KR100991588B1 - 분획된 대두 단백질 및 그 제조방법 - Google Patents
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Abstract
7S 글로불린과 11S 글로불린의 신규한 분획방법, 특히 공업적 규모로 실시할 수 있고, 고정밀도로서 효율이 양호한 분획방법을 목적으로 한다. 그리고 지질 회합 단백질의 혼입율이 적고, 순도가 높은 7S 글로불린과 11S 글로불린의 특징있는 성질을 가진 단백질 획분을 얻음에 있다.
대두 단백질을 함유한 용액을 pH 3.8∼6.8의 산성 하에서 30∼75℃의 가온 처리 후, 이온 강도 0.02 이상, pH 4.5 이상 5.6 미만에서 가용성 획분과 불용성 획분으로 분획하는 것을 특징으로 하는 대두 단백질의 제조방법.
Description
본 발명은 대두(大豆) 단백질을 함유한 용액으로부터 7S 글로불린이 풍부한 획분(劃分)과 11S 글로불린이 풍부한 획분을 제조하는 방법 및 그 제조방법에 의해 얻어지는 대두 단백질에 관한 것이다.
대두의 저장 단백질은 pH 4.5 부근에서 침전되어, 비교적 간단히 단백질 이외의 성분으로 분리할 수가 있다. 이 저장 단백질은 대두 분리 단백질로 불리며, 식품공업에서의 사용은 대부분 이러한 형태로 이루어진다. 그리고 단백질은 초원심 분리에 의한 침강 상수로부터 2S, 7S, 11S 및 15S의 각 글로불린으로 분류된다. 이 중에서 7S 글로불린과 11S 글로불린은 글로불린 획분의 주요한 구성 단백질 성분(주: 7S 글로불린 및 11S 글로불린은 침강법에 의한 분류명이고, 면역학적 명명법에서 말하는 β-콘글리시닌, 글리시닌에 실질적으로 상당한다)이고, 이 양자는 점성, 응고성, 계면활성 등에 있어서 상이한 성질을 가진다. 따라서 대두 단백질을 7S 글로불린이 풍부한 구분과 11S 글로불린이 풍부한 구분으로 분획할 수 있으면 양 단백질의 성질을 이용하는 것이 가능해져서 산업에서의 단백질 이용 분야의 확대를 기대할 수 있다.
7S 글로불린과 11S 글로불린은 몇 가지의 서브유닛으로 되어 있고, 7S 글로불린은 α, α', β의 3종류의 서브유닛, 11S 글로불린은 산성 폴리펩티드(A)와 염기성 폴리펩티드(B)를 한 쌍으로 한 몇 종류의 서브유닛으로 되어 있다. 종래의 가장 통상적인 대두(大豆)에 있어서 그 존재비율은 전형적으로는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 얻어진 패턴의 농도계(densitometry)에 의한 면적비로서 7S 글로불린:11S 글로불린이 약 1:2이다. 7S 글로불린과 11S 글로불린의 성질은 분자량과 하전의 상태도 아주 유사하다. 특히 이들 글로불린은 서브유닛의 조합에 의해 다양성을 가진 단백질이고, 이들의 성질은 어느 정도 폭이 있으며, 서로 오버랩하고 있다. 따라서 양자의 상호간의 혼입이 적은 유효한 분리를 한다는 것은 용이하지 않다.
종래부터 알려져 있는 분획법을 아래에서 설명한다. 즉,
(1) 등전점의 차이를 이용하는 것: 11S 글로불린의 등전점 근방에서 7S 글로불린만을 추출하는 방법(일본국 특개소 55-124457호 공보).
(2) 칼슘염과의 반응성의 차이를 이용하는 것: 추출시에 소량의 칼슘염을 첨가하여 7S 글로불린이 풍부한 획분을 추출하는 방법(일본국 특개소 48-56843호 공보).
(3) pH·이온 강도에서의 용해성의 차이를 이용하는 방법:
가) pH 1.2∼4.0의 염화 나트륨 또는 염화 칼륨 존재 하에 불용성 구분을 제거하여 7S 글로불린을 제조하는 방법(일본국 특개소 49-31843호 공보).
나) 등전점 침강한 슬러리를 pH 5.0∼5.6으로 조정하고, 또한 염화 나트륨 농도를 0.01∼0.2M의 몰 농도로 조정하여, 7S 글로불린과 11S 글로불린을 분리하는 방법(일본국 특개소 58-36345호 공보).
다) 단백질 함유 용액의 이온 강도를 0.2∼0.3으로 조정하고, 또한 pH값을 4.8∼5.2로 조정하여 불용성 획분을 제거한 후, 이온 강도를 0.2 미만 및 pH값을 4.6∼5.0으로 조정하여 7S 글로불린을 분취(分取)하는 방법(일본국 특개평 5-43597호 공보).
(4) 냉침현상과 환원제 등을 이용하는 것: 11S 글로불린이 저온 하에서는 용해성이 저하하는 현상[냉침(冷沈)현상이라 함]을 이용하는 것인데, 대두 단백질 원료를 아황산 화합물, 글루타티온 화합물, 또는 시스테인 화합물의 존재 하에, 또한 pH 6.5 이상의 물계(水系) 중에서 처리하여 pH 5.5∼7.0 및 22℃ 이하의 범위로 조정하여 7S 글로불린이 풍부한 가용성 획분과 11S 글로불린이 풍부한 불용성 획분으로 분획하는 방법(일본국 특개소 61-187755호 공보).
이들 종래부터 알려져 있는 분획방법은 7S 글로불린과 11S 글로불린의 pH, 이온 강도, 어떤 종류의 염의 존재, 온도 등에 의한 용해성의 차이를 능숙하게 이용한 기술이지만, 명확한 분획을 하기 위해서는 높은 원심력에 의한 분리를 필요로 하는 등, 공업적인 분획법으로서는 부적당하다고 하는 문제점이 있어 실용면에서 문제를 남기고 있었다. 예를 들면, 일본국 특개소 61-187755호 공보의 방법에서는, 냉침현상은 온도에 강하게 의존하기 때문에 5℃ 정도까지 냉각할 필요가 있고, 공업적으로 낮은 원심력으로 분리하기 위해서는 대량의 아황산 화합물 등의 첨가를 필요로 한다는 실용면에서의 문제와, 가용성 획분에의 11S 글로불린의 혼입이 적지 않게 있다는 분획 정밀도면에서의 문제를 남기고 있었다.
7S 글로불린이 풍부한 단백질을 얻는 것으로는, 육종에 의한 11S 글로불린 결손 대두, 즉 7S 글로불린이 풍부한 종자(Breeding Science, 46, 11, 1996)로부터 단백질을 분리하는 것이 검토되어, 그것을 응용한 보고(Breeding Science, 50, 101, 2000) 및 특허(US 6,171,640 B1)도 나와 있다.
이상과 같이, 가용성 및 불용성 획분에 대한 상호의 혼입율이 적고, 또한 간편히 효율적으로 공업규모에서의 제조를 할 수 있는 7S 글로불린이 풍부한 획분과 11S 글로불린이 풍부한 획분의 분획법의 개발 연구가 이루어지고 있다.
한편, 대두 유래의 단백질에는, 세포막을 비롯한 프로틴 보디, 오일 보디 등의 막을 구성하는 극성 지질과의 친화력이 높은 단백질(지질 회합 단백질)이 존재하고, 공업적으로 생산하는 분리 대두 단백질의 약 35％나 차지하고 있는 것이 佐本 등에 의해 보고되어 있다[Biosci. Biotechnol. Biochem., 62 (5), 935-940 (1998)]. 이 지질 회합 단백질은 막(膜)단백질을 주체로 하는 단백질군의 총칭으로서, 특히 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동에 의한 추정 분자량에 있어서 주로 34kDa, 24kDa, 18kDa를 나타내는 단백질을 함유하고, 클로로포름:메탄올=2:1의 극성 용매에 의해 추출되는 극성 지질을 10∼12 중량％ 정도 함유한다.
종래의 분획법은 7S 글로불린과 11S 글로불린에만 주목하고 있어, 각 획분에 혼재하는 지질 회합 단백질에 대해서는 고려되지 않고 있는 경우가 많았다. 그 이유로서, 지질 회합 단백질은 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동에 의한 분석으로는 7S 글로불린이나 11S 글로불린만큼 명확히 특정할 수 없고, 그 존재를 과소하게 평가하는 경우가 많았다. 환언하면, SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동에 의해 측정되는 순도만으로는 참된 순도를 과대하게 평가하고 있는 경우가 많아, 참으로 순도가 높은 7S 글로불린이나 11S 글로불린을 얻기 위해서는 이 지질 회합 단백질의 거동을 고려할 필요가 있다. 즉, 지금까지의 7S 글로불린/11S 글로불린의 2획분으로의 분획에서는 7S 글로불린과 11S 글로불린의 비율에 의해서만 분획품의 순도를 의논하고 있는 경우가 많았다. 그러나 각 획분은 지질 회합 단백질을 수반하고, 실제의 단백질 조성으로서는 지질 회합 단백질을 많이 함유하는 정제 순도가 다소 낮은 조(粗)분획품이 되는 경우가 많았다.
본 발명자들은 공업적인 7S 글로불린과 11S 글로불린의 분획이 가능해지는 산성 하에서의 가온 처리만의 방법(WO 02/28198 A1)을 제안했지만, 더욱 예의 연구한 결과, 대두 단백질을 함유하는 용액의 산성 하에서의 가온 처리와, 이온 강도의 조정을 조합함으로써, 7S 글로불린을 함유하는 가용성 획분과 11S 글로불린을 함유하는 불용성 획분의 분리 pH를 낮게 하는 것이 가능해져서, 가용성 획분과 불용성 획분의 분리가 한층 용이해지는 것을 발견하였다.
본 발명은 7S 글로불린과 11S 글로불린의 신규의 분획법을 제안하는 것이며, 특히 공업적 규모로 할 수 있고, 고정밀도로 효율이 양호한 분획법을 목적으로 한다. 또한 다른 목적은, 지질 회합 단백질의 혼입율이 적고 순도가 높은 7S 글로불린과 11S 글로불린의, 특징있는 성질을 가진 단백질 획분을 얻는 것에 있다.
[특허문헌 1] 특개소 55-124457호 공보
[특허문헌 2] 특개소 48-56843호 공보
[특허문헌 3] 특개소 49-31843호 공보
[특허문헌 4] 특개소 58-36345호 공보
[특허문헌 5] 특개평 5-43597호 공보
[특허문헌 6] 특개소 61-187755호 공보
[특허문헌 7] US 6,171,640 B1
[특허문헌 8] WO 02/28198 A1
[비특허문헌 1] K Yagasaki etc, Breeding Science, 46, 11, 1996
[비특허문헌 2] K Yagasaki etc, Breeding Science, 50, 101, 2000
[비특허문헌 3] M Samoto etc, Biosci. Biotechnol. Biochem., 62 (5), 935-940, 1998
본 발명은,
(1) 대두 단백질을 함유하는 용액을, 산성 하에서 가온 처리한 후, 이온 강도 0.02 이상, pH 4.5 이상 5.6 미만에서 가용성 획분과 불용성 획분으로 분획하는 것을 특징으로 하는 대두 단백질의 제조방법.
(2) 상기 (1)에 있어서, 대두 단백질을 함유하는 용액이 탈지 대두의 가수(加水) 슬러리, 이 슬러리로부터 얻어지는 탈지 두유, 산침전 대두 단백질 슬러리, 또는 분리 대두 단백질 용액인 제조방법.
(3) 상기 (1)에 있어서, 산성이 pH 3.8∼6.8인 제조방법.
(4) 상기 (1)에 있어서, 가온 처리가 30∼75℃인 제조방법.
(5) 상기 (1)에 있어서, 상기 (1)에 기재된 분획방법에 의해 얻어지는 가용성 획분으로부터 7S 글로불린/(11S 글로불린+7S 글로불린)의 비가 0.5 이상이고, 고형분 중의 클로로포름:메탄올=2:1 용매로써 추출되는 극성(極性) 지질 함량이 1 중량％ 이하인 7S 글로불린 단백질을 분취(分取)하는 제조방법.
(6) 고형분 중의 피트산 함량이 1.2 중량％ 이하인 상기 (5)에 기재된 방법으로 얻어진 7S 글로불린 단백질.
(7) 상기 (1)에 있어서, (1)에 기재된 분획방법에 의해 얻어지는 불용성 획분으로부터 11S 글로불린/(11S 글로불린+7S 글로불린)의 비가 0.7 이상이고, 고형분 중의 클로로포름:메탄올=2:1 용매로써 추출되는 극성 지질 함량이 2 중량％ 이하인 11S 글로불린 단백질을 분취하는 제조방법.
(8) 고형분 중의 피트산 함량이 1.2 중량％ 이하인, 상기 (7)에 기재된 방법으로 얻어진 11S 글로불린 단백질에 관한 것이다.
[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]
본 발명은, 대두 단백질을 함유하는 용액의 산성 하에서의 가온(加溫) 처리와 이온 강도의 조정을 조합함으로써, 공업적인 7S 글로불린과 11S 글로불린의 분획이 가능해지는 산성 하에서의 가온 처리만인 방법(WO 02/28198 A1)과 비교하여, 7S 글로불린을 함유하는 가용성 획분과 11S 글로불린을 함유하는 불용성 획분의 분리 pH를 낮게 할 수 있게 되고, 그것에 의하여 가용성 획분과 불용성 획분의 분리가 한층 용이해지는 것을 특징으로 하는 분획 대두 단백질의 제조방법이다.
상기 산성은 pH 3.8∼6.8이 바람직하고, 가온하는 온도는 30∼75℃가 바람직하다. 이온 강도는 0.02 이상이 바람직하고, 가용성 획분과 불용성 획분의 분리는 pH 4.5 이상 5.6 미만이 바람직하다. 이렇게 함으로써, 7S 글로불린이 풍부하고 지질 회합 단백질이 적은 가용성 획분을 얻을 수 있다. 또한 이렇게 함으로써 11S 글로불린 및 지질 회합 단백질이 풍부한 불용성 획분이 생성되는데, 이 불용성 획분의 11S 글로불린을 거의 중성(대략 pH 6.5∼7.5)의 수용액 중에서 약한 전단력으로 용해, 혹은 추출함으로써, 지질 회합 단백질을 불용화한 채로 11S 글로불린을 선택적으로 용해시켜 분리하는 것이 가능해서 11S 글로불린이 풍부하고 지질 회합 단백질이 적은 획분을 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 제조 공정 중, 피타아제에 의한 피트산 분해를 실시함으로써 얻어지는 단백질당 1.2％ 이하의 저피틴의 단백질 획분을 얻을 수 있다. 또한, 가용성 획분과 불용성 획분을 분리하기 전의 피타아제 처리에 의해 분리 효율을 향상시킬 수 있다.
상기 제조방법에 의해 얻어진 가용성 획분은 7S 글로불린/(11S 글로불린+7S 글로불린)의 비가 0.5 이상이며, 가용성 획분과 불용성 획분의 분리 pH를 적당히 선택함으로써 이 비가 0.8 이상, 0.85 이상, 혹은 0.9 이상인 고순도 7S 글로불린 획분을 용이하게 얻을 수 있다. 또 하나의 획분인 불용성 획분은 11S 글로불린/(11S 글로불린+7S 글로불린)의 비가 0.7 이상인 획분이며, 가용성 획분과 불용성 획분의 분리 pH를 적당히 선택함으로써 이 비가 0.8 이상, 0.85 이상, 혹은 0.9 이상인 고순도 11S 글로불린 획분을 용이하게 얻을 수 있다.
여기서 7S 글로불린/(11S 글로불린+7S 글로불린)이나 11S 글로불린/(11S 글로불린+7S 글로불린)의 비는, SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동으로 얻어진 영동 패턴을 농도계로써 측정하고, 해당 획분의 면적의 비율로부터 얻을 수 있다.
또한, 상기 지질 회합 단백질은 거의 변성해 있지 않은 산침전 단백질로부터 황산 나트륨을 사용해서 정밀하게 얻으면 산침전 단백질 중에 30∼35％ 정도 존재[상기 Biosci. Biotechnol. Biochem., 62 (5), 935-940 (1998)]한다. 또한, 클로로포름/메탄올=2:1(용량비)로써 추출되는 극성 지질이, 이 산침전 단백질 고형물 중에는 3∼4 중량％ 존재하고, 지질 회합 단백질 중에는 10∼12％ 존재하는 사실로부터 상기 극성 지질(이하, 간단히 「클로로포름·메탄올 유분(油分)」이라 할 경우가 있음)은 산침전 단백질 중에서도 지질 회합 단백질 중에 편재(偏在)하므로, 클로로포름·메탄올 유분의 10 중량배가 지질 회합 단백질로 환산될 수 있다. 단, 이 환산은 지질 회합 단백질이 헥산 등에 의한 탈지 공정을 거치고 있는 대상에 적용할 수 있고, 헥산 추출의 공정을 거치고 있지 않은 대상일 경우에는 헥산으로 미리 탈지한 후에 적용할 수 있다.
본 발명에 의해 얻어지는 7S 글로불린이 풍부한 가용성 획분은 클로로포름·메탄올 유분이 1％ 이하이고, 환산하면 지질 회합 단백질은 10％ 이하가 된다. 또한, 불용성 획분으로부터 추출한 11S 글로불린이 풍부한 획분은 클로로포름·메탄올 유분이 2％ 이하이고, 환산하면 지질 회합 단백질은 20％ 이하인 대두 단백질 획분이 된다.
본 발명에서 사용한 분석 방법을 아래에 기재한다.
＊ 조(粗)단백질: 켈달법에 근거해서 질소함량을 구하여, 계수 6.25를 곱해서 조단백질로 환산하였다.
＊ 불용성 획분의 분리 침강 속도: L.U.M.사제의 분리 특성 분석 장치 LUMiFuge 114를 사용하고, 불용성 획분을 함유하는 시료용액 0.5ml을 폴리스티렌제 각형 셀에 넣고, 100G에서 원심분리했을 때의 투과율 20％인 계면의 이동 속도를 분리 침강 속도로 하였다.
＊ SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동: Laemmli[Nature, 227, 680 (1970)]의 방법에 근거해서 겔 농도 10~20％의 그래디언트 겔로써 분석하였다. 단백질 적용량은 고형분 환산으로 6㎍으로 하고, 염색은 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250을 사용해서 하였다.
＊ 피트산: Alii Mohamed의 방법(Cereal Chemistry 63, 475-478, 1986)에 준거해서 측정하였다.
＊ 클로로포름·메탄올 유분: 시료 건조물에 대하여 클로로포름·메탄올의 혼합액(용량비, 2:1)을 약 50배 가하고, 환류 추출되는 고형분의 중량비를 클로로포름·메탄올 유분(油分)으로 측정하였다.
＊ 순도(SPE 기준): 상기의 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동으로 얻어진 영동 패턴을 농도계로써 측정하고, 그 전체에 대한 해당 획분의 면적비율을 순도(SPE 기준)로 하였다. 여기서 7S 글로불린 함량은 α, α', β 서브 유닛의 총 함량을 나타내고, 11S 글로불린 함량은 산성 폴리펩티드(A)와 염기성 폴리펩티드(B)의 총 량을 나타낸다.
＊ 보정 순도: 상기에서 얻어진 순도(SPE 기준)로부터, 혼재하는 지질 회합 단백질의 양도 고려한 보정 순도를 아래와 같이 산출하였다. 즉, 시료의 순도(SPE 기준)의 값을 A％로 하고, 이 시료 중에는 7S 글로불린 및 11S 글로불린 이외에 클로로포름·메탄올 유분의 10배 중량에 상당하는 지질 회합 단백질도 존재하므로, 7S 글로불린 및 11S 글로불린에 지질 회합 단백질의 양을 포함한 합계 단백질에 대한 순도로서 산출한다.
보정 순도(％)＝(100(％)－클로로포름·메탄올 유분(％)＊10)＊A(％)／100
＊ 이온 강도: 도전율계(2％/℃ 온도환산 기능 있음)를 사용하여 용액의 도전율을 측정하고, 그 도전율에 상당하는 NaCl 몰 농도를 이온 강도로 하였다.
아래에 본 발명의 바람직한 형태를 기재한다.
본 발명에서 사용하는 원료 대두는 시판의 대두, 또는 육종이나 유전자 조작 등에 의해 특정한 획분이 결손된 대두를 모두 사용할 수 있다. 대두 단백질을 함유하는 용액은, 탈지 대두의 가수(加水) 슬러리(이하, "탈지 대두 슬러리"라 함), 이 슬러리로부터 얻어지는 탈지 두유, 산침전 대두 단백질 슬러리(이하, "커드 슬러리"라 함), 또는 분리 대두 단백질 용액 중의 어느 것이라도 좋은데, 특히 탈지 대두의 가수 슬러리를 사용한 쪽이 가용성 획분과 불용성 획분의 분리가 용이하므로 바람직하다. 또한, 7S 글로불린이 풍부한 획분과 11S 글로불린이 풍부한 획분으로 분획하기 위해서는 미변성 혹은 저변성 대두 단백질 용액이 바람직하다.
대두 단백질을 함유하는 용액의 산성 하에서의 가온 처리는, pH 3.8∼6.8, 바람직하게는 pH 4.0∼6.6, 더욱 바람직하게는 pH 4.2∼6.2의 산성 하에서 30∼75℃, 바람직하게는 35∼65℃, 더욱 바람직하게는 40∼60℃에서의 가온 처리가 좋다.
이온 강도는 0.02 이상에서 가용성 획분과 불용성 획분의 분리가 용이해지고, 더욱 높게 함으로써 가용성 획분과 불용성 획분의 분리가 한층 용이해진다. 단, 이온 강도 0.2 이상의 경우, 분리 후의 가용성 획분으로부터 7S 글로불린을 등전점 침전시키기 위해서는 이온 강도를 0.2 미만으로 할 필요가 있고, 조작이 번잡해지므로, 바람직하게는 0.02 이상 0.2 미만이 좋다.
가용성 획분과 불용성 획분의 분리는 pH 4.5 이상 5.6 미만에서 실시함으로써 7S 글로불린이 풍부한 가용성 획분과 11S 글로불린이 풍부한 불용성 획분을 얻을 수 있다. 또한, 제조 공정 중, 특히 가용성 획분과 불용성 획분을 분획할 때까지의 어느 공정에서 대두 단백질과 공존하는 피트산을 피타아제로 분해함으로써 7S 글로불린이 풍부한 획분과 11S 글로불린이 풍부한 획분의 분리가 한층 용이해진다. 피타아제 처리는 산성 하에서의 가온 처리와 동시에 실시하면 간편하다. 피타아제는 기원에 따라 다소 다르기는 하지만, 통상적으로 pH 3.5∼9.0, 온도 20∼70℃, 5분간∼3시간, 단백질 중량(g)당 0.1∼100 unit 정도 작용시키는 것이 적합하다. 그리고 1 unit의 피타아제 활성은 pH 5.5, 37℃의 조건 하에서 반응 초기의 1분간에 기질인 피트산으로부터 1μ 몰의 인산을 유리하는 효소량을 의미한다.
상기 가온 처리를 위한 가온 유지 시간의 장단(長短)은 가온 처리의 pH나 온도에 비하여 분리의 난이(難易)에 그다지 크게 영향을 주지 않아 그다지 중요하지 않다. 가온 처리시의 pH가 3.8∼6.8의 범위 밖, 또는 온도가 30℃∼75℃의 범위 밖이면, 7S 글로불린과 11S 글로불린의 분리가 어렵게 된다.
가온 처리 후에는, 미생물 관리상 냉각하는 쪽이 바람직하지만, 그대로의 온도에서 분획으로 옮겨가도 좋다. 분획의 수단은, 공지의 분리 수단[여별(濾別), 원심분리 등]을 사용할 수 있고, 특히 연속식 원심분리기(예를 들면 디캔터) 등을 사용해도 용이하고 효율적으로 분리할 수 있다. 물론 배치식 등의 비연속식 원심분리기를 사용해도 괜찮다.
본 발명에 의한 가용성 획분인 7S 글로불린이 풍부한 획분과 불용성 획분인 11S 글로불린이 풍부한 획분의 분획 정밀도는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동으로 얻어진 패턴에 의해서 평가할 수 있다(순도는 SPE 기준).
그러나 SPE 기준의 순도에서는 지질 회합 단백질이 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동에서의 염색성이 낮기 때문에 과소하게 평가되므로, 상기 보정 순도(％)＝(100(％)－클로로포름·메탄올 유분(％)＊10)＊A(％)／100의 식을 사용한 보정 순도의 값쪽이 더욱 참된 순도에 가까운 값이라고 생각된다.
분리 후의 가용성 획분은 그대로 혹은 농축하고, 혹은 중화하고, 혹은 살균하고, 혹은 건조하여 7S 글로불린이 풍부한 획분으로 하여 사용할 수 있다. 농축하는 수단으로서는, 이온 강도를 0.2 미만으로 조정하고, 또한 pH값을 4.0∼5.0으로 조정해서 생기는 불용성 획분을 분리 회수하는 방법을 예시할 수 있고, 그 후, 가수(加水), 중화, 가열 살균 처리하고, 건조하는 형태가 가장 통상적이다. 가열 살균 처리는 공지의 HTST, UHT 처리 등으로 실시할 수 있다. 목적에 따라, 용액의 상태에서 프로테아제 등을 사용한 효소처리를 하는 것도 물론 가능하다.
분리 후의 불용성 획분으로부터는, 거의 중성(대략 pH 6.5∼7.5)의 수용액을 사용해서 11S 글로불린을 용해 혹은 추출함으로써 불용성의 지질 회합 단백질(불용성 획분이 비지 성분을 함유할 경우는 비지 성분도 포함한다)과 분리할 수 있다. 이때, 11S 글로불린의 용해 혹은 추출은 가능한 약한 전단력으로 실시한 쪽이 지질 회합 단백질 획분의 가용화를 막고, 11S 글로불린을 선택적으로 용해 혹은 추출할 수 있으므로 바람직하다. 또한, 용해 혹은 추출한 11S 글로불린과 지질 회합 단백질과의 분리에는 약 4,000G 이상의, 바람직하게는 약 5,000G 이상의 높은 G의 원심분리기에서 처리하는 것이 바람직하고, 이것에 의해 11S 글로불린/(11S 글로불린+7S 글로불린)의 비가 0.7 이상을 유지한 채로 클로로포름·메탄올 유분이 고형물 중에서 2％ 이하인 단백질을 얻을 수 있다.
거의 중성의 수용액을 사용해서 용해 혹은 추출한 클로로포름·메탄올 유분이 2％ 이하인 11S 글로불린이 풍부한 획분은, 그대로, 혹은 농축하고, 혹은 중화하고, 혹은 살균하고, 혹은 건조하여 11S 글로불린이 풍부한 획분으로 하여 사용할 수 있다. 농축하는 수단으로서는, 가용성 획분을 pH 4.5 이상 5.6 미만으로 조정해서 생기는 불용성 획분을 분리 회수하는 방법을 예시할 수 있고, 그 후, 가수, 중화, 가열 살균 처리하고, 건조하는 형태가 가장 통상적이다. 가열 살균 처리는 공지의 HTST, UHT 처리 등으로 실시할 수 있다. 목적에 따라, 용액의 상태로 프로테아제 등을 사용한 효소처리를 하는 것도 물론 가능하다.
이하, 본 발명의 실시예를 나타내지만, 본 발명이 이들에 의해 그 기술범위가 한정되는 것이 아니다.
<실시예 1>
대두를 압편(壓扁)하고, n-헥산을 추출 용매로 해서 기름을 추출 분리 제거하여 얻어진 저변성 탈지 대두(질소 가용 지수: NSI 91) 1 중량부에, 10 중량부의 추출수(抽出水)(이온 교환수)를 가하여, 호모 믹서를 사용해서 22℃에서 교반하고, 20％ 수산화 나트륨 용액으로 pH 7.2로 유지하면서 40분간 추출하였다. 이어서, 추출액을 여과포로써 여과하고, 다시 5,000G에서 10분간 원심분리해서 불용물을 제거한 탈지 두유를 얻었다. 얻어진 탈지 두유의 pH를 35％ 염산을 사용해서 pH 4.5로 조정하고, 3,000G에서 10분간 원심분리해서 산침전 단백질을 얻은 후, 단백질이 건조 중량으로 5％가 되도록 산침전 단백질에 이온 교환수를 가하여 폴리트론(KINEMATICA AG사제)에 의해 균질화(이하, "커드 슬러리(curd slurry)"라고 부른다.)하였다. 커드 슬러리의 이온 강도를 염화 나트륨을 사용해서 0.14로 조정하고, 22℃에서 30분간 교반, 이어서, 20％ 수산화 나트륨 용액을 사용해서 커드 슬러리의 pH를 5.3으로 조정하고, 22℃에서 20분간 교반하였다. 그 후, 커드 슬러리를 50℃까지 승온하고, 50℃에서 10분간 교반한 후, 즉시 22℃까지 냉각하였다. 이때, 승온 시작에서부터 22℃까지 냉각하는데 요한 시간은 25분간이었다. 22℃에서 다시 15분간 교반한 후, LUMiFuge 114를 사용해서 불용성 획분의 분리 침강 속도를 측정함과 아울러, 5,O0OG에서 5분간 원심분리해서 얻어진 가용성 획분과 불용성 획분을 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동으로 분석하여, 7S 글로불린과 11S 글로불린의 존재비(SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동법에 의한 영동 패턴을 농도계로써 측정한 해당 획분의 면적비)를 구하였다.
표 1에 불용성 획분의 분리 침강 속도, 표 2에 가용성 획분과 불용성 획분의 7S 글로불린과 11S 글로불린의 존재비를 나타낸다.
<비교예 1>
실시예 1과 마찬가지로 조제한 5％ 커드 슬러리의 이온 강도를 염화 나트륨을 사용해서 0.14로 조정하고, 22℃에서 30분간 교반, 이어서 20％ 수산화 나트륨 용액을 사용해서 커드 슬러리의 pH를 5.3으로 조정하고, 22℃에서 60분간 교반하였다. 그 후, 실시예 1과 같은 방법으로 불용성 획분의 분리 침강 속도를 측정함과 아울러, 5,000G에서 10분간 원심분리해서 얻어진 가용성 획분과 불용성 획분을 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동으로 분석하여 7S 글로불린과 11S 글로불린의 존재비를 구하였다.
표 1에 불용성 획분의 분리 침강 속도, 표 2에 가용성 획분과 불용성 획분의 7S 글로불린과 11S 글로불린의 존재비를 나타낸다.
(표 1) 불용성 획분의 분리 침강 속도
| 가온 처리 있음 가온 처리 없음 |
| 분리 침강 속도(㎛/초) 146 57 |
(표 2) 7S 글로불린과 11S 글로불린의 존재비(7S:11S)
| 가용성 획분 불용성 획분 |
| 가온 처리 있음 98:2 15:85 가온 처리 없음 98:2 13:87 |
실시예 1 및 비교예 1의 결과로부터, 커드 슬러리를 산성 하에서 가온 처리함으로써, 고순도의 7S 글로불린을 함유하는 가용성 획분과 고순도의 11S 글로불린을 함유하는 불용성 획분의 분리가 한층 용이해지는 것이 명확하다.
<실시예 2>
실시예 1과 마찬가지로 조제한 5％ 커드 슬러리의 이온 강도를 염화 나트륨을 사용해서 0.14로 조정하고, pH 조정을 하지 않고(pH 약 4.5) 22℃에서 30분간 교반한 후, 50℃까지 승온, 그 후 즉시 22℃까지 냉각하였다. 이때, 승온 시작에서부터 22℃까지 냉각하는데 요한 시간은 15분간이었다. 냉각 후, 20％ 수산화 나트륨 용액을 사용해서 커드 슬러리의 pH를 5.5로 조정해서 15분간 교반하고, 실시예 1과 같은 방법으로 불용성 획분의 분리 침강 속도를 측정함과 아울러, 가용성 획분과 불용성 획분의 7S 글로불린과 11S 글로불린의 존재비를 구하였다.
표 3에 가용성 획분과 불용성 획분의 7S 글로불린과 11S 글로불린의 존재비, 표 4에 불용성 획분의 분리 침강 속도를 나타낸다.
<비교예 2>
실시예 1과 마찬가지로 조제한 5％ 커드 슬러리의 이온 강도를 조정하지 않고(이온 강도 0.013), 실시예 2와 마찬가지의 가온 처리(pH 조정 없음, 22℃에서 30분간 교반한 후, 50℃까지 승온, 그 후 즉시 22℃까지 냉각)를 하였다. 이어서, 20％ 수산화 나트륨 용액을 사용해서 커드 슬러리의 pH를 5.9로 조정(이온 강도가 낮을 경우는, 가용성 획분과 불용성 획분의 분리 pH를 높게 하지 않으면 7S 글로불린과 11S 글로불린의 존재비가 동일한 정도의 획분을 얻을 수 없다)하고 15분간 교반한 후에, 실시예 1과 같은 방법으로 불용성 획분의 분리 침강 속도를 측정함과 아울러, 가용성 획분과 불용성 획분의 7S 글로불린과 11S 글로불린의 존재비를 구하였다.
표 3에 가용성 획분과 불용성 획분의 7S 글로불린과 11S 글로불린의 존재비, 표 4에 불용성 획분의 분리 침강 속도를 나타낸다.
(표 3) 7S 글로불린과 11S 글로불린의 존재비(7S:11S)
| 이온 강도 분리 pH 가용성 획분 불용성 획분 |
| 0.14 5.5 84:16 18:82 0.013 5.9 82:18 15:85 |
(표 4) 불용성 획분의 분리 침강 속도
| 이온 강도 0.14 0.013 |
| 분리 침강 속도(㎛/초) 204 48 |
실시예 2 및 비교예 2의 결과로부터, 이온 강도를 높게 하고, 또한 분리 pH를 낮게 함으로써, 7S 글로불린을 함유하는 가용성 획분과 11S 글로불린을 함유하는 불용성 획분의 분리가 한층 용이해지는 것이 명확하다.
이상까지의 실시예 및 비교예의 결과로부터, 대두 단백질을 함유하는 용액의 산성 하에서의 가온 처리와 이온 강도의 조정의 조합에 의해, 7S 글로불린을 함유하는 가용성 획분과 11S 글로불린을 함유하는 불용성 획분의 분리가 산성 하의 가온 처리뿐이거나, 혹은 이온 강도의 조정뿐인 경우보다도 한층 용이해지는 것이 명확하다.
<실시예 3>
실시예 1과 마찬가지로 탈지한 저변성 탈지 대두 1 중량부에 10 중량부의 22℃의 추출수(이온 교환수)를 가하고(이하, "탈지 대두 슬러리"라 부른다), 염화 나트륨을 사용해서 이온 강도가 0.17이 되도록 조정하고, pH 조정 없이 22℃에서 30분간 프로펠러 교반하였다. 이어서 35％ 염산을 사용해서 pH 5.3으로 조정하고, 50℃까지 승온해서 10분간 프로펠러 교반한 후 즉시 22℃까지 냉각하였다. 이때, 50℃까지 승온하는데 10분간, 22℃까지 냉각하는데 5분간을 각각 요하였다. 냉각한 후에 35％ 염산을 사용해서 pH 4.8로 조정하고, 22℃에서 다시 10분간 교반한 후, 실시예 1과 마찬가지로 불용성 획분의 분리 침강 속도를 측정함과 아울러, 5,000G에서 5분간 원심분리해서 얻어진 가용성 획분에 대해서는 실시예 1과 마찬가지로 7S 글로불린과 11S 글로불린의 존재비를 구하였다.
한편, 불용성 획분은 물을 가하고(탈지 대두의 7배 중량), 호모 믹서를 사용해서 22℃에서 교반, 20％ 수산화 나트륨 용액으로 pH를 7.2로 유지하면서 30분간 추출한 후, 5,000G에서 5분간 원심분리해서 얻어진 가용성 획분을 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동으로 분석하여 7S 글로불린과 11S 글로불린의 존재비를 구하였다.
표 5에 가용성 획분과 불용성 획분의 7S 글로불린과 11S 글로불린의 존재비, 표 6에 불용성 획분의 분리 침강 속도를 나타낸다.
<비교예 3>
실시예 3과 마찬가지로 조제한 탈지 대두 슬러리를, 염화 나트륨을 사용해서 이온 강도가 0.17이 되도록 조정하고, 22℃에서 30분간 교반, 이어서, 35％ 염산을 사용해서 탈지 대두 슬러리의 pH를 5.3으로 조정하고, 22℃에서 25분간 교반하였다. 그 후, 20％ 수산화 나트륨 용액을 사용해서 pH 4.8로 조정하고, 22℃에서 10분간 교반한 후, 실시예 1과 같은 방법으로 불용성 획분의 분리 침강 속도를 측정함과 아울러, 가용성 획분과 불용성 획분의 7S 글로불린과 11S 글로불린의 존재비 를 구하였다.
표 5에 가용성 획분과 불용성 획분의 7S 글로불린과 11S 글로불린의 존재비, 표 6에 불용성 획분의 분리 침강 속도를 나타낸다.
(표 5) 7S 글로불린과 11S 글로불린의 존재비(7S:11S)
| 가용성 획분 불용성 획분 |
| 가온 처리 있음 92:8 9:91 가온 처리 없음 91:9 10:90 |
(표 6) 불용성 획분의 분리 침강 속도
| 가온 처리 있음 가온 처리 없음 |
| 분리 침강 속도(㎛/초) 395 84 |
실시예 3 및 비교예 3의 결과로부터, 탈지 대두 슬러리를 사용할 경우도 산성 하의 가온 처리와 이온 강도의 조정에 의해 가용성 획분과 불용성 획분의 분리가 용이해지는 것이 명확하다.
<실시예 4>
실시예 1과 마찬가지로 조제한 5％ 커드 슬러리의 이온 강도를, 염화 나트륨을 사용해서 0.17로 조정하고, 실시예 3과 마찬가지의 가온 처리(pH 조정 없음에서 22℃, 30분간 프로펠러 교반. 이어서, pH 5.3으로 조정하고, 50℃까지 승온해서 10분간 프로펠러 교반한 후, 즉시 22℃까지 냉각)를 한 후, 20％ 수산화 나트륨 용액을 사용해서 pH 5.4로 조정하고(이온 강도가 동일한 탈지 대두 슬러리와 커드 슬러리의 경우, 7S 글로불린과 11S 글로불린의 존재비가 동일한 정도의 획분을 얻기 위해서는 커드 슬러리의 분리 pH를 탈지 대두 슬러리의 분리 pH보다 높게 설정할 필요가 있음), 22℃에서 다시 10분간 교반을 하였다. 그 후, 실시예 1과 마찬가지로 불용성 획분의 분리 침강 속도를 측정함과 아울러, 가용성 획분과 불용성 획분을 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동으로 분석하여 7S 글로불린과 11S 글로불린의 존재비를 구하였다.
표 7에 가용성 획분과 불용성 획분의 7S 글로불린과 11S 글로불린의 존재비, 표 8에 불용성 획분의 분리 침강 속도를 나타낸다.
(표 7) 7S 글로불린과 11S 글로불린의 존재비(7S:11S)
| 가용성 획분 불용성 획분 |
| 커드 슬러리 93:7 9:91 |
(표 8) 불용성 획분의 분리 침강 속도
| 커드 슬러리 |
| 분리 침강 속도(㎛/초) 156 |
실시예 3 및 실시예 4의 결과로부터, 대두 단백질을 함유하는 용액에는 탈지 대두 슬러리를 사용한 쪽이 불용성 획분의 분리 침강이 빠르고, 분리가 용이해지는 것이 명확하다.
<실시예 5>
실시예 1과 마찬가지로 조제한 5％ 커드 슬러리의 이온 강도를, 염화 나트륨을 사용해서 0.14로 조정하고, pH 조정을 하지 않고(pH 약 4.5) 22℃에서 30분간 교반한 후, 50℃까지 승온하였다. 이때, 승온에 요한 시간은 10분간이었다. 50℃에 도달한 후, 20％ 수산화 나트륨 용액을 사용해서 pH를 5.3으로 조정하고, 다시 20분간 가온 처리한 후, 22℃까지 냉각하였다. 이때, 냉각에 요한 시간은 5분간이었다. 냉각 후, 5,000G에서 10분간 원심분리해서 가용성 획분과 불용성 획분을 얻었다.
얻어진 가용성 획분은, 35％ 염산을 사용해서 pH 4.5로 조정하고, 3,000G에서 10분간 원심분리해서 침전 획분을 얻었다. 이어서, 침전 획분에 물을 가하고, 20％ 수산화 나트륨 용액을 사용해서 중화한 후, 동결 건조해서 7S 글로불린이 풍부한 획분을 얻었다.
한편, 5,000G에서 10분간 원심분리해서 얻어진 불용성 획분은, 5배 중량의 이온 교환수를 첨가하여 22℃에서 프로펠러 교반하고, 20％ 수산화 나트륨 용액으로 pH 6.8로 유지하면서 30분간 추출하였다. 이어서, 5,000G에서 10분간 원심분리하고, 얻어진 상청 획분의 pH를 35％ 염산을 사용해서 pH 4.5로 조정하고, 3,000G에서 10분간 원심분리해서 침전 획분을 얻었다. 이어서, 침전 획분에 물을 가하고, 20％ 수산화 나트륨 용액을 사용해서 중화한 후, 동결 건조해서 11S 글로불린이 풍부한 획분을 얻었다.
얻어진 각 획분의 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동에 의한 7S:11S의 존재비, 7S 글로불린이 풍부한 획분의 7S 글로불린 순도(SPE 기준)와 11S 글로불린이 풍부한 획분의 11S 글로불린 순도(SPE 기준), 클로로포름·메탄올 유분(油分), 7S 글로불린 보정 순도, 11S 글로불린 보정 순도, 및 두가지 획분의 피트산 함량을 표 9에 나타낸다. 또한, 표 10에 실시예 1과 마찬가지로 측정한 불용성 획분의 분리 침강 속도를 나타낸다.
(표 9) 각 획분의 조성 단위：％
| 가용성 획분 불용성 획분 |
| 7S:11S 96:4 13:87 순도(SPE 기준) 93.0 82.9 조단백질(건조 중량당) 95.7 94.2 클로로포름·메탄올 유분(건조 중량당) 0.65 1.30 보정 순도 87.0 72.1 피트산(건조 중량당) 2.1 2.0 |
(표 10) 불용성 획분의 분리 침강 속도
| 피타아제 처리 없음 |
| 분리 침강 속도(㎛/초 ) 182 |
이상의 결과로부터, 본 발명의 방법에 의해 클로로포름·메탄올 유분(油分)이 적은, 즉 지질 회합 단백질 함량이 적은 고순도의 7S 글로불린 및 11S 글로불린 획분을 용이하게 얻을 수 있는 것이 명확하다.
또한, 가온 처리 후 홀드하지 않고 즉시 냉각한 실시예 1과, 가온 처리 후 20분간 홀드한 실시예 5의 결과로부터 가온 처리 후에 홀드함으로써 분리 침강 속도가 향상하는 것을 알 수 있다.
<실시예 6>
실시예 1과 마찬가지로 조제한 5％ 커드 슬러리의 이온 강도를, 염화 나트륨을 사용해서 0.14로 조정하고, pH 조정을 하지 않고(pH 약 4.5) 22℃에서 30분간 교반한 후, 50℃까지 승온하였다. 이때, 승온에 요한 시간은 10분간이었다. 50℃에 도달한 후, 20％ 수산화 나트륨 용액을 사용해서 pH를 5.3으로 조정하고, 대(對)탈지 대두 0.2 중량％의 피타아제(新日本化學제 「스미치무 PHY」)를 첨가하고 다시 20분간 프로펠러 교반하였다. 그 후, 22℃까지 냉각하였다. 이때, 냉각에 요한 시간은 5분간이었다. 냉각 후, 5,000G에서 10분간 원심분리해서 가용성 획분과 불용성 획분을 얻었다. 얻어진 가용성 획분은, 35％ 염산을 사용해서 pH 4.5로 조정하고, 3,000G에서 10분간 원심분리해서 침전 획분을 얻었다. 이어서, 침전 획분에 물을 가하고, 20％ 수산화 나트륨 용액을 사용해서 중화한 후, 동결 건조해서 7S 글로불린이 풍부한 획분을 얻었다.
한편, 5,000G에서 10분간 원심분리해서 얻어진 불용성 획분은, 5배 중량의 이온 교환수를 첨가하여 22℃에서 프로펠러 교반하고, 20％ 수산화 나트륨 용액으로 pH 6.8로 유지하면서 30분간 추출하였다. 이어서, 5,000G에서 10분간 원심분리하고, 얻어진 상청(上淸) 획분의 pH를 35％ 염산을 사용해서 pH 4.5로 조정하고, 3,000G에서 10분간 원심분리해서 침전 획분을 얻었다. 이어서, 침전 획분에 물을 가하고, 20％ 수산화 나트륨 용액을 사용해서 중화한 후, 동결 건조해서 11S 글로불린이 풍부한 획분을 얻었다.
얻어진 각 획분의 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동에 의한 7S:11S의 존재비, 7S 글로불린이 풍부한 획분의 7S 글로불린 순도(SPE 기준)와 11S 글로불린이 풍부한 획분의 11S 글로불린 순도(SPE 기준), 클로로포름·메탄올 유분(油分), 7S 글로불린 보정 순도, 11S 글로불린 보정 순도, 및 피트산 함량을 표 11에 나타낸다. 또한, 표 12에 실시예 1과 마찬가지로 측정한 불용성 획분의 분리 침강 속도를 나타낸다.
(표 11) 각 획분의 조성 단위：％
| 가용성 획분 불용성 획분 |
| 7S:11S 97:3 14:86 순도(SPE 기준) 94.0 81.9 조단백질(건조 중량당) 96.2 92.4 클로로포름·메탄올 유분(건조 중량당) 0.61 1.24 보정 순도 88.3 71.7 피트산(건조 중량당) 0.05 0.12 |
(표 12) 불용성 획분의 분리 침강 속도
| 피타아제 처리 없음 |
| 분리 침강 속도(㎛/초 ) 248 |
실시예 5 및 실시예 6의 결과로부터, 피타아제에 의한 피트산의 분해를 병용함으로써 가용성 획분과 불용성 획분의 분리가 더 한층 용이해지고, 또한 저(低)피트산의 7S 글로불린이 풍부한 획분과 11S 글로불린이 풍부한 획분이 얻어지는 것이 명확하다.
이상 설명한 바와 같이, 본원 발명은 대두 단백질을 함유하는 용액의 이온 강도의 조정과 산성 하에서의 가온 처리를 조합함으로써, 7S 글로불린을 함유하는 가용성 획분과 11S 글로불린을 함유하는 불용성 획분을 공업적으로 간편하게 분획할 수 있다.
Claims (8)
- 대두 단백질을 함유하는 용액을 산성 하에서 가온 처리한 후, 이온 강도 0.02 이상, pH 4.5 이상 5.6 미만에서 가용성 획분과 불용성 획분으로 분획하는 것을 특징으로 하는 대두 단백질의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 대두 단백질을 함유하는 용액이 탈지 대두의 가수(加水) 슬러리, 상기 슬러리로부터 얻어지는 탈지 두유, 산침전 대두 단백질 슬러리, 또는 분리 대두 단백질 용액인 제조방법.
- 제1항에 있어서, 산성이 pH 3.8∼6.8인 제조방법.
- 제1항에 있어서, 가온 처리가 30∼75℃인 제조방법.
- 제1항에 있어서, 제1항에 기재된 분획방법에 의해 얻어지는 가용성 획분으로부터 7S 글로불린/(11S 글로불린+7S 글로불린)의 비가 0.5 이상이고, 고형분 중의 클로로포름:메탄올=2:1 용매로써 추출되는 극성 지질 함량이 1 중량％ 이하인 7S 글로불린 단백질을 분취(分取)하는 제조방법.
- 고형분 중의 피트산 함량이 1.2 중량％ 이하인, 제5항에 기재된 방법으로 얻 어진 7S 글로불린 단백질.
- 제1항에 있어서, 제1항에 기재된 분획방법에 의해 얻어지는 불용성 획분으로부터 11S 글로불린/(11S 글로불린+7S 글로불린)의 비가 0.7 이상이고, 고형분 중의 클로로포름:메탄올=2:1 용매로써 추출되는 극성 지질 함량이 2 중량％ 이하인 11S 글로불린 단백질을 분취하는 제조방법.
- 고형분 중의 피트산 함량이 1.2 중량％ 이하인, 제7항에 기재된 방법으로 얻어진 11S 글로불린 단백질.
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