CN105063150A - 酶解金枪鱼血蛋白降血压肽的制备方法 - Google Patents

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吴凯强
宋文东
胡世伟
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姜维
李世杰
王亚宁
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Abstract

本发明公开了酶解金枪鱼血蛋白降血压肽的制备方法,包括以金枪鱼血为原料,取金枪鱼血,去腥,用NaOH溶液调节pH,加热后保存;将金枪鱼血的温度升至55-60℃预热,而后加入碱性蛋白酶进行酶解,离心后,将酶解液依次经超滤、脱盐、冷冻干燥和层析,得到降血压肽。通过采用金枪鱼血为原料,可以将原先废弃物重新利用,有利于环境保护。金枪鱼血调节pH后经预热处理并酶解后,可以得到产率较高的活性物,且活性物的降压应用效果显著,本方法的综合效果显得出乎意料。因而本发明有有效成分产率高、降压效果好、安全可靠、生态友好的优点。

Description

酶解金枪鱼血蛋白降血压肽的制备方法
技术领域
本发明涉及一种降血压肽的制备方法,尤其涉及酶解金枪鱼血蛋白降血压肽的制备方法。
背景技术
血管紧张素转换酶是一种膜结合糖蛋白,分子量为150000,当人体循环或局部组织中ACE活性过高时,会使血管紧张素1的肽链C末端的组氨酸和亮氨酸残基水解形成具有增压作用的血管紧张素2,同时促血管舒张作用的缓激肽P物质的水解,导致血压升高。因此,寻找合适物质,抑制体内ACE的活性,即可达到降低血压的目的。目前,血管紧张素转换酶抑制剂是一类发展迅速的抗高血压药物。此类化学合成药物在临床应用过程中常引起患者咳嗽、味觉异常、粒细胞减少、皮疹等不良反应,给患者带来极大的不适感。
与化学合成的ACEI相比较,通过酶解食源性蛋白质获得的ACE抑制活性肽具有显著特点,主要体现在:(1)安全性高,无毒副作用:ACEP均以食源性蛋白为原料,采用食用级蛋白酶水解制备获得,多种ACEP动物实验及临床检验结果,均未观察到毒副作用;(2)原料来源广,制备条件温和,易于产业化:与化学降解相比较,酶解反应条件温和,生产过程中不会破坏氨基酸,形成Lys-Ala等有毒物质,对环境影响小。同时,生活中存在大量食源性蛋白,特别是水产加工过程中产生的副产物蛋白,成本极低,且减少环境污染。(3)降压效果专一,易于消化吸收:ACEP只对高血压患者具有降压作用,而对正常患者无影响;同时ACEP分子量低,极易吸收。因此,选择合适的蛋白酶在体外降解蛋白资源,研究和开发出具有降血压作用的活性肽食品或药物,成为研究的热点。
金枪鱼是世界远洋渔业的重要作业鱼种之一,据联合国粮农组织统计,世界金枪鱼年产量超过600万吨,占公海渔业总产量70%以上,在金枪鱼加工过程中产生大量的金枪鱼血。研究表明金枪鱼血中粗蛋白含量也比较高,是良好的蛋白质来源。然而,我国金枪鱼血的加工应用情况不仅如人意,90%以上仍被丢弃,造成金枪鱼资源的极大浪费,也给生态环境带来了较大压力。因此综合高效利用金枪鱼血具有重要的意义。
我国对于金枪鱼血ACEP的研究尚处于空白阶段,对于实际可行的酶解工艺及分离纯化目前未见报道。而工业化制备金枪鱼血ACE抑制肽既要考虑到降血压活性,还要考虑产品的得率,生产成本等方面。而目前已经报道的甲鱼、河蚌、贻贝等为原料制备ACEP的方法并不适用于以金枪鱼血为原料制备降压肽。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术提供一种有效成分产率高、降压效果好、安全可靠、生态友好的酶解金枪鱼血蛋白降血压肽的制备方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:酶解金枪鱼血蛋白降血压肽的制备方法,包括以金枪鱼血为原料,其具有如下步骤:
1)取金枪鱼血,去腥,用NaOH溶液调节pH,加热后保存;
2)将步骤1)处理后的金枪鱼血的温度升至55-60℃预热,以该金枪鱼血质量的0.5%-1.5%加入碱性蛋白酶进行酶解,酶解温度为55-60℃,酶解时间为4-6h;
3)将步骤2)所得的酶解产物经过灭酶处理得酶解液,离心后,将酶解液依次经超滤、脱盐、冷冻干燥和层析,得到降血压肽;
预热是在搅拌状态下进行,预热时间为15-20min。通过采用金枪鱼血为原料,可以将原先废弃物重新利用,有利于环境保护。金枪鱼血调节pH后经预热处理并酶解后,可以得到产率较高的活性物,且活性物的降压应用效果显著,本方法的综合效果显得出乎意料。
为优化上述技术方案,采取的措施还包括:步骤1)金枪鱼为大目金枪鱼或黄鳍金枪鱼或鲣鱼;步骤1)中,缓冲液是pH为9.5-10.5的甘氨酸-NaOH缓冲液。采用甘氨酸-NaOH缓冲液可以避免蛋白的意外变性产生不可逆转的后果而影响有关制备产物的活性。步骤1)中,金枪鱼血含有重量分数5-30%的保护剂;保护剂含有乳糖和海藻糖,且乳糖与海藻糖重量比为5:1至1:5。通过使用保护剂,可以取得意想不到的活性保持效果。步骤2)中,碱性蛋白酶的酶活力大于1.9×104U/g。较高的酶活可以缩短热处理时间,避免失活。步骤3)中,灭活条件为升温至95-100℃,并于此温度保持10-15min,再冷却至0-15℃以终止酶反应;所述步骤3)中,离心的条件为转速3000-5000r/min,时间15-20min,温度4-6℃;步骤3)中超滤条件为工作压力0.1-0.15Mpa和工作温度20-30℃。灭活会损失大量有效成分,因此,保护剂的使用可以提高作为混合物的产品中有效成分产率。步骤3)中,层析条件为酶解液的浓度为5mg/mL-15mg/mL,加入到D101大孔树脂层析柱进行脱盐,然后用70%乙醇进行解析,除去乙醇,浓缩液进行冷冻干燥,得超滤脱盐酶解物干粉;所述步骤3)中,层析的具体过程为:将超滤脱盐酶解物干粉溶解后上SephadexG-15或G-25凝胶层析柱,收集所得的高活性的小分子肽组分经冷冻干燥,得降血压肽。经过进一步纯化,冻干后,产品可以稳定的保存很长一段时间。
由于本发明采用了具有如下步骤:
1)取金枪鱼血,去腥,用NaOH溶液调节pH,加热后保存;
2)将步骤1)处理后的金枪鱼血的温度升至55-60℃预热,以该金枪鱼血质量的0.5%-1.5%加入碱性蛋白酶进行酶解,酶解温度为55-60℃,酶解时间为4-6h;
3)将步骤2)所得的酶解产物经过灭酶处理得酶解液,离心后,将酶解液依次经超滤、脱盐、冷冻干燥和层析,得到降血压肽;
预热是在搅拌状态下进行,预热时间为15-20min。通过采用金枪鱼血为原料,可以将原先废弃物重新利用,有利于环境保护。金枪鱼血调节pH后经预热处理并酶解后,可以得到产率较高的活性物,且活性物的降压应用效果显著,本方法的综合效果显得出乎意料。因而本发明具有有效成分产率高、降压效果好、安全可靠、生态友好的优点。
具体实施方式
以下结合附实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1:
酶解金枪鱼血蛋白降血压肽的制备方法,包括以金枪鱼血为原料,其具有如下步骤:
1)取金枪鱼血,去腥,用NaOH溶液调节pH,加热后保存;
2)将步骤1)处理后的金枪鱼血的温度升至55-60℃预热,以该金枪鱼血质量的0.5%-1.5%加入碱性蛋白酶进行酶解,酶解温度为55-60℃,酶解时间为4-6h;
3)将步骤2)所得的酶解产物经过灭酶处理得酶解液,离心后,将酶解液依次经超滤、脱盐、冷冻干燥和层析,得到降血压肽;
预热是在搅拌状态下进行,预热时间为15-20min。通过采用金枪鱼血为原料,可以将原先废弃物重新利用,有利于环境保护。金枪鱼血调节pH后经预热处理并酶解后,可以得到产率较高的活性物,且活性物的降压应用效果显著,本方法的综合效果显得出乎意料。步骤1)金枪鱼为大目金枪鱼或黄鳍金枪鱼或鲣鱼;步骤1)中,缓冲液是pH为9.5-10.5的甘氨酸-NaOH缓冲液。采用甘氨酸-NaOH缓冲液可以避免蛋白的意外变性产生不可逆转的后果而影响有关制备产物的活性。
步骤1)中,金枪鱼血含有重量分数5-30%的保护剂;保护剂含有乳糖和海藻糖,且乳糖与海藻糖重量比为5:1至1:5。通过使用保护剂,可以取得意想不到的活性保持效果。金枪鱼血含有的保护剂重量分数包括但不限于5%、8%、10%、15%、20%、25%、30%。含有的乳糖每200ml鱼血适配包括但不限于8.3g、8.5g、10g、15g、20g、25g、30g、35g、40g、45g、50g。含有的海藻糖每200ml鱼血适配包括但不限于8.3g、8.5g、10g、15g、20g、25g、30g、35g、40g、45g、50g。
步骤2)中,碱性蛋白酶的酶活力大于1.9×104U/g。较高的酶活可以缩短热处理时间,避免失活。步骤3)中,灭活条件为升温至95-100℃,并于此温度保持10-15min,再冷却至0-15℃以终止酶反应;所述步骤3)中,离心的条件为转速3000-5000r/min,时间15-20min,温度4-6℃;步骤3)中超滤条件为工作压力0.1-0.15Mpa和工作温度20-30℃。灭活会损失大量有效成分,因此,保护剂的使用可以提高作为混合物的产品中有效成分产率。步骤3)中,层析条件为酶解液的浓度为5mg/mL-15mg/mL,加入到D101大孔树脂层析柱进行脱盐,然后用70%乙醇进行解析,除去乙醇,浓缩液进行冷冻干燥,得超滤脱盐酶解物干粉;所述步骤3)中,层析的具体过程为:将超滤脱盐酶解物干粉溶解后上SephadexG-15或G-25凝胶层析柱,收集所得的高活性的小分子肽组分经冷冻干燥,得降血压肽。经过进一步纯化,冻干后,产品可以稳定的保存很长一段时间。下面结合实施例进行进一步说明:
(1)pH的调节:取金枪鱼血200mL,加入15g乳糖和20g海藻糖,用甘氨酸-NaOH缓冲液条件pH至10;
(2)预热:将混合液在温度为55℃,恒速搅拌15min;
(3)酶解:将上述混合液加入2g碱性蛋白酶,在温度为55℃下,酶解5h;
(4)灭活:将酶解液在95℃下保持15min,以终止酶反应;
(5)离心:将灭活后的液体在温度为4℃,转速为4000r/min的条件下离心15min,取上清液;
(6)超滤:将酶解液液先用0.45um的中空纤维进行微滤,微滤后的酶解液在0.13Mpa的工作压力和20℃的工作温度下,通过截留分子量为10KDa超滤膜进行超滤,除去大分子蛋白质及多糖等,所收集的透过液为超滤酶解液;
(7)D101大孔树脂脱盐:将超滤酶解液制成浓度为10mg/mL的溶液,加入到D101大孔树脂层析柱,以水洗除酶液中的盐,然后用70%乙醇以1.5BV/h的流速将酶解物从D101大孔树脂上解吸下来,低温真空浓缩除去乙醇,浓缩液进行冷冻干燥(-50℃,48h),得超滤脱盐酶解液干粉。
(8)凝胶柱层析:超滤脱盐酶解物干粉用去离子水配制成浓度为10mg/mL溶液,将5mL的该溶液上SephadexG-15凝胶层析柱,以0.5mL/min的流速用超纯水进行洗脱,收集组分,将其冷冻干燥(-50℃,48h);得降血压肽。
实施例2:
(1)pH的调节:取金枪鱼血200mL,加入10g乳糖和50g海藻糖,用甘氨酸-NaOH缓冲液条件pH至9.5;
(2)预热:将混合液在温度为60℃,恒速搅拌15min;
(3)酶解:将上述混合液加入2g碱性蛋白酶,在温度为55℃下,酶解5h。
(4)灭活:将酶解液在95℃下保持15min,以终止酶反应;
(5)离心:将灭活后的液体在温度为4℃,转速为4000r/min的条件下离心15min,取上清液;
(6)超滤:将酶解液液先用0.45um的中空纤维进行微滤,微滤后的酶解液在0.13Mpa的工作压力和20℃的工作温度下,通过截留分子量为10KDa超滤膜进行超滤,除去大分子蛋白质及多糖等,所收集的透过液为超滤酶解液;
(7)D101大孔树脂脱盐:将超滤酶解液制成浓度为10mg/mL的溶液,加入到D101大孔树脂层析柱,以水洗除酶液中的盐,然后用70%乙醇以1.5BV/h的流速将酶解物从D101大孔树脂上解吸下来,低温真空浓缩除去乙醇,浓缩液进行冷冻干燥(-50℃,48h),得超滤脱盐酶解液干粉。
(8)凝胶柱层析:超滤脱盐酶解物干粉用去离子水配制成浓度为10mg/mL溶液,将5mL的该溶液上SephadexG-15凝胶层析柱,以0.5mL/min的流速用超纯水进行洗脱,收集组分,将其冷冻干燥(-50℃,48h);得降血压肽。
实施例3:
(1)pH的调节:取金枪鱼血200mL,用甘氨酸-NaOH缓冲液条件pH至10;
(2)预热:在鱼血中加入45g乳糖和10g海藻糖将混合液在温度为55℃,恒速搅拌20min;
(3)酶解:将上述混合液加入2.5g碱性蛋白酶,在温度为60℃下,酶解6h。
(4)灭活:将酶解液在95℃下保持15min,以终止酶反应;
(5)离心:将灭活后的液体在温度为4℃,转速为4000r/min的条件下离心15min,取上清液;
(6)超滤:将酶解液液先用0.45um的中空纤维进行微滤,微滤后的酶解液在0.13Mpa的工作压力和20℃的工作温度下,通过截留分子量为10KDa超滤膜进行超滤,除去大分子蛋白质及多糖等,所收集的透过液为超滤酶解液;
(7)D101大孔树脂脱盐:将超滤酶解液制成浓度为10mg/mL的溶液,加入到D101大孔树脂层析柱,以水洗除酶液中的盐,然后用70%乙醇以1.5BV/h的流速将酶解物从D101大孔树脂上解吸下来,低温真空浓缩除去乙醇,浓缩液进行冷冻干燥(-50℃,48h),得超滤脱盐酶解液干粉。
(8)凝胶柱层析:超滤脱盐酶解物干粉用去离子水配制成浓度为10mg/mL溶液,将5mL的该溶液上SephadexG-15凝胶层析柱,以0.5mL/min的流速用超纯水进行洗脱,收集组分,将其冷冻干燥(-50℃,48h);得降血压肽。
实施例4:
(1)pH的调节:取金枪鱼血200mL,用甘氨酸-NaOH缓冲液条件pH至10;
(2)预热:将混合液在温度为55℃,恒速搅拌15min;
(3)酶解:将上述混合液加入2.5g碱性蛋白酶,在温度为55℃下,酶解4h。
(4)灭活:将酶解液在100℃下保持120min,以终止酶反应;
(5)离心:将灭活后的液体在温度为6℃,转速为5000r/min的条件下离心15min,取上清液;
(6)超滤:将酶解液液先用0.45um的中空纤维进行微滤,微滤后的酶解液在0.15Mpa的工作压力和30℃的工作温度下,通过截留分子量为10KDa超滤膜进行超滤,除去大分子蛋白质及多糖等,所收集的透过液为超滤酶解液;
(7)D101大孔树脂脱盐:将超滤酶解液制成浓度为10mg/mL的溶液,加入到D101大孔树脂层析柱,以水洗除酶液中的盐,然后用70%乙醇以1.5BV/h的流速将酶解物从D101大孔树脂上解吸下来,低温真空浓缩除去乙醇,浓缩液进行冷冻干燥(-50℃,48h),得超滤脱盐酶解液干粉。
(8)凝胶柱层析:超滤脱盐酶解物干粉用去离子水配制成浓度为10mg/mL溶液,将5mL的该溶液上SephadexG-15凝胶层析柱,以0.5mL/min的流速用超纯水进行洗脱,收集组分,将其冷冻干燥(-50℃,48h);得降血压肽。
实施例5:
(1)pH的调节:取金枪鱼血200mL,加入40g乳糖和40g海藻糖,用甘氨酸-NaOH缓冲液条件pH至9.5;
(2)预热:将混合液在温度为55℃,恒速搅拌15min;
(3)酶解:将上述混合液加入1.5g碱性蛋白酶,在温度为55℃下,酶解5h。
(4)灭活:将酶解液在100℃下保持20min,以终止酶反应;
(5)离心:将灭活后的液体在温度为4℃,转速为5000r/min的条件下离心20min,取上清液;
(6)超滤:将酶解液液先用0.45um的中空纤维进行微滤,微滤后的酶解液在0.13Mpa的工作压力和25℃的工作温度下,通过截留分子量为10KDa超滤膜进行超滤,除去大分子蛋白质及多糖等,所收集的透过液为超滤酶解液;
(7)D101大孔树脂脱盐:将超滤酶解液制成浓度为10mg/mL的溶液,加入到D101大孔树脂层析柱,以水洗除酶液中的盐,然后用70%乙醇以1.5BV/h的流速将酶解物从D101大孔树脂上解吸下来,低温真空浓缩除去乙醇,浓缩液进行冷冻干燥(-50℃,48h),得超滤脱盐酶解液干粉。
(8)凝胶柱层析:超滤脱盐酶解物干粉用去离子水配制成浓度为10mg/mL溶液,将5mL的该溶液上SephadexG-15凝胶层析柱,以0.5mL/min的流速用超纯水进行洗脱,收集组分,将其冷冻干燥(-50℃,48h);得降血压肽。
降血压肽性能测试将得到的降血压肽利用体外检测ACE抑制活性的高效液相色谱法,分别测其五个实施案例的IC50
实施例 1 2 3 4 5
IC50(mg/mL) 0.079 0.087 0.085 0.086 0.085
尽管已结合优选的实施例描述了本发明,然其并非用以限定本发明,任何本领域技术人员,在不脱离本发明的精神和范围的情况下,能够对在这里列出的主题实施各种改变、同等物的置换和修改,因此本发明的保护范围当视所提出的权利要求限定的范围为准。

Claims (6)

1.酶解金枪鱼血蛋白降血压肽的制备方法,包括以金枪鱼血为原料,其特征是:具有如下步骤:
1)取金枪鱼血,去腥,用NaOH溶液调节pH,加热后保存;
2)将步骤1)处理后的金枪鱼血的温度升至55-60℃预热,以该金枪鱼血质量的0.5%-1.5%加入碱性蛋白酶进行酶解,酶解温度为55-60℃,酶解时间为4-6h;
3)将步骤2)所得的酶解产物经过灭酶处理得酶解液,离心后,将酶解液依次经超滤、脱盐、冷冻干燥和层析,得到降血压肽;
所述的预热是在搅拌状态下进行,预热时间为15-20min。
2.根据权利要求1所述的酶解金枪鱼血蛋白降血压肽的制备方法,其特征是:步骤1)所述的金枪鱼为大目金枪鱼或黄鳍金枪鱼或鲣鱼;步骤1)中,所述的缓冲液是pH为9.5-10.5的甘氨酸-NaOH缓冲液。
3.根据权利要求1所述的酶解金枪鱼血蛋白降血压肽的制备方法,其特征是:步骤1)中,所述的金枪鱼血含有重量分数5-30%的保护剂;所述的保护剂含有乳糖和海藻糖,且所述的乳糖与海藻糖重量比为5:1至1:5。
4.根据权利要求1所述的酶解金枪鱼血蛋白降血压肽的制备方法,其特征是:步骤2)中,所述的碱性蛋白酶的酶活力大于1.9×104U/g。
5.根据权利要求1所述的酶解金枪鱼血蛋白降血压肽的制备方法,其特征是:步骤3)中,所述的灭活条件为升温至95-100℃,并于此温度保持10-15min,再冷却至0-15℃以终止酶反应;所述步骤3)中,所述的离心的条件为转速3000-5000r/min,时间15-20min,温度4-6℃;步骤3)中所述的超滤条件为工作压力0.1-0.15Mpa和工作温度20-30℃。
6.根据权利要求1所述的酶解金枪鱼血蛋白降血压肽的制备方法,其特征是:步骤3)中,所述的层析条件为酶解液的浓度为5mg/mL-15mg/mL,加入到D101大孔树脂层析柱进行脱盐,然后用70%乙醇进行解析,除去乙醇,浓缩液进行冷冻干燥,得超滤脱盐酶解物干粉;所述步骤3)中,所述的层析的具体过程为:将超滤脱盐酶解物干粉溶解后上SephadexG-15或G-25凝胶层析柱,收集所得的高活性的小分子肽组分经冷冻干燥,得降血压肽。
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