CN105063144A - 一种利用猪血红蛋白制取抗菌肽的方法 - Google Patents

一种利用猪血红蛋白制取抗菌肽的方法 Download PDF

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宁发子
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Abstract

本发明公开了一种利用猪血红蛋白制取抗菌肽的方法，包括以下步骤：将猪全血分离得猪血球，再将猪血球溶血、酶解、脱色、超滤、真空浓缩、冻干，即得抗菌肽；所述胰蛋白酶的加酶量是3000U／g，在pH8、温度45℃～55℃条件下，酶解反应时间4～6h。本发明的利用猪血红蛋白制取抗菌肽的方法，成本低、效果好。

Description

一种利用猪血红蛋白制取抗菌肽的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用猪血红蛋白制取抗菌肽的方法。
背景技术
抗菌肽(antibacterialpeptide，ABP)是生物体天然免疫防御系统的重要组成部分。抗菌肽具有抗菌谱广、热稳定性高、安全高效等诸多优点，食物源蛋白抗菌肽的制备成为生物领域的研究热点之一。
猪血是生猪屠宰加工过程中的主要副产物之一，营养价值很高，素有“液态肉”之称，我国猪血资源非常丰富，但利用率低，不超过10％，如被加工成血粉作为饲料添加剂，用于生化制药中血红素、蛋白胨的生产，这些产品附加值低，而大多数作为废弃物直接排出，造成了资源浪费和环境污染。
欧美、日本等发达国家将猪血开发成肽类试剂、肽类药物等多种功能食品及食品添加剂，普遍推广，利用率达50％以上。因此，以猪血为底物开发生物活性肽，可以提高生猪屠宰加工企业产品附加值，显示出巨大的市场前景。
研究表明，猪血中具有较强抗菌活性的多肽，因此开发研究一种从猪血中提取、纯化抗菌肽的成熟方法，可以一举多得。目前从猪血中提取抗菌肽的技术方法和产品尚未见报道。
发明内容
针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种成本低、效果好的利用猪血红蛋白制取抗菌肽的方法。
本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的：提供一种利用猪血红蛋白制取抗菌肽的方法，包括以下步骤：
（1）采集新鲜猪血，以5g／L的柠檬酸钠抗凝，在4℃、8000r／min离心10min，收集下层沉淀，以获得红血球；在红血球中加入同等体积的蒸馏水，超声波细胞破碎辅助溶血20min，然后在4℃、4000r／min离心10min，得到血红蛋白溶液，于4℃保存备用。
（2）取适量血红蛋白溶液，加入胰蛋白酶酶解（加酶量2500-3500U／g），搅拌，1mol/LNaoH溶液或HCl溶液维持体系pH8.0，45-55℃，4-6h；将酶解反应产物迅速升温至85℃并保持此温度10～15分钟，再迅速冷却至0～30℃以终止酶解反应，调节pH值至7.0左右，8000r／min离心15min，获得上清酶解液，4℃冷藏备用。
（3）活性炭用量为酶解液总重的5-30％，温度55℃，搅拌脱色20-30min；再进行粗滤处理后得粗滤酶解液；将粗滤酶解液在0.1～0.2Mpa的工作压力和0～45℃的工作温度下，采用截留分子质量为10kD超滤膜进行超滤处理，以除去大分子蛋白类物质，得超滤酶解液；再将超滤酶解液依次进行真空浓缩、冷冻干燥，得抗菌肽，-20℃保存。
以上所述的一种利用猪血红蛋白制取抗菌肽的方法，其特征是：所述步骤（2）中胰蛋白酶是酶比活力10×104u/g；胰蛋白酶加酶量是3000U／g。
本发明的一种利用猪血红蛋白制取抗菌肽的方法，具有如下优点：
1.本发明所制备的抗菌肽是猪血红蛋白经生物酶水解而得，属于天然提取物，具有天然、无毒、无污染、无残留、无副作用、高效抗菌等特点，是一种新型的绿色抗微生物药物。
2.采用本发明方法提取的抗菌肽，具有广谱抗菌、抗病毒、不产生耐药性、有免疫调节作用等功能。
3.本发明所采用的原料来源广泛，价格低廉，经过本发明的技术转化可以有效的提高猪血副产物的附加值，对继续促进生猪产业的发展有重要的意义。
4.本发明的产品可以作为药品、保健食品、食品、食品添加剂、药物增效剂等，工艺科学合理，操作简单，具有较强的工业实施性。
具体实施方式
实施例1
（1）采集新鲜猪血100L，以5g／L的柠檬酸钠抗凝，在4℃、8000r／min离心10min，收集下层沉淀，以获得红血球约45L（固含30%）；在红血球中加入45L蒸馏水，超声波细胞破碎辅助溶血20min，然后在4℃、4000r／min离心10min，得到血红蛋白溶液90L。
（2）取适量血红蛋白溶液，加入410g胰蛋白酶酶解（酶比活力为10×104u/g），搅拌，1mol/LNaoH溶液维持体系pH8.0，50℃，5h；将酶解反应产物迅速升温至85℃并保持此温度15分钟，再迅速冷却至0～30℃以终止酶解反应，调节pH值至7.0左右，8000r／min离心15min，获得上清酶解液90L。
（3）酶解液中加入活性炭用量15kg，温度55℃，搅拌脱色20-30min；再进行粗滤处理后得粗滤酶解液；将粗滤酶解液在0.1～0.2Mpa的工作压力和0～45℃的工作温度下，采用截留分子质量为10kD超滤膜进行超滤处理，收集超滤透过液78L；再将超滤透过液真空浓缩至30L，进行冷冻干燥，得抗菌肽1.68kg，-20℃保存。
检测结果，所得抗菌肽肽含量为92.01％，色泽白色细腻。
实施例2
（1）采集新鲜猪血50L，以5g／L的柠檬酸钠抗凝，在4℃、8000r／min离心10min，收集下层沉淀，以获得红血球约23L（固含30%）；在红血球中加入23L蒸馏水，超声波细胞破碎辅助溶血20min，然后在4℃、4000r／min离心10min，得到血红蛋白溶液46L。
（2）取适量血红蛋白溶液，加入200g胰蛋白酶酶解（酶比活力为10×104u/g），搅拌，1mol/LNaoH溶液维持体系pH8.0，50℃，5h；将酶解反应产物迅速升温至85℃并保持此温度15分钟，再迅速冷却至0～30℃以终止酶解反应，调节pH值至7.0左右，8000r／min离心15min，获得上清酶解液46L。
（3）酶解液中加入活性炭用量10kg，温度55℃，搅拌脱色20-30min；再进行粗滤处理后得粗滤酶解液；将粗滤酶解液在0.1～0.2Mpa的工作压力和0～45℃的工作温度下，采用截留分子质量为10kD超滤膜进行超滤处理，收集超滤透过液78L；再将超滤透过液真空浓缩至30L，进行冷冻干燥，得抗菌肽0.96kg，-20℃保存。
检测结果，所得抗菌肽肽含量为94.41％，色泽白色细腻。

Claims (3)

1.一种利用猪血红蛋白制取抗菌肽的方法，其特征是包括以下步骤：
（1）采集新鲜猪血，以5g／L的柠檬酸钠抗凝，在4℃、8000r／min离心10min，收集下层沉淀，以获得红血球；在红血球中加入同等体积的蒸馏水，超声波细胞破碎辅助溶血20min，然后在4℃、4000r／min离心10min，得到血红蛋白溶液，于4℃保存备用；
（2）取适量血红蛋白溶液，加入一定量的胰蛋白酶酶解，搅拌，1mol/LNaoH溶液维持体系pH8.0，45-55℃，4-6h；将酶解反应产物迅速升温至85℃并保持此温度10～15分钟，再迅速冷却至0～30℃以终止酶解反应，调节pH值至7.0左右，8000r／min离心15min，获得上清酶解液，4℃冷藏备用；
（3）活性炭用量为酶解液总重的5-30％，温度55℃，搅拌脱色20-30min；再进行粗滤处理后得粗滤酶解液；将粗滤酶解液在0.1～0.2Mpa的工作压力和0～45℃的工作温度下，采用截留分子质量为10kD超滤膜进行超滤处理，以除去大分子蛋白类物质，得超滤酶解液；再将超滤酶解液依次进行真空浓缩、冷冻干燥，得抗菌肽，-20℃保存。
2.根据权利要求1所述的一种利用猪血红蛋白制取抗菌肽的方法，其特征是：所述步骤（2）中胰蛋白酶是酶比活力10×104u/g。
3.根据权利要求1所述的一种利用猪血红蛋白制取抗菌肽的方法，其特征是：所述步骤（2）中胰蛋白酶加酶量是3000U／g。
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