ES2237834T3 - Bacteria lactobacillus helveticus que tiene alta capacidad de produccion de un tripeptido, producto lacteo fermentado y procedimiento para su preparacion. - Google Patents
Bacteria lactobacillus helveticus que tiene alta capacidad de produccion de un tripeptido, producto lacteo fermentado y procedimiento para su preparacion.Info
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Abstract
Bacterias de ácido láctico de Lactobacillus helveticus que tienen las siguientes propiedades bacteriológicas, produciendo dichas bacterias, si se cultivan en un medio de leche animal que contiene sólido de leche sin grasa al 9% en peso, tripéptidos Val-Pro-Pro e Ile-Pro-Pro en una cantidad no menor que 60 g en cuanto a Val-Pro-Pro por ml de medio, y mostrando dichas bacterias una actividad proteasa extracelular no menor que 400U/OD590: (Propiedades Morfológicas) 5) Forma de la célula; bacilo, 6) Movilidad; ninguna, 7) Formación de esporas; ninguna, 8) Tinción Gram; positiva, (Propiedades Fisiológicas) 7) Producción de catalasa; negativo, 8) Producción de indol; negativo, 9) Reducción de nitrato; negativo, 10) Crecimiento aeróbico; anaeróbico facultativo, 11) Formación de ácido DL-láctico a partir de glucosa mediante fermentación homoláctica sin formación de gases, 12) Degradación de carbohidratos: glucosa; + lactosa; + manosa; + fructosa; + galactosa; + sucrosa; - maltosa; - xilosa; - ramnosa; - celobiosa; - trealosa; - melibiosa; - rafinosa; - estaquiosa; - manitol; - sorbitol; - esculina; - salicina; -.
Description
Batería Lactobacillus helveticus que tiene
alta capacidad de producción de un tripéptido, producto lácteo
fermentado y procedimiento para su preparación.
La presente invención se refiere a nuevas
bacterias de ácido láctico de Lactobacillus helveticus que
pueden producir un tripéptido concreto con alta eficacia si se
cultivan en un medio lácteo animal y que tienen actividad proteasa
extracelular; un producto lácteo fermentado que contiene las
bacterias de ácido láctico; y un método para producir el
producto.
Se ha utilizado Lactobacillus helveticus
para producir leche fermentada durante un largo periodo de tiempo
como iniciador ("Starter") típico de bacterias de ácido
láctico para productos lácteos. Lactobacillus helveticus
tiene alta actividad proteolítica y, particularmente, su proteasa
extracelular, que tiene alta actividad, juega un papel importante
en la fermentación de la leche animal. Es decir, la proteasa
extracelular digiere las proteínas de la leche animal para producir
diversos fragmentos peptídicos. Además, los péptidos producidos se
someten a la acción de peptidasas para convertirse en péptidos de
menor peso molecular. Se sabe que una parte de los péptidos
producidos en un medio debido a la acción de enzimas proteasas se
introducen en las células de las bacterias de ácido láctico y se
utilizan como fuente de nitrógeno. También se ha informado que
algunos de los péptidos producidos en el medio tienen una actividad
inhibidora frente a la enzima convertidora de angiotensina (ECA) la
cual causa hipertensión. (J. Dairy Sci.
78:777-783 (1995)).
Como péptidos para inhibir la actividad de ECA y
suprimir la subida de la presión sanguínea, se ha informado de
diversos péptidos eficaces, tales como los derivados de los
productos de degradación de las proteínas de la leche, proteínas de
soja o proteínas de carne de pescado. Por ejemplo,
Val-Pro-Pro e
Ile-Pro-Pro (abreviados más adelante
en la presente memoria como VPP e IPP, respectivamente. Estos
péptidos, más adelante en la presente memoria, se denominan
colectivamente como lactotripéptidos) se conocen como péptidos que
tienen actividad inhibidora de ECA presente en una leche fermentada
con Lactobacillus helveticus. Se ha confirmado que estos
lactotripéptidos tienen un fuerte efecto hipotensor mediante
experimentos que usan ratas espontáneamente hipertensas (REH) (J.
Dairy Sci. 78:1.253-1.257 (1995)).
Sin embargo, la leche fermentada que contiene
lactotripéptido, producida mediante la fermentación de leche animal
con cepas convencionales de Lactobacillus helveticus, apenas
se puede tomar tal cual, porque muestra alta acidez debido a una
gran cantidad de ácido láctico generado durante el desarrollo de la
fermentación. La dilución de la leche fermentada da como resultado
una profunda disminución del contenido de los lactotripéptidos.
Por tanto, se desea producir leche fermentada con
mayor contenido de los lactotripéptidos en comparación con el
contenido del ácido láctico generado en la leche fermentada. Con
una adición de una pequeña cantidad de dicha leche fermentada a
diversas comidas y bebidas, se podrían preparar fácilmente y
proporcionar a los consumidores productos que tienen la función de
los lactotripéptidos en una forma agradable para tomar. Sin
embargo, ninguna de las cepas de bacterias de ácido láctico
conocidas producen el lactotripéptido con alta eficacia.
Es un objetivo de la presente invención
proporcionar una nueva cepa de bacterias de ácido láctico la cual
pueda producir una gran cantidad de lactotripéptido con alta
eficacia con respecto a la cantidad del ácido láctico
generado.
generado.
Es otro objetivo de la presente invención
proporcionar un producto lácteo fermentado el cual contenga el
lactotripéptido que tiene actividades tales como la actividad
hipotensora y se espera que tenga efecto antiestrés, y una cepa de
bacterias de ácido láctico capaz de producir una gran cantidad de
este lactotripéptido y el cual se pueda tomar de manera agradable
como alimento o bebida, y un método para producirlo.
De acuerdo con la presente invención, se ha
proporcionado bacterias de ácido láctico de Lactobacillus
helveticus que tienen las siguientes propiedades
bacteriológicas, produciendo dichas bacterias, si se cultivan en un
medio de leche animal que contiene sólido de leche sin grasa al 9%
en peso, los tripéptidos Val-Pro-Pro
e Ile-Pro-Pro en una cantidad no
menor que 60 \mug en cuanto a
Val-Pro-Pro por ml de medio, y
mostrando dichas bacterias una actividad proteasa extracelular no
menor que 400 U/OD_{590}:
- 1)
- Forma de la célula; bacilo
- 2)
- Movilidad; ninguna,
- 3)
- Formación de esporas; ninguna,
- 4)
- Tinción Gram; positiva,
- 1)
- Producción de catalasa; negativo,
- 2)
- Producción de indol; negativo,
- 3)
- Reducción de nitrato; negativo,
- 4)
- Crecimiento aeróbico; anaeróbico facultativo,
- 5)
- Formación de ácido DL-láctico a partir de glucosa mediante fermentación homoláctica sin formación de gases,
- 6)
- Degradación de carbohidratos:
- glucosa; +
- lactosa; +
- manosa; +
- fructosa; +
- galactosa; +
- sucrosa; -
- maltosa; -
- xilosa; -
- ramnosa; -
- celobiosa; -
- trealosa; -
- melibiosa; -
- rafinosa; -
- estaquiosa; -
- manitol; -
- sorbitol; -
- esculina; -
- salicina; -.
De acuerdo con la presente invención, también se
ha proporcionado las bacterias de ácido láctico de Lactobacillus
helveticus en las que dichas bacterias de ácido láctico es la
cepa CM4 de Lactobacillus helveticus (depositada en el
"National Institute of Bioscience and
Human-Technology Agency of Industrial Science and
Technology" el 15 de Agosto de 1997, número de depósito FERM
BP-6060).
De acuerdo con la presente invención, además se
ha proporcionado las bacterias de ácido láctico de Lactobacillus
helveticus que tienen un ADN cromosómico el cual da un
fragmento de ADN de 15 a 17 Kb cuando se digiere dicho ADN
cromosómico con enzimas de restricción PstI y EcoRI.
De acuerdo con la presente invención, también se
ha proporcionado un producto lácteo fermentado que contiene una
leche fermentada que comprende las anteriormente mencionadas
bacterias de ácido láctico y un tripéptido seleccionado entre el
grupo que consiste en Val-Pro-Pro,
Ile-Pro-Pro y mezclas de los
mismos.
De acuerdo con la presente invención, también se
ha proporcionado un método para producir un producto lácteo
fermentado que comprende fermentar un medio que contiene un
material alimenticio seleccionado entre el grupo que consiste en un
péptido, una proteína y mezcla de los mismos que incluye la
secuencia Val-Pro-Pro e
Ile-Pro-Pro, con la bacteria de
ácido láctico.
La Figura 1 es una fotografía que muestra el
patrón de electroforesis en gel de agarosa de los fragmentos de ADN
cromosómico de diversas cepas de Lactobacillus helveticus del
Ejemplo 2.
Las bacterias de ácido láctico de la presente
invención pertenecen a Lactobacillus helveticus, y se
caracterizan porque las bacterias de ácido láctico producen los
tripéptidos Val-Pro-Pro e
Ile-Pro-Pro en una cantidad no menor
que 60 \mug, y preferiblemente no menor que 70 \mug en cuanto a
Val-Pro-Pro por ml de medio si se
cultivan en un medio de leche animal que contiene sólido de leche
sin grasa al 9% en peso, y muestra una actividad proteasa
extracelular no menor que 400 U/OD_{590}, y preferiblemente no
menor que 430 U/OD_{590}. La productividad del lactotripéptido
definido es un índice para distinguir las presentes bacterias de
ácido láctico de las bacterias convencionales de ácido láctico de
Lactobacillus helveticus. Por ejemplo, mediante este índice
se define una propiedad de las presentes bacterias de ácido láctico
para producir, si se cultivan en leche animal que contiene sólido
de leche sin grasa al 9% en peso, los lactotripéptidos en una
cantidad no menor que 60 \mug en cuanto a VPP por ml de medio, lo
cual no se podría haber producido con las bacterias convencionales
de ácido láctico. Normalmente, a menor contenido del sólido de
leche sin grasa en el medio para cultivar, menor cantidad de los
lactotripéptidos a producir. A mayor contenido del sólido de leche
sin grasa, mayor cantidad del lactotripéptido.
La productividad de los lactotripéptidos como
índice se mide mediante las etapas de: inocular las bacterias de
ácido láctico a leche animal, tal como leche de vaca, leche de
cabra, leche de caballo y leches desnatadas de las mismas, que
contienen sólido de leche sin grasa al 9% en peso; cultivar las
bacterias a 37ºC durante 24 horas para preparar leche fermentada;
centrifugar 1 ml de la leche fermentada a 15.000 rpm durante 10
minutos; someter el sobrenadante a medición de las cantidades de VPP
e IPP; y convertir las cantidades en cantidad de VPP. La cantidad
convertida del lactotripéptido en cuanto a VPP se calcula mediante
la siguiente ecuación puesto que la actividad inhibidora de ECA de
IPP por unidad de peso es 1,7 veces la de VPP;
Cantidad
convertida de lactotripéptido (\mug en cuanto a VPP por ml) =
cantidad de IPP (\mug/ml) x 1,7 + cantidad de VPP
(\mug/ml)
La productividad máxima de lactotripéptido no
está particularmente limitada, sino que se puede alcanzar si todos
los Val-Pro-Pro e
Ile-Pro-Pro, incluidos como
secuencias en la proteína del medio, se extraen como tripéptidos
mediante digestión.
La actividad proteasa extracelular se mide de
acuerdo con el método de Yamamoto et al. (Yamamoto, N. et
al. J. Biochem. (1993) 114, 740) basado en el método de
Twining et al. (Twining, S. Anal. Biochem. 143
3.410 (1984)), y se expresa definiendo la cantidad de enzima que
muestra intensidad fluorescente al 1% para ser 1 U/OD_{590}. El
límite superior de la actividad proteasa extracelular tampoco está
limitado, sino que normalmente es 800 U/OD_{590}.
Las presentes bacterias de ácido láctico pueden
producir una gran cantidad del lactotripéptido con respecto a la
cantidad del ácido láctico generado durante la fermentación. Así, la
fermentación que usa las presentes bacterias de ácido láctico da
como resultado una leche fermentada que contiene una mayor cantidad
del lactotripéptido en comparación con la leche fermentada que
contiene la misma cantidad de ácido láctico preparada con bacterias
convencionales de ácido láctico. El ácido láctico debido a dicha
fermentación es ácido DL-láctico. La cantidad del
lactotripéptido producido mediante fermentación con las presentes
bacterias de ácido láctico es preferiblemente no menor que 30
\mug en cuanto a VPP por 1 ml de la leche fermentada resultante
que contiene 0,01 g/ml de ácido DL-láctico generado
durante la fermentación. El límite superior de la cantidad del
lactotripéptido no está particularmente limitado, sino que es
posible para las bacterias producir hasta aproximadamente 50 \mug
en cuanto a VPP por 1 ml de la leche fermentada que contiene 0,01 g
de ácido DL-láctico. La cantidad de ácido
DL-láctico es más o menos proporcional a la
cantidad del lactotripéptido. Por lo tanto, por ejemplo, si se
produce 0,02 g de ácido DL-láctico en 1 ml de la
leche fermentada, la cantidad de la producción de lactotripéptido
es preferiblemente no menor que 60 \mug en cuanto a VPP. Al
contrario, mediante la fermentación con las bacterias convencionales
de ácido láctico, la cantidad del lactotripéptido es, como máximo,
menor que 30 \mug en cuanto a VPP por 0,01 g de ácido
DL-láctico en 1 ml de leche fermentada.
Como ejemplo de las presentes bacterias de ácido
láctico, está depositada la cepa CM4 de Lactobacillus
helveticus como FERM BP-6060 en el "National
Institute of Bioscience and Human-Technology Agency
of Industrial Science and Technology" (depositada el 15 de Agosto
de 1997). La cepa CM4 de Lactobacillus helveticus tiene las
siguientes propiedades bacteriológicas:
- 1)
- Forma de la célula; bacilo,
- 2)
- Movilidad; ninguna,
- 3)
- Formación de esporas; ninguna,
- 4)
- Tinción Gram; positiva,
- 1)
- Producción de catalasa; negativo,
- 2)
- Producción de indol; negativo,
- 3)
- Reducción de nitrato; negativo,
- 4)
- Crecimiento aeróbico; anaeróbico facultativo,
- 5)
- Formación de ácido DL-láctico a partir de glucosa mediante fermentación homoláctica sin formación de gases,
- 6)
- Degradación de carbohidratos:
- glucosa; +
- lactosa; +
- manosa; +
- fructosa; +
- galactosa; +
- sucrosa; -
- maltosa; -
- xilosa; -
- ramnosa; -
- celobiosa; -
- trealosa; -
- melibiosa; -
- rafinosa; -
- estaquiosa; -
- manitol; -
- sorbitol; -
- esculina; -
- salicina; -.
Las propiedades bacteriológicas anteriormente
mencionadas de la cepa CM4 son idénticas que la cepa
NCDO-099 de Lactobacillus helveticus
públicamente conocida si se examinan mediante el método de Mitsuoka
et al. (Rinshoukensa 18, 1.163 (1974)). Sin embargo, en
cuanto a las siguientes propiedades, las cuales no están descritas
en Mitsuoka et al., la CM4 se distingue claramente de la
NCDO-099.
- 7)
- Actividad proteasa extracelular; no menor que 400 U/OD_{590}.
- 8)
- Productividad de lactotripéptido; producción de dos clases de tripéptidos (VPP e IPP) en una cantidad de 60 \mug o más en cuanto a VPP por ml de líquido fermentado si se cultiva en un medio que contiene leche desnatada al 9% en peso a 37ºC durante 24 horas.
La productividad de lactotripéptido en 8) se mide
usando leche desnatada como sólido de la leche sin grasa.
Se puede obtener la cepa de bacterias de ácido
láctico de la presente invención mediante la siguiente selección y
medición de la actividad proteasa extracelular.
Se cultivan las cepas a seleccionar en un medio
de leche desnatada al 9% en peso a 37ºC durante 24 horas. Tras
finalizar el cultivo, se mide el número de bacterias de ácido
láctico, la acidez del ácido láctico y la actividad inhibidora de
ECA. Se seleccionan las cepas que producen 1x10^{8} células/ml o
más de bacterias de ácido láctico, y que muestran una acidez del
ácido láctico de 1,6% en peso o mayor y una actividad inhibidora de
40 unidades/ml o mayor. La actividad inhibidora se mide mediante el
método de Cushman y Cheung (Cushman, D.W. y Cheung, H.S.
Pharmacol., 20 1.637 (1971)).
Se centrifugan los líquidos cultivados de las
cepas seleccionadas mediante la selección primaria a 15.000
rpmdurante 10 minutos, y sus sobrenadantes se someten a HPLC para
cuantificar el lactotripéptido. Se seleccionan las cepas que
producen no menos de 50 \mug en cuanto a VPP por ml.
Se cultiva cada una de las cepas seleccionadas
mediante la selección secundaria en un medio de leche desnatada al
9% en peso mientras su pH se mantiene a 6. Se toma la muestra a
mitad de la fase de crecimiento logarítmico, y se añade 1% en peso
de citrato de sodio, y se centrífuga a 5.000 rpm durante 10 minutos
para recoger las células. Se lavan las células recogidas con ácido
\beta-glicerofosfórico 50 mM, y se suspenden en
tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,8) para ajustar la
turbidez (OD_{590}) a 1. A continuación, se mide la actividad
proteasa en la superficie celular. Se confirmará que el resultado es
correlativo a la productividad de lactotripéptido de las cepas
medidas en la selección secundaria.
La cepa de bacterias de ácido láctico de
Lactobacillus helveticus seleccionada por el anterior método
se puede identificar y distinguir de otras cepas de bacterias de
ácido láctico mediante, por ejemplo, las anteriormente mencionadas
productividad de lactotripéptido y actividad proteasa
extracelular.
La bacteria de ácido láctico de la presente
invención tiene preferiblemente, además de las anteriormente
mencionadas productividad de lactotripéptido y actividad proteasa
extracelular, ADN cromosómico el cual da un fragmento de ADN de 15 a
17 Kb si se digiere el ADN cromosómico con enzimas de restricción
PstI y EcoRI. Por lo tanto, se puede distinguir claramente la
bacteria de ácido láctico de la presente invención de otras cepas de
la misma especie examinando si la cepa tiene el ADN cromosómico el
cual da dicho fragmento de ADN.
Se puede confirmar la existencia del fragmento de
ADN de 15 a 17 kb extrayendo el ADN cromosómico de la bacteria de
ácido láctico de acuerdo con el método de Leenhouts et al.
(Leenhouts, K. (1990) Appl. Environ. Microbiol. 56:2.726),
digiriendo el ADN cromosómico con EcoRI y PstI, realizando una
electroforesis en gel de agarosa al 0,8% de los fragmentos
digeridos, y analizando el patrón de electroforesis resultante. Tras
la electroforesis, claramente se confirma la existencia del
fragmento de ADN sometiendo al ADN del fago \lambda digerido con
una enzima de restricción Hind III a una electroforesis paralela
como marcador de tamaño.
El producto lácteo fermentado de la presente
invención contiene, como componente requerido, leche fermentada que
contiene las bacterias de ácido láctico y el tripéptido seleccionado
entre el grupo que consiste en VPP, IPP y mezclas de los mismos. Es
decir, el producto lácteo fermentado de la presente invención
contiene leche fermentada que contiene el lactotripéptido y las
bacterias de ácido láctico, y se prepara mediante fermentación de un
medio que contiene un material alimenticio compuesto de péptidos y/o
proteínas que incluyen la secuencia VPP y/o IPP con las bacterias de
ácido láctico de la presente invención. Así, se pueden seleccionar
adecuadamente los contenidos de las bacterias de ácido láctico y el
tripéptido dependiendo de la clase de producto lácteo fermentado a
preparar. El presente producto lácteo fermentado puede contener el
propio producto fermentado obtenido, un producto fermentado diluido
o un producto fermentado purificado.
El producto lácteo fermentado de la presente
invención contiene ácido DL-láctico generado durante
la fermentación. El producto lácteo fermentado de la presente
invención preferiblemente contiene el lactotripéptido en una
cantidad de 30 a 50 \mug en cuanto a VPP con respecto a 0,01 g del
ácido DL-láctico. La cantidad del ácido
DL-láctico es más o menos proporcional a la cantidad
del lactotripéptido. Así, si el producto lácteo fermentado contiene
una leche fermentada concentrada y contiene, por ejemplo, 0,02 g del
ácido DL-láctico, la cantidad del lactotripéptido
está preferiblemente en un intervalo entre 60 y 100 \mug en cuanto
a VPP. Si el producto lácteo fermentado contiene una leche
fermentada diluida y contiene, por ejemplo, 0,005 g del ácido
DL-láctico, la cantidad del lactotripéptido es
preferiblemente de 15 a 25 \mug en cuanto a VPP. Aunque el
producto lácteo fermentado de la presente invención puede contener
ácido L-láctico, el cual es un aditivo alimenticio
para ajustar la acidez, este ácido L-láctico es para
distinguirse del ácido DL-láctico generado durante
la fermentación.
Las bacterias de ácido láctico del producto
lácteo fermentado de la presente invención se pueden o bien
esterilizar después de la fermentación, o mantener vivas sin
esterilización.
El producto lácteo fermentado de la presente
invención puede ser: yogurt, bebidas acidificadas que contienen
leche, queso, alimentos procesados que contienen leche agria
fermentada y comidas dietéticas que contienen leche agria
fermentada. Así, el producto lácteo fermentado de la presente
invención puede contener, además de la leche fermentada como
componente requerido, diversos materiales los cuales normalmente se
añaden para producir tal diversidad de productos. El producto lácteo
fermentado de la presente invención puede estar en forma de sólido
tal como polvos, gránulos y pastillas, o de fluido tal como pasta,
gel y líquido.
El método para producir el producto lácteo
fermentado de la presente invención incluye fermentar con las
bacterias de ácido láctico un medio que contiene un material
alimenticio seleccionado entre el grupo que consiste en un péptido,
una proteína y mezclas de los mismos que incluyen
Val-Pro-Pro y/o
Ile-Pro-Pro como una parte de su
secuencia.
El material alimenticio del medio puede ser de
cualquier clase siempre que contenga péptidos y/o proteínas que
incluyan, como parte de su secuencia, VPP y/o IPP. Por ejemplo, el
material alimenticio puede ser leche animal, caseína de la leche,
maíz, proteína de maíz, trigo, proteína de trigo, soja, leche de
soja, soja sin grasa, proteína de soja, o mezclas de los mismos.
Particularmente, es preferible utilizar un material alimenticio que
contenga leche animal tal como leche de vaca, leche de cabra, leche
de caballo o leches desnatadas de estas. El contenido del sólido de
leche sin grasa en la leche animal no está particularmente limitado,
pero normalmente es de 5 a 20% en peso.
No hay particular limitación sobre la cantidad de
bacterias de ácido láctico que se inocula al medio. Normalmente la
cantidad de inoculación es aproximadamente 10^{5} a 10^{7}
células de la bacteria de ácido láctico por 1 g del anteriormente
mencionado material alimenticio específico en el medio.
La fermentación se puede realizar a 25 a 50ºC y
preferiblemente 30 a 45ºC, durante 6 a 30 horas y preferiblemente 10
a 24 horas, en el intervalo de pH de preferiblemente 3,0 a 4,0, y
más preferiblemente 3,0 a 3,5.
La fermentación se realiza preferiblemente de
modo que la cantidad del lactotripéptido no sea menor que 60 \mug
en cuanto a VPP por ml de la leche fermentada resultante.
Específicamente, si se emplea leche de vaca que contiene sólido de
leche sin grasa al 9% en peso como medio, la fermentación a 25 a
40ºC durante 12 a 48 horas da como resultado una leche fermentada
que contiene el lactotripéptido en una cantidad no menor que 70
\mug en cuanto a VPP por ml. El contenido del sólido de leche sin
grasa en el medio es más o menos proporcional al lactotripéptido a
producir. Por ejemplo, si el material alimenticio contiene sólido de
leche sin grasa al 5% en peso, la fermentación de acuerdo con las
condiciones anteriormente mencionadas dará como resultado la
producción del lactotripéptido en una cantidad de aproximadamente
33,3 \mug en cuanto a VPP por ml.
Se puede añadir a la leche fermentada obtenida
mediante la fermentación anteriormente mencionada el producto tal
cual. Si es necesario, se puede someter la leche fermentada a
dilución o purificación antes de mezclar. La leche fermentada se
puede enfriar y conservar a 5ºC y, a continuación, se añade otros
componentes para preparar un producto tal como un producto
refrigerado. Si no, la leche fermentada se puede someter a un
tratamiento de esterilización por calor y, si es necesario, se
pulveriza mediante un secado con pulverización para preparar un
producto para distribuir a una temperatura normal.
Puesto que el producto lácteo fermentado de la
presente invención contiene la leche fermentada obtenida mediante
fermentación con las bacterias de ácido láctico, se puede usar para
preparar fácilmente productos que tengan alto contenido del
lactotripéptido con respecto al contenido del ácido láctico, en una
forma agradable para tomar. Se espera que el producto lácteo
fermentado muestre el efecto hipotensor y el efecto antiestrés del
lactotripéptido si lo toma un ser humano.
Puesto que las bacterias de ácido láctico de la
presente invención pueden producir una gran cantidad del
lactotripéptido al cultivarlas en el material alimenticio
específico, las bacterias son útiles en la producción de una
diversidad de productos lácteos fermentados, alimentos funcionales,
alimentos dietéticos, alimentos para uso dietético especifico,
alimentos para uso especifico para personas mayores, y los
materiales de los mismos, que tienen el efecto hipotensor y el
efecto aliviador del estrés del lactotripéptido.
A continuación, se explicará la presente
invención en más detalle refiriéndose a los Ejemplos, pero la
presente invención no está limitada por los mismos.
Entre las cepas de Lactobacillus
helveticus usadas en los Ejemplos, la cepa CM4 está depositada
en el "National Institute of Bioscience and
Human-Technology Agency of Industrial Science and
Technology" y se ha concedido el número de accesión FERM
BP-6060. ATCC15009, NCDO-099,
JCM1006, ATCC10797, JCM1062, JCM1103, JCM1120 y JCM1004 son cepas
públicamente disponibles. Las cepas a parte de las anteriores cepas
usadas en los Ejemplos se seleccionan entre la colección de cepas
del solicitante.
Se seleccionaron 36 cepas de Lactobacillus
helveticus aisladas de diversos productos lácteos. Se midió la
actividad inhibidora de ECA de la leche fermentada con cada una de
las cepas mediante el siguiente procedimiento. Se cultivó cada una
de las cepas de Lactobacillus helveticus en un medio de
sólido de leche sin grasa al 9% en peso a 37ºC durante 24 horas. Se
añadió el medio cultivado a un medio fresco del mismo tipo en tal
cantidad que el nuevo medio contenía 3% en peso del medio cultivado.
Además, se realizó la fermentación a 37ºC durante 24 horas. Tras
finalizar la fermentación, se midieron la acidez de ácido láctico (%
en peso), la cantidad del péptido en el suero (mg/ml), el número de
células y la actividad inhibidora de ECA (U/ml). Los resultados se
muestran en la Tabla 1. 7 cepas de las 36 cepas tenían una capacidad
de fermentación muy débil. 15 cepas producían leche fermentada con
la acidez del ácido láctico generado no menor que 1,6% en peso. De
las 15 cepas, se seleccionaron 8 cepas que tenían una actividad
inhibidora de ECA no menor que 40 U/ml de suero en su leche
fermentada.
Se midió la actividad inhibidora de ECA de
acuerdo con el método de Cushman y Cheung (Cushman, D.W y Cheung,
H.S. Pharmacol., 20 1.637 (1971)). Es decir, se
centrifugó cada una de la leche fermentada a 15.000 rpm durante 5
minutos para obtener el sobrenadante (suero). Se diluyó
adecuadamente el suero para la medición. Se pusieron 80 \mul del
suero diluido en un tubo, se añadió 0,2 ml de tampón ácido bórico
0,1 M (conteniendo NaCl 0,3 M, pH 7,3) que contenía
hipuril-histidina-leucina 5 mM
(Hip-His-Leu, producida por SIGMA
CHEMICALS CO.) como sustrato, y además se añadió 20 \mul de una
disolución enzimática (0,1 U/ml, producida por SIGMA CHEMICALS CO).
Se hizo reaccionar la mezcla resultante a 37ºC durante 30 minutos y,
a continuación, se añadió 250 \mul de ácido hidroclórico 1N
durante la conclusión de la reacción. Posteriormente, se añadió a la
mezcla 1,7 ml de acetato de etilo, se agitó durante 20 segundos y, a
continuación, se centrifugó a 3.000 rpm durante 10 minutos para
recuperar 1,4 ml de la fase de acetato de etilo (fase superior). Se
calentó la fase superior a 120ºC durante 40 minutos para eliminar el
disolvente, se añadió 1 ml de agua destilada y se agitó durante
aproximadamente 20 segundos. Se midió el ácido hipúrico extraído por
absorbancia a 228 nm. Se calculó la actividad enzimática en unidad
mediante la siguiente ecuación con la cantidad que da una inhibición
del 50% de la actividad de ECA, definiéndose como una
unidad.
unidad.
Cantidad de la
enzima
(unidad)=((A-B)/(A-C))x100x1/50
A: Absorbancia a 228 nm sin muestra
B: Absorbancia a 228 nm con muestra
C: Absorbancia a 228 sin enzima ni muestra
Se realizó el análisis cuantitativo de los
péptidos de acuerdo con el método OPA (Charch, F.C. et al. J.
Dairy Sci. 66 1.219 (1883)). Como sustancia patrón para
generar una curva de calibración, se empleó caseína digerida
con
tripsina.
tripsina.
Posteriormente, se midieron las 8 cepas las
cuales daban leche fermentada que tenía alta actividad inhibidora
de ECA tal como se seleccionó anteriormente para VPP e IPP en su
leche fermentada.
Se centrifugó 1 ml de la leche fermentada a
15.000 rpm durante 10 minutos. Se recogió su sobrenadante, es
decir, el suero. Se sometió 0,3 ml del suero a adsorción con
Cartucho Sep-Pak (fabricado por WATERS INC), se lavó
con agua destilada y, a continuación, se eluyó con 5 ml de metanol.
Se secó el eluato bajo centrifugación y presión reducida. Se
disolvió el producto seco en 0,3 ml de una disolución acuosa al
0,05% de ácido trifluoroacético, y se sometió a un análisis HPLC
(Cromatografía Líquida de Alta Resolución) bajo las siguientes
condiciones. Los resultados se muestran en la Tabla 2.
Aparatos empleados:
- Detector Hitachi L4000UV (a 215 nm)
- Bomba inteligente L6200
- Horno en columna L5030 (35ºC)
Condición de Elución: Caudal 0,5 ml/min
Eluyente: disolución acuosa que contiene NaCl 0,3
M y ácido trifluoroacético al 0,05%
Columna: Asahipak GS320 (\Phi 3,9x600 mm).
Puesto que la actividad inhibidora de ECA de IPP
por unidad de peso es 1,7 veces la de VPP, se calculó la cantidad
de los lactotripéptidos en cuanto a VPP a partir de las cantidades
medidas de IPP y VPP de acuerdo con la siguiente ecuación. Los
resultados se muestran en la Tabla 2.
Cantidad
convertida de lactotripéptido (\mug en cuanto a VPP por
ml)=Cantidad de IPP (\mug/ml) x 1,7 + Cantidad de VPP
(\mug/ml)
\vskip1.000000\baselineskip
La leche fermentada con CM4 tenía la mayor
cantidad del lactotripéptido en cuanto a VPP, es decir, 78,5
\mug/ml de suero. Las otras siete cepas daban la cantidad promedio
de 34,2 \mug/ml de suero.
Se midió la actividad proteasa extracelular de 16
cepas las cuales daban resultados relativamente buenos en la
capacidad de fermentación mostrados en la Tabla 1. Se realizó la
medición de acuerdo con el método de Yamamoto et al.
(Yamamoto, N. et al. J. Biochem. (1993) 114, 740)
basado en el método de Twining et al. (Twining, S. Anal.
Biochem. 143 3.410 (1984)). Es decir, se cultivó cada
cepa en un medio de leche desnatada al 9% en peso mientras se
mantenía su pH a 6,0. Se tomó la muestra a mitad de la fase de
crecimiento logarítmico, y se añadió citrato de sodio de manera que
la concentración final era de 1% en peso, para aclarar el medio
lácteo. Se centrifugó la mezcla a 5.000 rpm durante 10 minutos para
recoger las células. Se lavaron las células con ácido
\beta-glicerofosfórico 50 mM, y se suspendieron en
tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,8) para ajustar la
turbidez (OD_{590}, es decir, medido por absorbancia a 590 nm) a
1. Se añadió a 30 \mul de la suspensión 20 \mul de
fluerescein-caseína al 0,4% (producida por SIGMA
CHEMICALS CO.), y se incubó a 42ºC durante 1 hora. Además se añadió
a la mezcla 120 \mul de ácido tricloroacético al 5%, se dejó
reposar durante 20 minutos y se centrifugó a 15.000 rpm durante 10
minutos. Se añadió 60 \mul del sobrenadante a 3 ml de tampón
Tris-HCl 500 mM (pH 8,3) y se midió su intensidad
fluorescente detectando la fluorescencia de 525 nm producida a una
longitud de onda de excitación de 490 nm. Se calculó la actividad
proteasa extracelular en unidad con la cantidad de la enzima la
cual muestra intensidad fluorescente al 1% bajo las anteriores
condiciones, definiéndose como una unidad. Los resultados se
muestran en la Tabla 3.
La actividad de Lactobacillus helveticus
CM4 era la mayor, es decir, 450 U/OD_{590}.La actividad promedio
para las otras 16 cepas era 141 U/OD_{590}, lo cual es
aproximadamente una tercera parte de la cepa CM4.
A partir de 11 cepas de las 36 cepas de
Lactobacillus helveticus seleccionadas en el Ejemplo 1, se
extrajo el ADN cromosómico de acuerdo con el método de Leenhouts
et al. (Leenhouts, K. (1990) Appl. Eviron. Microbiol.
56:2.726), se digirió con varias enzimas de restricción, y se
sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% para analizar el
patrón de electroforesis.
Como resultado, se observó un fragmento de ADN
característico entre los fragmentos de ADN del cromosoma de la cepa
CM4 digerido con EcoRI y PstI (mostrado por la flecha 1 en la
Figura 1). No se observó dicho fragmento en los fragmentos de
cromosomas de otras cepas a parte de CM4, y se observaron fragmentos
más cortos que el fragmento característico de CM4 en la mayoría de
las otras cepas (mostrado por la flecha 2 en la Figura 1). Se midió
el peso molecular del fragmento característico mediante
electroforesis comparativa de los productos de digestión de Hind III
del ADN del fago \lambda como marcadores de tamaño (23,1 kb, 9,4
kb, 6,6 kb, 4,4 kb, 2,3 kb y 2,0 kb, en el orden de incremento de
la movilidad), y se encontró que era aproximadamente 16 kb. Así, se
confirmó que la cepa CM4 tiene un ADN cromosómico el cual da el
fragmento de ADN que tiene un peso molecular de aproximadamente 16
kb, mediante digestión con EcoRI y PstI. También se confirmó que
otras cepas aparte de CM4 tienen ADN cromosómico el cual da un
fragmento de ADN común que tiene un peso molecular de
aproximadamente 13 kb.
Se produjo una leche fermentada con la cepa CM4
de Lactobacillus helveticus seleccionada en el Ejemplo 1. Se
cultivó la cepa CM4 en 100 g de leche desnatada al 9% en peso a
37ºC durante 12 horas. Posteriormente, se inoculó la leche desnatada
cultivada a 3 kg de medio fresco y se cultivó a 37ºC durante 12
horas. Tras finalizar la fermentación, se usó toda la leche
fermentada (número de células de cepa CM4; 6,3x10^{8} células/ml)
como iniciador para la fermentación de 100 kg de leche desnatada al
9% en peso a 32ºC durante 20 horas. Tras finalizar la fermentación,
la leche fermentada contenía 74,8 \mug/ml del lactotripéptido. El
contenido del ácido láctico era 1,9% en peso.
Se añadió a 43 kg de la leche fermentada obtenida
4 kg de azúcar granulado, 3 kg de agua y 0,15 kg de alta
metoxipectina y se homogeneizó para obtener 50 kg de yogurt líquido.
El yogurt líquido tenía un preferible sabor suave, pH de 3,6 y
4,6x10^{8} células/g de células CM4 vivas.
Se añadió a 26,5 kg de la leche fermentada
obtenida en el Ejemplo 3 45,0 kg de azúcar granulado, 4,7 kg de
jarabe de alta maltosa y 13,8 kg de agua. Se añadió 10 kg de una
disolución de alta metoxipectina al 3% en peso a la mezcla bajo
agitación. Se homogeneizó la mezcla resultante usando un
homogeneizador de laboratorio (fabricado por ATV GAULIN, INC.,
Modelo 15M-8BA) bajo una presión de tratamiento de
150 kg/cm^{2} y a un caudal de tratamiento de 2.500 ml/min. Se
añadió al líquido homogeneizado una esencia a vainilla y se
esterilizó calentando hasta 85ºC. Se cargó la leche fermentada así
esterilizada en una botella de cristal de 200 ml mientras se
calentaba. Se midió el contenido del lactotripéptido en el producto
lácteo fermentado esterilizado. Se descubrió que el contenido del
lactotripéptido correspondía al de la leche fermentada antes de la
esterilización. También se descubrió que el contenido del ácido
láctico era 0,5% en peso.
Claims (11)
1. Bacterias de ácido láctico de Lactobacillus
helveticus que tienen las siguientes propiedades
bacteriológicas, produciendo dichas bacterias, si se cultivan en un
medio de leche animal que contiene sólido de leche sin grasa al 9%
en peso, tripéptidos Val-Pro-Pro e
Ile-Pro-Pro en una cantidad no menor
que 60 \mug en cuanto a
Val-Pro-Pro por ml de medio, y
mostrando dichas bacterias una actividad proteasa extracelular no
menor que 400 U/OD_{590}:
Propiedades morfológicas
- 5)
- Forma de la célula; bacilo,
- 6)
- Movilidad; ninguna,
- 7)
- Formación de esporas; ninguna,
- 8)
- Tinción Gram; positiva,
Propiedades fisiológicas
- 7)
- Producción de catalasa; negativo,
- 8)
- Producción de indol; negativo,
- 9)
- Reducción de nitrato; negativo,
- 10)
- Crecimiento aeróbico; anaeróbico facultativo,
- 11)
- Formación de ácido DL-láctico a partir de glucosa mediante fermentación homoláctica sin formación de gases,
- 12)
- Degradación de carbohidratos:
- glucosa; +
- lactosa; +
- manosa; +
- fructosa; +
- galactosa; +
- sucrosa; -
- maltosa; -
- xilosa; -
- ramnosa; -
- celobiosa; -
- trealosa; -
- melibiosa; -
- rafinosa; -
- estaquiosa; -
- manitol; -
- sorbitol; -
- esculina; -
- salicina; -.
2. Las bacterias de ácido láctico de
Lactobacillus helveticus de la reivindicación 1, en las que
dichas bacterias de ácido láctico es la cepa CM4 de Lactobacillus
helveticus (número de depósito en el "National Institute of
Bioscience and Human-Technology Agency of
Industrial Science and Technology"; FERM
BP-6060).
3. Las bacterias de ácido láctico de
Lactobacillus helveticus de la reivindicación 1, en las que
dichas bacterias tienen un ADN cromosómico el cual da un fragmento
de ADN de 15 a 17 kb cuando dicho ADN cromosómico se digiere con
enzimas de restricción PstI y EcoRI.
4. Un producto lácteo fermentado que comprende
las bacterias de ácido láctico de la reivindicación 1, y un
tripéptido seleccionado entre el grupo que consiste en
Val-Pro-Pro,
Ile-Pro-Pro y mezclas de los
mismos.
5. El producto lácteo fermentado de la
reivindicación 4 comprendiendo además ácido
DL-láctico, en el que dicho producto contiene 30 a
50 \mug de dicho tripéptido en cuanto a
Val-Pro-Pro por 0,01 g de dicho
ácido DL-láctico.
6. El producto lácteo fermentado de la
reivindicación 4, en el que las bacterias de ácido láctico de la
reivindicación 1 están vivas.
7. El producto lácteo fermentado de la
reivindicación 4, en el que dicho producto lácteo fermentado se
selecciona entre el grupo que consiste en: yogurt, bebidas lácteas
ácidas, queso, alimentos procesados que contienen leche agria
fermentada y alimentos dietéticos que contienen leche agria
fermentada.
8. Un método para producir el producto lácteo
fermentado de la reivindicación 4, que comprende fermentar un medio
que contiene un material alimenticio seleccionado entre el grupo
que consiste en un péptido, una proteína y mezclas de los mismos que
incluyen la secuencia Val-Pro-Pro e
Ile-Pro-Pro, con las bacterias de
ácido láctico de la reivindicación 1.
9. El método de la reivindicación 8, en el que
dicho material alimenticio se selecciona entre el grupo que
consiste en: leche animal, caseína de la leche, maíz, proteína de
maíz, trigo, proteína de trigo, soja, leche de soja, soja sin grasa,
proteína de soja y mezclas de los mismos.
10. El método de la reivindicación 8, en el que
la fermentación se realiza a 25 a 50ºC durante 6 a 60 horas.
11. El método de la reivindicación 8, en el que
la fermentación se realiza bajo tales condiciones que la cantidad
de tripéptidos Val-Pro-Pro e
Ile-Pro-Pro producidos en la leche
fermentada resultante es 60 \mug en cuanto a
Val-Pro-Pro por ml.
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|---|---|---|---|
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Publications (1)
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES98901520T Expired - Lifetime ES2237834T3 (es) | 1997-09-26 | 1998-02-05 | Bacteria lactobacillus helveticus que tiene alta capacidad de produccion de un tripeptido, producto lacteo fermentado y procedimiento para su preparacion. |
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