CN111432647A - 脱色的油菜籽蛋白质分离物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有改善颜色的可溶性天然油菜籽蛋白质分离物，一种制备具有改善颜色的可溶性天然油菜籽蛋白质分离物的方法，以及所述油菜籽蛋白质分离物在食物产品中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有改善颜色的可溶性天然油菜籽蛋白质分离物，一种制备具有改善颜色的可溶性天然油菜籽蛋白质分离物的方法，以及所述油菜籽蛋白质分离物在食物产品中的用途。
背景技术
蛋白质是人类营养学的主要特征。这可能来源于动物(例如肉、鱼、蛋、乳制品)或蔬菜。人们普遍希望减少基于动物的蛋白质的量。卵蛋白的使用通常是非期望的。
基于植物的蛋白质在人类营养学中的用途是已知的，例如WO2008/094434公开了使用小麦蛋白质分离物作为使用蛋黄蛋白质的替代方案。然而，对于患有麸质过敏的人，小麦蛋白质分离物的使用可能是非期望的。例如在WO 2014/018922中也描述了使用基于大豆的蛋白质来代替乳清蛋白。大豆蛋白质被广泛使用，但是鉴于对大豆产品的一些不耐受性，需要其他来源的植物蛋白质。
合适的替代物包括豌豆蛋白质和油菜籽蛋白质。油菜籽富含油并且含有大量蛋白质，所述蛋白质占种子干重的17％至25％。加工油菜籽以获得供人食用的油产生了作为副产品的油菜籽粕(60％)，所述油菜籽粕含有约30％至40％的蛋白质。为此目的而使用的油菜通常是甘蓝型油菜(Brassica napus)和芥菜型油菜(Brassica juncea)品种。这些品种含有较低水平的芥酸和芥子油苷，并且被称为Canola。Canola是Canada和ola的缩约词，意为“低酸油”，但现在是通用术语，被定义为包含＜2％芥酸和＜30mmol/g芥子油苷的油菜籽油。所得的油菜籽粕目前被用作高蛋白质动物饲料。
蛋白质可作为水解产物、浓缩物和分离物获得。水解产物是通过将蛋白质暴露于破坏连接氨基酸的键的热、酸或酶而部分分解的蛋白质。这使所述水解产物尝起来更苦，但也使其比天然(非水解)蛋白质在消化期间被更快地吸收。分离物比浓缩物更纯净，这意味着其他非蛋白质组分已被部分去除以“分离出”蛋白质。许多浓缩物有约80％的蛋白质，这意味着以干基计，总重量的80％为蛋白质。分离物通常有约90％的蛋白质(以干基计)。这是使用凯氏定氮法(Kjeldahl method)计算的。
油菜籽中发现的主要贮藏蛋白是十字花科蛋白(cruciferin)和耐品蛋白(napin)。十字花科蛋白是球蛋白并且是种子中的主要贮藏蛋白。十字花科蛋白由6个亚基组成，并且总分子量为约300kDa。耐品蛋白是白蛋白，并且是分子量为约14kDa的低分子量贮藏蛋白。耐品蛋白更易溶解，并且在例如EP 1715752B1中公开了一种分离出更可溶的耐品蛋白级分，优选至至少85重量％的方法。最初提出将耐品蛋白用于在溶解度是关键的应用中使用。DE 10 2014 005466 A1还描述了一种获得纯化的十字花科蛋白级分和耐品蛋白级分的方法。在该方法期间，还获得了这两者的蛋白质混合物，该混合物具有55-60％的耐品蛋白和40-45％的十字花科蛋白。该蛋白质混合物的溶解度为约75％。
油菜籽蛋白质还可以根据以Svedberg(S)为单位的对应沉降系数分为不同的级分。该系数表示大分子在离心场中的沉降速度。对于油菜籽蛋白质，主要报道的级分是：12S、7S和2S。十字花科蛋白和耐品蛋白是在canola/油菜籽中发现的两种主要贮藏蛋白家族。耐品蛋白是2S白蛋白，而十字花科蛋白是12S球蛋白。此外，Schwenke和Linow(Nahrung(1982)26，K5-K6)指出，来自油菜籽(甘蓝型油菜)的12S球蛋白的可逆解离取决于离子强度。十字花科蛋白复合物当暴露于更高的离子强度(μ≥0.5mS/cm)时作为300kDa的12S六聚体存在，并且在暴露于低离子强度条件时可逆地解离成150kDa的7S三聚体分子。
例如在EP 1389921B1中描述的从油菜籽粕生产油菜籽蛋白质分离物，公开了用食品级盐水溶液提取油菜籽油种子粕以形成蛋白水溶液，随后通过胶束分离出两种蛋白质级分。WO 2013/000066公开了蛋白质含量为至少约60重量％并且具有低植酸含量的油菜籽蛋白质产品，其中偏好于具有等份的2S和7S以及微量含量的12S。EP 1720415公开了一种制备油菜籽蛋白质分离物的方法，所述油菜籽蛋白质分离物包含25重量％至55重量％的2S油菜籽蛋白质、47重量％至75重量％的7S油菜籽蛋白质和0重量％至15重量％的12S油菜籽蛋白质。该方法需要使用高水平的盐，这在水产养殖中没有问题，但不适用于人类营养学。在WO2016/042001中描述了一种方法，其中不需要分离出蛋白质成分，但是仍可以在更宽的pH范围内保持溶解性。
已经发现高纯度油菜籽蛋白质分离物在食物产品中具有基础广泛的功能性，这在蛋白质材料中是独特的。利用食物产品中植物来源的蛋白质的能力使得能够在已经不存在任何可用的代用品时使用蛋白和/或动物源性蛋白质的情况下提供真正的素食食物产品。
与通过上述工序产生的油菜籽蛋白质分离物相关的问题在于它们具有相对深黄色或棕褐色的颜色，并且常常具有不期望的风味。例如，着色通常使食物产品在视觉上没有吸引力，这使得在人类营养学中接受基于植物的蛋白质不必要地成问题。
附图说明
图1示出了在不同时间间隔用不同浓度的L-抗坏血酸或L-半胱氨酸处理油菜籽蛋白质提取物后获得的溶液的颜色。X轴：温育时间，以小时为单位。Y轴：100-L值。符号说明：○＝对照；●＝L-抗坏血酸(0.5g/kg)；■＝L-抗坏血酸(1.0g/kg)；▲＝L-半胱氨酸(0.5g/kg)；◆＝L-半胱氨酸(1.0g/kg)。
图2示出了在56℃温育油菜籽蛋白质提取物后获得的溶液的颜色，所述溶液是在不同的时间间隔处在所述提取液中用不同浓度的L-抗坏血酸和/或焦亚硫酸钠制备的。X轴：温育时间，以小时为单位。Y轴：100-L值。需注意，在t＝3h处进行测量后，通过将样品在-20℃下贮存更长的时间(10周)来暂时停止实验。此后，通过在图中所示的时间处在56℃下继续温育来继续测量，即图中省略了样品冷冻的时间段。符号说明：○＝对照；◇＝L-抗坏血酸(0.5g/kg)；□＝焦亚硫酸钠(0.1g/kg)；●＝L-抗坏血酸(0.25g/kg)加焦亚硫酸钠(0.05g/kg)；■＝L-抗坏血酸(0.25g/kg)加焦亚硫酸钠(0.1g/kg)；▲＝L-抗坏血酸(0.5g/kg)加焦亚硫酸钠(0.05g/kg)；◆＝L-抗坏血酸(0.5g/kg)加焦亚硫酸钠(0.1g/kg)。
具体实施方式
据报道油菜籽蛋白质分离物中的着色问题源于酚类化合物。油菜籽中含有的酚类化合物的量为大豆中存在的酚类化合物的量的约十倍。在被氧化后，酚类化合物能够导致发展出深色。在WO 2004/000032中，通过提倡多方面的方法来解决该问题。这包括加工油菜籽(特别是使去壳种子中的黑芥子酶失活)、处理粕(特别是使用溶剂提取酚类和其他着色组分)、利用特定形式的粕(特别是用空气去除了溶剂的粕或烤粕)、使用特定的提取条件(特别是通过添加抗氧化剂或着色组分吸收剂)、加工提取物(特别是在抗氧化剂的存在下进行渗滤)，以及回收分离物(特别是通过用溶剂提取分离物或将浓缩溶液添加到冷却水中)。在多种可能的措施中，WO 2004/000032描述了应用抗氧化剂(例如亚硫酸钠或抗坏血酸)来防止酚类氧化。该效应通过在420nm处减小的吸光度(A420，氧化的酚类)和在330nm处保持的吸光度(A330，非氧化的酚类)测得。实际上，抗坏血酸的存在会降低A420值并保持A330值。然而，A330值和A420值仅给出有关酚类和黄色酚类氧化产物存在或不存在的信息，而没有给出有关产物总体白度的信息，产物总体白度通常通过测量L值来表示。然而，对于一些实验，WO 2004/000032确实报告了L值。因此，在用乙醇进行颜色提取后，报告的L值介于80.67与83.53之间；当将吸附剂与抗坏血酸组合时报告的L值为约81；并且在沉淀的油菜籽蛋白质分离物中观察到了最高的L值(84.32)，其中使用乙醇提取和用抗坏血酸处理两者。最后，在单独的实验中，亚硫酸钠显示出改善的A330值，尽管是与附加措施(例如渗滤)组合。考虑到现有技术结果，存在很大的改善油菜籽蛋白质分离物白度的空间，即更高的L值(或更低的100-L值，100-L值是一种出于实际原因有时使用的替代表示)。
在本发明的第一方面中，提供了一种获得天然油菜籽蛋白质分离物的方法，所述方法包括以下步骤：
i)在45℃至65℃的温度下将冷榨油菜籽油粕与水性液体混合；
ii)从步骤i)中获得的混合物中分离所述水性液体；
iii)使步骤ii)中获得的所述水性液体脱脂；
iv)通过添加酸或碱将步骤iii)中获得的脱脂水性液体的pH调节至中性，并与沉淀剂混合以获得沉淀物，其中所述沉淀剂包括镁、锌、铁或钙的盐；
v)去除在步骤iv)中获得的沉淀物以获得水性液体；
vi)浓缩并洗涤在步骤v)中获得的水性液体；
vii)借助于干燥从在步骤vi)中获得的经浓缩和洗涤的水性液体中分离天然油菜籽蛋白质分离物。
在上述方法中，在步骤i)或ii)或iii)或iv)或v)或vi)中的任何一者之前、期间或之后加入抗坏血酸或其衍生物和亚硫酸盐。抗坏血酸(衍生物)和亚硫酸盐的联合使用在现有技术中尚未被报道或建议，并且如下面进一步概述的，会导致出乎意料的效应。
如上所述，油菜籽蛋白质分离物是从油菜籽油生产的副产品冷榨油菜籽压榨粕生产的。
该方法从提取步骤i)开始，在该步骤中将菜籽粕与盐水溶液(例如0％至5％的氯化钠)在介于4℃至75℃之间，更优选地介于20℃至75℃之间和最优选地介于45℃至65℃之间的温度下混合。优选地，在步骤i)中进行所述混合，以使所述冷榨油菜籽油粕与所述水性液体之间的比率为1:2至1:30(w/w)。粕与水的比率优选地在1:5至1:40的范围内，更优选地在1:5至1:20的范围内。
在5min至2小时的时间段之后，在分离步骤ii)中将富含蛋白质的溶液与不溶性物质分离。以下将富含蛋白质的溶液称为提取物。
优选将提取物的pH调节至中性，并对该提取物进行进一步加工以使物质澄清并去除非蛋白质物质。在脱脂步骤iii)中，通过固/液分离步骤(例如过滤或离心)去除残留的脂肪和形成的沉淀物。优选地，借助于离心进行步骤iii)中的脱脂。
然后在超滤/渗滤(UF/DF)步骤vi)中浓缩并洗涤提取物。UF/DF步骤的目的是使蛋白质浓缩并去除抗营养因子(例如多酚、残留的植酸盐、芥子油苷)。步骤vi)中的浓缩和洗涤优选借助于超滤和渗滤进行。
最后，在步骤vii)中，经洗涤的浓缩物可以在合适的干燥器(例如喷雾干燥器(单级或多级))中使用在150℃至200℃范围内的入口温度和在50℃至100℃范围内的出口温度干燥，从而产生油菜籽蛋白质分离物。
在一个实施方式中，抗坏血酸或其衍生物是L-抗坏血酸或L-抗坏血酸钙或L-抗坏血酸钾或L-抗坏血酸钠。在另一个实施方式中，亚硫酸盐是亚硫酸(sulfite)的铵盐或金属盐、酸式亚硫酸(bisulfite)的铵盐或金属盐或焦亚硫酸(metabisulfite)的铵盐或金属盐。非限制性示例是焦亚硫酸钠或焦亚硫酸钾。
抗坏血酸或其衍生物的量可以在宽范围内变化。合适的示例是其中相对于冷榨油菜籽油粕和水性液体的混合物，抗坏血酸的量为0.05g/kg至5g/kg，或0.25g/kg至1g/kg。相对于冷榨油菜籽油粕和水性液体的混合物，亚硫酸盐的量为0.01g/kg至0.5g/kg，或0.05g/kg至0.1g/kg。或者，抗坏血酸和亚硫酸盐的量以相对于组合物总重量的百分比表示。因此，对于抗坏血酸，这可以在0.005％至0.5％(w/w)，或者0.025％至0.1％(w/w)的范围内，并且对于亚硫酸盐，这可以在0.001％至0.05％(w/w)，或者0.005％至0.01％(w/w)的范围内。
有趣的是，抗坏血酸或其衍生物与亚硫酸盐的组合产生了前所未有的效应。例如，焦亚硫酸盐的施加导致颜色的初始去除，然而该颜色的初始去除看起来随着时间的推移不是持久的，并且在一些情况下，在长时间温育后甚至导致更深的颜色。另一方面，抗坏血酸的施加导致较小的颜色初始去除，但是该较小的颜色初始去除随着时间的推移更稳定并且最终导致显著较低的颜色值。当根据本发明将抗坏血酸和焦亚硫酸盐组合时，观察到了一种效应，借助于该效应所讨论的工艺物料流的所得颜色低于用单独组分测试的物料流的颜色。需注意的是，如在本发明的第二方面中进一步定义的，根据本发明获得的L颜色值显著高于关于现有技术油菜籽蛋白质分离物所报道的那些L颜色值。
在一个实施方式中，方法步骤i)-vi)在1-8h内，优选在3-5h内进行，在此时段期间观察到了与未处理对照的最大差异。在另一个实施方式中，方法步骤i)-vi)在4h，优选在30min-3.5h的条件下进行，在所述条件下提取物的颜色(以100-L表示)并且因此最终产物的颜色远低于未处理的提取物的颜色，但也低于仅用抗坏血酸或亚硫酸盐处理的提取物的颜色。
第一个方面的方法的优点是没有观察到感兴趣的蛋白质，特别是十字花科蛋白和耐品蛋白的显著减少。对于已知易于降解的耐品蛋白，这尤其令人惊讶。在上述条件下，耐品蛋白浓度保持为对照的初始耐品蛋白浓度的95％以上。
第一方面的方法的另一个优点是，在该过程期间获得的油菜籽蛋白质分离物的未处理的透明溶液具有随着时间推移发展出深色沉淀物的趋势，而在本发明的方法期间获得的样品不会发生这种情况。
优选地，所述油菜籽蛋白质分离物是以没有用于分离出十字花科蛋白和耐品蛋白的分馏步骤的方法获得的。
优选地，油菜籽蛋白质分离物是通过将耐品蛋白和十字花科蛋白的水平保持基本上恒定(即，既不故意提高也不故意降低耐品蛋白(2S)或十字花科蛋白(12S)的水平)的方法获得的。
本发明的方法的特征在于其非常适合用于大规模应用。因此，在一个实施方式中，该方法是以至少500kg，优选500kg至10,000kg或1,000kg至5,000kg的规模进行的。
在本发明的第二方面中，提供了一种天然油菜籽蛋白质分离物，该天然油菜籽蛋白质分离物包含40重量％至65重量％的十字花科蛋白和35重量％至60重量％的耐品蛋白并且在3至10范围内的pH和23±2℃的温度下的溶解度为至少88％，该天然油菜籽蛋白质分离物在pH 6和20±2℃下在0.2M磷酸盐缓冲液中的1重量％溶液中的L值为88至98。该范围可以按照本发明的方法实现，并且迄今尚未被报道。对于1重量％的水溶液，L的典型可接受的子范围是88.5至95，或89至93，或91±2。因此，通过执行第一方面的方法，即在制备油菜籽蛋白质分离物期间将抗坏血酸或其衍生物与亚硫酸盐一起组合，获得了比迄今为止可获得或报道的任何油菜籽蛋白质分离物颜色更低(即具有更高的白度)的产物。这对油菜籽蛋白质分离物在一系列应用中的接受具有重大的积极影响。
在一个实施方式中，天然油菜籽蛋白质分离物包含以干物质计5％至65％的12S油菜籽蛋白质，其中通过Blue Native PAGE验证12S的存在。优选地，天然油菜籽蛋白质分离物包含10％至65％，最优选地15％至65％，尤其是25％至65％，并且最特别地35％至65％(以干物质计)的12S油菜籽蛋白质，其中通过天然PAGE验证12S的存在。如上所述，一定含量的12S蛋白质不一定与十字花科蛋白相同，因为十字花科蛋白的300kDa的12S六聚体可以解离成150kDa的7S三聚体分子。优选地，本发明的天然油菜籽蛋白质分离物包含以干物质计少于20％的7S油菜籽蛋白质。
在一个实施方式中，天然油菜籽蛋白质分离物的十字花科蛋白与耐品蛋白的比率(C/N比)为0.9至1.3。
在一个实施方式中，当在3至10范围内的pH和23±2℃的温度下测量时，天然油菜籽蛋白质分离物的溶解度为至少88％，优选至少90％，更优选至少94％，并且最优选至少96％。这也被称为可溶性固体指数(SSI)。
为了用于人类食物消耗，天然油菜籽蛋白质分离物优选包含低水平的盐。这可以通过测量电导率来确定。优选地，在2至12范围内的pH下，天然油菜籽蛋白质分离物在2重量％水溶液中的电导率小于9,000μS/cm。更优选地，在2.5至11.5范围内的pH下，天然油菜籽蛋白质分离物在2重量％水溶液中的电导率小于4,000μS/cm。为了进行比较，5g/l氯化钠水溶液的电导率为约9,400μS/cm。
在另一个实施方式中，天然油菜籽蛋白质分离物的植酸水平小于0.4重量％，更优选小于0.3重量％，并且最优选小于0.15重量％。
在又一个实施方式中，天然油菜籽蛋白质分离物的蛋白质含量以干重计为至少90重量％(计算为凯氏定氮×6.25)，更优选至少94重量％，最优选至少96重量％，特别是至少98重量％。
优选地，天然油菜籽蛋白质分离物基本上未水解。基本上未水解是指蛋白质没有被故意水解。
本发明的第二方面的油菜籽蛋白质分离物的优点是亚硫酸盐的存在量低于10ppm的标记规格。本发明允许调谐在该过程中添加的抗坏血酸和亚硫酸盐的量，并且通过这样做，可以实现高白度，即高L值，同时将最终产物的亚硫酸盐含量控制为低于10ppm，例如低于8ppm，或介于1ppm与9ppm之间或介于2ppm与8ppm之间。可以使用本发明的第一方面中提到的范围来获得此类值。
在第三方面中，天然油菜籽蛋白质分离物可用于任何营养食物应用中，而无论该营养食物应用是用于人、宠物还是兽医应用，包括作为发泡剂以替代蛋白、作为乳化剂以替代例如蛋黄酱中的蛋黄，以及简单地作为提供优异氨基酸特征的营养组分。因此，本发明提供了根据本发明的第二方面的天然油菜籽蛋白质分离物作为食物产品的发泡剂或食物产品的乳化剂的用途。因此，本发明提供了一种食物产品或宠物食物产品，所述食物产品或宠物食物产品包含根据本发明的第二方面的天然油菜籽蛋白质分离物。本发明的油菜籽蛋白质分离物可以在食物产品(如棒条、巧克力、冰淇淋等)中用作蛋白质添加剂。
实施例
测试方法
蛋白质含量
通过凯氏定氮法，AOAC官方方法991.20牛奶中的氮(总量)(Kjeldahl method,AOAC Official Method 991.20Nitrogen(Total)in Milk)，使用转换系数6.25来测定蛋白质含量，以确定蛋白质的量(％w/w)。
使用紫外分光光度计进行颜色测量
使用具有96孔板的紫外分光光度计(TECAN Infinite M1000 Pro板标仪)测定颜色值。每孔的样品量为275μl。通过过滤(0.45μm)使样品澄清，然后进行吸光度测量。
使用DIN 5033第3部分和DIN 6174中所述的公式将在400-700nm(10nm间隔，经空白(MilliQ水)校正的)处测得的吸光度转换为L值。为了计算L，使用照明体D65和观测角为10°的“CIE 1964补充标准比色观测器”标准光谱函数。为了比较不同样品之间的100-L，使用外推的100-L值，因为L(或100-L)与样品浓度没有线性关系。
在相等的pH下从工艺中物料流采集样品，不进行进一步稀释。
使用Hunterlab分光光度计进行颜色测量
使用Hunterlab分光光度计，将颜色定义为三维空间中的固定点。测得的参数是L值、a值和b值。
L值：样品中的白色饱和量：值100是白色，值0是黑色
a值：从绿色至红色的颜色饱和度：正值是红色饱和，负值是绿色饱和
b值：从黄色至蓝色的颜色饱和度：正值是黄色饱和，负值是蓝色饱和
YI E313：黄度指数(ASTM E313)；用于表示样品黄度的数学计算：该值越高，则样品越黄
为了限定在脱色之后获得的白度，优选使用测得的L值。
电导率
使用以下电导率仪测量天然油菜籽蛋白质分离物在2重量％水溶液中的电导率：Hach senslON+EC71。
溶解度测试：
以下溶解度测试改编自Morr等人(J.Food Sci.(1985)50,1715-1718)，差异是使用水来代替0.1M的氯化钠。
将足以提供0.8g蛋白质的蛋白质粉末称量到烧杯中。将少量的脱矿质水添加到该粉末中，并搅拌混合物直至形成光滑的糊状物。然后添加附加的脱矿质水以使总重量为40g(产生2％w/w的蛋白质分散体)。使用磁力搅拌器将分散体缓慢搅拌至少30min。之后，测定pH并用氢氧化钠或盐酸将pH并调节至所需水平(2、3、4等)。测量分散体的pH并定期校正，然后进行60分钟搅拌。搅拌60分钟后，将等分的蛋白质分散体保留用于蛋白质含量测定(凯氏定氮分析)。将样品的另一部分以20,000g离心2min。离心后分离上清液和沉淀。还通过凯氏定氮分析来测定蛋白质含量。
蛋白质溶解度(％)＝(上清液中的蛋白质/总分散体中的蛋白质)×100。
用于测定溶解度的替代方法是可用的，并且在一些情况下使用缓冲液，如WO2011/057408中的硼酸盐-磷酸盐缓冲液。然而，此类值不能与在本申请中在不存在缓冲液的情况下测定获得的值相比。
通过蓝色天然PAGE进行分子量测定
在天然PAGE的情况下，蛋白质电荷会影响电泳迁移率。在蓝色天然PAGE(与透明天然PAGE相反)的情况下，考马斯亮蓝染料为蛋白质复合物提供必要的电荷以进行电泳分离。蛋白质溶解在500mM氯化钠中。由于高盐浓度与电泳分离不相容，因此将样品用水稀释10倍(最终盐浓度：50mM)。使用
G-250(SimplyBlueTM,ThermoFischerScientific)，并用ExQuestTM点切割器(BioRad)扫描凝胶。观察在进行蓝色天然PAGE后的所得条带。可以预期，约14kDa的条带表示2S蛋白质，约150kDa的条带表示7S蛋白质，约300kDa的条带表示12S蛋白质。
十字花科蛋白/耐品蛋白(C/N)比率
通过尺寸排阻色谱(SEC)分析确定C/N比率。将样品溶解在500mM氯化钠盐溶液中，并使用与流动相相同的溶液通过HP-SEC进行分析。通过测量280nm处的紫外吸光度进行检测。将十字花科蛋白和耐品蛋白的相对贡献(％)计算为每种蛋白质的峰面积相对于两个峰面积之和的比率。
植酸水平(phytate level)
根据Ellis等人(Anal.Biochem.(1977)77,536-539)，使用方法QD495在Eurofin处测定植酸。
比较实施例1
在不存在添加的脱色物质的情况下，从冷榨油菜籽油种子粕制备油菜籽蛋白质分离物
从油含量以干物质计低于15％的冷榨油菜籽油种子粕生产油菜籽蛋白质分离物，清洁，并在75℃下加工。
在提取步骤中，在介于40℃至75℃之间的温度下，将冷榨油菜籽油种子粕与盐水溶液(1％至5％氯化钠)混合。粕与盐水溶液的比率在1:5至1:20的范围内。在约30分钟至1小时后，将富含蛋白质的溶液(提取物)与不溶性物质分离。将提取物的pH调节至中性，并对该提取物进行进一步加工以使物质澄清并去除非蛋白质物质。在脱脂步骤中，通过使用离心的液/液分离步骤去除残留的脂肪。在使植酸沉淀的盐(例如氯化钙)存在下，通过将材料的pH值调节至中性来去除非蛋白质物质。通过固/液分离步骤(例如膜压滤器或离心)去除形成的沉淀物，在该固/液分离步骤中将杂质以固体盐形式(例如植酸钙)去除。然后在超滤/渗滤(UF/DF)步骤中浓缩并洗涤提取物。最后，将经洗涤的浓缩物在喷雾干燥器中使用在150℃至200℃范围内的入口温度和在50℃至100℃范围内的出口温度干燥，从而产生油菜籽蛋白质分离物。制备并测试几个批次。
在2.5至11.5范围内的pH下，所得的天然油菜籽蛋白质分离物在2％溶液中的电导率小于4,000μS/cm。
蓝色天然PAGE：在242kDa MW标记与480kDa MW标记之间观察到了约300kDa的主条带(图1)。一些染色可见为拖尾，是较低分子量(150kDa及以下)。在150kDa处未观察到清晰的条带。基于这些结果，油菜籽产品包含12S形式的十字花科蛋白。
所得天然油菜籽蛋白质分离物包含在40％至65％的十字花科蛋白和35％至60％的耐品蛋白的范围内。
所得的天然油菜籽蛋白质分离物含有小于0.26重量％的植酸。
当在3至10范围内的pH和23±2℃的温度下测量时，所得天然油菜籽蛋白质分离物的溶解度为至少88％，如下表中的两批次所示：
实施例1
在L-抗坏血酸或L-半胱氨酸存在下从冷榨油菜籽油种子粕制备油菜籽蛋白质分离物
以五种不同方式重复比较例1中所述的工序的提取部分。在通过固/液分离步骤进行沉淀物去除之后并且在浓缩和洗涤之前，将提取物用2％的氯化钠水溶液和以下脱色剂(所有溶液的pH值为5.9)以9:1w/w稀释：
I.无(对照)
II.L-抗坏血酸(0.5g/kg，终浓度)
III.L-抗坏血酸(1.0g/kg，终浓度)
IV.L-半胱氨酸(0.5g/kg，终浓度)
V.L-半胱氨酸(1.0g/kg，终浓度)
在振荡水浴(55℃；0-5h)中在封闭的50ml Greiner管中执行温育(每管22g样品，每浓度一个管)。图1中给出了使用上述方法和紫外分光光度计进行颜色测量的结果。观察到，对照的颜色在温育期间中加深(5h后+20％)，而含L-抗坏血酸的提取物的颜色在最初的2.5h内变浅并在2.5h与5h之间稳定，含L-半胱氨酸的提取物的颜色最初变浅，对于0.5g/kg样品又逐渐加深并且对于1.0g/kg样品稳定。
测定在t＝0h和t＝5h时十字花科蛋白和耐品蛋白的产率，参见下表。
对于十字花科蛋白，在所有测试条件下(-2％至+1％)在温育期间均未观察到产率的相关下降。对于耐品蛋白，对照和L-抗坏血酸样品均未观察到产率的显著降低，而对于与L-半胱氨酸一起温育的样品观察到了损失(5h后为-12％和-22％)。
表：在没有(对照)或有L-抗坏血酸或L-半胱氨酸的澄清提取物的温育期间十字花科蛋白和耐品蛋白的产量。将t＝0h处的十字花科蛋白和耐品蛋白的浓度设定为100％，其中[十字花科蛋白]t＝0h＝7.1mg/g并且[耐品蛋白]t＝0h＝5.7mg/g。
实施例2
在L-抗坏血酸和/或焦亚硫酸钠存在下从冷榨油菜籽油种子粕制备油菜籽蛋白质分离物
在pH 5.9下采用不同提取液浓度的以下添加剂以七种不同的方式重复如在比较例1中所述的工序：
I.无(对照)
II.L-抗坏血酸(0.5g/kg)
III.焦亚硫酸钠(0.1g/kg)
IV.L-抗坏血酸(0.5g/kg)加焦亚硫酸钠(0.1g/kg)
V.L-抗坏血酸(0.5g/kg)加焦亚硫酸钠(0.05g/kg)
VI.L-抗坏血酸(0.25g/kg)加焦亚硫酸钠(0.1g/kg)
VII.L-抗坏血酸(0.25g/kg)加焦亚硫酸钠(0.05g/kg)
L-抗坏血酸和焦亚硫酸钠的每种组合执行的运行次数如下表所示：
在通过固/液分离步骤进行沉淀物去除之后并且在浓缩和洗涤之前，在振荡水浴中(56℃；100rpm；0-3h)中在50ml Greiner管(密闭盖)中执行孵育。在t＝0h、t＝1.5h和t＝3h时从温育管中取出用于HP-SEC和颜色分析的样品。在t＝3h时，将样品冷冻贮存(-20℃)。在贮存10周后，通过将样品解冻和离心(10,000g；5min)并如上所述继续孵育来继续进行实验。每约2h采集一次样品进行颜色分析。图2中给出了使用上述方法和紫外分光光度计进行颜色测量的结果。
在t＝0h、t＝1.5h和t＝3h时，测定在没有(对照)或有L-抗坏血酸和/或焦亚硫酸钠的澄清提取物的温育期间耐品蛋白的产率(以％为单位)。将对照在t＝0h处的耐品蛋白浓度设置为100％，其中[耐品蛋白]t＝0h＝7.55mg/g。参见下表：
针对中心点(L-抗坏血酸(0.25g/kg)加焦亚硫酸钠(0.05g/kg))获得的颜色分析、十字花科蛋白、耐品蛋白和十字花科蛋白/耐品蛋白比率的的标准偏差如下：
关于颜色，观察到焦亚硫酸钠导致了颜色的初始去除(即，较低的100-L值)，该颜色的初始去除随着时间的推移不是持久的，事实上在9小时温育后100-L超过了未处理的对照的100-L。对于L-抗坏血酸，观察到了较小的颜色初始去除，然而该效应随着时间的推移更加稳定并且最终导致100-L值显著低于对照的100-L值。当将L-抗坏血酸和焦亚硫酸钠组合时，观察到了额外的效应。这适用于前三个小时期间的所有测试组合，即L-抗坏血酸(0.25g/kg)加焦亚硫酸钠(0.05g/kg)、L-抗坏血酸(0.25g/kg)加焦亚硫酸钠(0.1g/kgkg)、L-抗坏血酸(0.5g/kg)加焦亚硫酸钠(0.05g/kg)和L-抗坏血酸(0.5g/kg)加焦亚硫酸钠(0.1g/kg)，持续3小时。对于其中L-抗坏血酸为至少0.5g/kg和/或焦亚硫酸钠为至少0.1g/kg的组合，在随后的7小时期间也观察到了效应。通常，在3-5h的温育之间，在对照与用L-抗坏血酸和焦亚硫酸钠两者处理的提取物之间的相对颜色差异是最大的(约50％)。
对于耐品蛋白，针对对照和任何测试浓度的L-抗坏血酸和/或焦亚硫酸钠均未观察到明显的产率下降，在前三小时的温育内均保持为远高于95％的对照的初始耐品蛋白浓度。
实施例3
在L-抗坏血酸和焦亚硫酸钠存在下从冷榨油菜籽油种子粕制备油菜籽蛋白质分离物
在一系列制备物中，以试验厂规模重复比较例1中所述的工序，其中在提取步骤期间添加L-抗坏血酸和焦亚硫酸钠(下表中的百分比为相对于油菜籽油种子粕和盐水溶液的混合物的重量)。用Hunterlab分光光度计使用上述方法测定两批干燥产物的颜色。在pH 6下在0.2M磷酸盐缓冲液中制备1％的溶液。在测量之前，将样品在0.45pm的过滤器上过滤以去除颗粒(如果存在的话)。测量值如下：
Claims (15)
1.一种获得天然油菜籽蛋白质分离物的方法，所述方法包括以下步骤：
i)在45℃至65℃的温度下将冷榨油菜籽油粕与水性液体混合；
ii)从步骤i)中获得的所述混合物中分离所述水性液体；
iii)使步骤ii)中获得的所述水性液体脱脂；
iv)通过添加酸或碱将步骤iii)中获得的所述脱脂水性液体的pH调节至中性，并与沉淀剂混合以获得沉淀物，其中所述沉淀剂包括镁、锌、铁或钙的盐；
v)去除在步骤iv)中获得的所述沉淀物以获得水性液体；
vi)浓缩并洗涤在步骤v)中获得的所述水性液体；
vii)借助于干燥从在步骤vi)中获得的所述经浓缩和洗涤的水性液体中分离天然油菜籽蛋白质分离物，
其特征在于在步骤i)或ii)或iii)或iv)或v)或vi)中的任何一者之前、期间或之后加入抗坏血酸或其衍生物和亚硫酸盐。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗坏血酸或其衍生物是L-抗坏血酸或L-抗坏血酸钙或L-抗坏血酸钾或L-抗坏血酸钠，并且其中所述亚硫酸盐是亚硫酸的铵盐或金属盐、酸式亚硫酸的铵盐或金属盐，或焦亚硫酸的铵盐或金属盐。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述亚硫酸盐是焦亚硫酸钠或焦亚硫酸钾。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述L-抗坏血酸的量为0.05至5g/kg的冷榨油菜籽油粕和水性液体的所述混合物，并且所述亚硫酸盐的量为0.01至0.5g/kg的冷榨油菜籽油粕和水性液体的所述混合物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述L-抗坏血酸的量为0.25至1g/kg的冷榨油菜籽油粕和水性液体的所述混合物，并且所述亚硫酸盐的量为0.05至0.1g/kg的冷榨油菜籽油粕和水性液体的所述混合物。
6.一种天然油菜籽蛋白质分离物，所述天然油菜籽蛋白质分离物包含40重量％至65重量％的十字花科蛋白和35重量％至60重量％的耐品蛋白并且在3至10范围内的pH和23±2℃的温度下的溶解度为至少88％，所述天然油菜籽蛋白质分离物在pH 6和20±2℃下在0.2M磷酸盐缓冲液中的1重量％溶液中的L值为88至98。
7.根据权利要求6所述的天然油菜籽蛋白质分离物，所述天然油菜籽蛋白质分离物包含以干物质计5％至65％的12S油菜籽蛋白质，其中所述12S的存在是通过蓝色天然PAGE验证的。
8.根据权利要求6至7中任一项所述的天然油菜籽蛋白质分离物，在2至12范围内的pH下，所述天然油菜籽蛋白质分离物在2重量％水溶液中的电导率小于9,000μS/cm。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的天然油菜籽蛋白质分离物，所述天然油菜籽蛋白质分离物包含以干物质计少于20％的7S油菜籽蛋白质。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的天然油菜籽蛋白质分离物，所述天然油菜籽蛋白质分离物的C/N比率在0.9至1.3的范围内。
11.根据权利要求6至10中任一项所述的天然油菜籽蛋白质分离物，所述天然油菜籽蛋白质分离物的植酸水平小于0.4重量％。
12.根据权利要求6至11中任一项所述的天然油菜籽蛋白质分离物，其中当在3至10范围内的pH和23±2℃的温度下测量时，所述天然油菜籽蛋白质分离物的溶解度为至少94％。
13.根据权利要求6至12中任一项所述的天然油菜籽蛋白质分离物，所述天然油菜籽蛋白质分离物的亚硫酸水平为1ppm至9ppm。
14.根据权利要求6至13中任一项所述的天然油菜籽蛋白质分离物在食物产品中的用途。
15.一种食物产品或宠物食物产品，所述食物产品或宠物食物产品包含根据权利要求6至13中任一项所述的天然油菜籽蛋白质分离物。
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