MXPA00002575A - Bacterias de acido lactico del lactobacillus helveticus que tiene una productividad elevada de tripeptidos, producto de leche fermentada, y metodo de produccion de las mismas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un producto de leche fermentada que contiene bacterias delácido láctico capaces de producir una gran cantidad del lactotripéptido y una gran cantidad del ingrediente activo que tiene una actividad hipotensiva y un efecto antitensionante y que puede ser tomado agradablemente como alimentos o bebidas. Las bacterias delácido láctico del lactobacillus helveticus tiene propiedades bacteriológicas especificas, las bacterias, cuando se cultivan en un medio de la leche del animal que contiene 9%en peso de sólidos de la leche sin grasa, produce tripéptidos de Val-pro-pro e ile-pro- pro en una cantidad de 60 ug en términos del val-pro-pro por ml del medio y las bacterias exhiben la actividad de proteinasa extracelular no inferior a 400U/OD590. La cepa CM4 del Lactobacillus helveticus (depositada en el National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial science and technology, número de deposito FERM BP-6060. La invención también se refiere a un producto de leche fermentada obtenido por la fermentación de una leche de animal con esta bacteria delácido láctico.

Description

BACTERIAS DE ACIDO LÁCTICO DEL IACTOBACILLUS HELVETICUS QUE TIENE UNA PRODUCTIVIDAD ELEVADA DE TRIPEPTIDOS, PRODUCTO DE LECHE FERMENTADA, Y MÉTODO DE PRODUCCIÓN DE LAS MISMAS 5 Campo de la Invención La presente invención se refiere a nuevas bacterias del ácido láctico del Lactobacillus helveticus 10 que pueden producir un tripéptido particular con eficiencia elevada cuando las mismas son cultivadas en un medio de leche de animal y que tienen una actividad elevada de la proteinasa extracelular, a un producto de leche fermentada que contiene las bacterias del ácido láctico y a un método de producción del producto.

Antecedentes de la Técnica El lactobacillus helveticus ha sido empleado 20 para producir leche fermentada durante mucho tiempo como un iniciador para las bacterias de ácido láctico tipicas para los productos de leche de vaca. El lactobacillus helveticus tiene una actividad proteolitica elevada, y particularmente, su proteinasa extracelular que tiene una actividad elevada desempeña un papel importante en la fermentación de la leche del animal. Es decir, la proteinasa extracelular digiere las proteínas de la leche del animal para producir varios fragmentos de péptidos. Los péptidos producidos son sometidos adicionalmente a la acción de las peptidasas para llegar a ser péptidos de peso molecular inferior. Se sabe que una parte de los péptidos producidos en un medio debido a la acción de las enzimas de proteinasa es tomada en las células de las bacterias del ácido láctico y utilizadas como una fuente de nitrógeno. También se ha reportado que algunos de los péptidos producidos en el medio tienen una actividad inhibidora contra la enzima convertidora de la angiotensina (ACE) la cual provoca hipertensión. (J. Dairy Sci. 78:777-783 (1985)). Como los péptidos para inhibir la actividad de ACE y suprimir la elevación en la presión de la sangre, se han reportado varios péptidos efectivos, tales como aquellos derivados de los productos de la degradación de las proteínas de la leche, las proteínas de la soya o las proteínas de la carne de pescado. Por ejemplo, Val-Pro-Pro e Ile-Pro-Pro (abreviados aqui posteriormente como VPP e IPP, respectivamente. Estos péptidos son referidos aqui posterirmente como lactotripéptidos) son conocidos como péptidos que tienen una actividad inhibidora del ACE presente en una leche fermentada con el Lactobacillus helveticus. Estos lactotripéptidos se ha confirmado que tienen un efecto hipotensivo fuerte por experimentos utilizando la rata hipertensa espontáneamente (SHR) (J. 5 Dairy Sci. 78:1253-1257 (1995)). Sin embargo, la leche fermentada que contiene el lactotripéptido producido por la fermentación de la leche del animal con las cepas del Lactobacillus helveticus convencionales puede ser tomada difícilmente 10 como la misma es, a causa de que el mismo exhibe una acidez elevada debido a que una gran cantidad de ácido láctico es generada cuando progresa la fermentación. La dilución de la leche fermentada conduce a una disminución extrema en el contenido de los lactotripéptidos. 15 Por consiguiente, se desea producir leche fermentada con un contenido más elevado de los lactotripéptidos comparado con el contenido del ácido láctico generado en la leche fermentada. Con una adición de una cantidad pequeña de tal leche fermentada a varios alimentos y bebidas, los productos que tienen la función de los lactotripéptidos podrían ser preparados y provistos fácilmente a los consumidores en una forma agregable para su ingestión. Sin embargo, ninguna de las cepas de las bacterias del ácido láctico conocidas producen el lactotripéptido con una eficiencia elevada.

Descripción de la Invención Es un objeto de la presente invención proporcionar una nueva cepa de bacterias del ácido láctico la cual produzca una gran cantidad del lactotripéptido con una eficiencia elevada con respecto a la cantidad del ácido láctico generado. Es otro objeto de la presente invención proporcionar un producto de leche fermentada el cual contenga el lactotripéptido que tiene actividades tales como la actividad hipotensiva y se espera que tenga un efecto antitensionante, y una cepa de bacterias de ácido láctico capaz de producir una gran cantidad de este lactotripéptido y el cual pueda ser tomado agradablemente como alimentos o bebidas, y un método para producir el mismo. De acuerdo con la presente invención, se proporcionan bacterias de ácido láctico del Lactobacillus helveticus que tienen las siguientes propiedades bacteriológicas, dichas bacterias, cuando se cultivan en un medio de leche de animal que contiene 9 % en peso sólido de leche sin grasa, producen tripéptidos de Val- Pro-Pro y de Ile-Pro-Pro en una cantidad no menor que 60 µg en términos de Val-Pro-Pro por ml del medio, y las á?sá taJ?m** ** ***^. bacterias que exhiben una actividad de proteinasa extracelular no inferior que 400U/OD59o: (Propiedades Morfológicas) 5 1) Forma de la célula; bastón o barra, 2) Motilidad; ninguna, 3) Formación de esporas; ninguna, 4) Teñido Gram; positivo (Propiedades Fisiológicas) 10 1) Producción de Catalasa; negativa, 2) Producción de Indol; negativa, 3) Reducción de Nitrato; negativa, 4) Crecimiento Aeróbico; anaeróbico facultativo, 5) Formación de ácido DL-láctico a partir de la glucosa 15 por fermentación homoláctica sin formación de gases 6) Degradación de Carbohidratos glucosa; + lactosa; + mañosa; + 20 fructosa; + galactosa; + sucrosa; - maltosa; - xilosa; - 25 rhamnosa; - celobiosa; -trehalosa; -melibiosa; -raffinosa; -estaquiosa; -manitol; -sorbitol; -esculina; -salicina; -. De acuerdo con la presente invención, también se proporciona la bacteria del ácido láctico del Lactobacillus helveticus en donde la bacteria del ácido láctico es la cepa CM4 de Lactobacillus helveticus (depositada en el National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology el 15 de agosto de 1997, número de depósito FERM BP-6060) . De acuerdo con la presente invención, se proporciona además la bacteria del ácido láctico de Lactobacillus helveticus que tiene un ADN cromosómico el cual da un fragmento de ADN de 15 a 17 kb cuando el ADN cromosómico es digerido con las enzimas de restricción PstI y EcoRl. De acuerdo con la presente invención, se proporciona un producto de leche fermentada que contiene una leche fermentada que comprende la bacteria del ácido láctico mencionada anteriormente, y un tripéptido seleccionado del grupo que consiste de Val-Pro-Pro, Ile-Pro-Pro y las mezclas de los mismos. De acuerdo con la presente invención, también se proporciona un método para producir un producto de leche fermentada que comprende fermentar un medio que contiene un material alimenticio seleccionado del grupo que consiste de un péptido, una proteina y mezclas de los mismos que incluyen la secuencia Val-Pro-Pro e Ile-Pro-Pro, con la bacteria del ácido láctico.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 es una fotografía que muestra la configuración de electrofóresis del gel de agarosa de los fragmentos de ADN cromosómicos de varias cepas de Lactobacillus helveticus en el Ejemplo 2.

Modalidades Preferidas de la Invención La bacteria del ácido láctico de la presente invención pertenece al Lactobacillus helveticus, y está caracterizada porque la bacteria del ácido láctico produce tripéptidos de Val-Pro-Pro e Ile-Pro-Pro en una cantidad no menor que 60 µg, y preferentemente no menor que 70 µg en términos del Val-Pro-Pro por ml del medio cuando se cultiva en un medio de leche de animal que contiene 9 % en peso de sólido de leche sin grasa, y 5 exhibe una actividad de proteinasa extracelular no inferior a 4OOU/OD590 y preferentemente no menor que 43OU/OD590. La productividad del lactotripéptido definido es un Índice para distinguir la presente bacteria del ácido láctico de la bacteria del ácido láctico 10 convencional del Lactobacillus helveticus. Por ejemplo, por este índice está definida una propiedad de la presente bacteria de ácido láctico, cuando se cultiva en leche de animal que contiene 9 % en peso de sólidos de leche sin grasa, los lactotripéptidos en una cantidad no 15 menor que 60 µg en términos del VPP por ml del medio, lo cual podría no haber sido obtenido con la bacteria de ácido láctico convencional. Usualmente, mientras más reducido sea el contenido de sólidos de la leche sin grasa en el medio de cultivo, más pequeña es la cantidad de los lactotripéptidos que va a ser producida. Mientras más elevado sea el contenido de sólidos de la leche sin grasa, más grande es la cantidad del lactotripéptido. La productividad de los lactotripéptidos como el índice es medida por los pasos de inoculación con la bacteria del ácido láctico de la leche del animal, tal como la leche de vaca, la leche de cabra, la leche de caballo, y las leches desnatadas de las mismas, que contienen 9 % en peso de sólidos de la leche sin grasa, cultivar las bacterias a 37 °C durante 24 horas para 5 preparar la leche fermentada, centrifugar 1 ml de la leche fermentada a 15,000 rpm durante 10 minutos, someter el sobrenadante a la medición de las cantidades de VPP e IPP, y convertir las cantidades en la cantidad de VPP. La cantidad convertida del lactotripéptido en términos del 10 VPP es calculada por la siguiente ecuación puesto que la actividad inhibidora de ACE del IPP por peso unitario es de 1.7 veces aquella del VPP; Cantidad convertida del lactotripéptido (µg en términos 15 del VPP por ml) = cantidad de IPP (µg/ml) x 1.7 + cantidad de VPP (µg/ml) La productividad del lactotripéptido máxima no está limitada particularmente, pero puede ser lograda 20 cuando la totalidad de Val-Pro-Pro e Ile-Pro-Pro incluidas como las secuencias en la proteína del medio, son tomadas como los tripéptidos por digestión. La actividad de la proteinasa extracelular es medida de acuerdo con el método de Yamamoto et al. 25 (Yamamoto, N. et al. J. Biochem. (1993) 114, 740) basado en el método de Twining et al. (Twining, S. Anal. Biochem. 143 3410 (1984)), y expresa por definición la cantidad de la enzima que exhibe 1% de intensidad fluorescente, que va a ser de 1 U/OD59o. El límite superior de la actividad de la proteinasa extracelular no está limitada de ninguna manera, pero usualmente es de 800U/OD590. La presente bacteria del ácido láctico puede producir una gran cantidad del lactotripéptido con respecto a la cantidad del ácido láctico generado durante la fermentación. Por consiguiente, la fermentación utilizando la presente bacteria del ácido láctico conduce a una leche fermentada que contiene una cantidad más grande del lactotripéptido comparado con la leche fermentada que contiene una cantidad similar del ácido láctico preparada con las bacteria del ácido láctico convencional. El ácido láctico debido a tal fermentación es el ácido DL-láctico. La cantidad del lactotripéptido producido por la fermentación con la presente bacteria del ácido láctico preferentemente no es menor que 30 µg en términos de VPP por 1 ml de la leche fermentada resultante que contiene 0.01 g/ml del ácido DL-láctico generado durante la fermentación. El límite superior de la cantidad del lactotripéptido no está limitada particularmente, pero es posible para la bacteria ?g¡¡gg^ tó^M ¡^^^g^g^^^ producir hasta aproximadamente 50 µg en términos del VPP por 1 ml de la leche fermentada que contiene 0.01 g del ácido DL-láctico. La cantidad del ácido DL-láctico es aproximadamente proporcional a la cantidad del lactotripéptido. Por lo tanto, por ejemplo, cuando 0.02 g del ácido DL-láctico son producidos en 1 ml de leche fermentada, la cantidad de la producción del lactotripéptido es preferentemente no menor que 60 µg en términos del VPP. Por el contrario, por la fermentación con la bacteria del ácido láctico convencional, la cantidad del lactotripéptido es, cuando mucho, menor que 30 µg en términos del VPP por 0.01 g del ácido DL-láctico en 1 ml de leche fermentada. Como un ejemplo de la presente bacteria de ácido láctico, la cepa CM4 de Lactobacillus helveticus es depositada en FERM BP-6060 en el National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology (depositada el 15 de agosto de 1997). La cepa CM4 del Lactobacillus helveticus tiene las siguientes propiedades bacteriológicas: 1. Propiedades Morfológicas 1) Forma de la célula; bastón o barra, 2) Motilidad; ninguna 3) Formación de esporas; ninguna, 4) Teñido Grám; positivo ^^^^^-'^^te^¿a^^^=— 2. Propiedades Fisiológicas 1) Producción de Catalasa; negativa, 2) Producción de Indol; negativa, 3) Reducción de Nitrato; negativa, 5 4) Crecimiento Aeróbico; anaeróbico facultativo, 5) Formación de ácido DL-láctico a partir de la glucosa por fermentación homoláctica sin formación de gases 6) Degradación de Carbohidratos glucosa; + 10 lactosa; + mañosa; + fructosa; + galactosa; + sucrosa; - 15 maltosa; - xilosa; - rhamnosa; - celobiosa; - trehalosa; - 20 melibiosa; - raffinosa; - estaquiosa; - manitol; - sorbitol; - 25 esculina; - HJ^^^^^lH ¡¿ -l^ng salicina; -. Las propiedades bacteriológicas mencionadas anteriormente de la cepa CM4 son idénticas con la cepa NCDO-099 de Lactobacillus helveticus conocida públicamente, examinadas por el método de Mitsuoka et al.

(Rinshoulensa 18, 1163(1974). Sin embargo, en cuanto a las siguientes propiedades, las cuales no son descritas en Mitsuoka et al., el CM4 es distinguido claramente de NCDO-099. 7) Actividad de la proteinasa extracelular; no menor que 8) Productividad de lactotripéptido; producción de dos clases de tripéptidos (VPP e IPP) en una cantidad de 60 µg o más en términos de VPP por ml de líquido fermentado cuando se cultiva en un medio que contiene 9 % en peso de leche desnatada a 37 °C durante 24 horas La productividad del lactotripéptido en 8) es medida utilizando la leche desnatada como sólido de la leche sin grasa. La cepa de las bacterias del ácido láctico de la presente invención puede ser obtenida por la siguiente selección y medición de la actividad de la proteinasa extracelular.

^^^--- .. -^^^^^^A^^.^^-^^i.«^^MWfti^ - ~ « ~ - * * *** (1) Selección Primaria (Selección de la cepa por la medición de la actividad inhibitoria de ACE elevada en la leche fermentada) Las cepas que van a ser seleccionadas son cultivadas en un medio de leche desnatada al 9 % en peso a 37 °C durante 24 horas. Después de finalizar el cultivo, el número de bacterias del ácido láctico, la acidez del ácido láctico, y la actividad inhibitoria de ACE son medidas. Las cepas que producen lxlO8 células/ml o más de las bacterias del ácido láctico, y que exhiben una acidez del ácido láctico de 1.6 % en peso o mayor y una actividad inhibitoria del ACE de 40 unidades/ml son seleccionadas. La actividad inhibidora del ACE es medida por el método de Cushman y Cheung (Cushman, D. . Y Cheung, H.S. Pharmacol., 2JD 1637 (1971)). (2) Selección Secundaria (Selección de la cepa que tiene una productividad de lactotripéptido elevada) Los líquidos cultivados de las cepas seleccionadas por la selección primaria son centrifugadas a 15,000 rpm durante 10 minutos, y los sobrenadantes de los mismos son sometidos a CLAR por la cuantificación del lactotripéptido. Las cepas que produjeron no menos de 50 µg en los términos del VPP por ml son seleccionadas. 5 (3) Medición de la actividad de proteinasa extracelular Cada una de las cepas seleccionadas por la selección secundaria es cultivada en un medio de leche desnatada al 9 % en peso mientras que el pH del mismo es mantenido en 6. La muestra es tomada en la parte media de la fase de crecimiento logarítmico, y se mezcla con 1 % en peso del citrato de sodio, y se centrifuga a 5,000 rpm durante 10 minutos para colectar las células. Las células colectadas fueron lavadas con ácido ß-glicerofosfórico 50 M, y se suspende en solución amortiguadora de Tris-HCl al 50mM (pH 7.8) para ajustar la turbidez (OD59o) a 1. La actividad de la proteinasa sobre la superficie de la célula es medida entonces. Se confirmará que el resultado es correlativo con la productividad del lactotripéptido de las cepas medidas en la selección secundaria. La cepa de las bacterias del ácido láctico del Lactobacillus helveticus seleccionada por el método anterior puede ser identificada y distinguida de otras cepas de bacterias del ácido láctico por ejemplo, por la Ug£ productividad del lacfcotripéptido y la actividad de proteinasa extracelular mencionada anteriormente. La bacteria del ' ácido láctico de la presente invención preferentemente tiene, además de la 5 productividad del lactotripéptido y la actividad de la proteinasa extracelular mencionadas anteriormente, el ADN cromosómico de la cual da un fragmento de ADN de 15 a 17 kb cuando el ADN cromosómico es digerido con las enzimas de restricción PstI y EcoRI . Por lo tanto, las bacterias 0 del ácido láctico de la presente invención pueden ser distinguidas claramente de otras cepas de las mismas especies examinando si la cepa tiene el ADN cromosómico el cual proporciona tal fragmento de ADN. La existencia del fragmento de ADN de 15 a 17 5 kb puede ser confirmada extrayendo el ADN cromosómico de la bacteria del ácido láctico de acuerdo con el método de Leenhouts et al. (Leenhouts, K. (1990) Appl. Environ.Microbiol. 56:2726), digiriendo el ADN cromosómico con EcoRI y PstI, efectuando la 0 electrofóresis con gel de agarosa al 0.8% de los fragmentos digeridos, y analizando la configuración de electrofóresis resultante. Durante la electrofóresis, la existencia del fragmento del ADN es confirmada claramente sometiendo el ADN del fago ? con una enzima de * " '?^ J ^bai restricción Hind III a electrofóresis paralela como un marcador del tamaño. El producto de leche fermentada de la presente invención contiene como un componente requerido, la leche fermentada que contiene la bacteria del ácido láctico y el tripéptido seleccionado del grupo que consiste de VPP, IPP y mezclas de los mismos. Es decir, el producto de leche fermentada de la presente invención contiene leche fermentada que contiene el lactotripéptido y las bacterias del ácido láctico, y se prepara por la fermentación de un medio que contiene un material alimenticio compuesto de los péptidos y/o las proteínas que incluyen la secuencia de VPP y/o IPP con las bacterias de ácido láctico de la presente invención. Por consiguiente, el contenido de las bacterias del ácido láctico y el tripéptido puede ser seleccionada adecuadamente dependiendo de la clase del producto de leche fermentada que va a ser preparado. El presente producto de leche fermentada puede contener el propio producto fermentado obtenido, un producto fermentado diluido, o un producto fermentado purificado. El producto de leche fermentada de la presente invención contiene el ácido DL-láctico generado durante la fermentación. El producto de leche fermentada de la presente invención contiene preferentemente el lactotripéptido en una cantidad de 30 a 50 µg en términos del VPP con respecto a 0.01 g del ácido DL-láctico. La cantidad del ácido DL-láctico es aproximadamente proporcional a la cantidad del lactotripéptido. Por consiguiente, si el producto de leche fermentada contiene una leche fermentada concentrada y contiene, por ejemplo, 0.02 g del ácido DL-láctico, la cantidad del lactotripéptido está preferentemente en un intervalo de 60 a 100 µg en términos del VPP. Si el producto de leche fermentada contiene una leche fermentada diluida y contiene, por ejemplo, 0.005 g del ácido DL-láctico, la cantidad del lactotripéptido es preferentemente de 15 a 25 µg en términos del VPP. Aunque el producto de leche fermentada de la presente invención puede contener el ácido L-láctico, el cual es un aditivo alimenticio para ajustar la acidez, este ácido L-léctico va a ser distinguido del ácido DL-láctico generado durante la fermentación. Las bacterias del ácido láctico en el producto de leche fermentada de la presente invención puede ser ya sea esterilizado después de la fermentación, o mantenerse vivas sin esterilización. El producto de leche fermentada de la presente invención puede ser el yogur, bebidas acidas que contienen leche, queso, alimentos procesados que contienen leche agria fermentada, y alimentos saludables que contienen leche agria fermentada. Por consiguiente, el producto de leche fermentada de la presente invención puede contener, además de la leche fermentada como el componente requerido, varios materiales los cuales son agregados usualmente para producir tal variedad de productos. El producto de leche fermentada de la presente invención puede estar en la forma de sólidos tales como polvos, granulos y tabletas, o de fluidos tales como una pasta, gel y líquido. El método para producir el producto de leche fermentada de la presente invención incluye la fermentación con las bacterias del ácido láctico de un medio que contiene un material alimenticio seleccionado del grupo que consiste de un péptido, una proteína y mezclas de los mismos incluyendo Val-Pro-Pro y/o Ile-Pro-Pro como una parte de su secuencia. El material alimenticio en el medio puede ser de cualquier clase siempre que el mismo contenga péptidos y/o proteínas que incluyan, como una parte de su secuencia, el VPP y/o IPP. Por ejemplo el material alimenticio puede ser leche de animal, caseína de la leche, maíz, proteína del maíz, trigo, proteína de trigo, soya, leche de soya, soya desgrasada, proteína de soya, o mezclas de las mismas. Particularmente, es preferible emplear un material alimenticio que contiene leche animal tal como la leche de vaca, leche de cabra, leche de caballo, o leches desnatadas de éstas. El contenido del sólido de la leche sin grasa en la leche del animal no 5 está limitado particularmente, pero usualmente es de 5 a 20 % en peso. No existe límite particular sobre la cantidad de las bacterias del ácido láctico con la cual el medio es inoculado. La cantidad de inoculación es usualmente de 10 manera aproximada de 105 a 107 células de las bacterias del ácido láctico por 1 g del material alimenticio específico mencionado anteriormente en el medio. La fermentación puede ser efectuada en el intervalo de 25 a 50 °C y preferentemente de 30 a 45 °C, durante 6 a 30 horas y preferentemente 10 a 24 horas, en el intervalo de pH preferentemente de 3.0 a 4.0, y más preferentemente de 3.0 a 3.5. La fermentación es efectuada preferentemente de tal modo que la cantidad del lactotripéptido no sea menor 20 que 60 µg en términos del VPP por ml de la leche fermentada resultante. Específicamente, cuando la leche de vaca que contiene 9 % en peso de sólidos de leche sin grasa es empleada como un medio, la fermentación en el intervalo de 25 a 40 °C durante 12 a 48 horas conduce a 25 una leche fermentada que contiene el lactotripéptido en ^^^^|i una cantidad no menor que 70 µg en términos del VPP por ml. El contenido de sólidos de leche sin grasa en el medio es aproximadamente proporcional al lactotripéptido que va a ser producido. Por ejemplo, si el material 5 alimenticio contiene 5 % en peso de sólidos de leche sin grasa, la fermentación de acuerdo con las condiciones mencionadas anteriormente podría conducir a la producción del lactotripéptido en una cantidad de aproximadamente 33.3 µg en términos del VPP por ml . 10 La leche fermentada obtenida por la fermentación mencionada anteriormente puede ser mezclada con el producto como tal. Si es necesario, la leche fermentada puede ser sometida a dilución o purificación antes del mezclado. La leche fermentada puede ser enfriada y almacenada a 5 °C, y luego mezclada con otros componentes para preparar un producto tal como un producto enfriado. Alternativamente, la leche fermentada puede ser sometida a tratamiento de esterilización con calor, y, si es necesario, pulverizada por deshidratado por aspersión para preparar un producto para la distribución en una temperatura ordinaria. Puesto que el producto de leche fermentada de la presente invención contiene la leche fermentada obtenida por la fermentación con las bacterias del ácido láctico, la misma puede ser utilizada para preparar fácilmente productos que tienen un contenido elevado del lactotripéptido con respecto al contenido del ácido láctico, en una forma agregable para tomarse. El producto de leche fermentada se espera que exhiba un efecto 5 hipotensivo y un efecto antitensionante del lactotripéptido cuando se tome por un ser humano. Puesto que las bacterias del ácido láctico de la presente invención pueden producir una gran cantidad del lactotripéptido cultivándolas en el material alimenticio específico, las bacterias son útiles en la producción de una variedad de productos de leche fermentada, alimentos funcionales, alimentos saludables, alimentos para uso sanitario específicos, alimentos para uso específico en gente anciana, y los materiales de los mismos, que tienen un efecto hipotensivo y un efecto relevante de la tensión del lactotripéptido.

Ejemplos de la Invención La presente invención será explicada con mayor detalle aquí posteriormente por la referencia a los ejemplos, pero la presente invención no está limitada a los mismos. Entre las cepas de Lactobacillus helveticus utilizadas en los Ejemplos, la cepa de CM4 es depositada ?jg^^^^^^^^^^^^^^ en el National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology y ha sido registrada con el número de acceso FERM BP-6060. Las ATCC15009, NCDO-099, JCM1006, ATCC10797, JCM1062, JCM1103, JCM1120 y JCM1104 son cepas disponibles públicamente. Las cepas diferentes de las cepas anteriores utilizadas en los Ejemplos son seleccionadas de la colección de cepas del solicitante.

Ejemplo 1 (Selección de las cepas que dan una leche fermentada que tiene una actividad inhibidora elevada del ACE) 36 cepas del Lactobacillus helveticus aisladas de varios productos de lechería fueron seleccionadas. La actividad inhibidora del ACE de la leche fermentada con cada una de las cepas se midió por el siguiente procedimiento. Cada una de las cepas de Lactobacillus helveticus se cultivó en un 9 % en peso de sólidos del medio de leche sin grasa a 37 °C durante 24 horas. El medio cultivado se agregó a un medio fresco del mismo tipo en tal cantidad que el nuevo medio contenga 3 % en peso del medio cultivado. La fermentación se efectuó adicionalmente a 37 °C durante 24 horas. Después de finalizar la fermentación, la acidez del ácido láctico (% en peso), la cantidad del péptido en el suero (mg/ml), el número de células y la actividad inhibidora del ACE (U/ml) fueron medidos. Los resultados son mostrados en la Tabla 1. 7 cepas de las 36 cepas tuvieron una capacidad de fermentación muy débil. 15 cepas produjeron leche fermentada con la acidez del ácido láctico generado de no menos de 1.6 % en peso. De las 15 cepas, 8 cepas que tienen una actividad inhibidora del ACE de no menos de 40U/ml en su leche fermentada fueron seleccionadas.

(Medición de la actividad inhibidora del ACE de la leche fermentada) La actividad inhibidora del ACE se midió de acuerdo con el método de Cushman y Cheung (Cushman, D.W. y Cheung, H.S. Pharmacol., 20 1637(1971). Es decir, cada una de las leches fermentadas se centrifugó a 15,000 rpm durante 5 minutos para obtener el sobrenadante (suero) .

El suero se diluyó adecuadamente para la medición. 80 µl del suero diluido se colocan en un tubo, se mezclan con 0.2 ml de amortiguador de ácido bórico 0.1M (que contiene 0.3M de NaCl, pH 7.3) que contiene 5 mM de hippurilo histidina leucina (Hip-His-Leu, fabricada por SIGMA CHEMICALS CO. ) como un substrato, y se mezcla Hgg adicionalmente con 20 µl de la solución de la enzima (0.1 U/ml, fabricado por SIGMA CHEMICALS CO. ) . La mezcla resultante se hizo reaccionar a 37 °C durante 30 minutos, y luego se mezcla con 250 µl del ácido clorhídrico ÍN 5 para la terminación de la reacción. Subsiguientemente, la mezcla se combina con 1.7 ml del acetato de etilo, se agita durante 20 segundos, y luego se centrifuga a 3,000 rpm durante 10 minutos para recuperar 1.4 ml de la fase de acetato de etilo (fase superior) . La fase superior se calienta a 120 °C durante 40 minutos para remover el solvente, se mezcla con 1 ml de agua destilada, y se agita durante 20 segundos. El ácido hippurílico extraído se mide por absorbencia a 228 nm. La actividad de la enzima en la unidad se calcula por la siguiente ecuación con la cantidad que proporciona una inhibición del 50% de la actividad de ACE que es definida como una unidad.

Cantidad de la enzima (unidad) = ( (A-B) / (A-C) ) xl00xl/50 A: Absorbencia a 228 nm sin la muestra 20 B: Absorbencia a 228 nm con la muestra C: Absorbencia a 228 sin la enzima ni la muestra (Análisis cuantitativo de la cantidad de los péptidos en la leche fermentada) El análisis cuantitativo de los péptidos se efectuó de acuerdo con el método OPA (Carch, F.C. et al. J. Diary Scí. 66 1219 (1883)). Como una substancia estándar para generar una curva de calibración, la caseína digerida con tripsina fue empleada.

Tabla 1 (Selección de las cepas que tienen una productividad elevada de lactripéptidos) Subsiguientemente, las 8 cepas que dieron la leche fermentada que tiene la actividad inhibidora elevada del ACE que se seleccionaron anteriormente, se miden para VPPO e IPP en su leche fermentada. 1 ml de la leche fermentada se centrifugó a 15,000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante de la misma, es decir el suero, fue colectado. 0.3 ml del suero se sometieron a adsorción con un Cartucho Sep-Pak (fabricado por WATERS INC.), se lava con agua destilada, y luego se eluye con 5 ml de metanol. El eluido se seca bajo centrifugación y presión reducida. El producto seco se disuelve en 0.3 ml de una solución acuosa al 0.05% del ácido trifluoroacético, y se somete a análisis de CLAR (cromatografía líquida de alta resolución) bajo las siguientes condiciones. Los resultados se muestran en la Tabla 2. Aparato Empleado: detector Hitachi L4000UV (a 215nm) bomba inteligente L6200 horno de columna L5030 (35 °C) Condición de la Elución: Velocidad de flujo 0.5 ml/min.

Eluyente: Solución acuosa que contiene 0.3M de NaCl y 0.05% de ácido trifluoroacético Columna: Asahipak GS320 (f 3.9x600mm) Puesto que la actividad inhibidora de ACE del IPP por peso unitario es 1.7 veces aquella del VPP, la cantidad de los lactotripéptidos en términos del VPP se calculó a partir de las cantidades medidas del IPP y el VPP de acuerdo con la siguiente ecuación. Los resultados se muestran en la Tabla 2. 10 Cantidad convertida del lactotripéptido (µg en términos del VPP por ml ) = Cantidad del IPP (µg/ml)xl.7 + Cantidad del VPP (µg/ml) Tabla 2 ati .^ * ^á^.. .^^.^M HjU La leche fermentada de CM4 tuvo la cantidad más grande del lactotripéptido en términos de VPP, es decir, 78.5 µg/ml de suero. Otras siete cepas dieron la cantidad promedio de 34.2 µg/ml de suero.

(Medición de la proteinasa extracelular) La actividad de proteinasa extracellular se midió en 16 cepas las cuales dieron resultados relativamente buenos en la fermentabilidad mostrada en la Tabla 1. La medición se efectuó de acuerdo con el método de Yamamoto et al. (Yamamoto, N. et al. J. Biochem. (1993) 114, 740) basado en el método de Twining et al. (Twining, S. Anal. Biochem. 1_43 3410 (1984)). Es decir, cada cepa se cultivó en un medio de leche desnatada al 9 % en peso mientras que el pH del mismo se mantuvo en 6.0. La muestra fue tomada en la parte media de la fase de crecimiento logarítmico, y se mezcló con el citrato de sodio de modo que la concentración final fue del 1 % en peso, para aclarar el medio de la leche. La mezcla se centrifugó a 5,000 rpm durante 10 minutos para colectar las células. Las células fueron lavadas con ácido ß- glicerofosfórico 50 mM, y se suspendió en una solución amortiguadora de Tris-HCl 50 mM (pH 7.8) para ajustar la turbidez (OD590, es decir se midió por absorbencia a 590nm) a l. 30 µl de la suspensión se mezclaron con 20 µl de caseína-fluorosceína al 0.4% (fabricada por SIGMA CHEMICALS CO.), y se incubó a 42 °C durante 1 hora. La mezcla se mezcló adicionalmente con 120 µl de ácido tricloroacético al 5%, se permitió que repose durante 20 minutos, y se centrifugó a 15,000 rpm durante 10 minutos. 60 µl del sobrenadante se agregan a 3 ml de amortiguador de tris-HCl 500 mM (pH 8.3), y la intensidad fluorescente del mismo se midió por la detección de la fluorescencia de 525 nm producida a una longitud de onda de excitación de 490 nm. La actividad de proteinasa extracelular en unidades se calcula con la cantidad de la enzima la cual exhibe 1% de intensidad fluorescente bajo las condiciones anteriores que son definidas como una unidad. Los resultados son mostrados en la Tabla 3.

Z ?Z.-rZ.l?.~í.., Tabla 3 La actividad del Lactobacillus helveticus CM4 fue la más elevada, es decir, 450 U/OD590. La actividad promedio para las otras 16 cepas fue de 141U/OD59o, la cual es aproximadamente una tercera parte de aquella de la cepa CM4.

Ejemplo 2 De las 11 cepas de las 36 cepas del Lactobacillus helveticus seleccionadas en el Ejemplo 1, el ADN cromosómico fue extraído de acuerdo con el método de Leenhouts et al. (Leenhouts, K. (1990) Appl. Environ.Microbiol. 56:2726), se digirió con varias enzimas de restricción, y se sometió a electrofóresis de gel de agarosa al 0.8% para analizar la configuración por electrofóresis . Como resultado, un fragmento de ADN 5 característico fue observado entre los fragmentos de ADN del cromosoma de la cepa CM4 digerida con EcoRI y PstI (mostrado por la flecha 1 en la Figura 1) . Tal fragmento no fue observado en los fragmentos de los cromosomas de las cepas diferentes de CM4, y fragmentos más cortos que el fragmento característico de CM4 fueron observados en la mayoría de otras cepas (mostradas por la flecha 2 en la Figura 1) . El peso molecular del fragmento característico se midió por electrofóresis comparativa de los productos de la digestión de Hind III del ADN del fago ? como los marcadores de tamaño (23.1 kb, 9.4 kb, 6.6 kb, 4.4 kb, 2.3 kb y 2.0 kb, en el orden de incremento de la movilidad) , y se encontró que va a ser de aproximadamente 16 kb. Por consiguiente, se confirmó que la cepa CM4 tiene un ADN cromosómico el cual provee el fragmento de ADN que tiene el peso molecular de aproximadamente 16 kb, por la digestión con EcoRI y PstI. También se confirmó que las cepas diferentes de CM4 tienen el ADN cromosómico el cual dio un fragmento de ADN común que tiene un peso molecular de aproximadamente 13 kb. |jjy¿b^ .«JtofcM*^.^^fe,^^^^»^..

Ejemplo 3 Una leche fermentada fue producida con la cepa de CM4 de Lactobacillus helveticus seleccionada en el Ejemplo 1. La cepa CM4 fue cultivada en 100 g de leche desnatada al 9 % en peso a 37 °C durante 12 horas. Subsiguientemente, 3 kg del medio fresco se inoculan con la leche desnatada cultivada, y se cultivan a 37 °C durante 12 horas. Después de finalizada la fermentación, la totalidad de la leche fermentada (número de las células de la cepa de CM4; 6.3xl08 células/ml) fue utilizada como un iniciador o arrancador para la fermentación de 100 kg de leche desnatada al 9 % en peso a 32 °C durante 20 horas. Después de terminada la fermentación, 74.8 µg/ml del lactotripéptido estuvieron contenidos en la leche fermentada. El contenido del ácido láctico fue del 1.9 % en peso. 43 kg de la leche fermentada obtenida se mezclaron con 4 kg de azúcar granulada, 3 kg de agua y 0.15 g de metoxipectina superior, y se homogeneizó para obtener 50 kg de bebida de yogur. La bebida de yogur tuvo un sabor suave preferentemente, de pH de 3.6 y 4.6xl08 células/g de células de CM4 vivas.

Ejemplo 4 26.5 kg de la leche fermentada obtenida en el Ejemplo 3 se mezclan con 45.0 kg de azúcar granulada, 4.7 kg de jarabe con un contenido elevado de maltosa y 13.8 kg de agua. Se agregan 10 kg de solución de metoxipectina superior al 3% en peso a la mezcla bajo agitación. La mezcla resultante se homogeiniza utilizando un homogeneizador de laboratorio (fabricado por ATV GAULIN, INC., Modelo 15M-8BA) bajo una presión de tratamiento de 150 kg/cm2 y a una velocidad de flujo de tratamiento de 2500 ml/min. El líquido homogeneizado se mezcló con un sabor de vainilla y se esterilizó por calentamiento hasta 85 °C. La leche fermentada así esterilizada se cargó en una botella de vidrio de 200 ml mientras que está caliente. El contenido del lactotripéptido en el producto de leche fermentada esterizada fue medido. Se encontró que el contenido del lactotripéptido correspondió con aquel en la leche fermentada antes de la esterilización. También se encontró que el contenido del ácido láctico fue del 0.5 % en peso.

Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la cittóa invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes 15 20 25 ggmí *-***-— - «****A> * L***>~*»Í ggsgggg

Claims (11)

U REIVINDICACIONES

1. Las bacterias del ácido láctico del Lactobacillus helveticus, caracterizadas porque tienen 5 las siguientes propiedades bacteriológicas, dichas bacterias, cuando se cultivan en un medio de la leche animal que contiene 9 % en peso de sólidos de la leche sin grasa, producen los tripéptidos de Val-Pro-Pro e Ile- Pro-Pro en una cantidad no menor que 60 µg en términos 10 del Val-Pro-Pro por ml del medio, y las bacterias exhiben una actividad de la proteinasa extracelular no menor que 400U/OD590: (Propiedades Morfológicas) 1) Forma de la Célula: bastón o barra, 15 2) Motilidad; ninguna, 3) Formación de esporas; ninguna, 4) Teñido Gram; positivo (Propiedades Fisiológicas) 1) Producción de Catalasa; negativa, 20 2) Producción de Indol; negativa, 3) Reducción de Nitrato; negativa, 4) Crecimiento Aeróbico; anaeróbico facultativo, 5) Formación de ácido DL-láctico a partir de la glucosa por fermentación homoláctica sin formación de gases 25 6) Degradación de Carbohidratos >1¡ j^ÜH ¿•'. íSa glucosa; + lactosa; + mañosa; + fructosa; + galactosa; + sucrosa; -maltosa; -xilosa; -rhamnosa; -celobiosa; -trehalosa; -melibiosa; -raffinosa; -estaquiosa; -manitol; -sorbitol; -esculina; -salicina; -.

2. Las bacterias del ácido láctico del Lactobacillus helveticus de la reivindicación 1, caracterizadas porque las bacterias del ácido láctico son la cepa CM4 del Lactobacillus helveticus (número de depósito en el National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology; FERM BP-6060) .

3. Las bacterias del ácido láctico del Lactobacillus helveticus de conformidad con la reivindicación 1, caracterizadas porque las bacterias tiene un ADN cromosómico el cual provee un fragmento de ADN de 15 a 17 kb cuando el ADN cromosómico es digerido con las enzimas de restricción PstI y EcoRI .

4. Un producto de leche fermentada, caracterizado porque comprende las bacterias del ácido láctico de conformidad con la reivindicación 1, y un tripéptido seleccionado del grupo que consiste de Val-Pro-Pro, Ile-Pro-Pro y mezclas de los mismos.

5. El producto de leche fermentada de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque además comprende el ácido DL-láctico, en donde el producto contiene 30 a 50 µg del tripéptido en términos de Val-Pro-Pro por 0.01 g del ácido DL-láctico.

6. El producto de leche fermentada de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque 7» las bacterias del ácido láctico de la reivindicación 1 están vivas.

7. El producto de leche fermentada de 5 conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el producto de leche fermentada se selecciona del grupo que consiste de yogur, bebidas de leche acida, queso, alimentos procesados que contienen leche agria fermentada, y alimentos saludables que contienen leche 10 agria fermentada.

8. Un método para producir el producto de leche fermentada de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque comprende fermentar un medio que 15 contiene un material alimenticio seleccionado del grupo que consiste de un péptido, una proteína y mezclas de los mismos que incluyen la secuencia de Val-Pro-Pro e Ile- Pro-Pro, con la bacteria del ácido láctico de la reivindicación 1. 20

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el material alimenticio se selecciona del grupo que consiste de leche animal, caseína de la leche, maíz, proteína de maíz, trigo, proteína del trigo, soya, leche de soya, soya sin grasa, proteína de soya, y mezclas de los mismos.

.10. El método de conformidad con la 5 reivindicación 8, caracterizado porque la fermentación se efectúa en el intervalo de 25 a 50 °C durante 6 a 60 horas.

11. El método de conformidad con la 10 reivindicación 8, caracterizado porque la fermentación es efectuada bajo condiciones tales que la cantidad de los tripéptidos Val-Pro-Pro e Ile-Pro-Pro producida en la leche fermentada resultante es de 60 µg en términos de Val-Pro-Pro por ml . 15 20 25 ^^a^ ¿^ a^s—-^^^^^^^ BACTERIAS DE ACIDO LÁCTICO DEL LACTOBACILLUS HELVETICUS QUE TIENE UNA PRODUCTIVIDAD ELEVADA DE TRIPEPTIDOS , PRODUCTO DE LECHE FERMENTADA, Y MÉTODO DE PRODUCCIÓN DE LAS MISMAS RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un producto de leche fermentada que contiene bacterias del ácido láctico capaces de producir una gran cantidad del lactotripéptido y una gran cantidad del ingrediente activo que tiene una actividad hipotensiva y un efecto antitensionante, y que puede ser tomado agradablemente como alimentos o bebidas. Las bacterias del ácido láctico del Lactobacillus helveticus tiene propiedades bacteriológicas específicas, la bacterias, cuando se cultivan en un medio de la leche del animal que contiene 9 % en peso de sólidos de la leche sin grasa, produce tripéptidos de Val-Pro-Pro e Ile-Pro-Pro en una cantidad de 60 µg en términos del Val-Pro-Pro por ml del medio, y las bacterias exhiben la actividad de proteinasa extracelular no inferior a 400U/OD590. La cepa CM4 del Lactobacillus helveticus (depositada en el National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology, número de depósito FERM BP-6060) . La invención también se refiere a un producto de leche fermentada obtenido por la fermentación de una leche de animal con esta bacteria del lácido láctico.