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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer
mit 7S-Globulin-angereicherten Fraktion und einer mit 11S-Globulin-angereicherten
Fraktion aus einer Lösung,
die Sojabohnenprotein enthält.
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HINTERGRUNDTECHNIKEN
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Sojabohnen-Lagerungsprotein
wird bei einem pH-Wert von etwa 4,5 ausgefällt und kann relativ leicht von
den anderen Komponenten, außer
dem Protein, abgetrennt werden. Dieses wird als Sojabohnenproteinisolat
bezeichnet, und in vielen Fällen
wird Sojabohnenprotein in dieser Form in der Nahrungsmittelindustrie eingesetzt.
Das Sojabohnen-Lagerungsprotein
wird ferner in 2S-, 7S-, 11S- und 15S-Globuline gemäß den Niederschlagskonstanten
bei der Ultrazentrifugationsanalyse eingeteilt. Von diesen sind
7S-Globulin und 11S-Globulin
die vorherrschenden Proteinkomponenten von den Globulinfraktionen
(Anmerkung: 7S-Globulin und
11S-Globulin sind Klassifikationsnamen in einem Niederschlagsverfahren,
und sie entsprechen im wesentlichen β-Conglycinin bzw. Glycinin gemäß der immunologischen
Nomenklatur), und beide besitzen unterschiedliche spezifische Eigenschaften,
wie z. B. Viskosität,
Koagulationsfähigkeit,
Oberflächenaktivität, usw. Dann
ermöglicht
die Fraktionierung von Sojabohnenprotein in eine mit 7S-Globulin-angereicherte
Fraktion und eine mit 11S-Globulin-angereicherte Fraktion, die Eigenschaften
der entsprechenden Proteinkomponenten auszunutzen, und es wird erwartet,
dass dies die industrielle Verwendung von Proteinen erweitert.
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7S-Globulin
und 11S-Globulin setzen sich aus mehreren Untereinheiten zusammen.
7S-Globulin setzt sich aus drei Untereinheiten zusammen, d. h., α-, α'- und β-Untereinheiten.
11S-Globulin setzt sich aus einem Paar eines sauren Polypeptids
(A) und eines basischen Polypeptids (B) zusammen, von denen jedes
mehrere Untereinheiten aufweist. Das Zusammensetzungsverhältnis dieser
Untereinheiten in den meisten konventionellen Sojabohnen beträgt üblicherweise
1:2 im Verhältnis
von 7S-Globulin zu 11S-Globulin, bestimmt aus dem Densitometrie-Flächenverhältnis von
Migrationsmustern, die durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese erhalten
werden. Die Eigenschaften von 7S-Globulin
und 11S-Globulin spiegeln sich in ihren Molekulargewichten und Ladungszuständen wieder.
Insbesondere sind beide Globuline aufgrund der Kombinationen von
Untereinheiten diversifiziert, und ihre Eigenschaften variieren
bis zu einem gewissen Grad, wodurch sie miteinander überlappen.
Dementsprechend ist es nicht einfach, diese Globuline mit geringer
gegenseitiger Kontaminierung effizient zu trennen.
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WO 03/063608 offenbart
ein Verfahren zur Extraktion, Reinigung und enzymatischen Modifikation
der Soja-7S-Globulin-alpha'-Untereinheit als
Hypocholesterinämiemittel.
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US 4,368,151 offenbart ein
Verfahren zur Fraktionierung und Isolation von 7S- und 11S-Pflanzenprotein.
Dieses Verfahren umfasst die Ausfällung des 11S-Proteins bei
einem pH-Wert von 5,8 bis 6,3 in der Gegenwart von sorgfältig kontrollierten
Konzentrationen von wasserlöslichen
Salzen und schwefelhaltigen Ionen. Die mit 7S angereicherte Molke
(whey) kann dann auf einen pH-Wert von 5,3 bis 5,8 eingestellt werden,
um in wesentlichen alles des verbleibenden wasserlöslichen
11S-Proteins aus der Molke auszufällen, und eine mit 7S angereicherte
Fraktion kann dann aus der Molke gewonnen werden.
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EP 1 323 353 A1 offenbart
ein Verfahren zum Fraktionieren eines Sojabohnenproteins in hochreines 7S-Globulin
und 11S, wobei das Verfahren das Erwärmen einer Lösung, die
ein Sojabohnenprotein unter schwach sauren Bedingungen enthält, gefolgt
von Fraktionierung bei einem pH-Wert von 5,6 bis 6,6 in eine lösliche Fraktion
und eine unlösliche
Fraktion umfasst.
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Konventionell
bekannte Fraktionierungsverfahren sind wie folgt. Diese Verfahren
umfassen ein Verfahren, in dem ein Unterschied der isoelektrischen
Punkte ausgenutzt wird: in der Nähe
des isoelektrischen Punkts von 11S-Globulin wird nur 7S-Globulin
extrahiert (
JP 55-124457
A ); ein Verfahren, in dem ein Unterschied in der Reaktivität mit einem
Calciumsalz ausgenutzt wird: eine mit 7S-Globulin-angereicherte
Fraktion wird durch Zugabe einer kleinen Menge von Calcium während der
Extraktion extrahiert (
JP-A
48-56843 A ); ein Verfahren, in dem ein Unterschied in der
Löslichkeit
bei einem bestimmten pH-Wert und einer Ionenstärke ausgenutzt wird: 7S-Globulin
wird durch Entfernen der unlöslichen
Fraktionen in der Gegenwart von Natriumchlorid oder Kaliumchlorid
im pH-Bereich von 1,2 bis 4,0 hergestellt (
JP 49-31843 A ), 7S-Globulin
und 11S-Globulin werden durch Einstellen des pH-Werts einer Aufschlämmung nach
der isoelektrischen Punkt-Ausfällung
auf 5,0 bis 5,6 getrennt, während
die Natriumchloridkonzentration auf 0,01 bis 0,2 M eingestellt wird
(
JP 58-36345 A ),
und 7S-Globulin
wird durch Einstellen der Ionenstärke einer proteinhaltigen Lösung auf
0,2 bis 0,3 und des pH-Werts auf 4,8 bis 5,2, um unlösliche Fraktionen
zu entfernen, und dann Einstellen der Ionenstärke auf kleiner als 0,2 und
des pH-Werts auf
4,6 bis 5,0 fraktioniert (
JP
5-43597 A ); und ein Verfahren, in dem ein Kälte-Ausfällungsphänomen und
ein Reduktionsmittel, usw. ausgenutzt werden: hierbei wird das Phänomen ausgenutzt,
das die Löslichkeit
des 11S-Globulins bei niedriger Temperatur verringert ist (als Kryo-Ausfällungsphänomen bezeichnet),
und das Sojabohnenprotein-Ausgangsmaterial
wird in der Gegenwart einer schwefligen Säureverbindung, einer Glutathionverbindung
oder Cysteinverbindung in einem wässrigen System bei einem pH-Wert
von 6,5 oder höher
behandelt, gefolgt von Einstellen des pH-Werts auf 5,5 bis 7,0 und einer Temperatur
auf 22°C
oder niedriger, um in eine mit 7S-Globulin-angereicherte lösliche Fraktion
und eine mit 11S-Globulin-angereicherte unlösliche Fraktion zu fraktionieren
(
JP 61-187755 A ).
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Diese
bekannten Fraktionierungsverfahren nutzten in geschickter Weise
einen Löslichkeitsunterschied
zwischen 7S-Globulin
und 11S-Globulin aufgrund des pH-Werts, der Ionenstärke, der
Gegenwart eines bestimmten Salzes, der Temperatur, usw. aus. Jedoch
bestehen solche Probleme, dass diese bekannten Fraktionierungsverfahren
für industriell
anwendbare Fraktionierungsverfahren ungeeignet sind, weil z. B.
die Trennung mit einer hohen Zentrifugalkraft für eine klare Fraktionierung
erforderlich ist. Somit verbleiben in der Praxis weiterhin Probleme.
Z. B. hängt
in dem Verfahren aus
JP
61-187755 A das Kryo-Ausfällungsphänomen hochgradig von der Temperatur
ab, und es ist notwendig, die Reaktionsmischung auf etwa 5°C zu kühlen, was zu
solchen praktischen Problemen führt,
dass eine große
Menge einer schwefeligen Säureverbindung,
usw. zugegeben werden sollte, um die Fraktionen mit einer industriell
verfügbaren
kleinen Zentrifugalkraft zu trennen, und dies führt auch zu solchen Problemen
der Fraktionierungsgenauigkeit, dass eine geringe Menge von 11S-Globulin
die lösliche
Fraktion kontaminiert.
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Um
7S-Globulin-angereichertes Protein zu erhalten ist die Isolierung
von Protein aus 11S-Globulin-defekten Sojabohnen, d. h., aus mit
7S-Globulin-angereicherten Samen, hergestellt durch Züchtung,
untersucht worden (Breeding Science, 46, 11, 1996) und ihr Gebrauch
(Breeding Science, 50, 101, 2000) und ein Patent (
US 6,171,640 B1 ) können auch
gefunden werden.
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Wie
vorstehend beschrieben ist ein Verfahren zum Trennen einer mit 7S-Globulin-angereicherten Fraktion
und mit einer 11S-Globulin-angereicherten Fraktion erforscht und
entwickelt worden, wodurch eine gegenseitige Kontaminierung zwischen
löslichen
und unlöslichen
Fraktionen verringert ist und wodurch die Herstellung in industriellem
Maßstab
in geeigneter Weise und effizient erreicht wird.
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Andererseits
wurde von Samoto et al. berichtet, dass in aus Sojabohnen erhaltenem
Protein eine Proteinkomponente vorliegt, die eine hohe Affinität zu einem
polaren Lipid als Aufbauteil einer cycloplastischen Membran sowie
als Proteinkörper-
oder Ölkörpermembran
(Öl-Körper-assoziiertes
Protein) aufweist, was bis zu etwa 35% des industriell hergestellten
Sojabohnenproteinisolats ausmacht (Biosci. Biotechnol. Biochem., 62
(5), 935–940
(1998)). Das Öl-Körper-assoziierte Protein
ist ein allgemeiner Ausdruck für
Proteinkomponenten, die im wesentlichen aus Membranprotein bestehen,
insbesondere diejenigen, deren Molekulargewichte, gemessen mittels
SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese, im wesentlichen 34 kDa, 24
kDa und 18 kDa betragen und etwa 10 bis 12 Gew.% an polarem Lipid
enthalten, welche mit einer polaren Lösungsmittelmischung von Chloroform:Ethanol
im Verhältnis
2:1 extrahierbar sind.
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Die
konventionelle Fraktionierung konzentriert sich nur auf 7S- und
11S-Globuline, und in vielen Fällen wird
dem Öl-Körper-assoziierten Protein keine
Beachtung beschenkt, welches jede Fraktion kontaminiert, da das Öl-Körper-assoziierte Protein
nicht positiverweise als 7S- und 11S-Globuline identifiziert werden kann, wenn
mittels SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
analisiert wird, und es wird regelmäßig unterschätzt. Anders
ausgedrückt
ist die Reinheit, wenn sie nur mittels SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
bestimmt wird, regelmäßig höher als
die wirkliche Reinheit, und das Verhalten des Öl-Körper-assoziierten Proteins
sollte berücksichtigt
werden, um 7S- oder 11S-Globulin mit wirklich hoher Reinheit zu
erhalten. Somit handhabt die konventionelle Fraktionierung in die
zwei Fraktionen 7S-Globulin/11S- Globulin
die Reinheit einer Fraktion lediglich als Verhältnis zwischen 7S-Globulin
und 11S-Globulin. Jedoch ist jede Fraktion mit dem Öl-Körper-assoziierten Protein
assoziiert, und in vielen Fällen
ist ihr wirklicher Zustand ein relativ rohe (crude) Fraktion mit
einer geringfügig
geringeren Reinheit, deren Proteinzusammensetzung durch eine große Menge
des Öl-Körper-assoziierten
Proteins gekennzeichnet ist.
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Während die
vorliegenden Erfinder ein Verfahren vorgeschlagen haben, welches
die industrielle Fraktionierung von 7S-Globulin und 11S-Globulin nur durch
Wärmebehandlung
unter sauren Bedingungen ermöglicht
(
WO 02/28198 A1 ),
wurde als Ergebnis umfangreicher Untersuchungen gefunden, dass der
pH-Wert zum Trennen
einer löslichen
Fraktion, die 7S-Globulin enthält,
von einer unlöslichen
Fraktion, die 11S-Globulin enthält,
verringert werden kann, indem eine Wärmebehandlung einer Lösung, die
Sojabohnenprotein unter sauren Bedingungen enthält, mit einer Einstellung der
Ionenstärke
kombiniert wird, wodurch die Trennung der löslichen Fraktion und der unlöslichen
Fraktion weiter erleichtert wird.
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Die
vorliegende Erfindung schlägt
ein neues Fraktionierungsverfahren zwischen 7S-Globulin und 11S-Globulin vor, und
insbesondere ist ein hoch genaues und effizientes Fraktionierungsverfahren,
dass im industriellen Maßstab
durchgeführt
werden kann, eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung. Eine andere
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Proteinfraktionen bereitzustellen,
die charakteristische Merkmale mit geringer Kontamination des Öl-Körper-assoziierten Proteins
aufweisen und hohe Reinheiten von 7S-Globulin und 11S-Globulin besitzen.
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OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein:
- (1) Verfahren
zur Herstellung von Sojabohnenprotein, welches des Erwärmen einer
Lösung,
die das Sojabohnenprotein unter sauren Bedingungen enthält, und
dann Fraktionieren hiervon in eine lösliche Fraktion und eine unlösliche Fraktion
bei einer Ionenstärke
von 0,02 oder mehr und einem pH-Wert von 4,5 oder höher, jedoch
niedriger als 5, 6, umfasst.
- (2) Verfahren gemäß Anspruch
1, worin die Lösung,
die das Sojabohnenprotein enthält,
eine wässrige
Aufschlämmung
von entfetteten Sojabohnen, entfettete Sojabohnenmilch, erhalten
aus der Aufschlämmung, eine
Aufschlämmung
von Säure-ausgefälltem Sojabohnenprotein
oder eine Lösung
eines Sojabohnenproteinisolats ist.
- (3) Verfahren gemäß Anspruch
1, worin die sauren Bedingungen diejenigen bei einem pH-Wert von
3,8 bis 6,8 sind.
- (4) Verfahren gemäß Anspruch
1, worin das Erwärmen
bei 30 bis 75°C
durchgeführt
wird.
- (5) Verfahren gemäß Anspruch
1, welches ferner das Fraktionieren von 7S-Globulinprotein aus der
löslichen
Fraktion umfasst, die aus der Fraktionierung in Anspruch 1 erhalten
wird, worin das Verhältnis
7S-Globulin/(11S-Globulin + 7S-Globulin) des 7S-Globulinproteins
0,5 oder mehr beträgt
und der Gehalt eines polaren Lipids, extrahiert mit einem gemischten
Lösungsmittel
aus Chloroform und Methanol (Chloroform:Methanol = 2:1), in dem
Feststoffgehalt des 7S-Globulinproteins 1 Gew.% oder weniger beträgt.
- (6) Verfahren gemäß Anspruch
1, welches ferner das Fraktionieren von 11S-Globulinprotein aus
der unlöslichen
Fraktion umfasst, die aus der Fraktionierung in Anspruch 1 erhalten
wird, worin das Verhältnis 11S-Globulin/(11S-Globulin
+ 7S-Globulin) des 11S-Globulinproteins 0,7 oder mehr beträgt und der
Gehalt eines polaren Lipids, extrahiert mit einem gemischten Lösungsmittel
aus Chloroform und Methanol (Chloroform:Methanol = 2:1), in dem
Feststoffgehalt des 11S-Globulinproteins 2 Gew.% oder weniger beträgt.
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BESTE ART, DIE ERFINDUNG DURCHZUFÜHREN
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
ist dadurch gekennzeichnet, dass im Vergleich mit dem Verfahren, das
die industrielle Fraktionierung von 7S-Globulin und 11S-Globulin
nur durch Wärmebehandlung
unter sauren Bedingungen ermöglicht
(
WO 02/28198 A1 ),
der pH-Wert zum Trennen einer löslichen
Fraktion, die 7S-Globulin enthält,
von einer unlöslichen
Fraktion, die 11S-Globulin enthält,
verringert werden kann, indem eine Wärmebehandlung einer Lösung, die
Sojabohnenprotein unter sauren Bedingungen enthält, mit der Einstellung der
Ionenstärke
kombiniert wird, wodurch die Trennung der löslichen Fraktion und der unlöslichen Fraktion
weiter erleichtert wird. Die vorstehenden saueren Bedingungen sind
bevorzugt diejenigen bei einem pH-Wert von 3,8 bis 6,8, die Erwärmungstemperatur
beträgt
bevorzugt 30 bis 75°C,
die Ionenstärke
beträgt bevorzugt
0,02 oder mehr, und die Trennung der löslichen Fraktion von der unlöslichen
Fraktion wird vorzugsweise bei einem pH-Wert von 4,5 oder höher, jedoch
kleiner als 5,6, durchgeführt.
Hierdurch kann eine mit 7S-Globulin-angereicherte lösliche Fraktion,
die weniger Öl-Körper-assoziiertes Protein enthält, erhalten
werden, und ferner kann eine mit 11S-Globulin und Öl-Körper-assoziierten
Protein-angereichtere unlösliche
Fraktion erhalten werden. Es ist möglich, das 11S-Globulin selektiv
aufzulösen
und abzutrennen, wobei das Öl-Körper-assoziierte
Protein durch Ausüben
einer schwachen Scherbelastung auf die vorstehende unlösliche Fraktion
in einer wässrigen
Lösung
bei etwa neutralem pH-Wert (pH 6,5 bis 7,5) unlöslich gehalten wird, wodurch das
11S-Globulin in der unlöslichen
Fraktion aufgelöst
oder extrahiert wird, um eine mit 11S-Globulin- angereicherte Fraktion zu erhalten,
die weniger von Öl-Körper-assoziiertem Protein enthält.
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Ferner
kann erfindungsgemäß eine Proteinfraktion
mit einem kleinen Phytinsäuregehalt
von 1,2% oder weniger Phytinsäure
je Protein erhalten werden, indem Phytinsäure durch eine Phytase während des
Herstellungsschritts zersetzt wird. Die Trennungseffizienz kann
durch Durchführen
der Phytasebehandlung vor der Trennung der löslichen Fraktion und der unlöslichen
Fraktion weiter verbessert werden.
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Die
durch den vorstehenden Produktionsprozess erhaltene lösliche Fraktion
weist ein Verhältnis 7S-Globulin/(7S-Globulin + 11S-Globulin)
von 0,5 oder mehr auf, und eine hochgradig gereinigte 7S-Globulinfraktion
mit dem vorstehenden Verhältnis
von 0,8 oder mehr, 0,85 oder mehr oder 0,9 oder mehr kann leicht durch
geeignetes Auswählen
des pH-Werts zum Trennen der löslichen
Fraktion und der unlöslichen
Fraktion erhalten werden. Eine andere Fraktion, d. h., die unlösliche Fraktion,
weist ein 11S-Globulin/(11S-Globulin
+ 7S-Globulin)-Verhältnis
von 0,7 oder mehr auf, und eine hochgradig gereinigte 11S-Globulinfraktion
mit dem vorstehenden Verhältnis
von 0,8 oder mehr, 0,85 oder mehr, oder 0,90 oder mehr kann leicht
durch geeignetes Auswählen
des pH-Werts zum Trennen der löslichen
Fraktion und der unlöslichen
Fraktion erhalten werden.
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Hierin
kann das Verhältnis
7S-Globulin/(11S-Globulin + 7S-Globulin)
oder 11S-Globulin/(11S-Globulin + 7S-Globulin) aus dem Flächenverhältnis zwischen
den entsprechenden Fraktionen bestimmt werden, indem das Migrationsmuster
mittels Densitometrie vermessen wird, das durch SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese erhalten
wird.
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Das Öl-Körper-assoziierte
Protein ist in einem Anteil von ca. 30 bis 35 in Säure-ausgefälltem Protein vorhanden,
wenn das Protein unter präziser
Verwendung von Natriumsulfat aus dem Säure-ausgefälllten Protein, das im wesentlichen
frei von Denaturierung ist, erhalten wird (Biosci. Biotechnol. Biochem.,
62(5), 935–940
(1988)). Angesichts der Tatsache, dass das polare Lipid, das mit
einem gemischten Lösungsmittel aus
Chloroform und Methanol in einem Verhältnis von 2:1 (Volumenverhältnis) extrahiert
wird, in einem Anteil von 3 bis 4 Gew.% in den festen Bestandteilen
des Säure-ausgefällten Proteins
und in einem Anteil von 10 bis 12 Gew.% in dem Öl-Körper-assoziierten Protein vorliegt,
ist das vorstehende polare Lipid (nachstehend manchmal als "Chlorofrom-Methanol-Ölgehalt" abgekürzt) in
dem Öl-Körper-assoziierten Protein
des Säure-ausgefällten Proteins
ungleichmäßig verteilt,
und die Menge des Öl-Körper-assoziierten Proteins
kann als das 10-fache (gewichtsbezogen) des Chloroform-Methanol-Ölgehalts
berechnet werden. Jedoch ist diese Berechnung auf ein Zielmaterial
anwendbar, das über
einen Entfettungsschritt mit Hexan usw. hergestellt ist, und im
Fall eines Zielmaterials, das keiner Hexanextraktion unterworfen
wurde, ist die Berechnung erst nach dem Entfetten mit Hexan anwendbar.
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Die
erfindungsgemäß erhaltene,
mit 7S-Globulin-angereicherte lösliche
Fraktion enthält
1% oder weniger des Chloroform-Methanol-Ölgehalts,
und der Gehalt des Öl-Körper-assoziierten
Proteins wird zu 10% oder weniger abgeschätzt. Die aus der unlöslichen
Fraktion extrahierte, mit 11S-Globulin-angereichertes Fraktion enthält 2% oder
weniger des Chloroform-Methanol-Ölgehalts,
und der Gehalt des Öl-Körper-assoziierten Proteins
wird zu 20% oder weniger berechnet.
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Das
erfindungsgemäß verwendete
Untersuchungsverfahren wird nachstehend beschrieben.
- – Rohprotein:
Der Stickstoffgehalt wurde mit dem Kjejdahl-Verfahren bestimmt, und er wurde mit
einem Koeffizienten von 6,25 multipliziert, um ihn in die Menge
des Rohproteins umzuwandeln.
- – Trennungs-Niederschlagsgeschwindigkeit
der unlöslichen
Fraktion:
Es wurde ein Analysator für die Trennungscharakteristik
(separation characteristic analyzer) LUMiFuge 114, hergestellt von
L.U.M. Co. verwendet. Eine Probenlösung (0,5 ml), die die unlösliche Fraktion
enthielt, wurde in einer rechteckigen Polystyrolzelle platziert,
die Zelle wurde bei 100 G zentrifugiert, und die Bewegungsgeschwindigkeit
der Grenzfläche
mit einer Transmission von 20% wurde als Trennungs-Niederschlagsgeschwindigkeit
definiert.
- – SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese:
Ein Gradientgel mit einer Gelkonzentration mit 10 bis 20% gemäß dem Verfahren
von Laemmli (Nature, 227, 680 (1970)) wurde verwendet, um Protein
zu analysieren. Die eingesetzte Menge des Proteins betrug 6 μg, ausgedrückt als
Feststoffgehalt, und das Gel wurde mit Coomassie Brilliant Blue
R-250 angefärbt.
- – Phytinsäure. Die
Menge der Phytinsäure
wurde gemäß dem Alii-Mohamed-Verfahren
(Cereal Chemistry 63, 475–478
(1986)) untersucht.
- – Chloroform-Methanol-Ölgehalt:
Etwa das 50-fache an Volumen einer gemischten Lösung aus Chloroform-Methanol
(Volumenverhältnis:
2:1) wurde zu einer getrockneten Probe zugegeben, und der Gewichtsanteil
des Feststoffgehalts, extrahiert durch Refluxieren des Lösungsmittels,
wurde als Chloroform-Methanol-Ölgehalt,
gemessen.
- – Reinheit
(SPE-Standard): Das Migrationsmuster, das bei der vorstehenden SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese
erhalten wurde, wurde mittels Densitometrie vermessen. Der Flächenanteil
der gewünschten Fraktion
relativ zur Gesamtfläche
des Musters wurde als Reinheit (SPE-Standard) definiert. Der Gehalt von 7S-Globulin
bezeichnet den Gesamtgehalt von α-, α'- und β-Untereinheiten, und
der Gehalt von 11S-Globulin bezeichnet den Gesamtgehalt des sauren
Polypeptids (A) und des basischen Polypeptids (B).
- – Korrigierte
Reinheit: die korrigierte Reinheit wurde aus der vorstehend erwähnten Reinheit
(SPE-Standard) wie folgt berechnet, wobei des hierin kontaminierte Öl-Körper-assoziierte Protein berücksichtig
wurde. D. h., da eine Probe das Öl-Körper-assoziierte
Protein, das dem 10-fachen
Gewicht des Chloroform-Methanol-Ölgehalts
entspricht, zusätzlich
zu 7S-Globulin und 11S-Globulin enthält, wird die korrigierte Reinheit
unter der Annahme, dass A (%) die Reinheit (SPE-Standard) repräsentiert,
relativ zu dem Gesamtprotein, inklusive 7S-Globulin, 11S-Globulin und dem Öl-Körper-assoziierten
Protein, berechnet: Korrigierte Reinheit (%)
= (100 (%) – Chloroform-Methanol-Ölgehalt
(%) × 10) × A (%)/100
- – Ionenstärke: Die
Leitfähigkeit
einer Lösung
wurde mit einem Leitfähigkeitsmesser
(2%/°C,
mit einer Temperaturumwandlungsfunktion) gemessen, und die molare
Konzentration von NaCl, die der gemessenen Leitfähigkeit entspricht, wurde als
Ionenstärke
definiert.
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Nachstehend
werden bevorzugte Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung beschrieben.
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Als
Sojabohnenausgangsmaterial, das in der vorliegenden Erfindung verwendet
wird, können
irgendwelche Sojabohnen von käuflich
erhältlichen
Sojabohnen oder Sojabohnen, die einen Mangel einer spezifizierten
Fraktion aufweisen, hergestellt durch Züchten oder Genmanipulation,
verwendet werden. Während
die Lösung,
die Sojabohnenprotein enthält,
irgendeine von einer wässrigen
Aufschlämmung
entfetteter Sojabohnen (nachstehend als entfettete Sojabohnenaufschlämmung bezeichnet),
entfettete Sojabohnenmilch, die aus der Aufschlämmung erhalten wird, eine Aufschlämmung von
Säure-ausgefälltem Sojabohnenprotein
(nachstehend als Tofu (curd)-Aufschlämmung bezeichnet)
oder eine Lösung
eines Sojabohnenproteinisolats sein kann, ist es insbesondere bevorzugt,
eine wässrige
Aufschlämmung
von entfetteten Sojabohnen zu verwenden, da die lösliche Fraktion
und die unlösliche
Fraktion sich leicht trennen. Eine Lösung von nicht-denaturiertem
oder kaum denaturiertem Sojabohnenprotein ist bevorzugt, um in eine
mit 7S-Globulin-angereicherte Fraktion und eine mit 11S-Globulin-angereicherte
Fraktion zu fraktionieren.
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Das
Erwärmen
der Lösung,
die Sojabohnenprotein unter sauren Bedingungen unterhält, wird
bei einem pH-Wert von 3,8 bis 6,8, stärker bevorzugt 4,0 bis 6,6,
weiterhin bevorzugt 4,2 bis 6,2, bei einer Temperatur von 30 bis
75°C, stärker bevorzugt
35 bis 65°C,
und weiterhin bevorzugt 40 bis 60°C
durchgeführt.
Die Ionenstärke
von 0,02 oder mehr erleichtert die Trennung der löslichen
Fraktion und der unlöslichen
Fraktion, und eine höhere
Ionenstärke
kann die Trennung der löslichen
Fraktion und der unlöslichen
Fraktion weiter erleichtern. Da jedoch die Ionenstärke auf
kleiner als 0,2 für
die isoelektrischer Punkt-Ausfällung
von 7S-Globulin aus der löslichen
Fraktion nach der Trennung eingestellt werden sollte, wenn eine
Ionenstärke
von 0,2 oder größer zum
Trennen der Fraktion verwendet wird, ist eine Ionenstärke von
0,02 oder größer, jedoch
kleiner als 0,2 empfohlen, um komplexe Trennungsprozeduren zu vermeiden.
Die mit 7S-Globulin-angereicherte
lösliche Fraktion
und die mit 11S-Globulin-angereicherte
unlösliche
Fraktion können
erhalten werden, wenn die lösliche Fraktion
von der unlöslichen
Fraktion bei einem pH-Wert von 4,5 oder mehr, jedoch kleiner als
5,6 getrennt wird. Die Trennung der mit 7S-Globulin-angereicherten Fraktion
und der mit 11S-Globulin-angereicherten Fraktion
kann ferner durch Zersetzen von Phytinsäure, die in dem Sojabohnenprotein
enthalten ist, mit Phytase während
des Herstellungsprozesses erleichtert werden, insbesondere in irgendeinem
Schritt bevor die lösliche
Fraktion und die unlösliche
Fraktion getrennt werden. Die Phytasebehandlung wird vereinfacht
und erleichtert, wenn sie simultan mit der Wärmebehandlung unter sauren
Bedingungen durchgeführt
wird. Die optimalen Bedingungen für die Phytasebehandlung sind
gewöhnlich
ein pH-Wert von 3,5 bis 9,0 und eine Temperatur von 20 bis 70°C für 5 Minuten
bis 3 Stunden mit etwa 0,1 bis 100 Einheiten einer Phytase pro Proteingewicht
(g), obwohl die Bedingungen in Abhängigkeit vom Ursprung der Phytase
etwas variieren können.
Die Phytaseaktivität
von einer Einheit wird durch die Menge des Enzyms definiert, die
zum Freisetzen von 1 μmol Phosphorsäure aus
der Phytinsäure
als Substrat in 1 Minute zum Beginn der enzymatischen Reaktion bei
einem pH-Wert von 5,5 und 37°C
erforderlich ist.
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Im
Gegensatz zum pH-Wert und der Temperatur in der vorstehend beschriebenen
Wärmebehandlung hat
die Länge
der Zeitspanne des Erwärmens
keine große
Wirkung auf die Schwierigkeiten, die in einem Trennungsprozess auftreten,
und ist somit von geringem Signifikanz. In der Erwärmungsbehandlung
kann ein pH-Wert, der außerhalb
des Bereichs von pH 3,8 bis 6,8 liegt, oder eine Temperatur, die
außerhalb
des Bereichs von 30°C
bis 75°C
liegt, zu Schwierigkeiten beim Trennen in 7S-Globulin und 11S-Globulin
führen.
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Nach
der Erwärmungsbehandlung
kann die Fraktionierung bei der gleichen Temperatur durchgeführt werden,
obwohl es bevorzugt ist, eine Kühlung
sicherzustellen, um jegliche Mikroben zu kontrollieren. Die Fraktionierung
kann unter Verwendung einer bekannten Trennungsprozedur (wie Filtration
und Zentrifugation) erreicht werden, und es kann auch eine leichte
Trennung insbesondere durch Verwendung einer kontinuierlichen Zentrifuge
(wie ein Dekanter) erreicht werden. Selbstverständlich ist die Verwendung einer
nicht-kontinuierlichen
Zentrifuge, wie einer Chargen (batch)-Zentrifuge, nicht ausgeschlossen.
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Die
Genauigkeit der erfindungsgemäßen Fraktionierung
in die mit 7S-Globulin-angereicherte lösliche Fraktion und die mit
11S-Globulin-angereicherte unlösliche
Fraktion kann auf Grundlage des Musters bewertet werden, das mittels
SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese
erhalten wird (die Reinheit bezieht sich auf den SPE-Standard).
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Da
jedoch die Reinheit, die auf dem SPE-Standard beruht, aufgrund der
geringen Anfleckbarkeit des Öl-Körper-assoziierten Proteins
auf der SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese
unterschätzt
werden kann, wird angenommen, dass die korrigierte Reinheit, die
durch die obige Gleichung: Korrigierte Reinheit
(%) = (100 (%) – Chloroform-Methanol-Ölgehalt (%) × 10) × A (%)/100erhalten
wird, der wahren Reinheit näher
kommt.
-
Nach
der Trennung kann die lösliche
Funktion als mit 7S-Globulin-angereicherte
Fraktion als solche oder nach der Konzentration, Neutralisation,
Sterilisation oder dem Trocknen verwendet werden. Die Konzentration
kann z. B. durch Einstellen der Ionenstärke auf kleiner als 0,2 mit
einer pH-Einstellung
auf 4,0 bis 5,0 durchgeführt
werden, um die resultierende unlösliche
Fraktion abzutrennen und zurückzugewinnen.
Gewöhnlich
wird die lösliche
Fraktion weiterhin mit Wasser verdünnt, neutralisiert, durch Erwärmen sterilisiert
und getrocknet. Die Wärmesterilisation
kann mit einem bekannten Verfahren durchgeführt werden, wie z. B. HTST-, UHT-Behandlung.
Natürlich
kann die Fraktion für
einen bestimmten Zweck mit einem Enzym, wie z. B. einer Protease,
in einem Lösungszustand
behandelt werden.
-
Das
11S-Globulin kann aus der unlöslichen
Fraktion nach der Trennung unter Verwendung einer geeigneten neutralen
wässrigen
Lösung
(mit einem pH-Wert von etwa 6,5 bis 7,5) gelöst oder extrahiert werden, um
das 11S-Globulin von dem unlöslichen Öl-Körper-assoziierten
Protein [einschließlich
der "Okara (unlöslicher
Rest aus Sojabohnenmilch oder der Tofuherstellung)"-Komponente, wenn
die unlösliche
Fraktion diese enthält]
zu trennen. Zu diesem Zeitpunkt ist es bevorzugt, das 11S-Globulin
aufzulösen
oder zu extrahieren, wobei eine Scherbelastung ausgeübt wird,
die so schwach wie möglich
ist, um das 11S-Globulin selektiv aufzulösen oder zu extrahieren, während die
Löslichkeitsmachung
der Öl-Körper-assoziierten Proteinfraktion
vermieden wird. Bevorzugt wird eine Zentrifuge mit hohen G-Kräften mit
einer Zentrifugalkraft von etwa 4.000 G oder mehr, bevorzugt etwa
5.000 G oder mehr, zum Trennen des extrahierten oder gelösten 11S-Globulin
von dem Öl-Körper-assoziierten
Protein verwendet, wodurch es ermöglicht wird, eine Proteinfraktion
mit einem Chloroform-Methanol-Ölgehalt
von 2 oder weniger in den festen Inhaltsstoffen zu erhalten, während der
Anteil des 11S-Globulins bei 0,7 oder mehr, relativ zur Gesamtmenge
von 11S-Globulin und 7S-Globulin, gehalten wird.
-
Die
mit 11S-Globulin-angereicherte Fraktion, die unter Verwendung einer
geeigneten neutralen wässrigen
Lösung
gelöst
oder extrahiert ist und 2 oder weniger des extrahierten Chloroform-Methanol-Ölgehalts enthält, kann
als mit 11S-Globulin-angereicherte
Fraktion als solche oder nach der Konzentration, Neutralisation,
Sterilisation oder dem Trocknen verwendet werden. Die Konzentration
kann z. B. durch Einstellen der löslichen Fraktion auf einen
pH-Wert von 4,5 oder höher,
jedoch kleiner als 5,6, durchgeführt
werden, um die resultierende unlösliche
Fraktion abzutrennen und zurückzugewinnen.
Die unlösliche
Fraktion wird üblicherweise weiterhin
mit Wasser verdünnt,
neutralisiert und durch Erwärmen
Sterilisiert, gefolgt von Trocknen. Die Wärmesterilisation wird üblicherweise
mit einem bekannten Verfahren, wie HTST- und UHT-Behandlung, durchgeführt. Natürlich kann
die unlösliche
Fraktion für
einen bestimmten Zweck mit einem Enzym, wie einer Protease, in einem
Lösungszustand
bearbeitet werden.
-
Die
folgenden Beispiele werden die folgende Erfindung weiter veranschaulichen.
-
BEISPIEL 1
-
Zu
kaum denaturierten und entfetteten Sojabohnen (1 Gew.-Teil, Stickstoff-Löslichkeitsindex
(NSI): 91), die durch Häckseln
von Sojabohnen und Extrahieren ihres Öls mit einem Extraktionslösungsmittel,
n-Hexan, erhalten wurden, um das Öl zu trennen und zu entfernen,
wurde Extraktionswasser (10 Gew.-Teile, Ionenaustauschwasser) zugegeben.
Die Mischung wurde mit einem Homo-Mischer bei 22°C gerührt und für 40 Minuten extrahiert, wobei
der pH-Wert bei 7,2 durch Zugabe einer 20%igen Natriumhydroxidlösung gehalten
wurde. Dann wurde das Extrakt mit einem Filtertuch filtriert und
bei 5.000 G für
10 Minuten zentrifugiert, um unlösliche
Bestandteile zu entfernen, wodurch entfettete Sojabohnenmilch erhalten
wurde. Die Sojabohnenmilch wurde mit 35%iger Salzsäure auf
einem pH-Wert von 4,5 eingestellt und bei 3.000 G für 10 Minuten
zentrifugiert, um Säure-ausgefälltes Protein
zu erhalten. Es wurde Ionenaustauschwasser zu dem Säure-ausgefällten Protein
so zugegeben, dass der Proteingehalt 5 als Trockengewicht, betrug,
und die Lösung
wurde mit Polytron (hergestellt von KINEMATICA AG) homogenisiert
(hier nachstehend als Tofu-Aufschlämmung (curd slurry) bezeichnet).
Die Ionenstärke
der Tofu-Aufschlämmung
wurde mit Natriumchlorid auf 0,14 eingestellt und es wurde bei 22°C für 30 Minuten
gerührt,
und der pH-Wert der Tofu-Aufschlämmung wurde
mit einer 20%igen wässrigen Natriumhydroxidlösung auf
5,3 eingestellt, gefolgt von Rühren
bei 22°C
für 20
Minuten. Dann wurde die Tofu-Aufschlämmung auf 50°C erwärmt, und
nach Rühren
bei 50°C
für 10
Minuten wurde die Tofu-Aufschlämmung
unverzüglich
auf 22°C
gekühlt.
Die Zeit, die vom Beginn des Erwärmens
bis zum Abkühlen
auf 22°C
benötigt
wurde, betrug 25 Minuten. Nach weiterem Rühren bei 22°C für 15 Minuten wurde die Trennungs-Niederschlagsgeschwindigkeit
der unlöslichen
Fraktion mit LUMiFuge 114 gemessen. Gleichzeitig wurden die lösliche Fraktion
und die unlösliche
Fraktion, erhalten durch Zentrifugieren bei 5.000 G für 5 Minuten, mittels
SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese
untersucht, und die Anteile von 7S-Globulin und 11S-Globulin (Fraktionsflächenverhältnis, das
durch Vermessen der Migrationsmuster der SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese mit
einem Densitometer erhalten wurde) wurden bestimmt.
-
Die
Trennungs-Niederschlagsgeschwindigkeit der unlöslichen Fraktion ist in Tabelle
1 gezeigt, und die Anteile von 7S-Globulin und 11S-Globulin in der löslichen
Fraktion und der unlöslichen
Fraktion sind in Tabelle 2 gezeigt.
-
VERGLEICHSBEISPIEL 1
-
Die
Ionenstärke
einer 5%igen Tofu-Aufschlämmung,
die auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 hergestellt wurde, wurde
mit Natriumchlorid auf 0,14 eingestellt. Die Tofu-Aufschlämmung wurde
bei 22°C
für 30
Minuten gerührt,
mit einer 20%igen wässrigen
Natriumhydroxidlösung
auf einen pH-Wert von 5,3 eingestellt und dann bei 22°C für 60 Minuten
gerührt.
Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 wurde die Trennungs-Niederschlagsgeschwindigkeit
der unlöslichen
Fraktion gemessen, und die lösliche
Fraktion und die unlösliche
Fraktion, erhalten durch Zentrifugieren bei 5.000 G für 10 Minuten,
wurden mittels SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese vermessen, um die
Anteile von 7S-Globulin und 11S-Globulin zu bestimmen.
-
Die
Trennungs-Niederschlagsgeschwindigkeit der unlöslichen Fraktion ist in Tabelle
1 gezeigt, und die Anteile von 7S-Globulin und 11S-Globulin in der löslichen
Fraktion und in der unlöslichen
Fraktion sind in Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 1 Trennungs-Niederschlagsgeschwindigkeit
der unlöslichen
Fraktion
| | Mit
Erwärmen | Ohne
Erwärmen |
| Trennungs-Niederschlagsgeschwindigkeit
(μm/sec) | 146 | 57 |
TABELLE 2 Anteile von 7S-Globulin und 11S-Globulin
(7S:11S)
| | Lösliche Fraktion | Unlösliche Fraktion |
| Mit
Erwärmen | 98:2 | 15:85 |
| Ohne
Erwärmen | 98:2 | 13:87 |
-
Wie
aus den Ergebnissen des Beispiels 1 und des Vergleichsbeispiels
1 ersichtlich ist, ist es klar, dass die Trennung der löslichen
Fraktion, die hochgradig gereinigtes 7S-Globulin enthält, und
der unlöslichen
Fraktion, die hochgradig gereinigtes 11S-Globulin enthält, durch
Erwärmen
der Tofu-Aufschlämmung
unter sauren Bedingungen weiter erleichtert werden kann.
-
BEISPIEL 2
-
Die
Ionenstärke
einer 5%igen Tofu-Aufschlämmung,
hergestellt auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1, wurde mit Natriumchlorid
auf 0,14 eingestellt. Die Tofu-Aufschlämmung wurde bei 22°C über 30 Minuten ohne
Einstellen des pH-Werts (etwa pH 4,5) gerührt und auf 50°C erwärmt, gefolgt
von unmittelbarem Kühlen auf
22°C. Die
Zeit, die vom Beginn des Erwärmens
bis zum Kühlen
auf 22°C
benötigt
wurde, betrug 15 Minuten. Nach dem Kühlen wurde der pH-Wert der
Tofu-Aufschlämmung mit
einer 20%igen wässrigen
Natriumhydroxidlösung
auf 5,5 eingestellt, gefolgt von Rühren für 15 Minuten. Die Trennungs-Niederschlagsgeschwindigkeit
der unlöslichen
Fraktion wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 gemessen,
und die Anteile von 7S-Globulin und 11S-Globulin in der löslichen Fraktion und der unlöslichen
Fraktion wurden bestimmt.
-
Die
Anteile von 7S-Globulin und 11S-Globulin in der löslichen
Fraktion und in der unlöslichen
Fraktion sind in Tabelle 3 gezeigt, und die Trennungs-Niederschlagsgeschwindigkeit
der unlöslichen
Fraktion ist in Tabelle 4 gezeigt.
-
VERGLEICHSBEISPIEL 2
-
Eine
5%ige Tofu-Aufschlämmung,
hergestellt auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1, wurde einer
Wärmebehandlung
auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 (der pH-Wert wurde nicht
eingestellt; die Aufschlämmung
wurde bei 22°C
für 30
Minuten gerührt,
und sie wurde auf 50°C
erwärmt,
gefolgt von unmittelbarem Kühlen
auf 22°C)
ohne die Ionenstärke
einzustellen (Ionenstärke:
0,013) unterzogen. Dann wurde der pH-Wert der Tofu-Aufschlämmung mit
einer 20%igen wässrigen
Natriumhydroxidlösung
auf 5,9 eingestellt (eine Fraktion mit einem ähnlichen Anteil von 7S-Globulin
und 11S-Globulin konnte nicht erhalten werden, wenn nicht der pH-Wert
zum Trennen der löslichen
Fraktion und der unlöslichen
Fraktion erhöht
wurde, wenn die Ionenstärke gering
war). Nach Rühren
für 15
Minuten wurde die Trennungs-Niederschlagsgeschwindigkeit
der unlöslichen Fraktion
auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 gemessen, und die Anteile
von 7S-Globulin und 11S-Globulin in der löslichen Fraktion und in der
unlöslichen
Fraktion wurden gemessen.
-
Die
Anteile von 7S-Globulin und 11S-Globulin in der löslichen
Fraktion und der unlöslichen
Fraktion sind in Tabelle 3 gezeigt, und die Trennungs-Niederschlagsgeschwindigkeit
der unlöslichen
Fraktion ist in Tabelle 4 gezeigt. TABELLE 3 Anteile von 7S-Globulin und 11S-Globulin
(7S:11S)
| Ionenstärke | Trennungs-pH-Wert | Lösliche Fraktion | Unlösliche Fraktion |
| 0,14 | 5,5 | 84:16 | 18:82 |
| 0,013 | 5,9 | 82:18 | 15:85 |
TABELLE 4 Trennungs-Niederschlagsgeschwindigkeit
der unlöslichen
Fraktion
| Ionenstärke | 0,14 | 0,013 |
| Trennungs-Niederschlagsgeschwindigkeit
(μm/sec) | 204 | 48 |
-
Wie
aus den Ergebnissen des Beispiels 2 und des Vergleichsbeispiels
2 ersichtlich ist, ist es klar, dass die Trennung der löslichen
Fraktion, die 7S-Globulin enthält,
von der unlöslichen
Fraktion, die 11S-Globulin enthält,
durch Erhöhen
der Ionenstärke
und Verringern des Trennungs-pH-Werts weiter erleichtert werden kann.
-
Wie
aus den Ergebnissen der obigen Beispiele und Vergleichsbeispiele
ersichtlich ist, ist es klar, dass die Trennung der löslichen
Fraktion, die 7S-Globulin enthält,
und der unlöslichen
Fraktion, die 11S-Globulin enthält,
durch Kombinieren einer Wärmebehandlung
einer Sojabohnenprotein-enthaltenden
Lösung
unter sauren Bedingungen mit Einstellung der Ionenstärke, im
Vergleich mit der Wärmebehandlung
allein unter sauren Bedingungen oder Einstellen der Ionenstärke allein,
weiter erleichtert wird.
-
BEISPIEL 3
-
Extraktionswasser
(Ionenaustauschwasser, 10 Gew.-Teile, 22°C) wurde zu 1 Gew.-Teile von
kaum denaturierten und entfetteten Sojabohnen, die auf die gleiche
Weise wie in Beispiel 1 entfettet wurden (nachstehend als entfettete
Sojabohnenaufschlämmung
bezeichnet) zugegeben. Die Ionenstärke wurde mit Natriumchlorid
auf 0,17 eingestellt, und die Tofu-Aufschlämmung wurde mit einem Propeller
bei 22°C
für 30
Minuten gerührt,
ohne den pH-Wert einzustellen. Dann wurde der pH-Wert mit 35%iger
Salzsäure
auf 5,3 eingestellt, und die Rohaufschlämmung wurde auf 50°C erwärmt und
mit dem Propeller für
10 Minuten gerührt,
gefolgt von unmittelbarem Kühlen
auf 22°C.
Die Zeit, die zum Erwärmen
auf 50°C
benötigt
wurde, betrug 10 Minuten, während
die Zeit, die zum Kühlen
auf 22°C
benötigt
wurde, 5 Minuten betrug. Nach dem Kühlen wurde die Rohaufschlämmung mit
35%iger Salzsäure
auf einen pH-Wert von 4,8 eingestellt, und nach Rühren bei
22°C für zusätzliche
10 Minuten wurde die Trennungs-Niederschlagsgeschwindigkeit
der unlöslichen
Fraktion auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 gemessen. Ferner
wurden die Anteile von 7S-Globulin und 11S-Globulin auf die gleiche
Weise wie in Beispiel 1 in Bezug auf die lösliche Fraktion, die durch
Zentrifugation bei 5.000 G über
5 Minuten erhalten wurde, gemessen. Andererseits wurde Wasser (das
7-fache Gewicht der entfetteten Sojabohnen) zu der unlöslichen
Fraktion zugegeben, und das Protein wurde bei 22°C durch Rühren mit einem Homo-Mischer
für 30
Minuten extrahiert, während
der pH-Wert bei 7,2 durch Zugabe von 20%iger wässriger Natriumhydroxidlösung gehalten
wurde, und die lösliche
Fraktion, die durch Zentrifugation bei 5.000 G für 5 Minuten erhalten worden
war, wurde mittels SDS- Polyacrylamid-Elektrophorese
untersucht, um die Anteile von 7S-Globulin und 11S-Globulin zu bestimmen.
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Die
Anteile von 7S-Globulin und 11S-Globulin in der löslichen
Fraktion bzw. in der unlöslichen
Fraktion sind in Tabelle 5 gezeigt, und die Trennungs-Niederschlagsgeschwindigkeit
der unlöslichen
Fraktion ist in Tabelle 6 gezeigt.
-
VERGLEICHSBEISPIEL 3
-
Die
Ionenstärke
einer entfetteten Sojabohnenaufschlämmung, die auf die gleiche
Weise wie in Beispiel 3 hergestellt worden war, wurde mit Natriumchlorid
auf 0,17 eingestellt, und die Aufschlämmung wurde bei 22°C für 30 Minuten
gerührt.
Dann wurde der pH-Wert der entfetteten Sojabohnenaufschlämmung mit 35%iger
Salzsäure
auf 5,3 eingestellt, gefolgt von Rühren bei 22°C für 25 Minuten. Dann wurde der
pH-Wert der Aufschlämmung
mit 20%iger wässriger
Natriumhydroxidlösung
auf 4,8 eingestellt, und nach Rühren
bei 22°C
für 10
Minuten wurde die Trennungs-Niederschlagsgeschwindigkeit
der unlöslichen
Fraktion gemessen, und die Anteile von 7S-Globulin und 11S-Globulin
in der löslichen
Fraktion und der unlöslichen
Fraktion wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
-
Die
Anteile von 7S-Globulin und 11S-Globulin in der löslichen
Fraktion und in der unlöslichen
Fraktion sind in Tabelle 5 gezeigt, und die Trennungs-Niederschlagsgeschwindigkeit
der unlöslichen
Fraktion ist in Tabelle 6 gezeigt. TABELLE 5 Verhältnis
zwischen 7S-Globulin und 11S-Globulin (7S:11S)
| | Lösliche Fraktion | Unlösliche Fraktion |
| Mit
Erwärmen | 92:8 | 9:91 |
| Ohne
Erwärmen | 91:9 | 10:90 |
TABELLE 6 Trennungs-Niederschlagsgeschwindigkeit
der unlöslichen
Fraktion
| | Mit
Erwärmen | Ohne
Erwärmen |
| Trennungs-Niederschlagsgeschwindigkeit
(μm/sec) | 395 | 84 |
-
Wie
aus den Ergebnissen des Beispiels 3 und des Vergleichsbeispiels
3 ersichtlich ist, ist es klar, dass die Trennung der löslichen
Fraktion und der unlöslichen
Fraktion auch durch Einstellen der Wärmebehandlungstemperatur und
der Ionenstärke
unter sauren Bedingungen erleichtert wird, wenn die entfettete Sojabohnenaufschlämmung verwendet
wird.
-
BEISPIEL 4
-
Die
Ionenstärke
einer 5%igen Tofu-Aufschlämmung,
hergestellt auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1, wurde mit Natriumchlorid
auf 0,17 eingestellt. Nach Erwärmen
der Aufschlämmung
auf die gleiche Weise wie im Beispiel 3 (die Aufschlämmung wurde
bei 22°C
für 30
Minuten mit einem Propeller gerührt,
ohne den pH-Wert einzustellen, der pH-Wert wurde auf 5,3 eingestellt,
und die Aufschlämmung
wurde auf 50°C
erwärmt, mit
einem Propeller gerührt,
gefolgt von unmittelbarem Kühlen
auf 22°C).
Dann wurde der pH-Wert mit einer 20%igen wässrigen Natriumhydroxidlösung auf
5,4 eingestellt (der pH-Wert für
die Trennung der Tofu-Aufschlämmung sollte
höher als
der für
die Trennung der entfetteten Sojabohnenaufschlämmung sein, um Fraktionen mit
den gleichen Anteilen von 7S-Globulin und 11S-Globulin aus der entfetteten
Sojabohnenaufschlämmung
und der Tofu-Aufschlämmung zu
erhalten, wenn die Ionenstärke
der entfetteten Sojabohnenaufschlämmung die gleiche ist wie die
der Tofu-Aufschlämmung),
gefolgt von Rühren
bei 22°C
für zusätzliche
10 Minuten. Die Trennungs-Niederschlagsgeschwindigkeit
der unlöslichen
Fraktion wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 gemessen,
und die Anteile von 7S-Globulin und 11S-Globulin in der löslichen
Fraktion und in der unlöslichen
Fraktion wurden mittels SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese
bestimmt.
-
Die
Anteile von 7S-Globulin und 11S-Globulin in der löslichen
Fraktion und der unlöslichen
Fraktion sind in Tabelle 7 gezeigt, und die Trennungs-Niederschlagsgeschwindigkeit
der unlöslichen
Fraktion in Tabelle 8 gezeigt. TABELLE 7 Verhältnis
zwischen 7S-Globulin und 11S-Globulin (7S:11S)
| | Lösliche Fraktion | Unlösliche Fraktion |
| Tofu-Aufschlämmung | 93:7 | 9:91 |
TABELLE 8 Trennungs-Niederschlagsgeschwindigkeit
der unlöslichen
Fraktion
| | Tofu-Aufschlämmung |
| Trennungs-Niederschlagsgeschwindigkeit
(μm/sec) | 156 |
-
Wie
aus den Ergebnissen des Beispiels 3 und des Beispiel 4 ersichtlich
ist, ist es klar, dass die Trennung mit einer höheren Trennungs-Niederschlagsgeschwindigkeit
der unlöslichen
Fraktion im Falle der Verwendung der entfetteten Sojabohnenaufschlämmung in
der Lösung,
die Sojabohnenprotein enthält,
stark erleichtert ist.
-
BEISPIEL 5
-
Die
Ionenstärke
einer 5%igen Tofu-Aufschlämmung,
hergestellt auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1, wurde mit Natriumchlorid
auf 0,14 eingestellt, und die Aufschlämmung wurde bei 22°C für 30 Minuten
gerührt,
ohne den pH-Wert einzustellen (etwa pH 4,5), gefolgt von Erwärmen auf
50°C. Die
Zeit, die zum Erhöhen der
Temperatur auf 50°C
benötigt
wurde, betrug 10 Minuten. Nachdem die Temperatur auf 50°C erhöht worden war,
wurde der pH-Wert der Aufschlämmung
mit einer 20%igen wässrigen
Natriumhydroxidlösung
auf 5,3 eingestellt, und die Aufschlämmung wurde für zusätzliche
20 Minuten erwärmt,
gefolgt von Kühlen
auf 22°C.
Die Zeit, die zum Kühlen
benötigt
wurde, betrug 5 Minuten. Nach dem Kühlen wurde die Aufschlämmung bei
5.000 G für
10 Minuten zentrifugiert, um die lösliche Fraktion und die unlösliche Fraktion
zu erhalten.
-
Die
erhaltene lösliche
Fraktion wurde mit 35%iger Salzsäure
auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt und bei 3.000 G für 10 Minuten
zentrifugiert, um eine Niederschlagsfraktion zu erhalten. Dann wurde
zu der Niederschlagsfraktion Wasser zugegeben, und die Mischung
wurde mit 20%iger wässriger
Natriumhydroxidlösung
neutralisiert und gefriergetrocknet, um eine mit 7S-Globulin-angereicherte
Fraktion zu erhalten.
-
Andererseits
wurde das 5-fache Gewicht von Ionenaustauschwasser zu der durch
Zentrifugation bei 5.000 G für
10 Minuten erhaltenen unlöslichen
Fraktion zugegeben, und die Mischung wurde durch Rühren bei 22°C für 30 Minuten
mit einem Propeller extrahiert, während der pH-Wert der Mischung
mit einer 20%igen wässrigen
Natriumhydroxidlösung
bei 6,8 gehalten wurde. Dann wurde die Mischung bei 5.000 G für 10 Minuten
zentrifugiert, und der pH-Wert des erhaltenen Überstands wurde mit 35%iger
Salzsäure
auf 4,5 eingestellt, gefolgt von Zentrifugation bei 3.000 G für 10 Minuten,
um eine Niederschlagsfraktion zu erhalten. Dann wurde Wasser zu der
Niederschlagsfraktion zugegeben, und die Mischung wurde mit 20%iger
wässriger
Natriumhydroxidlösung
neutralisiert und gefriergetrocknet, um eine mit 11S-Globulin-angereicherte
Fraktion zu erhalten.
-
Das
Verhältnis
7S:11S jeder Fraktion, bestimmt mittels SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese, die Reinheit
von 7S-Globulin (SPE-Standard) in der mit 7S-Globulin-angereicherten
Fraktion und die Reinheit von 11S-Globulin (SPE-Standard) in der
mit 11S-Globulin-angereicherten Fraktion, die Menge des Chloroform-Methanol-Ölgehalts,
die korrigierte Reinheit von 7S-Globulin, die korrigierte Reinheit
von 11S-Globulin und der Gehalt von Phytinsäure in jeder Fraktion sind
in Tabelle 9 gezeigt. Tabelle 10 zeigt die Trennungs-Niederschlagsgeschwindigkeit
der unlöslichen
Fraktion, gemessen auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1. TABELLE 9 Zusammensetzung jeder Fraktion (Einheit:
%)
| | Lösliche Fraktion | Unlösliche Fraktion |
| 7S:11S | 96:4 | 13:87 |
| Reinheit
(SPE-Standard) | 93,0 | 82,9 |
| Rohprotein
(Trockengewicht) | 95,7 | 94,2 |
| Chloroform-Methanol-Ölgehalt (Trockengewicht) | 0,65 | 1,30 |
| Korrigierte
Reinheit | 87,0 | 72,1 |
| Phytinsäure (Trockengewicht) | 2,1 | 2,0 |
TABELLE 10 Trennungs-Niederschlagsgeschwindigkeit
der unlöslichen
Fraktion
| | Ohne
Phytasebehandlung |
| Trennungs-Niederschlagsgeschwindigkeit
(μm/sec) | 182 |
-
Wie
aus den vorstehenden Ergebnissen ersichtlich ist, ist es klar, dass
durch den erfindungsgemäßen Prozess
die Fraktionen von hochgradig gereinigtem 7S- und 11S-Globulin,
die eine geringe Menge der Chloroform-Methanolfraktion enthalten
oder die eine geringe Menge des Öl-Körper-assoziierten
Proteins enthalten, leicht erhalten werden können.
-
Von
den Ergebnissen des Beispiels 1, worin die Probenlösung unmittelbar
gekühlt
wurde, ohne die Temperatur nach der Wärmebehandlung zu halten, und
aus den Ergebnissen des Beispiels 5, worin die Temperatur für 20 Minuten
nach der Wärmbehandlung
gehalten wurde, ist ersichtlich, dass das Beibehalten der Temperatur
nach der Wärmebehandlung
die Trennungs-Niederschlagsgeschwindigkeit verbessern kann.
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BEISPIEL 6
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Die
Ionenstärke
einer 5%igen Tofu-Aufschlämmung,
hergestellt auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1, wurde mit Natriumchlorid
auf 0,14 eingestellt, die Aufschlämmung wurde bei 22°C für 30 Minuten
ohne Einstellen des pH-Werts (etwa pH 4,5) gerührt, gefolgt von Erwärmen auf
50°C. Die
Zeit, die zum Erwärmen
benötigt
wurde, betrug 10 Minuten. Als die Temperatur auf 50°C erhöht worden
war, wurde der pH-Wert der Aufschlämmung mit einer 20%igen wässrigen
Natriumhydroxidlösung
auf 5,3 eingestellt, Dann wurde Phytase (Sumizyme PHY, hergestellt
von Shin Nihon Chemical Co., Ltd.) in einem Anteil von 0,2 Gew.%,
bezogen auf das Gewicht der entfetteten Sojabohnen, zugegeben, und
die Aufschlämmung
wurde für
zusätzliche
20 Minuten mit einem Propeller gerührt. Dann wurde die Aufschlämmung auf
22°C gekühlt. Die
Zeit, die zum Kühlen benötigt wurde,
betrug 5 Minuten. Nach dem Kühlen
wurde die Aufschlämmung
bei 5.000 G für
10 Minuten zentrifugiert, um eine lösliche Fraktion und eine unlösliche Fraktion
zu erhalten. Die erhaltene lösliche
Fraktion wurde mit 35%iger Salzsäure
auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt, gefolgt von Zentrifugation
bei 3.000 G für 10
Minuten, um eine Niederschlagsfraktion zu erhalten. Dann wurde zu
der Niederschlagsfraktion Wasser zugegeben, und die Mischung wurde
mit 20%iger wässriger
Natriumhydroxidlösung
neutralisiert und gefriergetrocknet, um eine mit 7S-Globulin-angereicherte Fraktion
zu erhalten.
-
Andererseits
wurde das 5-fache Gewicht Ionenaustauschwasser zu der unlöslichen
Fraktion, die nach der Zentrifugation bei 5.000 G für 10 Minuten
erhalten worden war, zugegeben. Die Mischung wurde bei 22°C mit einem
Propeller gerührt,
und sie wurde für
30 Minuten extrahiert, während
der pH-Wert mit einer 20%igen wässrigen
Natriumhydroxidlösung
bei 6,8 gehalten wurde. Dann wurde die Mischung bei 5.000 G für 10 Minuten
zentrifugiert, der erhaltene Überstand
wurde mit 35%iger Salzsäure
auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt, gefolgt von Zentrifugation
bei 3.000 G für
10 Minuten, um eine Niederschlagsfraktion zu erhalten. Zu der Niederschlagsfraktion
wurde Wasser zugegeben und die Mischung wurde mit einer 20%igen
Natriumhydroxidlösung
neutralisiert und gefriergetrocknet, um eine mit 11S-Globulin angereichtere
Fraktion zu erhalten.
-
Das
Verhältnis
7S:11S von jeder Fraktion, bestimmt mittels SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese,
die Reinheit von 7S-Globulin
(SPE-Standard) in der mit 7S-Globulin-angereicherten Fraktion und
die Reinheit von 11S-Globulin (SPE-Standard) in der mit 11S-Globulin-angereicherten
Fraktion, die Menge des Chloroform-Methanol-Ölgehalts, die korrigierte Reinheit
von 7S-Globulin, die korrigierte Reinheit von 11S-Globulin und der Gehalt
von Phytinsäure
in jeder erhaltenen Fraktion sind in Tabelle 11 gezeigt. Tabelle
12 zeigt die Trennungs-Niederschlagsgeschwindigkeit
der unlöslichen
Fraktion, gemessen auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1. TABELLE 11 Zusammensetzung jeder Fraktion (Einheit:
%)
| | Lösliche Fraktion | Unlösliche Fraktion |
| 7S:11S | 97:3 | 14:86 |
| Reinheit
(SPE-Standard) | 94,0 | 81,9 |
| Rohprotein
(Trockengewicht) | 96,2 | 92,4 |
| Chloroform-Methanol-Ölgehalt (Trockengewicht) | 0,61 | 1,24 |
| Korrigierte
Reinheit | 88,3 | 71,7 |
| Phytinsäure (Trockengewicht) | 0,05 | 0,12 |
TABELLE 12 Trennungs-Niederschlagsgeschwindigkeit
der unlöslichen
Fraktion
| | Mit
Phytasebehandlung |
| Trennungs-Niederschlagsgeschwindigkeit
(μm/sec) | 248 |
-
Wie
aus den Ergebnissen in Beispielen 5 und 6 ersichtlich ist, ist es
klar, dass die begleitende Zersetzung von Phytinsäure mit
Phytase die Trennung der löslichen
Fraktion und der unlöslichen
Fraktion erleichtert und es ermöglicht,
eine mit 7S-Globulin-angereicherte Fraktion und eine mit 11S-Globulin-angereicherte
Fraktion zu erhalten, die beide weniger Phytinsäure enthalten.
-
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
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Wie
vorstehend beschrieben, können
erfindungsgemäß eine 7S-Globulin-haltige
lösliche
Fraktion und eine 11S-Globulin-haltige
unlösliche
Fraktion leicht und schnell im industriellen Maßstab fraktioniert werden, indem
eine Einstellung der Ionenstärke
und eine Wärmebehandlung
unter sauren Bedingungen einer Lösung, die
Sojabohnenprotein enthält,
kombiniert werden.