ES2941238T3 - Péptidos antihipertensivos del aceite de oliva - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a péptidos, a saber, aislados del aceite de oliva, que muestran actividad antihipertensiva. Los péptidos aislados de la invención comprenden al menos dos cisteínas separadas por n aminoácidos, siendo n un número entero de 0, 1, 2 ó 3, y con una longitud entre 5 y 10 aminoácidos. La invención también se refiere a composiciones y alimentos funcionales que comprenden dichos péptidos, así como a su uso como medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas a la hipertensión arterial y un método para su obtención. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Péptidos antihipertensivos del aceite de oliva

La invención se refiere en general a un péptido aislado del aceite de oliva, que muestra actividad antihipertensiva. La invención se refiere también a su uso como medicamento para el tratamiento de la prehipertensión y la hipertensión.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La hipertensión, o presión arterial elevada, es una enfermedad que afecta aproximadamente al 40% de los adultos de 25 años o más. Se define clínicamente como una presión arterial sistólica de 140 mm Hg o superior y una presión arterial diastólica de 90 mm Hg o superior. Los niveles normales de presión arterial sistólica y diastólica son especialmente importantes para la función eficiente de órganos vitales como el corazón, el cerebro y los riñones y para la salud y el bienestar general. Además, la hipertensión es un factor de riesgo principal de enfermedades cardiovasculares. Supone una seria amenaza para la salud de la población dado que en muchos casos es la causa de enfermedades coronarias, ictus e infarto de miocardio.

Aunque en la mayoría de los casos las causas de la hipertensión se desconocen, el sistema de renina-angiotensina desempeña un papel importante en la regulación de la presión arterial, el volumen sanguíneo y el tono vascular. En este sistema, un péptido denominado angiotensina I es hidrolizado por la acción de la enzima convertidora de la angiotensina (ACE). El producto de reacción, la angiotensina II, es un potente vasoconstrictor. La angiotensina II induce hipertensión al estimular la contracción de los músculos lisos en las paredes de los vasos sanguíneos. Además, la ACE estimula la degradación de bradicinina, un péptido que reduce la presión arterial. Por tanto, la inhibición de ACE evita no sólo la formación de angiotensina II, estimulando la hipertensión por péptidos, sino que también inhibe la hidrólisis de péptidos que reducen la presión arterial (bradicinina). Por tanto, la inhibición de ACE reduce la presión arterial y es posible reducir la hipertensión.

Existen en el mercado varios compuestos farmacéuticos cuyo mecanismo de acción es precisamente la inhibición de la ACE. Entre los ejemplos de estos fármacos se incluyen benaceprilo (Lotensin), captopril (Capoten), captopril / hidroclorotiacida (Capozide), maleato de enalapril (Vasotec), fosinoprilo (Monopril), lisinoprilo (Prinivil, Zestril), quinaprilo / carbonato de magnesio (Accupril), ramiprilo (Altace), trandolaprilo (Mavik). Estos inhibidores de ACE se usan ampliamente en el tratamiento hipertensivo y su uso se encuentra en auge continuo. Aunque estos productos farmacéuticos son eficaces para reducir la presión arterial, existen numerosos efectos secundarios producidos por los inhibidores de ACE. Estos efectos incluyen desarrollo de tos seca nocturna, mareo y cefaleas, y pueden provocar reacciones alérgicas ocasionalmente graves. Los inhibidores de ACE pueden causar también acumulación de potasio y problemas renales, de manera que es preciso vigilar los niveles de potasio y la función renal. Además, todos los inhibidores de ACE parecen capaces de producir una reacción alérgica grave que podría ser fatal.

Los inhibidores de ACE de péptidos bioactivos han sido aislados a partir de distintas fuentes de origen animal y vegetal. La inmensa mayoría de los péptidos inhibidores de la ACE descritos hasta ahora se obtienen por la acción de proteasas específicas en diferentes fuentes de proteínas de la dieta, entre ellas productos lácteos (fracciones hidrolizadas de caseína y suero de la leche) y leches fermentadas, huevos, soja, guisantes, frutos secos, atún, sardinas, gambas, pollo, calamar, entre otros [revisado en Saadi S, Saari N, F Anwar Abdul Hamid A, HM Ghazali. Recent advances in food biopeptides: Production, biological functionalities and therapeutic applications. Biotechnol Adv. 2015, 33: 80-116]. Los ejemplos más estudiados y representativos de estos inhibidores de ACE de péptidos bioactivos están presentes en los hidrolizados de las proteínas de la leche, obtenidos por diferentes enzimas y por fermentación de la leche con distintas bacterias. Sin embargo, la existencia de péptidos bioactivos con funciones definidas puede producirse también de forma natural (como en la leche materna) sin el uso de proteasas para su producción [Mandal SM, Bharti R, Porto WF, SS necessary Gauri, Mandal M, Franco OL, AK Ghosh. Identification of multifunctional peptides from human milk. Peptides. 2014, 56: 84-93]. Los efectos antihipertensivos de algunos de estos péptidos obtenidos de las proteínas de la leche han sido estudiados en modelos animales y en sujetos humanos [Ricci I Artacho R, M. Olalla With Milk protein peptides angiotensin I-converting enzyme inhibitory (ACEI) activity. Crit Rev Food Sci Nutr. 2010, 50:390-402]. Algunos ejemplos de péptidos que tienen actividad hipertensiva demostrada en modelos animales de hipertensión y sujetos humanos hipertensos son Ile-Pro-Pro (IPP) y Val-Pro-Pro (VPP). Análogamente, las solicitudes de patente europea EP-1.568.707-A1 y EP-2.495.250-A2 desvelan nuevos péptidos antihipertensivos obtenidos de hidrolizados de la caseína.

La solicitud de patente US4477440A describe péptidos y análogos del mismo que inhiben la renina y son útiles para tratar varias formas de hipertensión e hiperaldosterismo asociado a renina.

La publicación de Esteve C. et al. 2015 (Food Chemistry, 167: 272-280) describe péptidos antioxidantes y antihipertensivos extraídos de semillas de aceitunas con cinco enzimas diferentes.

No obstante, sería deseable identificar nuevos péptidos antihipertensivos alternativos a los existentes en la técnica con el fin de mejorar el tratamiento de enfermedades asociadas con presión arterial elevada.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han descubierto que los péptidos que comprenden dos cisteínas separadas por 0 aminoácidos, que consiste en una longitud entre 8, 9 o 10 aminoácidos , y que comprende la secuencia SEQ ID NO: 7 son, sorprendentemente, capaces de inhibir la actividad de la enzima convertidora de la angiotensina (ACE), siendo así útiles como agentes antihipertensivos. Los péptidos se aislaron y caracterizaron a partir del aceite de oliva y de los subproductos de la industria del aceite de oliva. Como puede verse en el Ejemplo 1, las materias primas se sometieron a diferentes procesos de extracción con disolventes orgánicos y los extractos se concentraron para obtener una composición rica en péptidos. Estos péptidos fueron purificados adicionalmente usando una cromatografía líquida por separación rápida de proteínas (FPL^c ), y se determinaron las secuencias de aminoácidos de los mismos mediante cromatografía líquida de nanoescala-Orbitrap acoplada con espectrometría de masas en tándem y secuenciación de novo (nanoLC-Orbitap-EM/EM). En el Ejemplo 2 se muestra la capacidad de estos péptidos para inhibir la actividad de la enzima convertidora de la angiotensina (ACE).

A la vista de lo anterior, los autores de la invención han desarrollado un conjunto de aspectos inventivos que se describirán en detalle a continuación. La presente invención se define por las reivindicaciones.

Péptido de la invención

Los inventores han descubierto que los péptidos que comprenden al menos dos cisteínas separadas por n aminoácidos, siendo n un número entero de 0, 1, 2 o 3, y que consisten en una longitud entre 5 y 10 aminoácidos consecutivos son capaces de inhibir la actividad de la enzima convertidora de la angiotensina (ACE), siendo así útiles como agentes hipertensivos (ver tabla 1 de abajo).

Tabla 1. Secuencias de péptidos antihipertensivos identificadas.

La nomenclatura usada en los péptidos enumerados en la Tabla 1 es la siguiente: A, alanina; C, cisteína; D, ácido aspártico; E, ácido glutámico; F, fenilalanina; G, glicina; H, histidina; K, lisina; L, leucina; M, metionina; N asparagina; P, prolina; Q, glutamina; R, arginina; S, serina; T, treonina; V, valina; W, triptófano; Y, tirosina. En las secuencias, la leucina (L) puede ser sustituida por isoleucina (I).

Así, en un aspecto, la presente invención se refiere a un péptido aislado, o cualquiera de las sales, ésteres, solvatos y anhidratos farmacéuticamente aceptables del mismo, denominado en lo sucesivo “péptido de la invención”, que comprende al menos dos cisteínas separadas por 0 aminoácidos, que consiste en una longitud entre 8, 9 o 10 aminoácidos, en el que el péptido muestra actividad antihipertensiva y comprende la secuencia SEQ ID NO: 7.

El término "péptido" tal como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a una serie lineal de restos de aminoácidos naturales, no naturales y/o modificados químicamente unidos entre sí por enlaces peptídicos. Los restos de aminoácidos están representados a lo largo de la memoria descriptiva y de las reivindicaciones por códigos de una a tres letras, como es común y conocido en la técnica.

El término "péptido aislado” se refiere a un péptido que está libre esencialmente de componentes celulares contaminantes, tales como impurezas de hidratos de carbono, lípidos u otros componentes proteicos asociados con el péptido por naturaleza o que, si está presente en el medio natural, ha sido alterado por síntesis (no natural) por la intervención humana. Normalmente, una preparación de péptido aislado contiene el péptido en una forma altamente purificada, es decir, de al menos aproximadamente el 80% de pureza, al menos aproximadamente el 90% de pureza, al menos aproximadamente el 95% de pureza, más del 95% de pureza o más del 99% de pureza.

En el contexto de la presente invención, se considera que un péptido muestra “actividad hipertensiva” cuando un péptido después de ser administrado a un sujeto es capaz de reducir o disminuir la presión arterial de dicho sujeto. En la técnica son muy conocidos los ensayos para identificar los compuestos con actividad hipertensiva. Por ejemplo, la inhibición de la enzima convertidora de la angiotensina (tal como se muestra en el Ejemplo 2 que ilustra la presente invención), o la administración del compuesto que se someterá a ensayo a un modelo de ratas espontáneamente hipertensas y analizar los cambios en la presión arterial sistólica y la presión arterial diastólica (véase el Ejemplo 3).

El péptido de la invención puede comprender cualquier resto de aminoácidos natural, no natural y/o modificado químicamente en su estructura. Sin embargo, los autores de la invención han encontrado además que si el péptido comprende un aminoácido aromático en su estructura, el péptido muestra mayor actividad antihipertensiva que aquellos péptidos que no comprenden aminoácidos aromáticos. Como sabe el experto en la materia, los aminoácidos aromáticos se caracterizan por tener en su estructura un anillo aromático. Entre los ejemplos de ácidos aromáticos se incluyen, pero no se limitan a, fenilalanina, triptófano, histidina, tirosina, tiroxina, 5-hidroxitriptófano y L-DOPA. En una realización particular, el aminoácido aromático se selecciona entre el grupo que consiste en fenilalanina, tirosina y triptófano. Los ejemplos de péptidos que comprende aminoácidos aromáticos incluyen, pero no se limitan a, péptidos que muestran las secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6.

Tal como se usan en la presente memoria descriptiva, los términos "análogo" y "derivado" son equivalentes y se refieren a un péptido que comprende al menos un resto de aminoácidos alterado por una sustitución, adición, deleción o modificación química de aminoácidos, en comparación con el péptido original, pero comprendiendo siempre dos cisteínas separadas por n aminoácidos, siendo n un número entero de 0, 1, 2 ó 3, que consiste en una longitud entre 5 y 10 aminoácidos, preferentemente, 6, 7, 8 ó 9 aminoácidos, y que muestra actividad antihipertensiva. Los derivados peptídicos incluyen en particular sustituciones y/o adiciones de aminoácidos con restos de aminoácidos de ocurrencia natural, y modificaciones químicas tales como, por ejemplo, modificaciones enzimáticas, presentes normalmente en la naturaleza. Los análogos de péptidos incluyen en particular sustituciones y/o adiciones de aminoácidos con restos de aminoácidos no naturales, y modificaciones químicas que no se producen en la naturaleza. Los análogos y los derivados comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en el 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ó 99% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 7.

En la presente invención, los términos “idéntico”, “ identidad de secuencia”, “ identidad” y “semejanza” se consideran equivalentes y pueden usarse indistintamente. El término “identidad de secuencia” (o sus equivalentes gramaticales) significa que una secuencia en particular tiene al menos un cierto porcentaje de restos de aminoácidos idéntico a los presentes en una secuencia de referencia especificada usando un algoritmo de alineación. El grado de identidad puede determinarse, por ejemplo, mediante el método Clustal, el método Wilbur-Lipman, el programa GAG, que incluye GAP, BLAST o b La STN, EMBOSS Needle, FASTA, etc. Además, puede usarse el algoritmo de Smith Waterman con el fin de determinar el grado de identidad entre dos secuencias. Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar la semejanza de secuencia es el algoritmo BLAST, que ha sido descrito en Altschul, y cols., J. Mol. Biol.215:403-410 (1990). El software para realizar análisis BLAST puede obtenerse públicamente en el National Center for Biotechnology Information.

El péptido de la invención es un péptido nuevo que inhibe la ACE y es absorbido intacto desde el tubo digestivo, lo que previene o reduce la hipertensión. Se determinó la cantidad para estos péptidos y se encontró que estaba comprendida entre 0,05 mg y 10 mg por kg de peso corporal al día, preferentemente entre 0,1 mg y 1 mg por kg de peso corporal al día, considerando que la cantidad eficaz se refiere a la suma de las cantidades de péptidos incluidos en la presente invención. Esta cantidad eficaz puede reducir la presión arterial sistólica en 5 mm Hg, o más, en sujetos prehipertensos o hipertensos.

los péptidos aquí descritos pueden obtenerse de cualquier fuente. Los péptidos pueden obtenerse de materia prima que procede de grasa animal o vegetal. Los ejemplos de grasa animal o vegetal incluyen, pero no se limitan a, aceitunas, grasa de ballena, semillas de girasol, aceite de oliva, aceite de girasol, aceite de soja, aceite de colza, aceite de maíz, aceite de maíz verde, aceite de palma, aceite de linaza, aceite de semilla de lino, aceite de almendra, aceite de aguacate, aceite de nuez, aceite de coco, aceite de ricino, aceite de semillas de algodón, aceite de cacahuete, aceite de cártamo, aceite de sésamo, manteca, mantequilla, grasa de cerdo, grasa de cabra, grasa de buey, grasa de vacuno, grasa de búfalo, grasa de oveja, grasa de aves de corral, aceite de pescado, aceite de algas y aceites de animales marinos. Los péptidos pueden obtenerse de materia prima que procede del prensado y/o la molienda de aceitunas, tal como, sin limitarse a, aceite de oliva o subproductos de la industria del aceite de oliva. Los ejemplos de subproductos de la industria del aceite de oliva incluyen, sin limitarse a ellos, pasta de aceitunas machacadas, aceite de orujo de oliva, orujo de oliva, alpechín, orujo de aceituna desecado/desgrasado y combinaciones y mezclas de los mismos. Con el fin de obtener los péptidos descritos en este documento, las materias primas se someten a diferentes procesos de extracción con disolventes orgánicos que son ampliamente conocidos por el experto en la materia.

La presente invención comprende también un péptido de fusión que comprende el péptido de la invención y un péptido de soporte o marcador, en donde

- El péptido de soporte es un péptido que internaliza el péptido en la célula, y

- El péptido marcador es una secuencia de aminoácidos útil para el aislamiento o la purificación del péptido aislado.

En el contexto de la presente invención, un “péptido de soporte” se define como un péptido con capacidad de internalizar un péptido en la célula. El péptido de soporte es un péptido capaz de atravesar la membrana celular y penetrar en la célula desde el exterior, una característica que puede conferida al péptido (por ejemplo, el péptido de la invención) con el que se fusiona (proteína de fusión de la invención), proporcionando así una alternativa al transporte de los péptidos de interés (por ejemplo, los péptidos de la invención) a las células diana. Este mecanismo de entrada de péptidos en la célula se conoce como " transducción o suministro de proteínas". Se conocen varios péptidos de soporte con capacidad para internalizar un péptido en una célula (Schwarze S.R. y cols., Science, 1999 Sep 3; 285(5433):1569-72; Niesner U. y cols., Bioconjug. Chem. 2002 Jul-Aug; 13(4):729-36; Ford K.G. y cols., Gene Therapy, 2001; 8:1-4; y Gusarova G.A. y cols., J. Clin. Invest. 2007 Jan; 117(1):99-111).

Para poner en práctica la presente invención puede usarse prácticamente cualquier péptido de soporte con capacidad de internalizar un péptido en una célula; no obstante, dicho péptido de soporte es un péptido que comprende un segmento "PTD" ("dominio de transducción de proteínas"). Los ejemplos no limitativos ilustrativos de proteínas que comprenden dominios de transducción de proteínas (PTD) incluyen la proteína TAT (proteína traduccional de transacción”) del virus de inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1), el factor de transcripción homeótica de Drosophila antennapedia (Antp) y la proteína de unión a ADN VP22 del virus del herpes simple 1 (VHS-1), aunque también se ha sugerido que otras proteínas tienen esta propiedad de internalización de péptidos en células, tales como la hemaglutinina del virus de la gripe, la lactoferrina, el factor de crecimiento de fibroblastos 1, el factor de crecimiento de fibroblastos 2 y las proteínas Hoxa-5, Hoxb-4 y Hoxc-8 (Ford K.G. y cols., Gene Therapy, 2001; 8:1-4). Los ejemplos de péptidos de soporte incluyen, sin limitarse a ellos,

- un péptido derivado de la proteína TAT de VIH-1, que comprende la secuencia responsable de la transducción peptídica, cuyo dominio básico (PTD) comprende las fracciones 49-57 de dicha proteína TAT de VIH-1, específicamente la secuencia de aminoácidos RKKRRQRRR (SEQ ID NO: 8), o las fracciones 47-57 de dicha proteína TAT de VIH-1, tal como el péptido cuya secuencia de aminoácidos es YG^r K^k RRQRRR (SEQ ID NO: 9) o el péptido cuya secuencia de aminoácidos es CGISYGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 10);

- un péptido derivado de la proteína Antp de D. antennapedia, que comprende el homeodominio de antennapedia (AntpHD) que comprende el dominio responsable de la transcripción peptídica (PTD) [fracciones 43-58 de dicha proteína Antp), que comprende la secuencia de aminoácidos RQIKiW f QNRr Mk w KK (SEQ ID NO: 11), o un fragmento funcional de la misma;

- un péptido derivado de la proteína VP22 de VHS-1 que comprende un dominio responsable de la transcripción peptídica (PTD); y

- un péptido derivado de la proteína de supresión tumoral ARF ("marco de lectura alternativo") que comprende la secuencia de aminoácidos responsable de la capacidad del péptido de penetrar en las células, tal como el fragmento que comprende las fracciones 26-44 de dicha proteína ARF, específicamente, la secuencia de aminoácidos KFVRSRRPRTASCALAFVN (SEQ ID NO: 12), o un fragmento de la misma que comprende las fracciones 37-44 de dicha proteína ARF, específicamente la secuencia de aminoácidos SCALAFVN (SEQ ID NO: 13).

El péptido de la invención puede unirse a cualquiera de los extremos terminales (amino o carboxilo) del péptido de soporte con capacidad de internalizar un péptido de la invención en una célula, y puede o no unirse directamente a dicho péptido de soporte con capacidad de internalizar un péptido en una célula. Por tanto, el péptido de la invención está unido directamente a dicho péptido de soporte o, alternativamente, está unido a un péptido ligador o separador entre los dos péptidos. Como péptido separador puede usarse cualquier péptido con flexibilidad estructural; no obstante, los ejemplos no limitativos ilustrativos de dichos péptidos separadores incluyen péptidos que contienen repeticiones de fracciones de aminoácidos, por ejemplo, de Gly y/o Ser, o cualquier otra repetición adecuada de fracciones de aminoácidos.

En el contexto de la presente invención, un péptido marcador es una secuencia de aminoácidos útil para el aislamiento o purificación de la proteína de fusión de la invención. Dicha secuencia estará localizada en una región de la proteína de fusión de la invención que no influya de forma adversa en la funcionalidad del péptido de la invención. Prácticamente cualquier secuencia de aminoácidos que puede usarse para aislar o purificar una proteína de fusión (denominados genéricamente péptidos tag o de etiqueta) puede estar presente en dicha proteína de fusión de la invención. A modo de ilustración no limitativa, dicha secuencia de aminoácidos útil para el aislamiento o la purificación de una proteína de fusión puede ser, por ejemplo, tag de arginina (Arg-tag), tag de histidina (His-tag), FLAG-tag, Strep-tag, un epítopo que puede ser reconocido por un anticuerpo, tal como c-myc-tag, SBP-tag, S-tag, péptido de unión a calmodulina, dominio de unión a celulosa, dominio de unión a quitina, glutatión S-transferasa-tag, proteína de unión a maltosa, NusA, TrxA, DsbA, Avi-tag, etc. (Terpe K., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2003), 60:523-525), p-galactosidasa, VSV-glucoproteína (YTDIEMNRLGK) (S^e Q ID NO: 14), o una secuencia de aminoácidos tal como: A ^h GHRP (SEQ ID NO: 15) (2, 4 y 8 copias), PIHDHDHPHLVIHS (SEQ ID NO: 16), etc.

Además, los péptidos descritos en la presente descripción pueden ser parte de una composición junto con otros compuestos útiles para su administración a un sujeto. Así, la presente descripción se refiere a una composición que comprende los péptidos descritos aquí o un derivado de los mismos.

El término “composición” se refiere a cualquier combinación de una o más sustancias en la que al menos una de dichas sustancias es un péptido de los descritos en este documento. Las composiciones pueden ser de diversas clases, lo que incluye, pero no se limita a, extractos de péptidos, suplementos nutricionales, preparaciones farmacéuticas, suplementos de vitaminas, aditivos de alimentos o suplementos alimentarios. En la presente memoria descriptiva los términos "composiciones farmacéuticas" y "formulaciones" se usan indistintamente.

La composición descrita aquí es un extracto de péptidos, una composición nutricional, un alimento, un suplemento, un nutracéutico, un probiótico o un simbiótico.

El término “extracto de péptidos” se refiere a una preparación que contiene el ingrediente activo de una sustancia en forma concentrada. En el contexto de la presente invención, el ingrediente activo son los péptidos de la presente descripción.

El término "composición nutricional" se refiere a un alimento que con independencia de que proporciona nutrientes al sujeto que lo ingiere, tiene un efecto beneficioso en una o más funciones corporales, de manera que proporciona un mejor estado de salud y bienestar. En consecuencia, dicha composición nutricional puede estar destinada a la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad o a la reducción de los factores de riesgo de una enfermedad.

El término "suplemento", que es sinónimo de cualquiera de los términos "suplemento dietético", "suplemento nutricional" o "suplemento alimentario", se refiere a un componente o componentes destinados a complementar la dieta y puede ser un alimento. Los ejemplos de suplementos dietéticos son, pero no se limitan a, vitaminas, minerales, productos botánicos, aminoácidos y componentes alimentarios tales como enzimas y extractos glandulares. No se presentan como sustitutos de los alimentos convencionales o como componente único de una comida o una dieta, sino como un suplemento dietético.

El término "nutracéutico" tal como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a las sustancias aisladas de un alimento usado en forma de dosificación y que tiene un efecto beneficioso en la salud humana. Dicho nutracéutico puede ser un suplemento.

El término "simbiótico" tal como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a aquellos alimentos que contienen una mezcla de prebióticos y probióticos. Como regla general, contienen un componente prebiótico para potenciar el crecimiento y/o la actividad metabólica y, en última instancia, el efecto del probiótico con el que se combina, como por ejemplo, pero sin limitarse a ello, la asociación de fructooligosacáridos y galactooligosacáridos.

La composición de la presente descripción puede ser un alimento seleccionado entre el grupo que consiste en una bebida, alimentos en infusión, leche, yogur, queso, bebidas lácteas de sabores, pan, tortas, mantequilla, margarina, una salsa, un condimento, un aliño de ensalada, mayonesa, zumo de frutas, sirope, un postre, glaseados y rellenos, un producto congelado suave, un dulce, goma de mascar y un alimento intermedio.

Además, la composición comprende una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de los péptidos descritos aquí o un derivado de los mismos.

El término “cantidad profilácticamente eficaz” tal como se usa en la presente memoria descriptiva significa que los péptidos contenidos en la composición están en cantidad suficiente para alcanzar el propósito deseado, como, por ejemplo, en este caso, prevenir o evitar un aumento de la presión arterial de un sujeto. El término “cantidad terapéuticamente eficaz” tal como se usa en la presente memoria descriptiva significa que los péptidos contenidos en la composición están en cantidad suficiente para alcanzar el propósito deseado, como, por ejemplo, en este caso, reducir o disminuir la presión arterial de un sujeto. La cantidad eficaz está comprendida entre 0,05 mg y 10 mg por kg de peso corporal al día, preferentemente entre 0,1 mg y 1 mg por kg de peso corporal al día. En el caso de que la composición comprenda una combinación de péptidos tal como se explica más adelante, dicha cantidad eficaz se refiere a la suma de la cantidad de los péptidos. Así la cantidad eficaz puede reducir la presión arterial sistólica 5 mmHg, o más, en sujetos prehipertensos o hipertensos.

Una disminución en la presión arterial puede medirse mediante el descenso de la presión arterial sistólica y/o la presión arterial diastólica. Los procedimientos de medida de la presión arterial son bien conocidos en la técnica, y no es preciso repetirlos en la presente memoria descriptiva. Por ejemplo, la presión arterial puede medirse usando dispositivos de medición por auscultación, tales como estetoscopios o esfigmomanómetros, o por dispositivos de medición oscilométricos que usan un detector electrónico de presión con una lectura numérica de presión arterial.

La composición descrita aquí puede comprender el péptido SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y/o combinaciones de los mismos. En una realización más en particular, la composición comprende las siguientes combinaciones de péptidos:

- SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2;

- SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3;

- SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 4;

- SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 5;

- SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 6;

SEQ ID NO SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 3

SEQ ID NO SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 4

SEQ ID NO SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 5

SEQ ID NO SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 6

SEQ ID NO SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO 4

SEQ ID NO SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO 5

SEQ ID NO SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO 6

SEQ ID NO SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO 4 y SEQ ID NO: 5;

SEQ ID NO SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO 4 y SEQ ID NO: 6;

SEQ ID NO SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6;

SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 3

SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 4

SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 5

SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 6

SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO 4

SEQ ID NO SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO 5

SEQ ID NO SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO 6

SEQ ID NO SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 y SEQ ID NO:

SEQ ID NO SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 y SEQ ID NO:

SEQ ID NO SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6;

SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO 4

SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO 5

SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO 6

SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 y SEQ ID NO: 5;

SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 y SEQ ID NO: 6;

SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6;

SEQ ID NO 4 y SEQ ID NO 5;

SEQ ID NO 4 y SEQ ID NO 6;

SEQ ID NO 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6;

SEQ ID NO 5 y SEQ ID NO 6;

Las composiciones pueden incluir un soporte. Dependiendo de la clase de composiciones, un soporte puede ser un soporte adecuado para la dieta o un soporte farmacéuticamente aceptable, siempre y cuando sea compatible con la clase concreta de composiciones. Los ejemplos de un soporte adecuado para la dieta incluyen, pero no se limitan a, excipientes adecuados para la dieta, diluyentes y soportes.

El término "excipiente" se refiere a una sustancia que ayuda a la absorción de cualquiera de los componentes de la composición de la presente invención, estabiliza dichos componentes o ayuda a la preparación de la composición en el sentido de proporcionar consistencia o de contribuir con sabores que la hagan más agradable. Así, los excipientes pueden tener la función de mantener cohesionados los componentes, tales como almidones, azúcares o celulosas, una función edulcorante, una función colorante, una función de protección frente a los medicamentos tal como el aislamiento del aire y/o la humedad, la función de rellenar un comprimido, cápsula u otra forma de presentación tal como, por ejemplo, fosfato de calcio dibásico, una función de desintegración para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir ningún otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo. Por tanto, el término "excipiente" se define como el material incluido en las formas galénicas se añade a los ingredientes activos o sus asociaciones para facilitar su preparación y estabilidad, modificar sus propiedades organolépticas o determinar las propiedades fisicoquímicas de la composición farmacéutica y su biodisponibilidad.

Los ejemplos de un soporte farmacéuticamente aceptable incluyen, pero no se limitan a, vehículos biocompatibles, adyuvantes, aditivos y diluyentes para conseguir una composición que pueda usarse como forma de dosificación. Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, los términos “farmacéuticamente aceptable”, “fisiológicamente tolerable”, y variaciones gramaticales de los mismos, en lo que se refiere a composiciones, soportes, diluyentes y reactivos, se usan indistintamente e indican que los materiales son susceptibles de administración a o en un mamífero sin la producción de efectos fisiológicos indeseables.

Análogamente, las composiciones descritas aquí pueden usarse en solitario o en combinación con otros ingredientes biológicamente activos. Los ejemplos de ingredientes biológicamente activos incluyen, sin limitarse a ellos, vitaminas, minerales, productos botánicos, aminoácidos, enzimas, extractos glandulares, probióticos, oligosacáridos, etc. El término "probiótico" tal como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a microorganismos que, cuando se administran en cantidades adecuadas, tienen efectos beneficiosos en la salud del organismo hospedador.

Una composición, en solitario o en combinación con otros ingredientes activos, puede administrarse a un sujeto en una dosis única o en múltiples dosis durante un periodo de tiempo, generalmente por administración oral. Para los expertos en la materia serán evidentes las diversas pautas de administración. Los intervalos de dosificación para la administración de las composiciones serán suficientemente elevados para producir el efecto deseado. La dosificación no debe ser tan elevada como para provocar efectos secundarios adversos, como reacciones cruzadas no deseadas y similares. En general, la dosificación variará con la edad, el peso, el sexo, el estado de salud y la duración de la afección en un sujeto dado, así como la finalidad que se persigue. La dosificación puede ser determinada por un experto en la materia sin experimentación indebida. La dosificación puede ajustarse en caso de existencia de contraindicaciones, tolerancia o condiciones semejantes. Los expertos en la materia pueden evaluar fácilmente dichos factores y, basándose en esta información, determinar la concentración eficaz en particular de una composición de cara a su uso con la finalidad pretendida. Por ejemplo, la concentración del péptido de la invención en una formulación monodosis está comprendida entre el 0,0005% y el 95% de la formulación total.

El término “unidad de dosificación” tal como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para animales, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el diluyente necesario, por ejemplo, un soporte o vehículo. Las especificaciones para la dosis unitaria están dictadas por y dependen directamente de (a) las características especiales del material activo y (b) las limitaciones intrínsecas en la técnica de formación de compuestos de dicho material activo para su uso terapéutico en animales.

En cada caso la forma galénica de la composición farmacéutica y, por tanto, el fármaco, se adaptará a la forma de dosificación usada. Por tanto, la composición descrita aquí puede proporcionarse en la forma de soluciones o cualquier otra forma de dosificación permitida clínicamente y en una cantidad terapéuticamente eficaz. La composición farmacéutica puede formularse en formas sólida, semisólida, líquida o gaseosa, tales como comprimido, cápsula, polvo, gránulo, pomada, solución, supositorio, inyección, inhalante, gel, microesfera o aerosol. La forma adaptada para administración oral se refiere a un estado físico que permitiría su administración oral. Dicha forma adaptada para administración oral se selecciona entre la lista que comprende, pero no se limita a, gotas, jarabe, infusión de hierbas, elixir, suspensión, suspensión extemporánea, frasco bebible, comprimido, cápsula, gránulo, oblea, píldora, comprimido, gragea, trocisco o forma liofilizada. Alternativamente, la composición farmacéutica puede presentarse también en una forma adaptada para administración sublingual, nasal, intratecal, bronquial, linfática, rectal, transdérmica, inhalada o parenteral.

Usos del péptido de la invención

Tal como se explica anteriormente, los autores de la presente invención han descubierto que el péptido de la invención es, sorprendentemente, capaces de inhibir la actividad de la enzima convertidora de la angiotensina (ACE), siendo así útiles como agentes antihipertensivos.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere al péptido para su uso como un medicamento.

En otro aspecto, la invención se refiere al péptido de la invención para su uso en el tratamiento y/o prevención de prehipertensión o hipertensión.

Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, "tratamiento”, "tratar” o "que trata”, se refiere a: (a) la prevención de la aparición de la enfermedad o dolencia en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad o dolencia pero al que todavía no se le ha diagnosticado; (b) la inhibición de la enfermedad o dolencia, es decir, la interrupción de su desarrollo; (c) el alivio o la mejoría de la enfermedad o dolencia, es decir, la inducción de la regresión de la enfermedad o dolencia; o (d) la curación de la enfermedad o dolencia, es decir, la interrupción de su desarrollo o progresión. La población de sujetos tratados por células madre, la población celular, el medio acondicionado o la composición farmacéutica de la invención incluye aquellos sujetos que padecen la dolencia o enfermedad no deseable, así como los sujetos en riesgo de desarrollo de la dolencia o enfermedad. En la presente invención, las enfermedades que se tratarán se seleccionan entre prehipertensión and hipertensión.

Los términos “trastorno” y '"enfermedad" se usan indistintamente para referirse a una dolencia en un sujeto. El término "sujeto” en las definiciones mencionadas anteriormente se refiere a cualquier animal, lo que incluye, pero no se limita a, mamíferos, preferentemente primates, más preferentemente seres humanos. Así, el péptido o la composición de la invención pueden usarse en el tratamiento de cualquier animal que padezca las enfermedades mencionadas anteriormente.

En el contexto de la presente invención, el término “prehipertensión” se refiere a una presión arterial ligeramente elevada, que tiene una presión sistólica de 120 a 139 milímetros de mercurio (mm Hg) o una presión diastólica de 80 a 89 mm Hg. La prehipertensión se convertirá probablemente en presión arterial elevada (hipertensión) a menos que se introduzcan cambios en el estilo de vida, tales como hacer más ejercicio y comer alimentos más saludables. La prehipertensión y presión arterial elevada elevan el riesgo de ataque cardiaco, ictus e insuficiencia cardiaca. El término “hipertensión” tal como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a una presión arterial sistólica de 140 mm Hg o superior y una presión arterial diastólica de 90 mm Hg o superior. En los párrafos precedentes se han citado procedimientos para medir la presión arterial.

El término “ ictus”, también conocido como accidente cerebrovascular (ACV), apoplejía o infarto cerebral, se aplica cuando un flujo sanguíneo insuficiente en el encéfalo produce la muerte celular. Existen dos tipos principales de ictus: isquémico, debido a la falta de flujo sanguíneo, y hemorrágico, debido a una hemorragia. El factor de riesgo principal de ictus es la presión arterial elevada.

El término “enfermedades coronarias” o “cardiopatía coronaria” o CC, también conocida como cardiopatía isquémica (CI), cardiopatía aterosclerótica, enfermedad cardiovascular aterosclerótica y cardiopatía coronaria, se refiere a una enfermedad en la que se acumula una sustancia cerosa denominada placa dentro de las arterias coronarias que aportan sangre rica en oxígeno el músculo cardiaco. Cuando se acumula placa en las arterias, la afección se denomina aterosclerosis.

El término “infarto de miocardio” (IM) o infarto de miocardio agudo (IMA), conocido comúnmente como ataque cardiaco, se refiere a una dolencia en la que se interrumpe el flujo sanguíneo en una parte del corazón, lo que ocasiona daños en el músculo cardiaco.

El término “síndrome metabólico” tal como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a un conjunto de afecciones (aumento de la presión arterial, alta concentración de azúcar en la sangre, exceso de grasa corporal en la cintura y niveles de colesterol elevados) que se producen conjuntamente, lo que eleva el riesgo de cardiopatía, ictus y diabetes.

El término “enfermedad de las arterias periféricas” (también enfermedad arterial periférica) tal como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a un problema circulatorio común en el que el estrechamiento de las arterias reduce el flujo sanguíneo en las extremidades.

El término “aneurisma de la aorta abdominal”, también conocido como triple-a, tal como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a un aumento de tamaño localizado de la aorta abdominal de manera que el diámetro es mayor que 3 cm o más del 50% mayor de lo normal. Normalmente no produce síntomas, salvo en caso de ruptura. En ocasiones puede existir dolor abdominal, lumbar o de las piernas. A veces, los grandes aneurismas pueden sentirse al presionar el abdomen. La ruptura puede provocar dolor en el abdomen o en la espalda, baja presión arterial o una breve pérdida de consciencia.

Como entiende el experto en la materia, los péptidos o composición descritos aquí pueden administrarse en combinación con otros fármacos para interrumpir o ralentizar algunas de las funciones corporales que provocan una presión arterial elevada. Los ejemplos de fármacos que reducen la presión arterial incluyen, pero no se limitan a, - Diuréticos (comprimidos en agua o líquido): limpian el exceso de sodio del cuerpo, lo que reduce la cantidad de líquido de la sangre y ayuda a reducir la presión arterial.

- Beta-bloqueantes: ayudan a que el corazón lata más despacio y con menos fuerza. En consecuencia, el corazón bombea menos sangre a través de los vasos sanguíneos, lo que puede ayudar a reducir la presión arterial.

- Inhibidores de la enzima convertidora de la angiotensina (ACE): la angiotensina II es una hormona que estrecha los vasos sanguíneos, aumentando la presión arterial. La ACE convierte la angiotensina I en angiotensina II. Los inhibidores de ACE bloquean este proceso, lo que interrumpe la producción de angiotensina II, reduciendo la presión arterial.

- Bloqueantes de los receptores de angiotensina II (ARB): bloquean la unión de la hormona angiotensina II con los receptores en los vasos sanguíneos. Cuando se bloquea la angiotensina II, los vasos sanguíneos no se estrechan ni se reducen, lo que puede rebajar la presión arterial.

- Bloqueantes de los canales del calcio: impiden que el calcio entre en las células de los músculos del corazón y los vasos sanguíneos. Ello permite que los vasos sanguíneos se relajen, lo cual puede reducir la presión arterial.

- Alfa-bloqueantes: reducen los impulsos nerviosos que tensan los vasos sanguíneos. Ello permite que la sangre circule más libremente, lo que provoca un descenso de la presión arterial.

- Alfa-beta bloqueantes: reducen los impulsos nerviosos de igual forma que los alfa-bloqueantes. Sin embargo, al igual que los beta-bloqueantes, también ralentizan el latido cardiaco. En consecuencia, la presión arterial disminuye. - Agentes de acción central: actúan en el encéfalo para reducir las señales nerviosas que estrechan los vasos sanguíneos, lo que puede reducir la presión arterial.

- Vasodilatadores: relajan los músculos en las paredes de los vasos sanguíneos, lo que puede rebajar la presión arterial.

Alternativamente, los péptidos y las composiciones descritos aquí pueden usarse para elaborar alimentos con propiedades antihipertensivas, denominados comúnmente alimentos funcionales. A modo de ejemplo no limitativo, los ejemplos o alimentos funcionales incluyen bebidas, alimentos en infusión, leche, yogur, queso, bebidas lácteas de sabores, pan, tortas, mantequilla, margarina, salsa, condimentos, aliño de ensalada, mayonesa, zumo de frutas, sirope, postres, glaseados y rellenos, productos congelados suaves, dulces, goma de mascar, pan, etc.

Procedimiento para obtener el péptido de la invención

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para obtener el péptido de la invención, denominado en lo sucesivo “procedimiento de la invención”, que comprende

(i) obtención de un precipitado de proteínas a partir de aceite procedente de aceitunas,

(ii) obtención de un extracto de péptidos a partir del precipitado de la etapa (i) que comprende el péptido de la invención, y

(iii) fraccionamiento y purificación del péptido de la invención.

Los péptidos descritos aquí pueden obtenerse de grasa animal o vegetal. Puede usarse cualquier grasa animal o vegetal para obtener el aceite a partir del cual se aislará el péptido de la invención. Los ejemplos de aceite procedente de grasa animal o vegetal incluyen, pero sin limitarse a ellos, aceite de oliva, aceite de girasol, aceite de soja, aceite de colza, aceite de maíz, aceite de maíz verde, aceite de palma, aceite de linaza, aceite de semilla de lino, aceite de almendra, aceite de aguacate, aceite de nuez, aceite de coco, aceite de ricino, aceite de semillas de algodón, aceite de cacahuete, aceite de cártamo, aceite de sésamo, manteca, mantequilla, grasa de cerdo, grasa de cabra, grasa de buey, grasa de vacuno, grasa de búfalo, grasa de oveja, grasa de aves de corral, aceite de pescado, aceite de algas, aceites marinos.

Los procedimientos para procesar las diferentes fuentes de grasa animal o vegetal con el fin de obtener aceite son ampliamente conocidos en la técnica. Los ejemplos de estos procesos son, sin limitarse a ellos, prensado y/o molienda por procedimientos físicos. El prensado y/o molienda de las fuentes de grasa animal o vegetal produce aceite y otros productos (denominados también productos derivados o subproductos) que, como entiende el experto en la materia, pueden ser procesados de nuevo para obtener más aceite.

En la presente invención, con el objetivo de obtener aceite procedente de aceitunas tal como se define en la etapa (i), las aceitunas se prensan y/o muelen para producir aceite y subproductos tales como orujo, pasta de aceitunas machacadas, alpechín, etc., que se usarán para obtener el péptido de la invención. Así, en la presente invención, el aceite a partir del cual se aislará el péptido de la invención puede proceder del aceite obtenido directamente del procesado de las aceitunas, o de subproductos derivados del tratamiento físico de la misma. Los ejemplos de subproductos derivados del procesado de la grasa animal o vegetal son, sin limitarse a ellos, pasta de aceitunas machacadas, aceite de orujo de oliva, orujo de oliva, alpechín, orujo de aceituna desecado/desgrasado, y mezclas de los mismos. Así, en una realización particular, el aceite usado en el procedimiento de la invención procede del prensado y/o molienda de aceitunas, en otra realización particular, el aceite procede del grupo que consiste en pasta de aceitunas machacadas, aceite de orujo de oliva, orujo de oliva, alpechín, orujo de aceituna desecado/desgrasado, y combinaciones y mezclas de los mismos.

Como entiende el experto en la materia, para obtener aceite de los subproductos derivados del procesado de las aceitunas, los subproductos deben ser tratados. Ejemplos de los diferentes procedimientos que pueden usarse para este fin incluyen, sin limitarse a ellos:

- Pasta de aceitunas machacadas

La pasta de aceitunas machacadas obtenida de la molienda de las aceitunas contiene aceite de oliva y es una fuente de péptidos antihipertensivos. El procedimiento para obtener los péptidos consiste primero en eliminar el agua residual agua del material de partida usando los procedimientos estándar disponibles. A continuación, se extrae el aceite con hexano. Los productos resultantes de la extracción son extracto de hexano de aceite de oliva y pulpa de aceitunas desgrasada. Se evapora el hexano y se obtiene el aceite de oliva.

- Orujo de oliva.

El orujo de oliva son los restos sólidos de las aceitunas después de la extracción del aceite de oliva. Para obtener los péptidos a partir de orujo de oliva, la primera etapa consiste en eliminar el agua residual del orujo usando los procedimientos estándar disponibles. A continuación, se extrae el aceite residual usando hexano como disolvente. Se obtienen dos fracciones: aceite extraído por hexano y un residuo de orujo desgrasado (o torta). La evaporación del hexano produce el aceite extraído, en concreto aceite de orujo de oliva.

- Alpechín.

El alpechín contiene un alto porcentaje de agua que debe eliminarse primero usando procedimientos convencionales de secado. A continuación, se realiza la extracción del aceite residual (0,5-1%) usando hexano como disolvente, que posteriormente se evapora.

- Torta de orujo de oliva.

El orujo de oliva primero se seca para eliminar la humedad residual usando procedimientos estándar. A continuación, se extrae el aceite presente en el orujo desecado usando hexano como disolvente, seguido por la evaporación del hexano. A continuación, se somete la torta de orujo seca y desgrasada obtenida a un proceso de solubilización de proteínas y péptidos a pH 10,5.

Los péptidos aquí descritos también pueden obtenerse a partir de cualquier material de partida de origen vegetal o animal que contenga las secuencias de aminoácidos de péptidos bioactivos de interés, mediante un proceso de hidrólisis de materias primas usando enzimas proteolíticas. Este material de partida o materia prima se disuelve o se dispersa a una concentración adecuada, en agua o en solución tampón. El pH de la solución debe ser adecuado para la actividad de una proteasa capaz de degradar las proteínas del material de partida, para producir los péptidos de interés. Las proteasas pueden ser cualquier endopeptidasa o exopeptidasa tales como tripsina, quimotripsina, elastasa, trombina, subtilisina, alcalasa, flavourzyme, pepsina, pancreatina, etc. Más específicamente, puede usarse alcalasa y flavourzyme a pH 8 y pH 7, respectivamente. La hidrólisis se realiza a 37°C durante un periodo de entre 10 minutos y 12 horas, preferentemente 45 minutos. Las enzimas se inactivan por calentamiento a 95°C.

El procedimiento de la invención puede comprender la obtención de un precipitado de proteínas a partir del aceite. En el contexto de la presente invención puede usarse cualquier procedimiento para obtener un precipitado de proteínas a partir de aceite. Por ejemplo, puede añadirse un volumen de una mezcla de disolventes orgánicos, preferentemente acetona/hexano (1:1), al aceite de oliva obtenido de la etapa precedente. A continuación, puede centrifugarse la mezcla a 10.000g durante 15 minutos a 4°C y se recogen los sedimentos (o precipitado de proteínas), que contienen los péptidos. Esta etapa puede realizarse entre 2 y 7 veces, preferentemente entre 3 y 5 veces.

La etapa (ii) del procedimiento de la invención comprende la obtención de un extracto de péptidos a partir del precipitado de la etapa (i) que comprende el péptido de la invención.

Los procedimientos para obtener un extracto de péptidos a partir del precipitado son ampliamente conocidos en la técnica. Los sedimentos recogidos pueden, por ejemplo, llevarse a sequedad a una temperatura inferior a 40°C, para obtener un precipitado que vuelve a ponerse en suspensión, y los péptidos del aceite de oliva pueden extraerse usando mezclas apropiadas de agua y acetonitrilo, preferentemente 80:20, a 4°C. A continuación, puede someterse el extracto a un proceso de sonicación durante más de 30 minutos y centrifugarse de nuevo. Se recogerán los sobrenadantes que contienen los péptidos de aceite de oliva concentrado.

Finalmente, el procedimiento de la invención comprende una etapa (iii) que comprende el fraccionamiento y purificación del péptido de la invención.

El término "purificar" tal como se usa en la presente descripción se refiere al aislamiento del péptido de la invención y a su concentración a partir de los otros péptidos presentes en el medio de cultivo. El aislamiento puede realizarse por medio de técnicas de solubilidad diferencial, cromatografía, electroforesis o enfoque isoeléctrico. Las técnicas cromatográficas pueden basarse en el peso molecular, la carga iónica (basándose en el estado de ionización de los aminoácidos en condiciones de trabajo), la afinidad de la proteína por determinadas matrices o columnas cromatográficas o por etiquetas de purificación y pueden realizarse en columnas, en papel o en placas. El aislamiento del péptido puede realizarse, por ejemplo, por precipitación con sulfato de amonio, cromatografía líquida por separación rápida de proteínas (FPLC) o cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), usando sistemas automatizados que reducen notablemente el tiempo de purificación y aumentan el rendimiento de purificación.

En la presente invención, los péptidos de aceite de oliva concentrado obtenidos en la etapa precedente pueden ser fraccionados por cromatografía por exclusión de tamaños, usando un sistema de cromatografía líquida por separación rápida de proteínas (FPLC) y una columna de exclusión molecular específica para péptidos. Para este fin, se inyecta una cierta cantidad de péptidos concentrados de la etapa precedente en el sistema FPLC. La separación de los péptidos se realiza usando una mezcla de agua/acetonitrilo (80:20) con ácido trifluoroacético al 0,1%. Como sabe el experto en la materia, también puede usarse cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC). Como puede observarse a partir de los ejemplos de la presente invención, al poner en práctica esta etapa, pueden obtenerse varias fracciones que comprenden péptidos purificados (véase Tabla 3).

Alternativamente a, o después de, la etapa (iii), el péptido de la invención, puede concentrarse por ultrafiltración, diálisis, electrodiálisis y pueden secarse por liofilización, atomización, evaporación, etc., para producir un concentrado seco que contiene el péptido de la invención.

Tal como se ha indicado más arriba, los péptidos aquí descritos pueden obtenerse también por la hidrólisis de grasa animal o vegetal usando enzimas proteolíticas. Este material de partida (fuentes de grasa animal o vegetal) se disuelve o se dispersa, en una concentración adecuada, en agua o en una solución tampón. El pH de la solución debe ser adecuado para la actividad de una proteasa capaz de degradar las proteínas del material de partida, para producir los péptidos de interés. Las proteasas pueden ser cualquier endopeptidasa o exopeptidasa tal como tripsina, quimotripsina, elastasa, trombina, subtilisina, alcalasa, flavourzyme, pepsina, pancreatina, etc. Más específicamente, puede usarse alcalasa y flavourzyme a pH 8 y pH 7, respectivamente. La hidrólisis se realiza a 37°C durante un periodo de entre 10 minutos y 12 horas, preferentemente 45 minutos. Las enzimas se inactivan por calentamiento a 95°C. Así, en una realización particular, la etapa (i) del procedimiento de la invención comprende la hidrólisis de la materia prima por una proteasa, preferentemente, la proteasa es alcalasa o flavourzyme. Además, pueden usarse también microorganismos o fracciones bacterianas que pueden producir hidrólisis de proteínas que originan péptidos. Las soluciones de hidrolizado obtenidas con estas metodologías se desecan usando procedimientos convencionales.

Salvo que se defina de otra forma, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria descriptiva tienen el mismo significado que entienden habitualmente los expertos en la materia a la que corresponde la presente invención. En la práctica de la presente invención pueden usarse procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria descriptiva. A lo largo de la descripción y de las reivindicaciones el término "comprende" y sus variaciones no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes, o etapas. Para los expertos en la materia serán evidentes objetos, ventajas y características adicionales de la invención tras el estudio de la descripción, o bien pueden aprenderse mediante la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos, dibujos y listados de secuencias se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden limitar la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Fuentes preferidas de péptidos antihipertensivos de la invención.

Figura 2. Distribución de pesos moleculares de los péptidos concentrados extraídos de aceite de oliva obtenidos por FPLC.

Figura 3. Análisis por nano-Orbitrap LC EM/EM de péptidos extraídos del aceite de oliva. Se muestra la cromatografía iónica total de los péptidos concentrados. Se muestran los tiempos de retención de los péptidos más relevantes. La tabla muestra las secuencias de péptidos y los tiempos de retención identificados por cromatografía.

Figura 4. Panel A: actividad inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina (ACEi) de péptidos concentrados extraídos del aceite de oliva (1/2 a 1/128 diluciones). Panel B: curva de calibración obtenida de los datos del panel A y usada para determinar CI⁵⁰.

Figura 5. Variaciones de presión arterial sistólica (PAS, Panel A) y presión arterial diastólica (PAD, Panel B) detectadas en ratas hipertensas espontáneamente (RHE) producidas por la administración de: agua (grupo de control, O); captopril 50 mg/kg (□); péptidos concentrados de aceite de oliva (10 mg/kg) (■); péptidos concentrados de aceite de oliva (100 mg/kg) (A ); péptidos concentrados de aceite de oliva (250 mg/kg) (♦). Los datos mostrados son valores medios ± error estándar de las medias. *, P <0,05 comparado con el grupo de control.

Ejemplos

MATERIAL Y PROCEDIMIENTOS

Determinación de la actividad inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina (ACEi)

La actividad inhibidora de la ACE se determinó de acuerdo con el procedimiento descrito en Sentandreu y Toldrá (2006) [Sentandreu, M.A., Toldrá, F. A fluorescence-based protocol for quantifying angiotensin-converting enzyme activity. 2006. Nat. Protoc., 1 (5), 2423-2427], con algunas modificaciones. Este ensayo se basa en la capacidad de la ACE para hidrolizar el sustrato o-aminobenzoilglicil-p-nitrofenilalanil-prolina (Abz-Gly-Phe-(NO²)-Pro, Bachem Feinchemikalien, Suiza), para producir el producto fluorescente o-aminobenzoilglicina (Abz-Gly). Se usaron los siguientes reactivos: tampón A: tampón Tris-HCl 150 mM (pH 8,3), con ZnCb 0,1 pM; tampón B: tampón Tris-HCl 150 mM (pH 8,4), con NaCl 1,125 M; solución ACE: se diluyó ACE de pulmón de conejo (Sigma), disuelto previamente en glicerol al 50%, en tampón A para preparar una concentración de enzimas de 0,042 U/mL. Esta solución se preparó de nuevo cada día para realizar el experimento. Solución de sustrato: se disolvió Abz-Gly-Phe(NO²)-Pro en tampón B hasta una concentración final de 0,45 mM a pH 8,3. Esta solución se preparó también todos los días antes de su uso y se protegió de la luz y se mantuvo a 4°C.

El ensayo se realizó usando una técnica de fluorescencia. Se usaron placas de poliestireno negro de 96 pocillos (Thermo Scientific, EE.UU.). Los pocillos contenían las siguientes soluciones: control: 40 pL de agua y 40 pL de ACE solución; blanco: 40 pL de agua y 40 |iL de tampón A; muestra: 40 pL de muestra de inhibidor y 40 pL de solución ACE; blanco de muestra: 40 pL de muestra de inhibidor y 40 pL de tampón A. La reacción enzimática se inició añadiendo 160 pL (volumen final en cada pocillo 240 pL) de solución de sustrato e, inmediatamente, se mezcló la placa y se incubó a 37°C en un fluorómetro VICTOR X5 (PerkinElmer, EE.UU.). La fluorescencia generada se mide después de 30 minutos usando 355 y 420 nm como longitudes de onda de excitación y de emisión, respectivamente. La actividad inhibidora de la ACE de cada muestra se determinó por triplicado.

La actividad inhibidora de la ACE se calculó usando la fórmula siguiente:

Actividad inhibidora de ACE (%) =

~ ~ ~ p^{B m} ) x 100

F^{e -} F^b

F^c (Control): Fluorescencia emitida después de la acción de ACE en el sustrato, sin inhibidor (es decir, muestra). F^m (Muestra): Fluorescencia emitida después de la acción de ACE en el sustrato, con muestra de inhibidor.

F^b : (Blanco): Fluorescencia emitida por el sustrato.

FBm (Blanco de muestra): Fluorescencia emitida por el sustrato y la muestra.

La actividad inhibidora de la ACE se expresa como CI⁵⁰ que es la concentración de inhibidor requerida para inhibir la actividad de ACE en un 50%.

Aislamiento de fracciones de péptidos por cromatografía por exclusión de tamaños usando cromatografía líquida por separación rápida de proteínas (FPLC)

Los concentrados de péptidos de la invención, obtenidos por los procedimientos descritos anteriormente, se fraccionaron por cromatografía de filtración en gel usando un sistema de purificación de péptidos y proteínas “ÁKTApurifier” (GE Healthcare, Inglaterra) equipado con una columna de exclusión por tamaños Superdex Peptide 10/300 GL (GE Healthcare) con un intervalo de separación de entre 0,1 y 7,0 kDa. Se llevó a cabo la elución de las muestras usando un procedimiento isocrático con acetonitrilo al 20% con ácido trifluoroacético al 0,1% y flujo de 0,8 mL/minuto durante 64 minutos. Se supervisó la elución a 280 nm. Se usaron proteínas estándar de masa molecular conocida para el calibrado de la columna cromatográfica de exclusión por tamaños. Las proteínas usadas fueron citocromo C (12.384 Da), aprotinina (6.512 Da), vitamina B12 (1.355 Da) y triptófano (204 Da) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.). El volumen de inyección de las muestras y los patrones en el ÁKTApurifier fue de 200 pL. Se recogieron 17 fracciones de 2 mL después de cada inyección. Se agruparon las fracciones en 6 grupos (F1-F6) basados en el perfil cromatográfico registrado a 280 nm de absorbancia. Se secó cada una de las fracciones F1-F6 usando un evaporador rotatorio Buchi R-205 (BÜCHI Labortechnik AG, Suiza).

Medidas de concentración de péptidos

La concentración de péptidos se determinó usando un kit de cuantificación de proteínas (FluoroProfile, Sigma-Aldrich). Se usó albúmina de suero bovino como patrón. Se realizó cuantificación fluorimétrica a 530 nm y 630 nm como longitudes de onda de excitación y emisión, respectivamente.

Identificación de péptidos por nanoLC-Orbitrap-EM/EM y secuenciación de novo

La secuencia de péptidos en aceite de oliva y en subproductos de la industria del aceite de oliva se determinó por cromatografía líquida de nanoescala-Orbitrap acoplada con espectrometría de masas en tándem y secuenciación de novo (nanoLC-Orbitap-EM/EM). Se usaron las siguientes etapas.

a) Preparación de muestras. Se diluyeron las muestras con agua mili Q y ácido fórmico al 0,1% hasta una concentración final de proteínas de 0,25 mg/mL.

b) Cromatografía nanolíquida y análisis por espectrometría de masas. Se inyectó aproximadamente 1 pg de proteínas totales en el sistema y se analizó por triplicado. Se separaron los péptidos en una nanocolumna de fase inversa C-18 (75 pm id x 15 cm; 3 pm, Nikkyo Technos Co., Japón) acoplada con una nanoprecolumna (100 pm id x 2 cm, 5 pm, Thermo Fisher Scientific, EE.UU.). Se realizó la separación cromatográfica con ácido fórmico al 0,1% en agua (fase A) y ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo (fase B), usando el siguiente gradiente: del 0 al 5% de B en 4 min, del 5 al 15% de B en 60 min, del 15 al 35% de B en 60 min y del 35 al 95% de B en 10 min, mantenido durante 20 minutos. Se usó una velocidad de flujo de 300 nl/minutos para eluir péptidos para ionización y fragmentación de péptidos en tiempo real en un espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap Veilos Pro (Thermo Fisher). Se obtuvo un espectro de resolución FT mejorada (resolución = 30.000 FHMW) seguido por un análisis EM/EM dependiente de los datos. El episodio EM/EM dependiente de los datos consiste en fragmentación CID (energía de colisión normalizada al 35%) y adquisición IT-EM/EM de los diez iones principales más intensos con un rechazo de estado de carga de uno y una exclusión dinámica de 0,5 minutos que se usa para identificación de péptidos.

c) Identificación de péptidos por secuenciación de novo. La secuenciación de novo se realizó usando el software Peaks Studio 7. [Sin Ma, Kaizhong Zhang, Christopher Hendrie, Chengzhi Liang, Ming Li, Amanda Doherty-Kirby, Gilles Lajoie. PEAKS: Powerful Software for Peptide De Novo Sequencing by MS/MS. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 17(20):2337-2342.2003]. El software extrae y somete a desconvolución los espectros EM y EM/EM de las muestras analizadas, comparando los análisis de iones de producto obtenidos con los fragmentos de masa teóricos esperados para dichos péptidos que se corresponden con la masa exacta medida en los análisis EM y EM/EM. El software Peaks asigna una puntuación de confianza local para cada aminoácido en secuencias de novo. La puntuación de confianza local está comprendida entre el 0% y el 99%, lo que indica el grado de confianza que el algoritmo atribuye a que un aminoácido en particular está secuenciado correctamente. Por otra parte, la secuencia de péptidos es evaluada por puntuación ALC (media de confianza local). ALC es la media de la puntuación de confianza local de todos los aminoácidos en la secuencia. El valor mínimo recomendado por el fabricante para considerar la existencia de una correspondencia aceptable para comparación de péptidos de novo es ALC > 55%. Para la secuenciación de novo en las muestras analizadas se realizó una mejora previa de los datos teniendo en cuenta el valor de corte de peso molecular de cada fracción. Se permitió un error de 10 ppm en la masa del precursor y 0,8 Da en iones de fragmentos y se seleccionó la oxidación de restos de metionina como una posible modificación.

Estudio de la actividad hipertensiva en ratas hipertensas espontáneamente (RHE)

Se estudió el efecto antihipertensor de los péptidos de la invención en la presión arterial de ratas hipertensas espontáneamente. El desarrollo de una presión arterial elevada (hipertensión, HT) en RHE tiene claras analogías con el desarrollo de HT en seres humanos. Para estos estudios se purificaron los péptidos ad hoc. Se midió la presión arterial sistólica (PAS) y la presión arterial diastólica (PAD) de las ratas usando el procedimiento de "manguito en la cola". Este modelo no es invasivo y el único contacto con los animales es la minuciosa administración de un pequeño volumen del extracto del estudio, seguido por las determinaciones de la PAS y la PAD. Antes de colocar el manguito y el transductor en la cola de las ratas, se expuso a los animales a una temperatura cercana a 37°C para facilitar la dilatación de la arteria caudal. Para evitar interferencias y dado que las RHE son especialmente nerviosas, se familiarizó a los animales con el procedimiento durante un periodo de tiempo de 2 a 3 semanas antes de iniciar el experimento.

Se tomaron tres medidas consecutivas de PAS y PAD de cada animal. Se usaron los valores medios. Los animales usados fueron RHE macho, de 17-20 semanas de vida, que pesaban aproximadamente 0,3 kg. Para la prueba, se mantuvo a las RHE a 23°C, con ciclos de luz-oscuridad de 12 horas. Los animales tuvieron acceso libre al agua y a la comida (dieta de control estándar). Se dividió a las ratas aleatoriamente en 3 grupos de estudio. Los animales recibieron una dosis oral de 5 ml/kg de los siguientes compuestos:

- Grupo de control negativo (n = 8): agua.

- Grupo de control positivo (n = 8): Captopril a una dosis de 50 mg/kg

- Grupo experimental 1 (n = 8): Péptidos concentrados de aceite de oliva a una dosis de 0,425 mg/kg

Se midió la PAS y la PAD en las ratas antes de la administración de la dosis correspondiente y 2, 4, 6, 8, 24 y 48 horas más tarde. Se analizaron los datos usando ANOVA de una cola con el software SPSS 15.0. Los valores P < 0,05 se consideraron significativamente diferentes. [M Quinones, Miguel M, Muguerza B, Aleixandre A. Effect of a cocoa polyfenol extract in spontaneously hypertensive rats. Food Funct. 2011; 649-653]

EJEMPLO 1: Preparación de una composición antihipertensiva

El aceite de oliva se obtiene de aceitunas de la variedad Picual. Las aceitunas se recogieron directamente de los árboles en la fase de cambio de maduración. Se lavaron las aceitunas y se extrajo el aceite de oliva usando una planta de extracción en dos fases que produce aceite de oliva, orujo de oliva y alpechín. La extracción del aceite de oliva se realizó en un plazo de 48 horas desde la recogida de las aceitunas. Se llevó a cabo una primera extracción de los péptidos de la invención en varios lotes con una mezcla de acetona: hexano (1:1) usando una relación de aceite de oliva/disolvente de 1:2,5 (p/v), durante 1 h en la sala fría a 4-6°C. A continuación, se centrifugó la mezcla a 10.000 g durante 15 minutos a 4°C. Se desechó el sobrenadante y se separó el precipitado, que contenía los péptidos. Se repitió el proceso de extracción con cada lote de aceite de oliva. Se guardaron los precipitados que contenían los péptidos y se desecaron (extracto inicial), manteniéndolos siempre a una temperatura por debajo de 40°C. A continuación, se suspendió el extracto inicial en mezclas adecuadas de agua y acetonitrilo, preferentemente 80:20. A continuación, se sometió el extracto a un proceso de sonicación durante 30 minutos y se centrifugó otra vez a 10.000 g durante 15 minutos a 4°C. Se recogieron los sobrenadantes, que contenían los péptidos de aceite de oliva concentrado. Este concentrado posee actividad inhibidora de la ACE (véase Ejemplo 2).

Los péptidos de aceite de oliva concentrado pueden purificarse con un sistema FPLC usando una columna de exclusión molecular Superdex Peptide 10/300 GL (GE Healthcare, RU) capaz de separar péptidos de entre 100 y 7.000 Da. Se seleccionaron tres fracciones de péptidos importantes, con masas moleculares comprendidas entre 5.300 y 1.600 Da (F3), 1.600-700 Da (F4) y 700-200 Da (F5, véase Figura 2). Se analizaron los péptidos de concentrados de aceite de oliva de la invención (antes de purificación por FPLC), y los péptidos contenidos en las fracciones purificadas por FPLC mediante nanoLC-Orbitap-EM/EM (Figura 3), por triplicado, y se obtuvieron sus secuencias de aminoácidos por secuenciación de novo tal como se describe en la sección de procedimientos analíticos. Se identificaron varios péptidos nuevos con actividad inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina, con el número de secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 (véase Tabla 2).

Tabla 2: Nuevos péptidos con actividad inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina y su tiempo de retención.

Se someten los péptidos concentrados de aceite de oliva a un proceso de secado, preferentemente secado por pulverización, después de la adición de maltodextrina (para alcanzar un mínimo del 2% de sólidos totales), lo que dio lugar a un extracto concentrado seco que contenía los péptidos de la invención. Los procedimientos de secado alternativos son evaporación, liofilización u otros. El extracto concentrado seco (polvo) puede usarse tal cual, disuelto en agua, solución acuosa, gelatina, disolventes orgánicos o mezclas de los mismos, para alimentos y aplicaciones farmacéuticas.

EJEMPLO 2: Inhibición de enzima convertidora de la angiotensina

Se determinó la actividad inhibidora de la ACE para péptidos concentrados de aceite de oliva y también para las tres fracciones purificadas por FPLC F3, F4 y F5 descritas en el ejemplo 1 (véase Tabla 3 y Figura 4).

Tabla 3. Actividad inhibidora de la ACE de péptidos concentrados de aceite de oliva y de las fracciones purificadas por FPLC F3, F4 y F5. Los datos se expresan como valores medios ± desviación típica.

Se seleccionaron los péptidos del aceite de oliva que mostraron la mayor abundancia y se sintetizaron químicamente, más específicamente SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7. Se determinó la actividad inhibidora de la ACE para estos péptidos sintetizados (intervalo de pureza 95-100%), tal como se muestra en la Tabla 4.

Tabla 4. Actividad inhibidora de la ACE de péptidos de aceite de oliva seleccionados obtenidos por síntesis (intervalo de pureza 95-100%). Los datos se expresan como valores medios ± desviación típica.

Los péptidos concentrados de aceite de oliva, las 3 fracciones principales purificadas por FPLC (F3-F5) y los péptidos individuales obtenidos por síntesis mostraron una importante actividad inhibidora de la ACE. Por tanto, los autores de la invención concluyen que la inhibición de ACE es el mecanismo de acción de la actividad hipertensiva de los péptidos del aceite de oliva. Sin embargo, no pueden descartarse otros mecanismos adicionales.

EJEMPLO 3: Efecto de disminución de la presión arterial en ratas hipertensas

Se estudió la actividad hipertensiva de péptidos concentrados de aceite de oliva en un modelo de ratas hipertensas espontáneamente (RHE). La figura 5 muestra los cambios en la presión arterial sistólica (PAS) y la presión arterial diastólica (PAD) obtenidos en RHE después de la administración de los diferentes compuestos sometidos a ensayo. Los valores iniciales de PAS y PAD de las RHE antes de la administración de las soluciones de prueba fueron 210 ± 2,3 mmHg y 157 ± 3,0 mm Hg, respectivamente. El captopril produjo un descenso muy acusado en la PAS y la PAD en las RHE. El máximo efecto hipotensor se registró entre 4 y 6 horas después de la administración. La PAS y la PAD recuperaron los valores basales al cabo de 48 horas.

Los péptidos concentrados de aceite de oliva produjeron reducciones importantes en la PAS y la PAD en las RHE. En el caso de la PAS, la reducción comenzó a detectarse 2 horas después de la administración del extracto y pudo medirse durante las primeras 6 h, antes de recuperar el valor basal. En el caso de la PAD, los péptidos concentrados de aceite de oliva también produjeron reducciones que fueron detectables 2, 4, 6 y 8 horas después de la administración. Los datos de PAS y PAD obtenidos a las 48 horas fueron similares a los obtenidos a las 24 horas. En conclusión, la composición de péptidos de aceite de oliva descrita en el ejemplo 1 posee actividad hipertensiva.

EJEMPLO 4: Preparación de un alimento que contiene una composición antihipertensiva

Se preparó un zumo enriquecido usando los siguientes ingredientes:

Tecnología de procesado:

Se preparó el producto final a partir de un zumo concentrado mediante adición de agua e ingredientes hidrosolubles. A continuación, se añadió el extracto seco que contenía los péptidos del aceite de oliva de la invención que tenían las secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7 y se mezcló y se pasteurizó y homogeneizó el producto resultante. Finalmente, se enfrió el producto y se envasó.

EJEMPLO 5: Preparación de un alimento basado en aceite (margarina) que contiene una composición antihipertensiva

Puede

Tecnología de procesado:

Se prepara el producto de untar usando un proceso similar al usado para la producción de margarina. Se prepara una emulsión de agua en aceite dispersando la fase acuosa en la fase oleosa en la proporción de fase acuosa al 60% y oleosa al 40% en peso de la emulsión de agua en aceite.

Para preparar la fase oleosa, se añaden ingredientes a un tanque de mezclado, se incrementa la temperatura a 45°C y se mezclan los ingredientes hasta una homogeneidad completa. Se mezclan los ingredientes de la fase acuosa en un tanque independiente a 75°C. Con la fase oleosa a 45°C y la fase acuosa a 75°C, se dispersa la fase acuosa en la proporción del 60% en peso de la emulsión de agua en aceite en la fase oleosa en la proporción del 40% en peso de la emulsión de agua en aceite para formar la emulsión de agua en aceite. Se procesa la emulsión de agua en aceite resultante por medios convencionales, normalmente, en un intercambiador de superficie barrida y un equipo auxiliar para pasteurización y a continuación se enfría. Se enfría la emulsión y se somete a un proceso de texturización para proporcionar una consistencia untable que sea sólida a temperatura ambiente.

EJEMPLO 6: Preparación de un yogur que contiene una composición antihipertensiva

El yogur y las leches fermentadas pueden prepararse usando los siguientes ingredientes:

Tecnología de procesado:

Se estandarizan la grasa de la leche y el contenido en sólidos de la leche de acuerdo con la fórmula anterior y se añaden los péptidos de la invención. Se homogeneiza la leche a 20-25 MPa, a una temperatura de 65-70°C. A continuación, se calienta la leche a 90-95°C durante 5 minutos. Este tratamiento permite desnaturalizar aproximadamente el 70-80% de las proteínas del suero de la leche. A continuación se enfría la leche a 40-45°C y se dispensa cultivo matriz de yogur durante el transporte de la leche desde el tanque de almacenamiento a la máquina de llenado. Una vez terminada la fase de llenado del producto, a continuación se transporta a una cámara de incubación en la que la fermentación tiene lugar a 40-45°C durante 5-6 horas, o hasta que el valor de pH alcanza 4,5. Finalmente, se almacena la leche fermentada resultante en una cámara a 5°C.

EJEMPLO 7: Preparación de cápsulas de gelatina que contienen una composición antihipertensiva

Tecnología de procesado:

Se pesan las materias primas y se transfieren al área de fabricación. Se cribó la lactosa anhidra y el estearato de magnesio. Se añade el 50% (p/p) de la lactosa anhidra al estearato de magnesio y se mezcló durante 5 minutos en una mezcladora, a velocidad media. A continuación, se añade el extracto seco que contiene los péptidos del aceite de oliva de la invención y se mezcla durante otros 5 minutos. A continuación, se añade el 50% (p/p) restante de la lactosa anhidra y se vuelve a mezclar. Se encapsula el producto resultante en cápsulas de gelatina dura de 300 mg usando un sistema de llenado de cápsulas manual, semiautomático o automático, de acuerdo con procedimientos farmacéuticos establecidos.

EJEMPLO 8: Preparación de una mezcla de aceites comestibles que contiene una composición antihipertensiva

El aceite de oliva o cualquier tipo de aceite comestible puede enriquecerse con los péptidos de la invención usando los siguientes ingredientes:

Tecnología de procesado:

Se prepara una emulsión de agua en aceite (emulsión ag/ac) dispersando la fase acuosa en la fase oleosa. Para ello, se calienta la fase oleosa (aceite de oliva o cualquier aceite comestible) a 45°C. A continuación se mezclan el aceite de oliva y la lecitina hasta una homogeneidad completa. A continuación, se disuelve el extracto seco que contiene los péptidos concentrados de aceite de oliva de la invención en agua a 70°C. Finalmente, se añade la fase acuosa a la fase oleosa y se mezclan suavemente hasta homogeneidad completa. Se calienta la emulsión resultante antes del envasado, ya que puede tener un aspecto turbio.

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Un péptido aislado, o cualquiera de las sales, ésteres, solvatos y anhidratos farmacéuticamente aceptables del mismo, que comprende al menos dos cisteínas separadas por 0 aminoácidos, que consiste en una longitud entre 8, 9 o 10 aminoácidos, en el que el péptido muestra actividad antihipertensiva y comprende la secuencia SEQ ID NO: 7.

2. Un péptido de fusión que comprende el péptido según la reivindicación 1 y un péptido de soporte o marcador, en donde

- El péptido de soporte es un péptido que internaliza el péptido en la célula, y

- El péptido marcador es una secuencia de aminoácidos útil para el aislamiento o la purificación del péptido aislado.

3. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, para su uso como un medicamento.

4. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, para su uso en el tratamiento y/o prevención de prehipertensión o hipertensión.

5. Un procedimiento para obtener un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 que comprende

(i) obtención de un precipitado de proteínas desde el aceite procedente de aceitunas,

(ii) obtención de un extracto de péptidos a partir del precipitado de la etapa (i) que comprende el péptido, y

(iii) Fraccionamiento y purificación del péptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el aceite procede del prensado y/o molienda de aceitunas, preferentemente, el aceite procede del grupo que consiste en pasta de aceitunas machacadas, aceite de orujo de oliva, orujo de oliva, alpechín, orujo de aceituna desecado/desgrasado, y combinaciones y mezclas de los mismos.