescentada no curso da fermentação, de forma a ter uma concentração final que seja bactericida para a cepa considerada. Esta concentração é dependente de cepa.

- Após a incubação a 35-40°C, as culturas são lavadas duas vezes com triptona sal.

- Os resíduos são recuperados na triptona sal, em seguida, caldos de MRS neutros são recolocados em cultura.

Incubação a 35-40°C, até que se tenha um crescimento da cepa.

- Isolamentos são, em seguida, realizados no MRS neutro + Xgal + IPTG, em seguida incubados a 35-40°C sob CO2. Esta etapa é um teste colorimétrico que permite

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14/29 determinar se uma cepa bacteriana é lactose positiva ou lactose negativa: Se a cepa for capaz de utilizar a lactose como fonte de carbono, haverá produção de uma substância azul, a colônia será, consequentemente, azul e no caso contrário (cepa lactose negativa), ela será branca.

- As colônias brancas são repicadas em MRS neutro e incubadas a 35-40°C.

A invenção será adicionalmente descrita com o auxílio dos exemplos a seguir, os quais são não limitativos.

EXEMPLOS DE REALIZAÇÃO

EXEMPLO 1: Obtenção de cepas possuindo um fenótipo lactose negativa

Material e métodos

Cepas iniciais (cepas ditas mães)

1-3431	depositada	na	CNCM	em	25/05/05
1-3434	depositada	na	CNCM	em	25/05/05
1-3435	depositada	na	CNCM	em	25/05/05

Teste de sensibilidade à estreptozotocina

Em um primeiro momento, é verificado que as cepas mães são sensíveis ao antibiótico utilizado, a estreptozotocina. A densidade óptica (DO) a 580 nm é realizada em culturas a 42 °C em caldo MRS (Man Rogosa Sharp) neutro. Quando esta atinge 0,1, a estreptozotocina é acrescentada em um tubo a fim de se ter 50 pg/mL ao final (por exemplo, 100 μΐ de uma solução a 5 mg/ml por 10 ml de meio).

Seleção de cepas lactose negativa

As etapas a seguir são realizadas a fim de se obter cepas Lactobacillus helveticus lactose negativa:

Primeira repicagem das cepas Lactobacillus helveticus iniciais (cepas mães) a partir das cúpulas do estoque de trabalho, em caldo MRS neutro, à noite, a 37°C.

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- Segunda repicagem a 1% em MRS neutro.

- Incubação, 16h, a 37°C.

Inoculação de 10 ml de MRS a 5% (p/p) de lactose, a 1% e incubação a 40 °C com acompanhamento da DO a 580 nm.

A estreptozotocina é preparada extemporaneamente, e é acrescentada ao final de 2hl5 ou de 4h de fermentação, de forma a ter uma concentração final de 50 pg/ml.

- Após as 7h30 de incubação a 40°C, as culturas são lavadas duas vezes com triptona sal.

- Os resíduos são recuperados em 2 ml de triptona sal, em seguida, caldos de MRS neutros são inoculados a 10%.

Incubação a 37 °C, até que se tenha um crescimento da cepa.

- Isolamentos são, em seguida, realizados em MRS neutro + Xgal + IPTG, em seguida incubados a 37 °C sob CO₂. Esta etapa é um teste colorimétrico que permite determinar se uma cepa bacteriana é lactose positiva ou lactose negativa: Se a cepa for capaz de utilizar a lactose como fonte de carbono, há uma produção de uma substância azul, a colônia será, consequentemente, azul e no caso contrário (cepa lactose negativa), ela será branca.

- As colônias brancas são repicadas em MRS neutro e incubadas a 37°C.

Resultados

Este procedimento permitiu obter as cepas vivas, possuindo um fenótipo lactose negativa que, em seguida, foram o objeto de depósitos junto à CNCM (Coleção Nacional de Culturas de Microorganismos) , rua du Docteur Roux n°28, 75724 Paris, França, em conformidade com as disposições do Tratado de Budapeste:

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1-3504 depositada	na	CNCM	em	14/10/05;
proveniente da cepa mãe 1-3431
1-3505 depositada	na	CNCM	em	14/10/05;
proveniente da cepa mãe 1-3434
1-3508 depositada	na	CNCM	em	14/10/05;

proveniente da cepa mãe 1-3435

O fenótipo lactose negativa das cepas obtidas é de novo confirmado em um meio gelose de MRS neutro + Xgal + IPTG (teste de coloração dito branco/azul).

EXEMPLO 2: Cepas possuindo um fenótipo Lactose negativa

A cepa 1-3504, depositada em 14/10/05 junto à CNCM (Coleção Nacional de Culturas de Microorganismos), rua du Docteur Roux n°28, 75724 Paris, França, em conformidade com as disposições do Tratado de Budapeste, é uma cepa de Lactobacillus helveticus possuindo as seguintes propriedades:

- Lactose negativa; Frutose negativa

- produção de IPP e VPP: vide Figuras 4 e 5

- propriedades de acidificação: vide figura 1

- inibição da ACE: vide Figura 6

A cepa 1-3505, depositada em 14/10/05 junto à CNCM (Coleção Nacional de Culturas de Microorganismos), rua du Docteur Roux n°28, 75724 Paris, França, em conformidade com as disposições do Tratado de Budapeste, é uma cepa de Lactobacillus helveticus possuindo as seguintes propriedades:

- Lactose negativa; Frutose negativa

- produção de IPP e VPP: vide Figura 5

- propriedades de acidificação: vide figura 2

A cepa 1-3508, depositada em 14/10/05 junto à CNCM (Coleção Nacional de Culturas de Microorganismos), rua du Docteur Roux n°28, 75724 Paris, França, em conformidade

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17/29 com as disposições do Tratado de Budapeste, é uma cepa de

Lactobacillus helveticus possuindo as seguintes propriedades:

- Lactose negativa; Frutose negativa

- produção de IPP e VPP: vide Figura 5

- propriedades de acidificação: vide figura 3

1. Medida das propriedades de acidificação das diferentes cepas variantes

As propriedades de acidificação são avaliadas como a seguir:

Um meio contendo 12Og de leite em pó desnatado (PLE) em 930ml de água é pasteurizado 10 min a 95°C. Este meio é inoculado a 0,5%, em seguida submetido à fermentação a 37°C em presença de diferentes concentrações de glicose. (A abreviação Gx indica uma concentração de x% (p/p) de glicose no meio antes da fermentação). O pH é então controlado em função do tempo, para diferentes cepas. Uma extração de meio fermentado efetuada a 30h de fermentação será utilizada para as medidas de produção dos tripeptídeos

IPP e VPP, assim como para as medidas de atividade ACEI cujos resultados serão indicados abaixo.

Para	1-3504,	são apresentados	também os
resultados da	cepa mãe	(1-3431, cepa lactose	positiva).
(vide figura 1)
Para	1-3505,	são apresentados	também os
resultados da	cepa mãe	(1-3434, cepa lactose	positiva).
(vide figura 2)
Para	1-3508,	são apresentados	também os
resultados da	cepa mãe	(1-3435, cepa lactose	positiva).
(vide figura 3)

Os resultados apresentados nas figuras 1 a 3 demonstram que as cepas de acordo com a invenção permitem vantajosamente controlar finamente o pH ao fim da

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18/29 fermentação de acordo com a quantidade de glicose inicialmente presente no meio. Por outro lado, a fermentação por cepas lactose negativa conduz vantajosamente a valores de pH elevados, que darão produtos alimentares organolepticamente aceitáveis.

2. Medida da produção dos tripeptideos IPP e VPP

Material e método

Uma amostra de meio lácteo extraída em 30 horas de fermentação, tal como descrito precedentemente no ponto 1, é utilizada para fazer esta medida.

A análise do conteúdo em peptídeos, notadamente o teor em tripeptideos IPP e VPP, é conduzida com um método de cromatografia líquida CLHP associada a um sensor do tipo MS/MS como descrito a seguir:

- Devido às interferências inerentes à análise de amostras complexas, o uso de padrões internos deuterados acrescentados em quantidade conhecida e controlada no momento da preparação da amostra é fortemente aconselhado.

- A preparação da amostra é feita por diluição do meio fermentado em uma mistura de água, de metanol e de ácido trifluoroacético (50/50/0,1%), contendo 25 ppm de padrão interno VPP deuterado (referido, a seguir, como VPPd, de fórmula H-Val [D8]-Pro-Pro-OH, MM = 319,45 g/mol, disponível junto à sociedade Bachem Chemicals, França) e 10 ppm de padrão interno deuterado (referido, a seguir, como IPPd, de fórmula H-Ile [D10N15]-Pro-Pro-OH, MM = 336,2 g/mol, disponível junto à sociedade NEOMPS, Groupe SNPE, rua de Boulogne n°7, 67100 Strasbourg, França) em uma relação de 1 para 3 (por exemplo, pesagem precisa em um eppendorf de 600 mg de amostra em 1200 mg de mistura águametanol-TFA contendo os padrões internos).

Esta amostra diluída é, em seguida, centrifugada a 14000g durante 15 minutos. O sobrenadante

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19/29 claro obtido, contendo os peptídeos gerados durante a fermentação, é, em seguida, diluído precisamente ao 1/50 em uma mistura de água-metanol (50/50, v/v) contendo 0,1% de ácido trifluoroacético.

- A solução diluída assim obtida é, em seguida, analisada em um sistema cromatográfico CLHP do tipo Agilent 1100 (sociedade Agilent Technologies France, rua Galvani n°l 91745 Massy cedex, França), equipado de uma colônia adaptada para a análise dos peptídeos, do tipo Waters Biosuite® (3mm 2,1 x 150mm, C18 PA-A, WAT186002427, Waters France, rua Jacques Monod n°5, 78280 Guyancourt) à temperatura de 50°C, vazão de 0,25 ml/min. Os peptídeos são eluídos de forma clássica com um gradiente crescente de solvente B (Acetonitrila + 0,100% de ácido fórmico) no solvente A (Água + 0,106% de ácido fórmico), em uma duração de 35 min a 2 horas em função da resolução cromatográfica desejada. 0 método adaptado à dosagem dos peptídeos IPP e VPP utiliza o seguinte gradiente:

Tempo	% Tampão A	% Tampão B
0	100	0
3	96	4
6	89	11
15	60	40
18	0	100
21	100	0
24	0	100
27,5	100	0
35	100	0

- A detecção é feita com o auxílio de um detector específico do tipo MS/MS, por exemplo, com um aparelho com porta iônica como o Esquire3000+ (Bruker Daltonique, rua de 1'Industrie, 67166 Wissembourg Cedex), parametrízado em

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20/29 ionização por eletrospray no modo positivo, seja para a análise global do conteúdo peptidico (modo MS-MS) , seja para a quantificação precisa e específica de um peptídeo a partir de seus fragmentos característicos (modo MRM) . No caso da dosagem dos peptídeos IPP e VPP, mas também dos padrões internos IPPd e VPPd, esses peptídeos são isolados a partir de sua massa específica (íons monocarregados 312,2 Da para VPP; 326,2 Da para IPP; 320,2 Da para VPPd; 337,3 Da para IPPd) e quantificados a partir da intensidade de seus íons específicos após a fragmentação (fragmentos >= 85 Da) .

A integração dos picos cromatográficos de cada um dos peptídeos IPP, VPP e a comparação nas superfícies de pico dos padrões internos de concentrações conhecidas IPPd e VPPd permite, em seguida, calcular, por regressão linear simples, o teor inicial da amostra em VPP e IPP (geralmente expresso em mg/kg ou ppm).

Resultados

	VPPeq (mg/kg de meio fermentado)
Calpis CM4	51
CNRZ 244	57

1-3504 (com 2% (p/p) de glicose)	80

A figura 4 mostra uma comparação da produção em tripeptídeos IPP e VPP da cepa 1-3504 (2% (p/p) de glicose são acrescentados ao meio) em relação a duas cepas da técnica anterior.

A cepa CM4 da sociedade CALPIS é descrita na patente EP 1 016 709 enquanto que a cepa CNRZ 244 é descrita no pedido de patente WO 2004/060073.

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É claro nesta figura que a cepa 1-3504 (cepa de acordo com a invenção) possui uma produção de tripeptideos

IPP e VPP bem superior àquelas duas cepas precedentes nas mesmas condições.

A figura 5 mostra uma comparação da produção em tripeptideos IPP e VPP das cepas de acordo com a invenção entre si.

3. Medida da atividade ACEI (Inibição da Enzima de Conversão da Angiotensina)

Material e método

Uma amostra de meio lácteo extraída depois de 30 horas de fermentação, tal como descrito precedentemente no ponto 1, é utilizada para fazer esta medida. O presente método tem como base o método de Cushman e Cheng (Cushman e outros Biochem. Pharmacol. 1871. 20:1637), adaptado para torná-lo compatível com amostras do tipo produtos lácteos fermentados.

1. Preparação dos reativos e das soluções

1.1 Tampão borato de sódio 0,1M pH 8,3, adicionado de 0,3M de NaCl

Pesar 6, 1843 g de H3BO3 (Cario Erba ref: 402 7 66) . Dissolver em aproximadamente 800 ml de água desmineralizada, ajustar ao pH 8,3 com uma solução de NaOH, em seguida acrescentar 12,0 g de NaCl (concentração final 0,3M) e completar em 1 litro com a água desmineralizada.

1.2 Preparação do substrato HHL: solução de Hip-His-Leu a 5mM em um tampão de borato de sódio 0,lM pH

8,3 com 0,3M de NaCl

Pesar exatamente 42,95 mg de peptídeo HHL anidro (N-Hipuril-Histidil-Leucina tetrahidrato PM: 501,5 g, Sigma-Aldrich ref: 53285-250 mg) e dissolver em aproximadamente 15 mL de tampão de borato de sódio 0,lM pH

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8,3 com 0,3M de NaCI, depois completar em 20 mL com este mesmo tampão.

1.3 Preparação da solução de ACE a 0,1 U/mL

A enzima de conversão da angiotensina sob a forma de pó liofilizado (origem: pulmões de coelho, Sigma-Aldrich ref. A6778, 0,25 unidades) é solubilizada em 2,5 mL de tampão de borato de sódio 0,lM pH 8,3 para obter uma solução a 0,1 U/mL. A solução assim preparada deve ser utilizada, armazenada a 4°C, até no máximo 2 semanas para preservar uma atividade enzimática suficiente.

2. Preparação das amostras de leite fermentado

É necessário acondicionar a amostra a um pH compreendido entre 8,0 e 8,5 de forma a ficar próximo do pH ótimo da ACE. O leite fermentado é primeiramente centrifugado, o pH do sobrenadante é, em seguida, ajustado entre 8,0 e 8,5 (idealmente pH 8,3), depois ultrafiltrado com o auxilio da unidade de filtração Vivaspin com um limiar de divagem de 10000 Daltons (Vivascience, França) a fim de eliminar os elementos interferentes (proteínas inteiras, sais de cálcio).

O protocolo completo é o seguinte:

- Depositar cerca de 6 mL de leite fermentado em um tubo tipo falcon de 15 mL após ter previamente pesado o tubo vazio. Pesar a quantidade de leite fermentado depositada no tubo.

- Centrifugar em 14000 g durante 10 min a 10°C.

- Recuperar o sobrenadante.

- Quantificar a proporção resíduo/sobrenadante, o que permite, se necessário, determinar o IC50 equivalente ao produto de origem e não a seu único sobrenadante.

- Extrair 2,0 mL de sobrenadante em um tubo de ensaio e medir o pH.

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- Acrescentar o volume necessário de NaOH 2M a fim de obter um pH compreendido entre 8,0 e 8,5 (alvo: 8,3) após o acréscimo do tampão de borato, e depois agitar.

- Acrescentar o volume necessário de tampão de borato para diluir o sobrenadante inicial a 1/2 levando em conta o volume exato de NaOH acrescentado (por exemplo: amostra de ensaio de sobrenadante = 2 mL + 250 pL NaOH + 1,75 mL tampão borato).

Verificar que o pH final está compreendido entre 8,0 e 8,5. Mais à frente, recomeçar acrescentando mais ou menos NaOH. Um precipitado é formado: ele é devido aos sais de cálcio.

- Ultracentrifugar a amostra em 12000 g durante 15 min a 10 °C com o auxílio de unidades de filtração Vivaspin 10000 Daltons (capacidade 4-6 mL) a fim de obter uma amostra límpida.

3. Medida da inibição da ACE pelas amostras de leites fermentados

A cada série de análise, testes de controle (0 e 100% atividade ACE) devem ser preparados. Para cada amostra, dois ensaios independentes e um branco são realizados para cada diluição. Deve-se, na verdade, ajustar ao máximo (diluindo) a quantidade de amostra necessária para diminuir de 50% a atividade da ACE.

Para isto:

- Depositar 80 pL da amostra condicionada a um pH

8,3 no tubo branco e nos tubos de ensaio.

- Depositar 80 pL de água desmineralizada nos tubos de controle 0 e 100%.

- Acrescentar 200 pL da solução de substrato HHL a 5mM em todos os tubos. Agitar.

Colocar os tubos em um banho de água termostatado a 37°C, deixar se equilibrar na temperatura.

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- Desencadear a reação enzimática por acréscimo, em cada tubo, de 20 pL da solução de ACE a 0,lU/mL, salvo para os brancos e controle 0% para as quais se deve depositar 20 pL de tampão borato pH 8,3.

- Deixar hidrolisar durante lh exatamente a 37°C.

Interromper a reação acrescentando, em cada tubo, 250 pL da solução de HC1 1M.

Tabela recapitulativa da composição dos diferentes meios reacionais:

	Amostra de ensaio	Acréscimo do substrato	Desencadeamento hidrólise
100% controle	80 pL água desmineralizada	200 pL HHL	20 pL ACE
0% controle	80 pL água desmineralizada	200 pL HHL	2 0 pL tampão borato
Amostra (ensaio)	80 pL amostra	200 pL HHL	20 pL ACE
Amostra branca	80 pL amostra	200 pL HHL	2 0 pL tampão borato

A leitura é feita por extração do substrato hidrolisado (ácido hipúrico) e sua quantificação com o auxílio de um espectrofotômetro, com o seguinte protocolo:

Acrescentar, em cada tubo,	1,7 mL acetato	de
etila, agitar.
Centrifugar a 2000 g durante	5 min a 10°C.
Extrair 1 mL exatamente do	sobrenadante em	um
microtubo eppendorf.
Evaporar o acetato de etila	a 120°C durante	10

min em um bloco aquecedor.

Acrescentar exatamente 1 mL de água desmineralizada, depois agitar 10 seg para retomar o ácido hipúrico.

Ler a absorvância a 22 8 nm em cubas adaptadas à leitura em UV.

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Expressão dos resultados:

A porcentagem de inibição da ACE é calculada como a seguir:

(Abs 100% ctl - Abs 0% ctl)-(Abs am - Abs am branca) x 100 (Abs 100% ctl - Abs 0% ctl) com Abs = absorvância a 228 nm após a extração do ácido hipúrico ctl = controle am = amostra

Para um leite fermentado, expressamos o IC50 como sendo a quantidade de sobrenadante deste leite fermentado que inibe 50% da atividade enzimática da ACE no meio reacional, seja em microlitros de sobrenadante de leite fermentado por mililitro de meio reacional.

Resultados

A figura 6 mostra uma comparação da atividade inibitória da enzima de conversão da angiotensina das diferentes cepas de acordo com a presente invenção com a de outras cepas da técnica anterior.

Na ordenada é expressa a concentração equivalente de leite fermentado por ml de meio reacional necessária para inibir 50% da atividade da enzima de conversão da angiotensina (IC50). Quanto mais elevada for esta concentração, menos capacidade tem, consequentemente, a cepa de inibir a enzima de conversão da angiotensina.

EXEMPLO 3: preparação de um produto lácteo (probiótico) de acordo com a invenção

Um produto lácteo fermentado é obtido como indicado abaixo.

Leite de grande mistura, previamente desnatado, pré-pasteurizado e resfriado a 4°C é padronizado em proteínas (4,0%) com leite em pó desnatado e adicionado com

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26/29 glicose a uma razão de 1,8% (p/p) . O meio lácteo então preparado é submetido a uma pasteurização (95°C - 8 min). Após o resfriamento a 37 °C, o meio lácteo é inoculado com uma cepa de acordo com a presente invenção a uma razão de 10⁷ UFC/mL e mantido a 37 °C durante toda a duração da fermentação. Quando o pH 3,8 é alcançado, a coalhada é retirada da cuba de fermentação para sofrer filtração (lissage) (por passagem através de um filtro) e resfriada até 10°C em um permutador de placa. A coalhada filtrada e resfriada é, em seguida, adicionada de uma preparação de frutas (tendo um pH entre 4 e 4,1) a uma razão de 15% do produto final, acondicionada em frascos de 110 mL e estocada a 4°C durante 28 dias.

O produto assim preparado contém tripeptídeos de seqüência IPP/VPP a uma razão de 65 mg/kg de equivalente em VPP. O teor em peptídeos do produto é vantajosamente estável durante toda a duração de vida do produto. A diminuição de pH no curso da estocagem refrigerada é vantajosamente desprezível (inferior a 0,1 unidade) e a população das cepas de acordo com a invenção permanece vantajosamente compreendida entre 10⁷ e 10⁸ UFC/mL.

EXEMPLO 4: Identificação de mutações pontuais sem sentido no operão lactose de cepas de acordo com a invenção

A partir das seqüências dos operões lactose das cepas DPC4571 e ATCC15009 disponíveis no genbank, oligonucleotídeos (percursores) foram escolhidos em genes que pareciam estar mais conservados. Esses oligonucleotídeos permitiram realizar uma PCR de longa faixa, depois de começar a seqüenciação do operão lactose de acordo com a invenção. A seqüenciação foi, em seguida, praticada passo a passo, isto é, em função das seqüências obtidas, outros percursores serviram para novas reações de seqüência.

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ΊΊ/Ί^

Uma mutação sem sentido foi identificada na cepa

1-3504 em relação à cepa mãe 1-3431: no sentido 5'-3', uma base de citosina é substituída por uma Timina, o que faz aparecer um códon de terminação com 1320 pares de bases do 5 códon de iniciação do gene lacL (que faz cerca de 1900 pbs) codificador para a β-galactosidase.

Fora esta mutação, os operões lactose das duas cepas 1-3431 e 1-3504 são idênticos.

Seqüência do operão lactose da cepa 1-3431 10 (mutação delimitada) aaatgaaaattcatgatctaactctggattaatgtgataagcgctttcaacatcagtgccccagctgtcaattcctccaacgccgcg aactgcacctgcaattactaacacggttctgcgaacaagtggtagttcttcaatgttagtagcgttctGaagctcctcagcagtata aggcaaacaactga aatta aa tggttt ttctgcttgttg aattgagagactgaacttttcatttgtacgatctacattatttt g tgtggtttc acgattaatggttaacttctíagíttgcatgtgcattccattttcctgcggaacúaaatactcggtaactggcaaaccatcgatatgga atttaccttcttta gctccagccattctatcaggataagtttcaccggataaaccttcata atcaaa tcctgtagcagccgttggca Éa atcaatcgaataccaattacaggcaggggtggtaatcccttcttaccataataacgcattgtaaccttaatgtgaccgacatcatc aatattatagatgatttttgcatttgttgcaggagtagttaaagtttgataggtaaatgaaatttcagcacttttlgcatactcgtgattgct aaatttgttgttaaagggtgcaataggcagtícggcaaagtcatgtctgtctacttttaaatggatatcagtacantagtaaacatat cagctccgagccattgagctgcçtttagattaaatccactgcctcggtcgttatctgtagttgctcgccaaaaagtaggagtaggta cacgataaagccattccttgccgtgtacttttaacgattcaagtccgccgcgttcataactaaagatgtattgaaaatctttgccatta acgccaaatgtggcatccccataaatgatatgcaattgattatttgtgtaatccataatagtatctcacttcctgcatagctggttttggt ttÈctatctgcgaacattaaaccatcgccagaaaattcataatctgaatgacgatcatcaaaattgccgccataacgcaaaacat catgtccactaatttcatcatgaaccaataatgcctgatcgataaagtcccagataaatccaccgaagtattgagggtatttatcaa gtaatttgaíatatgaatccatgccgccgttagaattgcccatgtcatgcatatattcgúattccataaatggctttggtggatcattttg caagtattGttcaacctttttaggtgg1aaatacatacagctttcaacatctgaaattttatcttttaattcgggacggtgcactacgccít catagtgaactaagcgtgtatcatcgtgagatttgtaaaattcattçattgcgatgatgttgtctccagcataggattcgttgccaagt gaccaaaagagaatagaggtgtgattcttga aa gtctcgtag ttattgcgtgctcgatcaatcactgcttctttc^attgcg g a atcg aacctggtacattgtcagaaggttcaatctctcccattttttgccaagtaccatgtgattcaaggttattctcggccatgacataaatg ccattttgatcgcaaagataataccacggaatttggtttgggtagtgacatgttctaacagcaltaatattattt(ctttaaaagtattaa tgtcagttgtcatatca ctcattgttatg ctgcgaccacg ttttgcatcccattcatgtcggttaaGtccattgataaftaa a cgcttgcca tttaacaaaacaactttttctggactaatttcaattctcctaaagccaaattggaaaggaatcagctctagcaagttttgttgttcatca taaacttcaattagaagGtgataaagatatggatcatggttattoGaaagatgcacgttítcgaatttttcattattaatttgaacgttGtc tttgatatettcattttt€tccsgaagagtatgt€Ccttaatatctttgactaataaatgga3tgaacGggattttttaccaataaaatgaa gGttaaggttgaagatgccatcttgataattatctgcaactcigtggtttcaaatccatgtccattaagtgggtagcggggatacctag tagttcaadgagcggaagatgccagagaagcggaacatgtcttggtettctagccaagâtgcagtactgtgtttaaaaacttcta ctgctaaaagattatctttttcttgaatatatggcgttaaatcaaaWctgaaggagtaaagctgtcitccgcatagccGacaaaatg cccgtttaaccatacatacattgctttttogacgccttcaaatttaatatgaacatcttttccaattaaggctgagcttaaalcaaatcg cttcaagtatgaaccgactgtgttatctgcgccttkjctaaatgagccttcltGatgatcaltaggatctaaagcgtaagGtgggcçig cggaagattttgcGttcccaaggaaggaggacattaatatattgattttgagtatagtlgGtcaattcgatttcacttggaactgggat cgaatcaaaatttgaagaatcaaaalcacgctgataaaaatcttglggacgatccataggattagcggaaaaatgaaatttacat tttccatttaaaGtttgttgatagGtactgtgttgcttttgccâCtegcgataatctctaaaaaagggatgateactgtgtgcgggcaiatt gatk|accctgaatacctcaggat.tatctagccaattgatatttgcttgcataatatgacctcatttctattaaaatatatttcgaaagc gcltttattatagcatgtaaataaacaatttattagtattagtaaagaatttatttacaatatttaataagatttacttgctataaagactg aataGatgcagalaatagaacíitttatttattggaatttagtaaatattttgtataataaagaaagagaatttataaaaatagaaaag aaataaLtaEgagaacaattaaagaaattgcgDtggaatcaggctaitctccagcgaGagtatcscgtUattaaataatgatGcta atttgtctattactgcagatawaaaaataagattttiggagattgctaataaaltgggctattgggaagatcatcaagaaaagaaa atuaagcGcacaattgctttactttatcgagtaaâtcataaggaacaattgCaggatgagtatttGaGttcgttgaaacaagGatta gtttcaactgtagagcgagatgcgctgaagatgaaaaacttttatgacatagaagatttaatcaagaacgcttctttgttccaagga tttatlggsglaggggcggagcca attgaaa acgcecagttggttaagctgeataaagttttgcctaatg gtgtttttgtlgataccaa

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28/29 tccagctaccgaattalttgatteaaticgccctaatctgcctcttacggttaaaaatgctattgatttgtttatcaaaaatggcatteac aagatcggttttatcggtggc!gttggccctaagoatgaccatattcaggaaaaagatngcgttcaattacttttgttga3tacat0aa aactagaggcatggatacÈaaatggacatgcgttgaaggacGggttagGgttgaaaatggttataaattgggaaaaalggttttg gcíaaatacaaaaatgatLtacctgaagcatttltaatlgcatctgatactttagccgttggcgttttacaagcctttaacgaagaaaa GglaaatgtacGaaaagataGtaag3tcüaagtattaataatagcaatgtggttaagtatgtttcaccaGcaGtttGttcgttGaaca ttaateaacaagaaatgattgatatggcacrtgatactttgactcatttgattattGatccagategaccaaagattgatatccggatg aacactaatttggtagtacgaaaaagcttGgttcccGaagaaaagtaaattttttagtaaaaaaatattttttgatagaaaataaaa aagagaatgtgaaGagctcacattctetttttatttacttagttaacaaaggagcgtatatgactttcatgcaaacgattgcagagatt cattggggaggaaygaaaaagatgaalaatcataaaatctcagyaaagcíiagtcâtttcctatgcgtccttttgútggggaatH aggatacgcagctttttatggcgtaatgagtacgtattttattatttttatcactagtgccatgtttacag ga ctag atcattGagttgcag ataagttaattggcttaattactgcattgatagttttagtaagaaaltgtagagttagÈaattgatGcagtgttggggaacatcgttgat aatacb8aacaaggtgaggcaagtHaagcct(ggatctttaítgg3acggtagctagtgcegcatt3ctgetaattctctttactg gtâttttcggcttggcacataagagttggattcttlttgca attttatttgtaatcatttatatcggttNgacgttttttattccttatcagatgg ggcatggttccagccttaagtgaggattcacacgcacgtggtatttatactgctttggggactttttcaggtgcaattggttggaacg gactaactatcattgttgtgccactggttaccggtgtaaGttatgcaatgactggcaagcatgaagaaggggctGctggttggtttg GctUgcggcggttalttcagccttagGtattct(tgtgcaGtaatcgtatgtttaggaactaatgaaaaaiGataatttaattagaaattct gccaagta aaaaaGaactttag gtcaagtattlggggcaa Lttcacataatgatcagattttaiagccaagtttggcttatttgatgttc tGattggctaatgtaattac3aatggggtaatgttttatctgtacaaattGgtgattaataaaccaaatgacttctgggttgttggtgtGa ttgGcacattaatcgttttttgcattagtCCattgtttccaattttaaataaatatattccaagaaaatggctatttattggcggtoaaatttg tatgattÉtggcatacgggttgttcattttcggtcgcaataacgtcattttaatggatttagggttagctctafttaatatcaactttgctcaa ttagtaactgttttaacattaactgatgccafcgaatatggtcagctgaaaagtggtcagsgaaatgaagccgtcgtUtsgctgttc gaGCaatgg!cgataaaLttaccggtgctalttcaaacgcgc4aotaggatatgtagcaatÊgcggcaggcatgaetggttcagG aactgcagcagatagacaagtcacgatattagcattttcaaiattatggGtttatatgtgG<;attaattttggcagtttÍagctattatcat ttttataagca aggtaadttatctgaaaagaaacacgctca agtggttgaagaa ttaaagagGaaacttgcacaâggg aagat cgaagatggcaatttacctgcagcaaatttaaagtcgactgccat.üatgcacctgcagatggtaaattaatgaGtatgíctgaagt aatcgatgaaaatggc3aaacatttcctggtaaaggctttgGaatcgatccaagcaglgggcaaatttttgccacatttgatggta aaattaagtttacctítggtaccaagcatgcgtttgaaattgtaactgaaaatggtcfgcaagttatagttcacgttggtcttggcaca gttaatttgcgtggtgaaggatttga gtcatattatga tgatggacaaattgttaaaaaaggtgaactgcta ttagaatctgaccgtg atttagcactaaaaa3tggttataaagatacgatagtaattÜGtatactcaaGGtggtag3gtagaaaaaatgagtaaaatttcgg caggteaagltgttgaacatggtGaaaaggtggltgaagtgaagtttaagLagaggaaactgalgtaagcataaatttacitattga tttacatgtataaaaaagaatgacttttagtgttaagtaaac[ttttggt3aagaaaaaattttataagcGÜttttttaaaaaaagaatg acgtaaataagcctLttcittaaatatttatacttagtaaatagcUagtaaatctaaataaatattttactagaacaaaaaaaaatgaí aaattatttcgtglaagügatttctgaaaaggaatcttgggaggaattatcatgcataatcataaagtttcggggaaacaaatagttt cctatgcatcaittttgtctgggcaatttggggcactcagcattttatggtgtaatgagtacatattttattatttttattactagtggaatgttt ggcggattaaa|caa1ccgttgctgataaattagtaggtttaattactggattaatggtactagtaagaaltatc>gaactagtcattga ccctaittttg-cagcattattacttattctatttactggtaLtttiggattagcacaacagaattggatccttittgcaattttgtttgtgttgattt acatcgcttttgatgttttctattcattatcagatgtttcatattggggcatggttccagctttgagtgaagattcacatgaacgtggtattt atacttcacttggtgccttttGaggtactattggttggaatagtttgccaattattgtIgtgccactggttaccggtgtaaGttacgGQgtt aGtggcaaacaegaagaaggagGtcctggctggttcgcctttgcggccgtaatttcagccttagcaattatttgtgGCttgattgtttg ctltggtactaaagaaaagcacaacattattagaaattcggccaaacagaaaacGactttgcgtcaagtatttggtgcgattttCG ataatgatcaaattttglggcGaagtttagcttacttattgtattcactigctgttgtaattactaatggtgítttgttGtacatâtacaagttt gtaattggcaagccaaatgatttctgggtagtaggtgtaaitgcaacaattattggttgctgcattagtccalcLttcccggttttgaaG aaatatattccaagaaaatggitgtttattgcaggcGaaacttgtalggtattagcatatgtcçtatttatctttggtcgtsscaatgtctt GttaatggatltaggültagttttattcaatattaaGttcgctGlgltggtaaGtgttita3cntaaetgatgctattgaatatggtGaactta agattggtcaaagaaatgaagccgttgttttagctgítcgtccaatgattgataaatttactggtgclgtttGaaatgccttagltggtí3 tgtggcaattgcagctgggatgactggatcagctactgcagcagatatgacgagcaaaggtattaacacatttaatatla(tggcttt alatattactttagcttfggcagttttatctattgtagtatttttgagc3aagtaact«gagtgaaaagaaacacgcacaagttattgaa ga aítgaagagtaaacttgcacaaggcgagatEgaaa ag aagacltcagtag atacaggaacaa aagaagtaacíatttatg cacctgctgatgglgaattaatgcaaatgtcttctgttgttgatgaagatggtaaaecattccctgglaaaggalttgcaattgagGc aagcagtggtcaaatttatgcaccatttgatggaacgatcaagttlactttcggtacaaagcatgcattcgagaltgtgtcacaaaa tggactacaagttgttgtGcatgtaggattgggftactgtcaalttacgtggagaaggcttÈgaaactttctacgatgatggtcaaaca gtgaaaaagggcgataaattactfgagtttgatcgtgatttggctGttaaGaatggtLataaagacacgatcgígatattdatactc aaccaggtagaaLtcaaaattctggtgGtattcaagctggtaaagatat

Petição 870180138968, de 08/10/2018, pág. 33/48

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Da mesma forma, análises de seqüenciações revelam as seguintes mutações no operão lactose de cepas de acordo com a invenção:

- Cepa 1-3505 por comparação com a cepa 1-3434:

Na cepa 1-3505, uma base adenosina substitui uma base guanina que provoca a aparição de um códon de terminação, com 1713 pares de bases do início do gene lacL codificador para a beta-galatosidase.

- Cepa 1-3508 por comparação com a cepa 1-3435:

Na cepa 1-3508, uma base adenosina substitui uma base guanina que provoca a aparição de um códon de terminação, com 183 pares de bases do início do gene lacL codificador para a beta-galatosidase.

Claims

1. Processo de preparação de um produto alimentício ou farmacêutico, notadamente de um produto lácteo fermentado caracterizado por utilizar uma cepa de Lactobacillus helveticus selecionada a partir do grupo consistindo nas cepas 1-3431, 1-3434 ou 1-3435 depositadas na CNCM em 25/05/2005, e cepas obtidas delas, que possuem pelo menos uma mutação pontual introduzindo um códon de terminação no operon da lactose.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o produto alimentício ou farmacêutico possui propriedades anti-hipertensivas.

3. Produto alimentício, notadamente produto lácteo fermentado, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos uma cepa de Lactobacillus helveticus selecionada a partir do grupo consistindo nas cepas 1-3431, 1-3434 ou 1-3435 depositadas na CNCM em 25/05/2005, e cepas obtidas delas, que possuem pelo menos uma mutação pontual introduzindo um códon de terminação no operon da lactose .

4. Produto alimentício, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de conter pelo menos 10⁶, preferencialmente pelo menos 10⁷, preferencialmente pelo menos 10⁸ UFC/mL de bactérias Lactobacillus helveticus vivas.

5. Produto alimentício, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 e 4, caracterizado pelo fato de conter pelo menos 25 mg, preferencialmente pelo menos 50 mg, mais preferencialmente pelo menos 75 mg de VPPeq por kg do produto alimentício.

6. Produto alimentício, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente preparações de fruta(s), notadamente pedaços e/ou suco de fruta(s).

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7. Produto alimentício, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, caracterizado pelo fato de possuir um pH superior ou igual a 3,85, preferencialmente superior ou igual a 4,00, mais preferencialmente superior ou igual a 4,20.

8. Produto alimentício, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 7, caracterizado pelo fato de possuir propriedades anti-hipertensivas.

9. Processo de preparação de um produto alimentício caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas:

selecionar uma matéria-prima contendo proteínas de leite, notadamente proteínas contendo as seqüências peptídicas IPP e/ou VPP;

selecionar pelo menos uma cepa de Lactobacillus helveticus selecionada a partir do grupo consistindo nas cepas 1-3431, 1-3434 ou 1-3435 depositadas na CNCM em 25/05/2005, e cepas obtidas delas, que possuem pelo menos uma mutação pontual introduzindo um códon de terminação no operon da lactose;

inocular a matéria-prima com a cepa; e fermentar a matéria-prima em presença de 1 a 3% (p/p) de glicose durante 12 a 30 horas a 30 a 45 °C, e na presença da cepa.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de ser desprovido de qualquer etapa de terminação após a fermentação.