CN103755792B - 一种高纯度11s大豆球蛋白的制备方法及其应用 - Google Patents

一种高纯度11s大豆球蛋白的制备方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN103755792B
CN103755792B CN201410026014.0A CN201410026014A CN103755792B CN 103755792 B CN103755792 B CN 103755792B CN 201410026014 A CN201410026014 A CN 201410026014A CN 103755792 B CN103755792 B CN 103755792B
Authority
CN
China
Prior art keywords
elution
solution
glycinin
elutriant
damping fluid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201410026014.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103755792A (zh
Inventor
谯仕彦
白晶
宋青龙
何涛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BEIJING LONGKE FANGZHOU BIOLOGICAL ENGINEERING TECHNOLOGY Co Ltd
Original Assignee
BEIJING LONGKE FANGZHOU BIOLOGICAL ENGINEERING TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BEIJING LONGKE FANGZHOU BIOLOGICAL ENGINEERING TECHNOLOGY Co Ltd filed Critical BEIJING LONGKE FANGZHOU BIOLOGICAL ENGINEERING TECHNOLOGY Co Ltd
Priority to CN201410026014.0A priority Critical patent/CN103755792B/zh
Publication of CN103755792A publication Critical patent/CN103755792A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103755792B publication Critical patent/CN103755792B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种高纯度11S大豆球蛋白的制备方法及其应用。本发明公开的一种11S大豆球蛋白的制备方法，包括如下步骤：（1）将脱脂大豆粉用酸沉法得蛋白粗提液；（2）将（1）的粗提液进行强阴离子交换层析进行分离纯化，收集目的洗脱液1；（3）将目的洗脱液1进行陶瓷羟基磷灰石层析分离纯化，收集目的洗脱液2，即为目的蛋白；所述目的蛋白为沉降系数为11S的大豆球蛋白。本发明公开的方法工艺简单，易于流水线分离纯化，便于工业化生产。

Description

一种高纯度11S大豆球蛋白的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种高纯度11S大豆球蛋白的制备方法及其应用。
背景技术
大豆不仅是优良的油料作物，而且是理想的食用蛋白资源，随着现代科技的发展以及人们对大豆蛋白营养特性和功能特性认识的加深，高蛋白含量的脱脂大豆粉及其分离纯化的蛋白已经广泛应用于动物养殖、食品加工等领域。
根据超速离心法的沉降系数不同将大豆蛋白分为2S、7S、11S和15S大豆球蛋白。7S与11S球蛋白占大豆总蛋白含量的80％以上，它们的功能性质(水溶性、乳化性与表面活性等)与营养性质存在显著差异，11S大豆球蛋白具有高凝胶性，7S大豆球蛋白具有高乳化性。
目前分离11S与7S大豆球蛋白的方法主要是根据等电点不同采取酸沉淀法使两种蛋白分步沉淀。但由于11S与7S大豆球蛋白的等电点相差不大，由该方法往往需要采用多步分离，并借助低温设备与高速离心装置提高分离的精度，分离工艺繁杂冗长，大多只能用于实验室样品的制备；其次，大部分方法分离所得的蛋白纯度较低，限制了两种蛋白在实际生产中的应用，目前还没有一种工艺相对简单且能够面向工业化生产的有效方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种高纯度11S大豆球蛋白的制备方法及其应用。
本发明公开的一种11S大豆球蛋白的制备方法，包括如下步骤：
（1）将脱脂大豆粉用酸沉法得蛋白粗提液；
（2）将（1）的粗提液进行强阴离子交换层析进行分离纯化，收集目的洗脱液1；
（3）将目的洗脱液1进行陶瓷羟基磷灰石层析分离纯化，收集目的洗脱液2，即为目的蛋白；
所述目的蛋白为沉降系数为11S的大豆球蛋白。
上述方法中，所述步骤（1）的步骤为：
1）将所述脱脂大豆粉与含有10mM巯基乙醇的Tris-HCl缓冲液按照1g:20ml的比例混合，37℃提取1小时，离心后收集上清液；
2）将1）的上清液pH调至6.4，离心收集沉淀；
3）将2）的沉淀用Tris-HCl缓冲液溶解，经滤膜过滤收集滤液，即为所述蛋白粗提液；
所述Tris-HCl缓冲液为50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液；
所述滤膜为0.45μm滤膜。
上述任一所述的方法中，所述步骤(2)中，强阴离子交换层析的柱填料为Capto Q；
所述强阴离子交换层析的柱的内径为1.6cm，填料高度为5cm；
所用的洗脱缓冲液由如下A溶液和B溶液组成：
A溶液：50mM pH8.0Tris-HCl缓冲液；
B溶液：在50mM pH8.0Tris-HCl缓冲液中加入NaCl至终浓度为1M；
洗脱方式为线性梯度洗脱，所述B溶液在所述洗脱缓冲液中的体积百分含量变化为从0到100%；
所用洗脱缓冲液的用量为3-4个柱体积；
所述洗脱缓冲液的流速为10ml/min；
在280nm处监测洗脱液的吸光度，收集各洗脱峰；将各洗脱峰进行SDS-PAGE电泳，根据蛋白分子量确定哪种洗脱峰为目的洗脱液1。
上述任一所述的方法中，所述步骤(3)中，所述陶瓷羟基磷灰石的柱的内径为1.6cm，填料高度为5cm；
所用的洗脱缓冲液由如下A溶液和B溶液组成：
A溶液：50mM pH6.5的PB缓冲液；
B溶液：在50mM pH6.5的PB缓冲液中加入NaCl至终浓度为1M；
洗脱方式为线性梯度洗脱，所述B溶液在所述洗脱缓冲液中的体积百分含量变化为从0到100%；
所述洗脱缓冲液的用量为3-5个柱体积；
所述洗脱缓冲液的流速为10ml/min；
在280nm处监测洗脱液的吸光度，收集各洗脱峰；将各洗脱峰进行SDS-PAGE电泳，根据蛋白分子量确定哪种洗脱峰为目的洗脱液2。
上述任一所述的方法在制备11S大豆球蛋白中的应用也属于本发明的保护范围；
所述11S大豆球蛋白为沉降系数为11S的大豆球蛋白。
本发明具有如下优点和有益效果：
（1）将酸沉淀和柱层析有效结合，从而提高了11S大豆球蛋白的纯度，纯度在97%以上。
（2）11S大豆球蛋白分离纯化工艺简单，易于流水线分离纯化，便于工业化生产。
附图说明
图1为11S大豆球蛋白的Capto Q纯化谱图。
图2为11S大豆球蛋白的SDS-PAGE电泳检测。
图3为11S大豆球蛋白的CHT纯化谱图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液按照如下方法制备：121gTris碱，加800ml纯水，溶解后，用浓盐酸调节pH值到8.0，然后用纯水再定容到1L，配制成1M的母液，然后用纯水按照1:20的体积比稀释成50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液。
500mM pH6.5的PB缓冲液按照如下方法制备：
A液：取NaH2PO4·H2O27.6g溶于蒸馏水，定容至1000ml。
B液：取Na2HPO4·7H2O53.6g溶于蒸馏水，定容至1000ml。
取A液68.5ml与B液31.5ml混合，用水定容至400ml，调pH至6.5。
50mM pH6.5的PB缓冲液按照如下方法制备：将500mM pH6.5的PB缓冲液用水稀释10倍。
巯基乙醇购自北京益德益华科技发展有限公司，产品目录号为M-6250。
脱脂大豆粉购自安阳市奇天生物技术有限公司，产品目录号为201010101010。
Capto Q填料购自GE Healthcare，货号为20091005。
XK16/20柱购自GE Healthcare，货号为28-9889-37。
CHT填料购自Bio-Rad，货号为Bio-Scale CHT1。
实施例1、11S大豆球蛋白的分离纯化
一、11S大豆球蛋白的粗提取
（一）将脱脂大豆粉按照1g:20ml的体积比与50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液（含10mM巯基乙醇）混合，37℃提取1小时，28℃10000rpm离心15分钟，收集上清液。
（二）用2mol/L的HCl将上清液的pH调至6.4，28℃10000rpm离心15分钟，收集沉淀。
（三）将沉淀用50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液溶解，经0.45μm滤膜过滤收集滤液。
二、11S大豆球蛋白的强阴离子交换层析
（一）取10ml Capto Q填料装填XK16/20柱子（内径1.6cm，填料高度为5cm），装填完毕后用50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液平衡10个柱体积。
（二）将步骤一得到的滤液上柱，采用50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液平衡柱子，平衡完毕后采用洗脱缓冲液进行线性梯度洗脱，共洗脱3-4个柱体积，流速为10ml/min，在280nm处测收集管溶液的吸光度，收集各洗脱峰。
洗脱缓冲液由A溶液和B溶液组成：
A溶液：50mM pH8.0Tris-HCl缓冲液；
B溶液：在50mM pH8.0Tris-HCl缓冲液中加入终浓度为1M的NaCl；
线性梯度洗脱过程中，B溶液在洗脱缓冲液中的体积比例由0%-100%逐渐提高。
洗脱曲线如图1所示。
图1中：A-1（洗脱峰体积8mL）、A-2（洗脱峰体积为7mL）和A-3（洗脱峰体积为5mL）为三个洗脱峰。
三、采用SDS-PAGE电泳分别检测各洗脱峰，确定目的蛋白分布峰。
分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为4%，以分子量标准蛋白（条带大小分别为100、30、25、20、15、10、5、3.4KDa）以及三个洗脱峰A-1、A-2和A-3进行电泳，电泳条件为浓缩胶恒压80V，分离胶恒压120V。电泳结束后用考马斯亮兰G250染色液染色6小时以上，脱色观察。检测结果如图2所示。
图2中，1为Capto Q穿透1；2为蛋白质marker；3为Capto Q穿透2；4为Capto Q穿透3；5为Capto Q洗脱1；6为Capto Q洗脱2；7为Capto Q洗脱3；8为Capto Q洗脱4；9为CHT洗脱；10为CHT穿透。
Capto Q穿透1、Capto Q穿透2、Capto Q穿透3和Capto Q穿透4分别是指上样后不同时间点流出的溶液（未与柱子内的填料结合的液体）；Capto Q洗脱1、CaptoQ洗脱2和Capto Q洗脱3分别代表三个洗脱峰A-1、A-2和A-3；Capto Q洗脱4代表洗脱峰A-3之后收集的洗脱液。
图2表明，洗脱峰A-3中含有11S大豆球蛋白（即分子量为340000-375000Da的蛋白质）。
四、11S大豆球蛋白的陶瓷羟基磷灰石纯化
取10ml CHT填料装填XK16/20柱子（内径1.6cm，填料高度为5cm），装填完毕后用50mM pH6.5的PB缓冲液平衡10个柱体积，将步骤三检测的含有11S球蛋白的A-3样品上柱，上样完毕后继续用50mM pH6.5的PB缓冲液平衡，平衡完毕，再用洗脱缓冲液进行线性梯度洗脱，共洗脱3-5个柱体积，流速为10ml/min，在280nm处测收集管溶液的吸光度，收集各洗脱峰。
洗脱缓冲液由A溶液和B溶液组成：
A溶液：50mM pH6.5的PB缓冲液；
B溶液：在50mM pH6.5的PB缓冲液中加入终浓度为1M的NaCl；
线性梯度洗脱过程中，B溶液在洗脱缓冲液中的体积比例由0%-100%逐渐提高。
洗脱曲线如图3所示。
图3中，B-1（洗脱峰体积15mL）和B-2（洗脱峰体积为7mL）为两个洗脱峰。
五、采用SDS-PAGE电泳分别检测各洗脱峰，确定目的蛋白分布峰。
分离凝胶浓度为10%，浓缩胶浓度为4%，以分子量标准蛋白（条带大小分别为100、30、25、20、15、10、5、3.4KDa）以及两个洗脱峰B-1和B-2进行电泳，电泳条件为浓缩胶恒压80V，分离胶恒压120V。电泳结束后用考马斯亮兰G250染色液染色6小时以上，脱色观察。检测结果如图2所示。
图2中，其中9代表CHT洗脱（B-2）；10代表CHT穿透。CHT穿透是上样过程中的收集的流穿溶液（未与柱子内的填料结合的液体）。
图3表明，洗脱峰B-2含有11S大豆球蛋白，经过第二次柱纯化后11S大豆球蛋白得到有效分离收集，11S大豆球蛋白的纯度达到97%以上。

Claims (5)

1.一种11S大豆球蛋白的制备方法，包括如下步骤：
(1)将脱脂大豆粉用酸沉法得蛋白粗提液；
(2)将(1)的粗提液进行强阴离子交换层析进行分离纯化，收集目的洗脱液1；
(3)将目的洗脱液1进行陶瓷羟基磷灰石层析分离纯化，收集目的洗脱液2，即为目的蛋白；
所述步骤(2)中，强阴离子交换层析的柱填料为Catpo Q；
所用的强阴离子交换层析洗脱缓冲液由如下A溶液和B溶液组成：
A溶液：50mM pH8.0Tris-HCl缓冲液；
B溶液：在50mM pH8.0Tris-HCl缓冲液中加入NaCl至终浓度为1M；
强阴离子交换层析的洗脱方式为线性梯度洗脱，所述B溶液在所述洗脱缓冲液中的体积百分含量变化为从0到100％；
所述步骤(3)中，所用的陶瓷羟基磷灰石层析洗脱缓冲液由如下a溶液和b溶液组成：
a溶液：50mM pH6.5的PB缓冲液；
b溶液：在50mM pH6.5的PB缓冲液中加入NaCl至终浓度为1M；
陶瓷羟基磷灰石层析的洗脱方式为线性梯度洗脱，所述b溶液在所述洗脱缓冲液中的体积百分含量变化为从0到100％；
所述目的蛋白为沉降系数为11S的大豆球蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)的步骤为：
1)将所述脱脂大豆粉与含有10mM巯基乙醇的Tris-HCl缓冲液按照1g:20ml的比例混合，37℃提取1小时，离心后收集上清液；
2)将1)的上清液pH调至6.4，离心收集沉淀；
3)将2)的沉淀用Tris-HCl缓冲液溶解，经滤膜过滤收集滤液，即为所述蛋白粗提液；
所述Tris-HCl缓冲液为50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液；
所述滤膜为0.45μm滤膜。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述强阴离子交换层析的柱的内径为1.6cm，填料高度为5cm；
所用洗脱缓冲液的用量为3-4个柱体积；
所述洗脱液的流速为10ml/min；
在280nm处监测洗脱液的吸光度，收集各洗脱峰；将各洗脱峰进行SDS-PAGE电泳，根据蛋白分子量确定哪种洗脱峰为目的洗脱液1。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述陶瓷羟基磷灰石的柱的内径为1.6cm，填料高度为5cm；
所述洗脱缓冲液的用量为3-5个柱体积；
所述洗脱液的流速为10ml/min；
在280nm处监测洗脱液的吸光度，收集各洗脱峰；将各洗脱峰进行SDS-PAGE电泳，根据蛋白分子量确定哪种洗脱峰为目的洗脱液2。
5.权利要求1-4任一所述的方法在制备11S大豆球蛋白中的应用；
所述11S大豆球蛋白为沉降系数为11S的大豆球蛋白。
CN201410026014.0A 2014-01-21 2014-01-21 一种高纯度11s大豆球蛋白的制备方法及其应用 Expired - Fee Related CN103755792B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410026014.0A CN103755792B (zh) 2014-01-21 2014-01-21 一种高纯度11s大豆球蛋白的制备方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410026014.0A CN103755792B (zh) 2014-01-21 2014-01-21 一种高纯度11s大豆球蛋白的制备方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103755792A CN103755792A (zh) 2014-04-30
CN103755792B true CN103755792B (zh) 2014-12-31

Family

ID=50523142

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410026014.0A Expired - Fee Related CN103755792B (zh) 2014-01-21 2014-01-21 一种高纯度11s大豆球蛋白的制备方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103755792B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1561384A1 (en) * 2002-11-12 2005-08-10 Fuji Oil Company, Ltd. Fractionated soybean protein and process for producing the same
CN101184403A (zh) * 2005-05-30 2008-05-21 不二制油株式会社 分级的大豆蛋白质材料，适用于该材料的加工后大豆，及制备大豆蛋白质材料和加工后大豆的工艺

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1561384A1 (en) * 2002-11-12 2005-08-10 Fuji Oil Company, Ltd. Fractionated soybean protein and process for producing the same
CN101184403A (zh) * 2005-05-30 2008-05-21 不二制油株式会社 分级的大豆蛋白质材料，适用于该材料的加工后大豆，及制备大豆蛋白质材料和加工后大豆的工艺

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Rapid separation of soybean globulins by reversed-phase high performance liquid chromatography;M.C. Garcia等;《Journal of Chromatography A》;19970110;第758卷(第1期);第75-83页 *
响应面分析法优化大豆11S球蛋白提取工艺条件;韩景华等;《食品与发酵工业》;20090430;第35卷(第4期);第70-74页 *
大豆11S球蛋白提取分离方法研究;陈学玲等;《中国粮油学报》;20070131;第22卷(第1期);第35-37 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN103755792A (zh) 2014-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101638427B (zh) 一种病毒抗原的纯化方法
CN102351938A (zh) 一种高纯度茶皂素的制备方法
CN101721979B (zh) 一种缬氨酸分离专用大孔吸附树脂的制备方法
CN103509133B (zh) 一种香菇多糖快速分离的方法
CN106198172B (zh) 一种黑果枸杞中花色苷类化合物的选择性富集方法
CN112646050B (zh) 一种肺炎球菌多糖的纯化工艺
CN102702341B (zh) 基于cho细胞表达系统的重组人神经生长因子纯化方法
Colpan et al. Large-scale purification of viroid RNA using Cs2SO4 gradient centrifugation and high-performance liquid chromatography
JP6592500B2 (ja) フィダキソマイシンの精製方法
CN103755792B (zh) 一种高纯度11s大豆球蛋白的制备方法及其应用
CN103739689B (zh) 一种高纯度7s大豆球蛋白的制备方法及其应用
CN105505225A (zh) 高辣素含量辣椒油树脂中辣素和色素的分离及辣素精制的方法
CN105505574A (zh) 一种层析分离制备高纯蓖麻油的方法
CN103382185B (zh) 6,12-二苯基二苯并[b,f][1,5]二氮杂环辛四烯的手性制备及构型确定
CN106496077B (zh) 一种从樟脑磺酸合成母液回收樟脑磺酸的方法
CN102796193A (zh) 一种从鸡蛋清中提取卵转铁蛋白的方法
CN102675108B (zh) 一种除虫菊酯粗提物的精制方法
CN106539848A (zh) 一种甜柿黄酮的制备方法
CN108003211A (zh) 一种从灵芝副产物中快速分离灵芝酸的方法
CN103864958A (zh) 一种制备高纯度肝素钠的方法
CN108250066A (zh) 一种高纯度不饱和脂肪酸的分离纯化方法
CN108148111B (zh) 一种脾氨肽内多肽的提取方法
CN102731644A (zh) 从藻类中分离制备药用级藻蓝蛋白的方法
CN105693841A (zh) 一种提取纯化波形蛋白的方法
CN102558382A (zh) 一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20141231

Termination date: 20220121