ES2237834T3

ES2237834T3 - Bacteria lactobacillus helveticus que tiene alta capacidad de produccion de un tripeptido, producto lacteo fermentado y procedimiento para su preparacion.

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Publication number: ES2237834T3
Application number: ES98901520T
Authority: ES
Inventors: Naoyuki Calpis Co. Ltd. YAMAMOTO; Natsue Calpis Co. Ltd. KAWAKAMI; Yuu Calpis Co. Ltd. ISHIDA; Hirokazu Calpis Co. Ltd. YADA
Original assignee: Calpis Co Ltd
Current assignee: Asahi Soft Drinks Co Ltd
Priority date: 1997-09-26
Filing date: 1998-02-05
Publication date: 2005-08-01
Anticipated expiration: 2018-02-05
Also published as: PT1016709E; HU225980B1; DE69829983D1; EP1016709B1; PL188675B1; KR100404154B1; TR200000854T2; PL339343A1; DE69829983T2; WO1999016862A1; IN188418B; CN1279712A; US6534304B1; SK284755B6; BR9813218A; US20030064501A1; HUP0003744A2; KR20010024311A; AR017153A1; EP1016709A4

Abstract

Bacterias de ácido láctico de Lactobacillus helveticus que tienen las siguientes propiedades bacteriológicas, produciendo dichas bacterias, si se cultivan en un medio de leche animal que contiene sólido de leche sin grasa al 9% en peso, tripéptidos Val-Pro-Pro e Ile-Pro-Pro en una cantidad no menor que 60 g en cuanto a Val-Pro-Pro por ml de medio, y mostrando dichas bacterias una actividad proteasa extracelular no menor que 400U/OD590: (Propiedades Morfológicas) 5) Forma de la célula; bacilo, 6) Movilidad; ninguna, 7) Formación de esporas; ninguna, 8) Tinción Gram; positiva, (Propiedades Fisiológicas) 7) Producción de catalasa; negativo, 8) Producción de indol; negativo, 9) Reducción de nitrato; negativo, 10) Crecimiento aeróbico; anaeróbico facultativo, 11) Formación de ácido DL-láctico a partir de glucosa mediante fermentación homoláctica sin formación de gases, 12) Degradación de carbohidratos: glucosa; + lactosa; + manosa; + fructosa; + galactosa; + sucrosa; - maltosa; - xilosa; - ramnosa; - celobiosa; - trealosa; - melibiosa; - rafinosa; - estaquiosa; - manitol; - sorbitol; - esculina; - salicina; -.

Description

Batería Lactobacillus helveticus que tiene alta capacidad de producción de un tripéptido, producto lácteo fermentado y procedimiento para su preparación.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevas bacterias de ácido láctico de Lactobacillus helveticus que pueden producir un tripéptido concreto con alta eficacia si se cultivan en un medio lácteo animal y que tienen actividad proteasa extracelular; un producto lácteo fermentado que contiene las bacterias de ácido láctico; y un método para producir el producto.

Antecedentes de la invención

Se ha utilizado Lactobacillus helveticus para producir leche fermentada durante un largo periodo de tiempo como iniciador ("Starter") típico de bacterias de ácido láctico para productos lácteos. Lactobacillus helveticus tiene alta actividad proteolítica y, particularmente, su proteasa extracelular, que tiene alta actividad, juega un papel importante en la fermentación de la leche animal. Es decir, la proteasa extracelular digiere las proteínas de la leche animal para producir diversos fragmentos peptídicos. Además, los péptidos producidos se someten a la acción de peptidasas para convertirse en péptidos de menor peso molecular. Se sabe que una parte de los péptidos producidos en un medio debido a la acción de enzimas proteasas se introducen en las células de las bacterias de ácido láctico y se utilizan como fuente de nitrógeno. También se ha informado que algunos de los péptidos producidos en el medio tienen una actividad inhibidora frente a la enzima convertidora de angiotensina (ECA) la cual causa hipertensión. (J. Dairy Sci. 78:777-783 (1995)).

Como péptidos para inhibir la actividad de ECA y suprimir la subida de la presión sanguínea, se ha informado de diversos péptidos eficaces, tales como los derivados de los productos de degradación de las proteínas de la leche, proteínas de soja o proteínas de carne de pescado. Por ejemplo, Val-Pro-Pro e Ile-Pro-Pro (abreviados más adelante en la presente memoria como VPP e IPP, respectivamente. Estos péptidos, más adelante en la presente memoria, se denominan colectivamente como lactotripéptidos) se conocen como péptidos que tienen actividad inhibidora de ECA presente en una leche fermentada con Lactobacillus helveticus. Se ha confirmado que estos lactotripéptidos tienen un fuerte efecto hipotensor mediante experimentos que usan ratas espontáneamente hipertensas (REH) (J. Dairy Sci. 78:1.253-1.257 (1995)).

Sin embargo, la leche fermentada que contiene lactotripéptido, producida mediante la fermentación de leche animal con cepas convencionales de Lactobacillus helveticus, apenas se puede tomar tal cual, porque muestra alta acidez debido a una gran cantidad de ácido láctico generado durante el desarrollo de la fermentación. La dilución de la leche fermentada da como resultado una profunda disminución del contenido de los lactotripéptidos.

Por tanto, se desea producir leche fermentada con mayor contenido de los lactotripéptidos en comparación con el contenido del ácido láctico generado en la leche fermentada. Con una adición de una pequeña cantidad de dicha leche fermentada a diversas comidas y bebidas, se podrían preparar fácilmente y proporcionar a los consumidores productos que tienen la función de los lactotripéptidos en una forma agradable para tomar. Sin embargo, ninguna de las cepas de bacterias de ácido láctico conocidas producen el lactotripéptido con alta eficacia.

Descripción de la invención

Es un objetivo de la presente invención proporcionar una nueva cepa de bacterias de ácido láctico la cual pueda producir una gran cantidad de lactotripéptido con alta eficacia con respecto a la cantidad del ácido láctico
generado.

Es otro objetivo de la presente invención proporcionar un producto lácteo fermentado el cual contenga el lactotripéptido que tiene actividades tales como la actividad hipotensora y se espera que tenga efecto antiestrés, y una cepa de bacterias de ácido láctico capaz de producir una gran cantidad de este lactotripéptido y el cual se pueda tomar de manera agradable como alimento o bebida, y un método para producirlo.

De acuerdo con la presente invención, se ha proporcionado bacterias de ácido láctico de Lactobacillus helveticus que tienen las siguientes propiedades bacteriológicas, produciendo dichas bacterias, si se cultivan en un medio de leche animal que contiene sólido de leche sin grasa al 9% en peso, los tripéptidos Val-Pro-Pro e Ile-Pro-Pro en una cantidad no menor que 60 \mug en cuanto a Val-Pro-Pro por ml de medio, y mostrando dichas bacterias una actividad proteasa extracelular no menor que 400 U/OD_{590}:

Propiedades morfológicas

1): Forma de la célula; bacilo

2): Movilidad; ninguna,

3): Formación de esporas; ninguna,

4): Tinción Gram; positiva,

Propiedades fisiológicas

1): Producción de catalasa; negativo,

2): Producción de indol; negativo,

3): Reducción de nitrato; negativo,

4): Crecimiento aeróbico; anaeróbico facultativo,

5): Formación de ácido DL-láctico a partir de glucosa mediante fermentación homoláctica sin formación de gases,

6): Degradación de carbohidratos:

: glucosa; +

: lactosa; +

: manosa; +

: fructosa; +

: galactosa; +

: sucrosa; -

: maltosa; -

: xilosa; -

: ramnosa; -

: celobiosa; -

: trealosa; -

: melibiosa; -

: rafinosa; -

: estaquiosa; -

: manitol; -

: sorbitol; -

: esculina; -

: salicina; -.

De acuerdo con la presente invención, también se ha proporcionado las bacterias de ácido láctico de Lactobacillus helveticus en las que dichas bacterias de ácido láctico es la cepa CM4 de Lactobacillus helveticus (depositada en el "National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology" el 15 de Agosto de 1997, número de depósito FERM BP-6060).

De acuerdo con la presente invención, además se ha proporcionado las bacterias de ácido láctico de Lactobacillus helveticus que tienen un ADN cromosómico el cual da un fragmento de ADN de 15 a 17 Kb cuando se digiere dicho ADN cromosómico con enzimas de restricción PstI y EcoRI.

De acuerdo con la presente invención, también se ha proporcionado un producto lácteo fermentado que contiene una leche fermentada que comprende las anteriormente mencionadas bacterias de ácido láctico y un tripéptido seleccionado entre el grupo que consiste en Val-Pro-Pro, Ile-Pro-Pro y mezclas de los mismos.

De acuerdo con la presente invención, también se ha proporcionado un método para producir un producto lácteo fermentado que comprende fermentar un medio que contiene un material alimenticio seleccionado entre el grupo que consiste en un péptido, una proteína y mezcla de los mismos que incluye la secuencia Val-Pro-Pro e Ile-Pro-Pro, con la bacteria de ácido láctico.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una fotografía que muestra el patrón de electroforesis en gel de agarosa de los fragmentos de ADN cromosómico de diversas cepas de Lactobacillus helveticus del Ejemplo 2.

Realizaciones preferidas de la invención

Las bacterias de ácido láctico de la presente invención pertenecen a Lactobacillus helveticus, y se caracterizan porque las bacterias de ácido láctico producen los tripéptidos Val-Pro-Pro e Ile-Pro-Pro en una cantidad no menor que 60 \mug, y preferiblemente no menor que 70 \mug en cuanto a Val-Pro-Pro por ml de medio si se cultivan en un medio de leche animal que contiene sólido de leche sin grasa al 9% en peso, y muestra una actividad proteasa extracelular no menor que 400 U/OD_{590}, y preferiblemente no menor que 430 U/OD_{590}. La productividad del lactotripéptido definido es un índice para distinguir las presentes bacterias de ácido láctico de las bacterias convencionales de ácido láctico de Lactobacillus helveticus. Por ejemplo, mediante este índice se define una propiedad de las presentes bacterias de ácido láctico para producir, si se cultivan en leche animal que contiene sólido de leche sin grasa al 9% en peso, los lactotripéptidos en una cantidad no menor que 60 \mug en cuanto a VPP por ml de medio, lo cual no se podría haber producido con las bacterias convencionales de ácido láctico. Normalmente, a menor contenido del sólido de leche sin grasa en el medio para cultivar, menor cantidad de los lactotripéptidos a producir. A mayor contenido del sólido de leche sin grasa, mayor cantidad del lactotripéptido.

La productividad de los lactotripéptidos como índice se mide mediante las etapas de: inocular las bacterias de ácido láctico a leche animal, tal como leche de vaca, leche de cabra, leche de caballo y leches desnatadas de las mismas, que contienen sólido de leche sin grasa al 9% en peso; cultivar las bacterias a 37ºC durante 24 horas para preparar leche fermentada; centrifugar 1 ml de la leche fermentada a 15.000 rpm durante 10 minutos; someter el sobrenadante a medición de las cantidades de VPP e IPP; y convertir las cantidades en cantidad de VPP. La cantidad convertida del lactotripéptido en cuanto a VPP se calcula mediante la siguiente ecuación puesto que la actividad inhibidora de ECA de IPP por unidad de peso es 1,7 veces la de VPP;

Cantidad convertida de lactotripéptido (\mug en cuanto a VPP por ml) = cantidad de IPP (\mug/ml) x 1,7 + cantidad de VPP (\mug/ml)

La productividad máxima de lactotripéptido no está particularmente limitada, sino que se puede alcanzar si todos los Val-Pro-Pro e Ile-Pro-Pro, incluidos como secuencias en la proteína del medio, se extraen como tripéptidos mediante digestión.

La actividad proteasa extracelular se mide de acuerdo con el método de Yamamoto et al. (Yamamoto, N. et al. J. Biochem. (1993) 114, 740) basado en el método de Twining et al. (Twining, S. Anal. Biochem. 143 3.410 (1984)), y se expresa definiendo la cantidad de enzima que muestra intensidad fluorescente al 1% para ser 1 U/OD_{590}. El límite superior de la actividad proteasa extracelular tampoco está limitado, sino que normalmente es 800 U/OD_{590}.

Las presentes bacterias de ácido láctico pueden producir una gran cantidad del lactotripéptido con respecto a la cantidad del ácido láctico generado durante la fermentación. Así, la fermentación que usa las presentes bacterias de ácido láctico da como resultado una leche fermentada que contiene una mayor cantidad del lactotripéptido en comparación con la leche fermentada que contiene la misma cantidad de ácido láctico preparada con bacterias convencionales de ácido láctico. El ácido láctico debido a dicha fermentación es ácido DL-láctico. La cantidad del lactotripéptido producido mediante fermentación con las presentes bacterias de ácido láctico es preferiblemente no menor que 30 \mug en cuanto a VPP por 1 ml de la leche fermentada resultante que contiene 0,01 g/ml de ácido DL-láctico generado durante la fermentación. El límite superior de la cantidad del lactotripéptido no está particularmente limitado, sino que es posible para las bacterias producir hasta aproximadamente 50 \mug en cuanto a VPP por 1 ml de la leche fermentada que contiene 0,01 g de ácido DL-láctico. La cantidad de ácido DL-láctico es más o menos proporcional a la cantidad del lactotripéptido. Por lo tanto, por ejemplo, si se produce 0,02 g de ácido DL-láctico en 1 ml de la leche fermentada, la cantidad de la producción de lactotripéptido es preferiblemente no menor que 60 \mug en cuanto a VPP. Al contrario, mediante la fermentación con las bacterias convencionales de ácido láctico, la cantidad del lactotripéptido es, como máximo, menor que 30 \mug en cuanto a VPP por 0,01 g de ácido DL-láctico en 1 ml de leche fermentada.

Como ejemplo de las presentes bacterias de ácido láctico, está depositada la cepa CM4 de Lactobacillus helveticus como FERM BP-6060 en el "National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology" (depositada el 15 de Agosto de 1997). La cepa CM4 de Lactobacillus helveticus tiene las siguientes propiedades bacteriológicas:

1. Propiedades morfológicas

1): Forma de la célula; bacilo,

2): Movilidad; ninguna,

3): Formación de esporas; ninguna,

4): Tinción Gram; positiva,

2. Propiedades fisiológicas

1): Producción de catalasa; negativo,

2): Producción de indol; negativo,

3): Reducción de nitrato; negativo,

4): Crecimiento aeróbico; anaeróbico facultativo,

6): Degradación de carbohidratos:

: glucosa; +

: lactosa; +

: manosa; +

: fructosa; +

: galactosa; +

: sucrosa; -

: maltosa; -

: xilosa; -

: ramnosa; -

: celobiosa; -

: trealosa; -

: melibiosa; -

: rafinosa; -

: estaquiosa; -

: manitol; -

: sorbitol; -

: esculina; -

: salicina; -.

Las propiedades bacteriológicas anteriormente mencionadas de la cepa CM4 son idénticas que la cepa NCDO-099 de Lactobacillus helveticus públicamente conocida si se examinan mediante el método de Mitsuoka et al. (Rinshoukensa 18, 1.163 (1974)). Sin embargo, en cuanto a las siguientes propiedades, las cuales no están descritas en Mitsuoka et al., la CM4 se distingue claramente de la NCDO-099.

7): Actividad proteasa extracelular; no menor que 400 U/OD_{590}.

8): Productividad de lactotripéptido; producción de dos clases de tripéptidos (VPP e IPP) en una cantidad de 60 \mug o más en cuanto a VPP por ml de líquido fermentado si se cultiva en un medio que contiene leche desnatada al 9% en peso a 37ºC durante 24 horas.

La productividad de lactotripéptido en 8) se mide usando leche desnatada como sólido de la leche sin grasa.

Se puede obtener la cepa de bacterias de ácido láctico de la presente invención mediante la siguiente selección y medición de la actividad proteasa extracelular.

(1) Selección primaria Selección de cepa mediante la medición de alta actividad inhibidora de ECA en la leche fermentada

Se cultivan las cepas a seleccionar en un medio de leche desnatada al 9% en peso a 37ºC durante 24 horas. Tras finalizar el cultivo, se mide el número de bacterias de ácido láctico, la acidez del ácido láctico y la actividad inhibidora de ECA. Se seleccionan las cepas que producen 1x10^{8} células/ml o más de bacterias de ácido láctico, y que muestran una acidez del ácido láctico de 1,6% en peso o mayor y una actividad inhibidora de 40 unidades/ml o mayor. La actividad inhibidora se mide mediante el método de Cushman y Cheung (Cushman, D.W. y Cheung, H.S. Pharmacol., 20 1.637 (1971)).

(2) Selección secundaria Selección de cepa que tenga alta productividad de lactotripéptido

Se centrifugan los líquidos cultivados de las cepas seleccionadas mediante la selección primaria a 15.000 rpmdurante 10 minutos, y sus sobrenadantes se someten a HPLC para cuantificar el lactotripéptido. Se seleccionan las cepas que producen no menos de 50 \mug en cuanto a VPP por ml.

(3) Medición de la actividad proteasa extracelular

Se cultiva cada una de las cepas seleccionadas mediante la selección secundaria en un medio de leche desnatada al 9% en peso mientras su pH se mantiene a 6. Se toma la muestra a mitad de la fase de crecimiento logarítmico, y se añade 1% en peso de citrato de sodio, y se centrífuga a 5.000 rpm durante 10 minutos para recoger las células. Se lavan las células recogidas con ácido \beta-glicerofosfórico 50 mM, y se suspenden en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,8) para ajustar la turbidez (OD_{590}) a 1. A continuación, se mide la actividad proteasa en la superficie celular. Se confirmará que el resultado es correlativo a la productividad de lactotripéptido de las cepas medidas en la selección secundaria.

La cepa de bacterias de ácido láctico de Lactobacillus helveticus seleccionada por el anterior método se puede identificar y distinguir de otras cepas de bacterias de ácido láctico mediante, por ejemplo, las anteriormente mencionadas productividad de lactotripéptido y actividad proteasa extracelular.

La bacteria de ácido láctico de la presente invención tiene preferiblemente, además de las anteriormente mencionadas productividad de lactotripéptido y actividad proteasa extracelular, ADN cromosómico el cual da un fragmento de ADN de 15 a 17 Kb si se digiere el ADN cromosómico con enzimas de restricción PstI y EcoRI. Por lo tanto, se puede distinguir claramente la bacteria de ácido láctico de la presente invención de otras cepas de la misma especie examinando si la cepa tiene el ADN cromosómico el cual da dicho fragmento de ADN.

Se puede confirmar la existencia del fragmento de ADN de 15 a 17 kb extrayendo el ADN cromosómico de la bacteria de ácido láctico de acuerdo con el método de Leenhouts et al. (Leenhouts, K. (1990) Appl. Environ. Microbiol. 56:2.726), digiriendo el ADN cromosómico con EcoRI y PstI, realizando una electroforesis en gel de agarosa al 0,8% de los fragmentos digeridos, y analizando el patrón de electroforesis resultante. Tras la electroforesis, claramente se confirma la existencia del fragmento de ADN sometiendo al ADN del fago \lambda digerido con una enzima de restricción Hind III a una electroforesis paralela como marcador de tamaño.

El producto lácteo fermentado de la presente invención contiene, como componente requerido, leche fermentada que contiene las bacterias de ácido láctico y el tripéptido seleccionado entre el grupo que consiste en VPP, IPP y mezclas de los mismos. Es decir, el producto lácteo fermentado de la presente invención contiene leche fermentada que contiene el lactotripéptido y las bacterias de ácido láctico, y se prepara mediante fermentación de un medio que contiene un material alimenticio compuesto de péptidos y/o proteínas que incluyen la secuencia VPP y/o IPP con las bacterias de ácido láctico de la presente invención. Así, se pueden seleccionar adecuadamente los contenidos de las bacterias de ácido láctico y el tripéptido dependiendo de la clase de producto lácteo fermentado a preparar. El presente producto lácteo fermentado puede contener el propio producto fermentado obtenido, un producto fermentado diluido o un producto fermentado purificado.

El producto lácteo fermentado de la presente invención contiene ácido DL-láctico generado durante la fermentación. El producto lácteo fermentado de la presente invención preferiblemente contiene el lactotripéptido en una cantidad de 30 a 50 \mug en cuanto a VPP con respecto a 0,01 g del ácido DL-láctico. La cantidad del ácido DL-láctico es más o menos proporcional a la cantidad del lactotripéptido. Así, si el producto lácteo fermentado contiene una leche fermentada concentrada y contiene, por ejemplo, 0,02 g del ácido DL-láctico, la cantidad del lactotripéptido está preferiblemente en un intervalo entre 60 y 100 \mug en cuanto a VPP. Si el producto lácteo fermentado contiene una leche fermentada diluida y contiene, por ejemplo, 0,005 g del ácido DL-láctico, la cantidad del lactotripéptido es preferiblemente de 15 a 25 \mug en cuanto a VPP. Aunque el producto lácteo fermentado de la presente invención puede contener ácido L-láctico, el cual es un aditivo alimenticio para ajustar la acidez, este ácido L-láctico es para distinguirse del ácido DL-láctico generado durante la fermentación.

Las bacterias de ácido láctico del producto lácteo fermentado de la presente invención se pueden o bien esterilizar después de la fermentación, o mantener vivas sin esterilización.

El producto lácteo fermentado de la presente invención puede ser: yogurt, bebidas acidificadas que contienen leche, queso, alimentos procesados que contienen leche agria fermentada y comidas dietéticas que contienen leche agria fermentada. Así, el producto lácteo fermentado de la presente invención puede contener, además de la leche fermentada como componente requerido, diversos materiales los cuales normalmente se añaden para producir tal diversidad de productos. El producto lácteo fermentado de la presente invención puede estar en forma de sólido tal como polvos, gránulos y pastillas, o de fluido tal como pasta, gel y líquido.

El método para producir el producto lácteo fermentado de la presente invención incluye fermentar con las bacterias de ácido láctico un medio que contiene un material alimenticio seleccionado entre el grupo que consiste en un péptido, una proteína y mezclas de los mismos que incluyen Val-Pro-Pro y/o Ile-Pro-Pro como una parte de su secuencia.

El material alimenticio del medio puede ser de cualquier clase siempre que contenga péptidos y/o proteínas que incluyan, como parte de su secuencia, VPP y/o IPP. Por ejemplo, el material alimenticio puede ser leche animal, caseína de la leche, maíz, proteína de maíz, trigo, proteína de trigo, soja, leche de soja, soja sin grasa, proteína de soja, o mezclas de los mismos. Particularmente, es preferible utilizar un material alimenticio que contenga leche animal tal como leche de vaca, leche de cabra, leche de caballo o leches desnatadas de estas. El contenido del sólido de leche sin grasa en la leche animal no está particularmente limitado, pero normalmente es de 5 a 20% en peso.

No hay particular limitación sobre la cantidad de bacterias de ácido láctico que se inocula al medio. Normalmente la cantidad de inoculación es aproximadamente 10^{5} a 10^{7} células de la bacteria de ácido láctico por 1 g del anteriormente mencionado material alimenticio específico en el medio.

La fermentación se puede realizar a 25 a 50ºC y preferiblemente 30 a 45ºC, durante 6 a 30 horas y preferiblemente 10 a 24 horas, en el intervalo de pH de preferiblemente 3,0 a 4,0, y más preferiblemente 3,0 a 3,5.

La fermentación se realiza preferiblemente de modo que la cantidad del lactotripéptido no sea menor que 60 \mug en cuanto a VPP por ml de la leche fermentada resultante. Específicamente, si se emplea leche de vaca que contiene sólido de leche sin grasa al 9% en peso como medio, la fermentación a 25 a 40ºC durante 12 a 48 horas da como resultado una leche fermentada que contiene el lactotripéptido en una cantidad no menor que 70 \mug en cuanto a VPP por ml. El contenido del sólido de leche sin grasa en el medio es más o menos proporcional al lactotripéptido a producir. Por ejemplo, si el material alimenticio contiene sólido de leche sin grasa al 5% en peso, la fermentación de acuerdo con las condiciones anteriormente mencionadas dará como resultado la producción del lactotripéptido en una cantidad de aproximadamente 33,3 \mug en cuanto a VPP por ml.

Se puede añadir a la leche fermentada obtenida mediante la fermentación anteriormente mencionada el producto tal cual. Si es necesario, se puede someter la leche fermentada a dilución o purificación antes de mezclar. La leche fermentada se puede enfriar y conservar a 5ºC y, a continuación, se añade otros componentes para preparar un producto tal como un producto refrigerado. Si no, la leche fermentada se puede someter a un tratamiento de esterilización por calor y, si es necesario, se pulveriza mediante un secado con pulverización para preparar un producto para distribuir a una temperatura normal.

Puesto que el producto lácteo fermentado de la presente invención contiene la leche fermentada obtenida mediante fermentación con las bacterias de ácido láctico, se puede usar para preparar fácilmente productos que tengan alto contenido del lactotripéptido con respecto al contenido del ácido láctico, en una forma agradable para tomar. Se espera que el producto lácteo fermentado muestre el efecto hipotensor y el efecto antiestrés del lactotripéptido si lo toma un ser humano.

Puesto que las bacterias de ácido láctico de la presente invención pueden producir una gran cantidad del lactotripéptido al cultivarlas en el material alimenticio específico, las bacterias son útiles en la producción de una diversidad de productos lácteos fermentados, alimentos funcionales, alimentos dietéticos, alimentos para uso dietético especifico, alimentos para uso especifico para personas mayores, y los materiales de los mismos, que tienen el efecto hipotensor y el efecto aliviador del estrés del lactotripéptido.

Ejemplos de la invención

A continuación, se explicará la presente invención en más detalle refiriéndose a los Ejemplos, pero la presente invención no está limitada por los mismos.

Entre las cepas de Lactobacillus helveticus usadas en los Ejemplos, la cepa CM4 está depositada en el "National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology" y se ha concedido el número de accesión FERM BP-6060. ATCC15009, NCDO-099, JCM1006, ATCC10797, JCM1062, JCM1103, JCM1120 y JCM1004 son cepas públicamente disponibles. Las cepas a parte de las anteriores cepas usadas en los Ejemplos se seleccionan entre la colección de cepas del solicitante.

Ejemplo 1 Selección de cepas que dan leche fermentada que tiene alta actividad inhibidora de ECA

Se seleccionaron 36 cepas de Lactobacillus helveticus aisladas de diversos productos lácteos. Se midió la actividad inhibidora de ECA de la leche fermentada con cada una de las cepas mediante el siguiente procedimiento. Se cultivó cada una de las cepas de Lactobacillus helveticus en un medio de sólido de leche sin grasa al 9% en peso a 37ºC durante 24 horas. Se añadió el medio cultivado a un medio fresco del mismo tipo en tal cantidad que el nuevo medio contenía 3% en peso del medio cultivado. Además, se realizó la fermentación a 37ºC durante 24 horas. Tras finalizar la fermentación, se midieron la acidez de ácido láctico (% en peso), la cantidad del péptido en el suero (mg/ml), el número de células y la actividad inhibidora de ECA (U/ml). Los resultados se muestran en la Tabla 1. 7 cepas de las 36 cepas tenían una capacidad de fermentación muy débil. 15 cepas producían leche fermentada con la acidez del ácido láctico generado no menor que 1,6% en peso. De las 15 cepas, se seleccionaron 8 cepas que tenían una actividad inhibidora de ECA no menor que 40 U/ml de suero en su leche fermentada.

Medición de la actividad inhibidora de ECA de la leche fermentada

Se midió la actividad inhibidora de ECA de acuerdo con el método de Cushman y Cheung (Cushman, D.W y Cheung, H.S. Pharmacol., 20 1.637 (1971)). Es decir, se centrifugó cada una de la leche fermentada a 15.000 rpm durante 5 minutos para obtener el sobrenadante (suero). Se diluyó adecuadamente el suero para la medición. Se pusieron 80 \mul del suero diluido en un tubo, se añadió 0,2 ml de tampón ácido bórico 0,1 M (conteniendo NaCl 0,3 M, pH 7,3) que contenía hipuril-histidina-leucina 5 mM (Hip-His-Leu, producida por SIGMA CHEMICALS CO.) como sustrato, y además se añadió 20 \mul de una disolución enzimática (0,1 U/ml, producida por SIGMA CHEMICALS CO). Se hizo reaccionar la mezcla resultante a 37ºC durante 30 minutos y, a continuación, se añadió 250 \mul de ácido hidroclórico 1N durante la conclusión de la reacción. Posteriormente, se añadió a la mezcla 1,7 ml de acetato de etilo, se agitó durante 20 segundos y, a continuación, se centrifugó a 3.000 rpm durante 10 minutos para recuperar 1,4 ml de la fase de acetato de etilo (fase superior). Se calentó la fase superior a 120ºC durante 40 minutos para eliminar el disolvente, se añadió 1 ml de agua destilada y se agitó durante aproximadamente 20 segundos. Se midió el ácido hipúrico extraído por absorbancia a 228 nm. Se calculó la actividad enzimática en unidad mediante la siguiente ecuación con la cantidad que da una inhibición del 50% de la actividad de ECA, definiéndose como una
unidad.

Cantidad de la enzima (unidad)=((A-B)/(A-C))x100x1/50

A: Absorbancia a 228 nm sin muestra

B: Absorbancia a 228 nm con muestra

C: Absorbancia a 228 sin enzima ni muestra

Análisis cuantitativo de la cantidad de péptidos en la leche fermentada

Se realizó el análisis cuantitativo de los péptidos de acuerdo con el método OPA (Charch, F.C. et al. J. Dairy Sci. 66 1.219 (1883)). Como sustancia patrón para generar una curva de calibración, se empleó caseína digerida con
tripsina.

TABLA 1

1

Selección de cepas que tienen alta productividad de lactotripéptido

Posteriormente, se midieron las 8 cepas las cuales daban leche fermentada que tenía alta actividad inhibidora de ECA tal como se seleccionó anteriormente para VPP e IPP en su leche fermentada.

Se centrifugó 1 ml de la leche fermentada a 15.000 rpm durante 10 minutos. Se recogió su sobrenadante, es decir, el suero. Se sometió 0,3 ml del suero a adsorción con Cartucho Sep-Pak (fabricado por WATERS INC), se lavó con agua destilada y, a continuación, se eluyó con 5 ml de metanol. Se secó el eluato bajo centrifugación y presión reducida. Se disolvió el producto seco en 0,3 ml de una disolución acuosa al 0,05% de ácido trifluoroacético, y se sometió a un análisis HPLC (Cromatografía Líquida de Alta Resolución) bajo las siguientes condiciones. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Aparatos empleados:

: Detector Hitachi L4000UV (a 215 nm)

: Bomba inteligente L6200

: Horno en columna L5030 (35ºC)

Condición de Elución: Caudal 0,5 ml/min

Eluyente: disolución acuosa que contiene NaCl 0,3 M y ácido trifluoroacético al 0,05%

Columna: Asahipak GS320 (\Phi 3,9x600 mm).

Puesto que la actividad inhibidora de ECA de IPP por unidad de peso es 1,7 veces la de VPP, se calculó la cantidad de los lactotripéptidos en cuanto a VPP a partir de las cantidades medidas de IPP y VPP de acuerdo con la siguiente ecuación. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Cantidad convertida de lactotripéptido (\mug en cuanto a VPP por ml)=Cantidad de IPP (\mug/ml) x 1,7 + Cantidad de VPP (\mug/ml)

TABLA 2

4

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La leche fermentada con CM4 tenía la mayor cantidad del lactotripéptido en cuanto a VPP, es decir, 78,5 \mug/ml de suero. Las otras siete cepas daban la cantidad promedio de 34,2 \mug/ml de suero.

Medición de proteasa extracelular

Se midió la actividad proteasa extracelular de 16 cepas las cuales daban resultados relativamente buenos en la capacidad de fermentación mostrados en la Tabla 1. Se realizó la medición de acuerdo con el método de Yamamoto et al. (Yamamoto, N. et al. J. Biochem. (1993) 114, 740) basado en el método de Twining et al. (Twining, S. Anal. Biochem. 143 3.410 (1984)). Es decir, se cultivó cada cepa en un medio de leche desnatada al 9% en peso mientras se mantenía su pH a 6,0. Se tomó la muestra a mitad de la fase de crecimiento logarítmico, y se añadió citrato de sodio de manera que la concentración final era de 1% en peso, para aclarar el medio lácteo. Se centrifugó la mezcla a 5.000 rpm durante 10 minutos para recoger las células. Se lavaron las células con ácido \beta-glicerofosfórico 50 mM, y se suspendieron en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,8) para ajustar la turbidez (OD_{590}, es decir, medido por absorbancia a 590 nm) a 1. Se añadió a 30 \mul de la suspensión 20 \mul de fluerescein-caseína al 0,4% (producida por SIGMA CHEMICALS CO.), y se incubó a 42ºC durante 1 hora. Además se añadió a la mezcla 120 \mul de ácido tricloroacético al 5%, se dejó reposar durante 20 minutos y se centrifugó a 15.000 rpm durante 10 minutos. Se añadió 60 \mul del sobrenadante a 3 ml de tampón Tris-HCl 500 mM (pH 8,3) y se midió su intensidad fluorescente detectando la fluorescencia de 525 nm producida a una longitud de onda de excitación de 490 nm. Se calculó la actividad proteasa extracelular en unidad con la cantidad de la enzima la cual muestra intensidad fluorescente al 1% bajo las anteriores condiciones, definiéndose como una unidad. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

TABLA 3

5

La actividad de Lactobacillus helveticus CM4 era la mayor, es decir, 450 U/OD_{590}.La actividad promedio para las otras 16 cepas era 141 U/OD_{590}, lo cual es aproximadamente una tercera parte de la cepa CM4.

Ejemplo 2

A partir de 11 cepas de las 36 cepas de Lactobacillus helveticus seleccionadas en el Ejemplo 1, se extrajo el ADN cromosómico de acuerdo con el método de Leenhouts et al. (Leenhouts, K. (1990) Appl. Eviron. Microbiol. 56:2.726), se digirió con varias enzimas de restricción, y se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% para analizar el patrón de electroforesis.

Como resultado, se observó un fragmento de ADN característico entre los fragmentos de ADN del cromosoma de la cepa CM4 digerido con EcoRI y PstI (mostrado por la flecha 1 en la Figura 1). No se observó dicho fragmento en los fragmentos de cromosomas de otras cepas a parte de CM4, y se observaron fragmentos más cortos que el fragmento característico de CM4 en la mayoría de las otras cepas (mostrado por la flecha 2 en la Figura 1). Se midió el peso molecular del fragmento característico mediante electroforesis comparativa de los productos de digestión de Hind III del ADN del fago \lambda como marcadores de tamaño (23,1 kb, 9,4 kb, 6,6 kb, 4,4 kb, 2,3 kb y 2,0 kb, en el orden de incremento de la movilidad), y se encontró que era aproximadamente 16 kb. Así, se confirmó que la cepa CM4 tiene un ADN cromosómico el cual da el fragmento de ADN que tiene un peso molecular de aproximadamente 16 kb, mediante digestión con EcoRI y PstI. También se confirmó que otras cepas aparte de CM4 tienen ADN cromosómico el cual da un fragmento de ADN común que tiene un peso molecular de aproximadamente 13 kb.

Ejemplo 3

Se produjo una leche fermentada con la cepa CM4 de Lactobacillus helveticus seleccionada en el Ejemplo 1. Se cultivó la cepa CM4 en 100 g de leche desnatada al 9% en peso a 37ºC durante 12 horas. Posteriormente, se inoculó la leche desnatada cultivada a 3 kg de medio fresco y se cultivó a 37ºC durante 12 horas. Tras finalizar la fermentación, se usó toda la leche fermentada (número de células de cepa CM4; 6,3x10^{8} células/ml) como iniciador para la fermentación de 100 kg de leche desnatada al 9% en peso a 32ºC durante 20 horas. Tras finalizar la fermentación, la leche fermentada contenía 74,8 \mug/ml del lactotripéptido. El contenido del ácido láctico era 1,9% en peso.

Se añadió a 43 kg de la leche fermentada obtenida 4 kg de azúcar granulado, 3 kg de agua y 0,15 kg de alta metoxipectina y se homogeneizó para obtener 50 kg de yogurt líquido. El yogurt líquido tenía un preferible sabor suave, pH de 3,6 y 4,6x10^{8} células/g de células CM4 vivas.

Ejemplo 4

Se añadió a 26,5 kg de la leche fermentada obtenida en el Ejemplo 3 45,0 kg de azúcar granulado, 4,7 kg de jarabe de alta maltosa y 13,8 kg de agua. Se añadió 10 kg de una disolución de alta metoxipectina al 3% en peso a la mezcla bajo agitación. Se homogeneizó la mezcla resultante usando un homogeneizador de laboratorio (fabricado por ATV GAULIN, INC., Modelo 15M-8BA) bajo una presión de tratamiento de 150 kg/cm^{2} y a un caudal de tratamiento de 2.500 ml/min. Se añadió al líquido homogeneizado una esencia a vainilla y se esterilizó calentando hasta 85ºC. Se cargó la leche fermentada así esterilizada en una botella de cristal de 200 ml mientras se calentaba. Se midió el contenido del lactotripéptido en el producto lácteo fermentado esterilizado. Se descubrió que el contenido del lactotripéptido correspondía al de la leche fermentada antes de la esterilización. También se descubrió que el contenido del ácido láctico era 0,5% en peso.

Claims

1. Bacterias de ácido láctico de Lactobacillus helveticus que tienen las siguientes propiedades bacteriológicas, produciendo dichas bacterias, si se cultivan en un medio de leche animal que contiene sólido de leche sin grasa al 9% en peso, tripéptidos Val-Pro-Pro e Ile-Pro-Pro en una cantidad no menor que 60 \mug en cuanto a Val-Pro-Pro por ml de medio, y mostrando dichas bacterias una actividad proteasa extracelular no menor que 400 U/OD_{590}:

Propiedades morfológicas

5): Forma de la célula; bacilo,

6): Movilidad; ninguna,

7): Formación de esporas; ninguna,

8): Tinción Gram; positiva,

Propiedades fisiológicas

7): Producción de catalasa; negativo,

8): Producción de indol; negativo,

9): Reducción de nitrato; negativo,

10): Crecimiento aeróbico; anaeróbico facultativo,

11): Formación de ácido DL-láctico a partir de glucosa mediante fermentación homoláctica sin formación de gases,

12): Degradación de carbohidratos:

: glucosa; +

: lactosa; +

: manosa; +

: fructosa; +

: galactosa; +

: sucrosa; -

: maltosa; -

: xilosa; -

: ramnosa; -

: celobiosa; -

: trealosa; -

: melibiosa; -

: rafinosa; -

: estaquiosa; -

: manitol; -

: sorbitol; -

: esculina; -

: salicina; -.

2. Las bacterias de ácido láctico de Lactobacillus helveticus de la reivindicación 1, en las que dichas bacterias de ácido láctico es la cepa CM4 de Lactobacillus helveticus (número de depósito en el "National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology"; FERM BP-6060).

3. Las bacterias de ácido láctico de Lactobacillus helveticus de la reivindicación 1, en las que dichas bacterias tienen un ADN cromosómico el cual da un fragmento de ADN de 15 a 17 kb cuando dicho ADN cromosómico se digiere con enzimas de restricción PstI y EcoRI.

4. Un producto lácteo fermentado que comprende las bacterias de ácido láctico de la reivindicación 1, y un tripéptido seleccionado entre el grupo que consiste en Val-Pro-Pro, Ile-Pro-Pro y mezclas de los mismos.

5. El producto lácteo fermentado de la reivindicación 4 comprendiendo además ácido DL-láctico, en el que dicho producto contiene 30 a 50 \mug de dicho tripéptido en cuanto a Val-Pro-Pro por 0,01 g de dicho ácido DL-láctico.

6. El producto lácteo fermentado de la reivindicación 4, en el que las bacterias de ácido láctico de la reivindicación 1 están vivas.

7. El producto lácteo fermentado de la reivindicación 4, en el que dicho producto lácteo fermentado se selecciona entre el grupo que consiste en: yogurt, bebidas lácteas ácidas, queso, alimentos procesados que contienen leche agria fermentada y alimentos dietéticos que contienen leche agria fermentada.

8. Un método para producir el producto lácteo fermentado de la reivindicación 4, que comprende fermentar un medio que contiene un material alimenticio seleccionado entre el grupo que consiste en un péptido, una proteína y mezclas de los mismos que incluyen la secuencia Val-Pro-Pro e Ile-Pro-Pro, con las bacterias de ácido láctico de la reivindicación 1.

9. El método de la reivindicación 8, en el que dicho material alimenticio se selecciona entre el grupo que consiste en: leche animal, caseína de la leche, maíz, proteína de maíz, trigo, proteína de trigo, soja, leche de soja, soja sin grasa, proteína de soja y mezclas de los mismos.

10. El método de la reivindicación 8, en el que la fermentación se realiza a 25 a 50ºC durante 6 a 60 horas.

11. El método de la reivindicación 8, en el que la fermentación se realiza bajo tales condiciones que la cantidad de tripéptidos Val-Pro-Pro e Ile-Pro-Pro producidos en la leche fermentada resultante es 60 \mug en cuanto a Val-Pro-Pro por ml.