CN105779548A - 一种驼血多肽的制备纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种驼血多肽的制备方法。该方法以驼血为原料，经预处理后加入到细胞破碎装置中，加入溶剂，利用细胞破碎技术进行细胞破碎，再利用酶解技术酶解驼血蛋白质获得驼血多肽酶解液，然后利用膜过滤技术进行分离纯化，进行脱色脱腥处理，收集脱色脱腥液，最后利用膜浓缩或减压真空浓缩，干燥后制备驼血多肽产品。根据本发明专利制备的驼血多肽产品具有分子量集中、水溶性好、回收率高、脱色效果好、无腥味等优点，大大提高了产品的价值，可广泛应用于医药、保健品、食品、化妆品等行业。

Description

一种驼血多肽的制备纯化方法

技术领域

本发明属于活性物质筛选纯化技术领域，具体涉及一种驼血多肽的制备纯化方法。

背景技术

骆驼(Camel)是偶蹄目骆驼科骆驼属大型反刍哺乳动物的统称，分单峰驼和双峰驼。我国是世界上骆驼养殖量较多的国家之一，根据中国统计年鉴2015资料统计，2014年全国约有骆驼33.4万峰，其中，新疆16.0万峰，内蒙古13.8万峰。按类型划分，我国的双峰驼大致分为三个驼系：新疆驼(Xinjiangcamel)、苏尼特驼(Sunitecamel)、阿拉善双峰驼(AlxaBactriancamel)。由于骆驼生存在严酷的恶劣环境条件下，与其它动物的血液相比，特殊的环境使其蛋白质类型、分子量、含量等有显著差异，具有特殊的生理、营养功能。骆驼血清蛋白质共有白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白等5个组分。双峰驼血清的蛋白质总量中，白蛋白含量高达73.20％，明显高于绵羊、牛、马等哺乳类动物中血液的白蛋白。

现代研究表明，人类对蛋白质的利用是将蛋白质酶解成小分子多肽或低聚肽吸收利用。小分子多肽或低聚肽具有不需消化直接吸收、不需消耗人体能量、吸收速度快、优先吸收、在人体中合成蛋白质的速率较氨基酸快等诸多优点。以驼血为原料，制备驼血多肽及相关产品，开发出抗疲劳、抗衰老、增强免疫力等功能的药品、保健品、食品、化妆品等，将会极大提高驼血的附加值，可推动骆驼养殖业的发展，具有重要的经济效益和社会效益。因此，从驼血中制备驼血多肽，可以提高驼血中蛋白质的利用率。同时，可以促进骆驼养殖业的发展，具有较好的应用前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题，是要既使驼血中蛋白被酶解而使其易于被人们所吸收，又使其中活性成份得到保留，提升驼血多肽制品的产品价值，从而提供一种驼血多肽的制备纯化方法。

本发明以驼血为原料，经预处理后加入到细胞破碎装置中使细胞破碎，经过酶解得到驼血多肽酶解液，然后利用膜过滤进行分离纯化，再进行脱色脱腥处理，收集脱色脱腥液，最后利用膜浓缩或减压真空浓缩，干燥后制备驼血多肽产品。

本发明的一种驼血多肽的制备纯化方法，其具体操作步骤如下：

1)原料的预处理：将新鲜驼血或冷冻的驼血解冻，匀浆后用4～400目的滤网过滤，得到预处理的驼血；

2)细胞破碎：将经过预处理的驼血加入到细胞破碎装置，进行细胞破碎，得到驼血溶液；

3)酶解：向已进行细胞破碎的驼血溶液再加入0～20倍体积量的水，然后向发酵罐中加入蛋白酶进行酶解，酶解温度为30～70℃，酶切时间为0.5～8h，酶解结束后高温灭酶灭菌；将灭酶灭菌后的酶解液冷却至室温后，经5000～20000r/min的转速离心分离，收集上清液，得驼血多肽酶解液；

所述的蛋白酶是指Neutrase中性蛋白酶、中性蛋白酶Protex.7L、Alcalase碱性蛋白酶、碱性蛋白酶Protex-6L、微生物蛋白酶、动物蛋白复合水解酶、金属基质蛋白酶、氨肽酶、羧肽酶、胶原蛋白酶、糜蛋白酶、地衣芽抱杆菌蛋白酶、端肽酶、沙雷肽酶、Aspergillusmelleus、Aspergi11usoryzae、Aspergillusniger、Bacilluslicheniformis、Bacillussubtilis、BacilluseStearothermophi、Bacillusamyloliquefaciens或Rhizopusniveus的微生物来源酶中的一种或者组合；

4)膜过滤：将已离心的驼血多肽酶解液通过孔径为0.01～5μm的微滤器过滤，再以截留分子量为300～10000道尔顿的超微膜过滤，收集透过的低分子量部分驼血多肽酶解液；

5)脱色脱腥：先调节过滤得到的驼血多肽酶解液的pH值为3～10，脱色脱腥剂用量按照底物浓度的0.02～50％计算，利用反应釜或装柱进行脱色脱腥，得到脱色脱腥后的驼血多肽酶解液；

所述的脱色脱腥剂为活性炭、硅藻土、氧化铝、离子交换树脂、大孔树脂、凹凸棒、膨润土、高岭土、白土、壳聚糖中的任一种或几种组合；

所述的脱色脱腥步骤，一种方法是将脱色脱腥剂加入到反应釜中，再加入已调pH值的驼血多肽酶解液，搅拌速度为10～300r/min，温度为5～70℃，时间为0.1～10h。脱色脱腥完成后，经5000～20000r/min的转速离心分离，收集上清液，得到脱色脱腥液；

所述的脱色脱腥步骤，另一种方法是将脱色脱腥剂装柱，将pH值为3～10的驼血多肽酶解液流经柱子，控制温度为5～50℃，流速为1～30BV/h，进行脱色脱腥，收集脱色脱腥液；

6)浓缩：将脱色脱腥后的驼血多肽酶解液利用膜浓缩或减压真空浓缩技术进行浓缩；

所述的膜浓缩是指纳米膜浓缩，在温度为0～70℃时，用截留分子量为70～400道尔顿的卷式纳米膜对纯化后的驼血多肽酶解液进行过滤，以滤去70～400道尔顿以下的水溶液，获得驼血多肽浓缩液；

本发明提供的减压真空浓缩是指将纯化后的驼血多肽酶解液转移至减压真空浓缩设备中，控制真空度为-0.1～-0.01MPa，温度为10～60℃，在低温和低压下将水除去；

7)干燥：将驼血多肽浓缩液进行干燥(喷雾干燥、冷冻干燥、微波真空干燥、减压真空干燥、气流干燥、玻态干燥等)，得到驼血多肽。

本发明与已有技术方法相比，优点在于提供了一种利用细胞破碎技术、酶解技术和膜过滤技术相结合从驼血中制备驼血多肽的方法。本发明方法具有收率高、产量大、操作简单、成本低等优点，有利于工业化的生产；采用本发明得到的驼血多肽产品水溶性好、生物利用度高，可广泛应用于医药、保健品、食品、化妆品等行业。采用细胞破碎技术可以有效地减少酶解时间，快速高效，膜分离技术可以实现不同分子量驼血多肽的制备，且避免大量有毒有害溶剂的使用，绿色环保，应用前景广阔。

附图说明

图1为本发明产品的液相色谱图，色谱峰为驼血多肽的吸收峰。

具体实施方式

本发明得到的驼血多肽产品为白色或淡黄色粉末，驼血多肽纯度为50～99％。按照本发明制备的驼血多肽可应用领于医药、保健品、食品、化妆品等领域，即以制备的驼血多肽为主要组分，用常规的制剂工艺，单独使用或与其他组分配合制备成经胃肠道给药剂型，如散剂、片剂(包括普通压制片、包衣片、糖衣片、薄膜衣片、肠溶衣片、多层片、分散片、舌下片、口含片、植入片、溶液片、微囊片、缓释片等，其中不包括泡腾片、咀嚼片和奶片)、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂等；非经胃肠道给药剂型，注射给药剂型(如注射剂，包括静脉注射、肌内注射、皮下注射、皮内注射及腔内注射等多种注射途径)，呼吸道给药剂型(如喷雾剂、气雾剂、粉雾剂等)，皮肤给药剂型(如外用溶液剂、洗剂、搽剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴剂等)，粘膜给药剂型(如滴眼剂、滴鼻剂、眼用软膏剂、含漱剂、舌下片剂、粘贴片及贴膜剂等)，腔道给药剂型(如栓剂、气雾剂、滴剂及滴丸剂等，用于直肠、阴道、尿道、鼻腔、耳道等)等。

本发明的产品参照国标GB/T22729-2008中液相色谱法进行测定。

色谱条件：

色谱柱：TSKgelG2000SWXL300mm×7.8mm或性能与此相近的同类型其它适用于测定蛋白质和多肽的凝胶柱。

流动相：乙腈:水:三氟乙酸＝45:55:0.1(v:v:v)；流速：0.5mL/min；检测波长：220nm；参比波长：360nm；柱温：30℃，进样量：20μL。

实施例1

步骤1，原料的预处理：称取新鲜驼血1kg，用100目的滤网过滤，除去驼毛等杂质。

步骤2，细胞破碎：将经过预处理的驼血加入到高速剪切设备的储液罐中，加入已预处理驼血10倍重量的水(10kg)。启动高速剪切设备，控制温度为10～20℃，调节转速为8000～10000r/min，时间为0.1～1h，进行细胞破碎，此时细胞破碎率为90％，得到驼血溶液。

步骤3，酶解：向已进行细胞破碎的驼血溶液置入发酵罐中，再加入5倍量的水(5kg)，然后向发酵罐中先加入底物浓度1％的地衣芽抱杆菌蛋白酶20g进行酶解，控制温度为60℃，酶切时间为1h，酶切后进行高温(90℃)灭酶灭菌0.5h；将灭酶灭菌后的酶解液冷却至室温后，经10000r/min的转速离心分离，收集上清液，得驼血多肽酶解液。

步骤4，膜过滤：将已离心的驼血多肽酶解液置于缓冲罐中，启动循环泵，控制温度为20～30℃，先通过孔径为1μm的微滤器过滤，再以截留分子量为5000道尔顿的超微膜过滤，收集低于5000道尔顿的部分，制备纯化的驼血多肽酶解液。

步骤5，脱色脱腥：先调节驼血多肽酶解液的pH值为5，按照底物浓度的5％比例加入活性炭，搅拌速度为100r/min，温度为40℃，时间为2h。脱色脱腥完成后，经8000r/min的转速离心分离，收集上清液，得到澄清透明、无腥味的驼血多肽酶解液。

步骤6，浓缩：将脱色后的驼血多肽酶解液利用纳米膜浓缩技术进行浓缩，先将溶液置于缓冲罐中，控制温度为50℃，用截留分子量为200道尔顿的卷式纳米膜对纯化后的驼血多肽酶解液进行过滤，以滤去200道尔顿以下的水溶液，获得分子量低于5000道尔顿的驼血多肽浓缩液，其固含量为30％。

步骤7，干燥：利用冷冻干燥技术，将驼血多肽浓缩液进行干燥。先将驼血多肽浓缩液平均加入到不锈钢冷冻干燥盘中，液体厚度约为10mm，放入冻干仓内后，封闭舱门。启动冷冻压缩机组，在-30℃中速冻4h，使浓缩液冻结成固态，然后继续降温至-70℃，再启动真空泵抽真空到相对真空度为-100Pa，冷冻干燥20h。本发明得到的驼血多肽产品为淡黄色粉末，驼血多肽纯度为80％。

实施例2

步骤1，原料的预处理：称取冷冻的驼血10kg，室温解冻，用200目的滤网过滤，除去驼毛等杂质。

步骤2，细胞破碎：将经过预处理的驼血加入到超声反应釜中，加入已预处理驼血20倍重量的水(200kg)，控制温度为30～40℃，超声功率为200～4000W，发射频率为20kHz～150kHz，时间为0.1～2h，进行细胞破碎，此时细胞破碎率为85％，得到驼血溶液。

步骤3，酶解：向已进行细胞破碎的驼血溶液置入发酵罐中，再加入2倍量的水(20kg)，然后向发酵罐中先加入底物浓度2％的碱性蛋白酶Protex-6L40g进行酶解，控制温度为40℃，酶切时间为6h，酶切后进行高温(105℃)灭酶灭菌0.3h；将灭酶灭菌后的酶解液冷却至室温后，经8000r/min的转速离心分离，收集上清液，得驼血多肽酶解液。

步骤4，膜过滤：将已离心的驼血多肽酶解液置于缓冲罐中，启动循环泵，控制温度为40℃，先通过孔径为5μm的微滤器过滤，再以截留分子量为10000道尔顿的超微膜过滤，收集低于10000道尔顿的部分，制备纯化的驼血多肽酶解液。

步骤5，脱色脱腥：先调节驼血多肽酶解液的pH值为8，按照底物浓度的10％比例称取阴离子交换树脂200g，装柱，通过泵将调好pH值的驼血多肽酶解液流经柱子，控制温度为20℃，流速为20BV/h，进行脱色脱腥，收集脱色脱腥液。

步骤6，浓缩：将脱色后的驼血多肽酶解液利用减压真空浓缩技术进行浓缩，先将纯化后的驼血多肽酶解液转移至减压真空浓缩设备中，启动真空泵，控制真空度为-0.08～-0.07MPa，温度为30～40℃，在低温和低压下将水除去，浓缩液的固含量为50％。

步骤7，干燥：利用喷雾干燥技术，将驼血多肽浓缩液进行干燥。先将驼血多肽浓缩液置于不锈钢桶中，控制进风温度为180～190℃，出风温度为90～100℃。干燥后即得驼血多肽粉。本发明得到的驼血多肽产品为白色粉末，驼血多肽纯度为60％。

实施例3

步骤1，原料的预处理：称取新鲜驼血或20kg，用50目的滤网过滤，除去驼毛等杂质。

步骤2，细胞破碎：将经过预处理的驼血加入到胶体磨中，加入已预处理驼血5倍重量的水(100kg)，控制温度为50～60℃，调节转速为1000～15000r/min，时间为0.1～4h，进行细胞破碎，此时细胞破碎率为95％，得到驼血溶液。

步骤3，酶解：向已进行细胞破碎的驼血溶液置入发酵罐中，再加入10倍量的水(200kg)，然后向发酵罐中先加入底物浓度10％的氨肽酶和羧肽酶(1:1)400g进行酶解，控制温度为50℃，酶切时间为0.5h，酶切后进行高温(85℃)灭酶灭菌1h；将灭酶灭菌后的酶解液冷却至室温后，经15000r/min的转速离心分离，收集上清液，得驼血多肽酶解液。

步骤4，膜过滤：将已离心的驼血多肽酶解液置于缓冲罐中，启动循环泵，控制温度为50℃，先通过孔径为0.5μm的微滤器过滤，再以截留分子量为8000道尔顿的超微膜过滤，收集低于8000道尔顿的部分，制备纯化的驼血多肽酶解液。

步骤5，脱色脱腥：先调节驼血多肽酶解液的pH值为7，按照底物浓度的20％比例加入凹凸棒800g，搅拌速度为200r/min，温度为60℃，时间为6h。脱色脱腥完成后，经15000r/min的转速离心分离，收集上清液，得到澄清透明、无腥味的驼血多肽酶解液。

步骤6，浓缩：将脱色后的驼血多肽酶解液利用纳米膜浓缩技术进行浓缩，先将溶液置于缓冲罐中，控制温度为10℃，用截留分子量为300道尔顿的卷式纳米膜对纯化后的驼血多肽酶解液进行过滤，以滤去300道尔顿以下的水溶液，获得分子量低于5000道尔顿的驼血多肽浓缩液，其固含量为20％。

步骤7，干燥：利用减压真空干燥技术，将驼血多肽浓缩液进行干燥。先将驼血多肽浓缩液平均加入到不锈钢干燥盘中，液体厚度约为5mm，放入干燥仓内后，封闭舱门。启动真空泵和加热机组，控制真空度为-0.98～-0.05MPa，温度为30～60℃，干燥1～30h。本发明得到的驼血多肽产品为淡黄色粉末，驼血多肽纯度为90％。

实施例4

步骤1，原料的预处理：称取冷冻的驼血40kg，室温解冻，用20目的滤网过滤，除去驼毛等杂质。

步骤2，细胞破碎：将经过预处理的驼血加入到均质机中，加入已预处理驼血10倍重量的水(10kg)，控制温度为10～20℃，调节压力为10～80MPa，时间为0.1～4h，进行细胞破碎，此时细胞破碎率为97％，得到驼血溶液。

步骤3，酶解：向已进行细胞破碎的驼血溶液置入发酵罐中，再加入1倍量的水(40kg)，然后向发酵罐中先加入底物浓度5％的动物蛋白复合水解酶、端肽酶和沙雷肽酶(1:2:3)400g进行酶解，控制温度为35℃，酶切时间为4h，酶切后进行高温(100℃)灭酶灭菌1.5h；将灭酶灭菌后的酶解液冷却至室温后，经6000r/min的转速离心分离，收集上清液，得驼血多肽酶解液。

步骤4，膜过滤：将已离心的驼血多肽酶解液置于缓冲罐中，在温度为10℃时，先通过孔径为0.02μm的微滤器过滤，再以截留分子量为1000道尔顿的超微膜过滤，收集低于1000道尔顿的部分，制备纯化的驼血多肽酶解液。

步骤5，脱色脱腥：先调节驼血多肽酶解液的pH值为6，按照底物浓度的1％比例加入硅藻土和膨润土(1:1)80g，装柱，通过泵将调好pH值的驼血多肽酶解液流经柱子，控制温度为30℃，流速为10BV/h，进行脱色脱腥，收集脱色脱腥液。

步骤6，浓缩：将脱色后的驼血多肽酶解液利用减压真空浓缩技术进行浓缩，先将纯化后的驼血多肽酶解液转移至减压真空浓缩设备中，启动真空泵，控制真空度为-0.09～-0.08MPa，温度为50℃，在低温和低压下将水除去，浓缩液的固含量为40％。

步骤7，干燥：利用微波真空干燥技术，将驼血多肽浓缩液进行干燥。先将驼血多肽浓缩液平均加入到不锈钢干燥盘中，液体厚度约为8mm，放入干燥仓内后，封闭舱门。启动真空泵、微波机组和加热机组，控制真空度为-0.98～-0.05MPa，温度为10～70℃，微波输出功率为0～1000W，频率为0～2600MHz，干燥时间为1～28h。本发明得到的驼血多肽产品为淡黄色粉末，驼血多肽纯度为70％。

上述实施例为本发明较好的实施方式，但本发明的实施方式并不接受上诉实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下的所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换防止，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种驼血多肽的制备纯化方法，其特征在于，所述的方法是以驼血为原料，经预处理后加入到细胞破碎装置中使细胞破碎，经过酶解得到驼血多肽酶解液，然后利用膜过滤进行分离纯化，再进行脱色脱腥处理，收集脱色脱腥液，最后利用膜浓缩或减压真空浓缩，干燥后获得驼血多肽。

2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述的方法的步骤如下：

1)原料的预处理：将新鲜驼血或冷冻的驼血解冻，匀浆后用4～400目的滤网过滤，得到预处理的驼血；

2)细胞破碎：将经过预处理的驼血加入水进行细胞破碎，得到驼血溶液；

3)酶解：向已进行细胞破碎的驼血溶液再加入0～20倍体积量的水，然后向发酵罐中加入蛋白酶进行酶解，酶解温度为30～70℃，酶切时间为0.5～8h，酶解结束后高温灭酶灭菌；将灭酶灭菌后的酶解液冷却至室温后，经5000～20000r/min的转速离心分离，收集上清液，得驼血多肽酶解液；

4)膜过滤：将已离心的驼血多肽酶解液通过孔径为0.01～5μm的微滤器过滤，再以截留分子量为300～10000道尔顿的超微膜过滤，收集透过的低分子量部分，得到驼血多肽酶解液；

5)脱色脱腥：先调节过滤得到的驼血多肽酶解液的pH值为3～10，脱色脱腥剂用量按照底物浓度的0.02～50％计算，利用反应釜或装柱进行脱色脱腥，得到脱色脱腥后的驼血多肽酶解液；

6)浓缩：将脱色脱腥后的驼血多肽酶解液利用膜浓缩或减压真空浓缩技术进行浓缩；

7)干燥：将驼血多肽浓缩液进行干燥，得到驼血多肽；

干燥方法为喷雾干燥、冷冻干燥、微波真空干燥、减压真空干燥、气流干燥或玻态干燥。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞破碎装置为高速剪切机、胶体磨、均质机、超声波仪或高压细胞破碎机。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蛋白酶为Neutrase中性蛋白酶、中性蛋白酶Protex.7L、Alcalase碱性蛋白酶、碱性蛋白酶Protex-6L、微生物蛋白酶、动物蛋白复合水解酶、金属基质蛋白酶、氨肽酶、羧肽酶、胶原蛋白酶、糜蛋白酶、地衣芽抱杆菌蛋白酶、端肽酶、沙雷肽酶、Aspergillusmelleus、Aspergillusoryzae、Aspergillusniger、Bacilluslicheniformis、Bacillussubtilis、BacilluseStearothermophi、Bacillusamyloliquefaciens或Rhizopusniveus的微生物来源酶中的一种或者其组合。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微滤器孔径为0.01～5μm，温度为0～70℃，截留分子量为300～10000道尔顿。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的脱色脱腥剂为活性炭、硅藻土、氧化铝、离子交换树脂、大孔树脂、凹凸棒、膨润土、高岭土、白土、壳聚糖中的任一种或几种组合。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的脱色脱腥步骤，一种方法是将脱色脱腥剂加入到反应釜中，再加入已调pH值的驼血多肽酶解液，搅拌速度为10～300r/min，温度为5～70℃，时间为0.1～10h；脱色脱腥完成后，经5000～20000r/min的转速离心分离，收集上清液，得到脱色脱腥液。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的脱色脱腥步骤，另一种方法是将脱色脱腥剂装柱，将pH值为3～10的驼血多肽酶解液流经柱子，控制温度为5～50℃，流速为1～30BV/h，进行脱色脱腥，收集脱色脱腥液。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的膜浓缩是指纳米膜浓缩，在温度为0～70℃时，用截留分子量为70～400道尔顿的卷式纳米膜对纯化后的驼血多肽酶解液进行过滤，以滤去70～400道尔顿以下的水溶液，获得驼血多肽浓缩液。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的减压真空浓缩是将纯化后的驼血多肽酶解液转移至减压真空浓缩设备中，控制真空度为-0.1～-0.01MPa，温度为10～60℃，在低温和低压下将水除去。