JP3973244B2

JP3973244B2 - 医薬の製造のためのベンゾジアゼピン型活性を有するデカペプチドの使用

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Publication number: JP3973244B2
Application number: JP31317695A
Authority: JP
Inventors: ミクロローラン; ペリンエマニュエル; ドロウアラン; ブディエジャン−フランソワ; イングカトリーヌ; リンデンギィ
Original assignee: アングレディア
Priority date: 1994-11-30
Filing date: 1995-11-30
Publication date: 2007-09-12
Anticipated expiration: 2015-11-30
Also published as: ATE178615T1; ES2135023T3; EP0714910B1; DK0714910T3; SI0714910T1; GR3030650T3; US5846939A; EP0714910A1; DE69508890T2; FR2727315A1; JPH08268903A; FR2727315B1; DE69508890D1

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は薬品と補助栄養食品の製造のための、α_s1カゼインに含まれるデカペプチドの使用に関する。
【０００２】
【発明の背景】
カゼイン全体は、例えばリバドー−ドュマ（Ｒｉｂａｄｅａｕ−Ｄｕｍａｓ）（１）によって深く研究されてきた牛乳蛋白の集合物である。カゼインはＤＥＡＥ−セルロースによるクロマトグラフィーでそれぞれがγカゼイン類，κカゼイン、βカゼイン、α_s1カゼイン、α_s2カゼインと名付けられた主な画分に分けられる。これらのカゼインのアミノ酸配列はよく知られている；特にα_s1カゼインの配列はマーサー（Ｍｅｒｘｉｅｒ）等（２）やナガノ等（３）によって決定されている。
これらの様々なカゼインのあるペプチド断片は様々な生物学的な活性や特に鎮痛や抗鎮痛活性を有することが既に知られている。このようにα_s1カゼインの９０−９６、９０−９５、９１−９６、および９１−９５のペプチドが鎮痛活性を持っている［ジオドロら（４）およびルーカスら（５）（Ｚｉｏｕｄｒｏｕｅｔａｌ．（４）ａｎｄＬｏｕｋａｓｅｔａｌ．（５）］。
本出願はα_s1カゼインやその断片の他のタイプの活性、特にベンゾジアゼピン型の活性を調べた。
“ベンゾジアゼピン型の活性”という言葉は特に抗痙攣剤や抗不安剤的な特性に用いられる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、特に痙攣と不安の治療のためのベンゾジアゼピン型活性を有する医薬組成物、および、ベンゾアゼピン型の活性を有する補助栄養食品、食品材料およびこれらの製造方法を提供しようとする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
すなわち本発明は、下記のアミノ酸配列（配列表の配列番号１）を持つデカペプチドを有効成分として含有するベンゾジアゼピン型活性を有する薬剤、
医薬品として許容される媒体と、活性成分として有効量の下記のアミノ酸配列（配列表の配列番号１）を持つデカペプチドとを含有する医薬組成物、
有効量の下記のアミノ酸配列（配列表の配列番号１）を持つデカペプチド、該デカペプチドを含むα_s1カゼインのトリプシン全加水分解物、および該デカペプチドを含む該加水分解物の画分からなる群から選ばれる少なくとも１つまたはこれと医薬品として許容される媒体とを含有する補助栄養食品、
有効量の下記のアミノ酸配列（配列表の配列番号１）を持つデカペプチド、該デカペプチドを含むα_s1カゼインのトリプシン全加水分解物、および該デカペプチドを含む該加水分解物の画分からなる群から選ばれる少なくとも１つを含有する特別な食事療法のための食品材料、
および、特に痙攣と不安の治療に効果的なベンゾジアゼピン型活性を有する薬剤を製造する際の下記のアミノ酸配列（配列表の配列番号１）を持つデカペプチドの使用に関する。

【０００５】
下記に定義されるデカペプチドと該ペプチドを含むトリプシン全加水分解物が優れた抗痙攣剤や抗不安剤的な特性を有する事がベンゾジアゼピンのレセプターのインビトロでのテストとインビボでのラットの行動テストで見いだされた。
このように本発明は特に痙攣と不安の治療のための、下記のアミノ酸配列を有するデカペプチドを有効成分とするベンゾジアゼピン型活性を有する医薬組成物、および、痙攣と不安の治療のためのベンゾアゼピン型の活性を有する医薬の製造における下記のアミノ酸配列（配列表の配列番号１）を有するデカペプチドの使用を提示する。

【０００６】
本発明は医薬品として許容される媒体と、活性成分として有効量の上記のアミノ酸配列を持つデカペプチドとを含有する医薬組成物を提示する。
本発明はまた上記デカペプチドを含有する補助栄養食品、あるいは上記デカペプチドを含むα_s1カゼインのトリプシン全加水分解物、あるいは活性成分として上記デカペプチドを含む上記加水分解物の画分またはこれらを含有する補助栄養食品に関する。これらの補助栄養食品は特に痙攣や不安の疾病患者のための食品に添加するのに適している。
【０００７】
分子量１２６７ダルトンの下記のアミノ酸配列を有する前記デカペプチドはα_s1カゼインの９１−１００のペプチドに相当する。

このデカペプチドはα_s1カゼインの酵素加水分解物、好ましくは特にトリプシンを用いた酵素による加水分解によりα_s1カゼインから得られる。続いて、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、陰イオン交換高性能液体クロマトグラフィーあるいは１８００ダルトンの閾値を持つゲル濾過クロマトグラフィー、あるいは膜上での遠心や他の膜分離技術（微小濾過（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ），限外濾過等）で濃縮され単離される。
前記デカペプチドはまた例えばメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）（６）により記述されているような当業者にはよく知られている方法を使ったペプチド合成で得られうる。
カゼイン全体はよく知られている方法を応用して酸による沈殿とアルカリを使った中和によって牛乳から得られる。例えばニックマン（Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ）ら（７）の方法を用いることができる。
【０００８】
本発明において、全トリプシン加水分解物とデカペプチドを得るための出発物質として使われる前記α_s1カゼインは当業者によく知られている通常の方法をによって、牛乳、全カゼイン類、カゼイン酸類、全牛乳蛋白類濃縮物から得られる、例えばサムソン（Ｔｈｏｍｓｏｎ）（８）やモーボワ（Ｍａｕｂｏｉｓ）（９）によって記述されている方法を用いて得られる。
【０００９】
例えば、サノゴ（Ｓａｎｏｇｏ）ら（１０）によって記述された方法を実施することによってα_s1カゼインを調製することができる。上記方法は溶離剤としての塩化カルシウムの不連続濃度勾配を用いたＤＥＡＥ−セルロースで分画する方法である。該方法は全てのカゼイン類を速やかに分画することができるという利点がある。該方法は、最初の使用に先立って酸塩基による前処理が不要な予め膨潤させた樹脂であるＤＥＡＥ−セルロースＤＥ５２［プリングフィールド、英国のワットマンリミテッド（ＷｈａｔｍａｎＬｔｄ．）によって販売されている］を陰イオン交換保持体として使って、有利に実施される。他の型のＤＥＡＥ−セルロース樹脂を使うことによって、得られるα_s1カゼインの純度と収量を向上させつつ、たった二段階でα_s1カゼイン以外の全てのカゼインを除去することができる。これには、例えば、予め膨潤させてある樹脂の代わりに乾燥した樹脂、例えばＤＥＡＥ−セルロースＤＥ２３［上記のワットマンによって販売されている］、を使うことが可能である。乾燥した樹脂を使って最大充填量を得るのに必要な前処理を省略すると、該樹脂の充填効果は制限られ、それゆえ樹脂上への基質の吸着量は限られる。
【００１０】
本発明で定義されるデカペプチドを用いて製造される痙攣や不安の治療に効果的な医薬は様々な方法で投与されてよく、例えば経口や非経口で投与される。
例えば経口投与には本発明の医薬組成物は錠剤、カプセル、粉末、顆粒状の形態やあるいは経口投与に適していれば他のいかなる形態でもよい。
本発明の医薬組成物はまた経口の製剤に普通に使われる適用可能な医薬用媒体を含有してもよい。
非経口投与には、生理食塩水や適合可能な分散剤を含んでもよい注射可能な溶液を用いることが可能である。
前述した条件下でα_s1カゼインにトリプシンを反応させて得られる全トリプシン加水分解物は５〜６重量％の前述の９１−１００のペプチドが含まれている。
該加水分解物は蛋白又は糖質の食品媒体や特別な食事療法の為の食材中の他の物質と組み合わせた補助栄養素食品中で活性成分として用いてもよい。
【００１１】
【実施例】
以下に、本発明を実施例および比較例を挙げて具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの具体例に限定されない。
【００１２】
実施例１：α _s1 カゼインからの９１−１００のペプチド（（ｆ９１−１００）−ＣＮα _s1 ペプチド）の調製
Ａ−α _s1 カゼインの調製
５ｇのカゼイン酸ナトリウムをｐＨ６．６で尿素３．３Ｍ、ＥＤＴＡ３５ｍＭ、２−メルカプトエタノール０．１％を含有する２０ｍＭの酢酸緩衝液１００ｍｌに溶解して、それから上記と同じ緩衝液で平衡化したＤＥ２３ＤＥＡＥ−セルロースを加え、その混合液を２５℃で約１５分間攪拌した。該混合液をブフナー漏斗を通して濾過し、その残渣は酢酸−尿素−ＥＤＴＡ緩衝液２５０ｍｌで２回溶出された。１回目の濾過でγ、κおよびβカゼインを含む画分ＦＩが除去された。その後塩化カルシウム３５ｍＭ含有する酢酸−尿素緩衝液が２５０ｍｌ加えられ、上記操作が繰り返され、α_s2カゼインを含む第二の画分ＦＩＩが除去された。上記の抽出は７０ｍＭの塩化カルシウムを含む酢酸−尿素緩衝液を使って繰り返され、α_s1カゼインを含む第三の画分が単離された。
上記処方の最後に、樹脂は最初の緩衝液で洗浄され、０．２％のアジ化ナトリウムを含有する前記の溶液中で＋４℃で保存された。この方法で保存することにより、再生せずに直接他の抽出に本樹脂を再利用することができる。
【００１３】
超純水で透析し、凍結乾燥した後、分画度を見るために濾液ＦＩ、ＦＩＩ、ＦＩＩＩをポリアクリルアミド−尿素ゲル電気泳動にかけた。
塩化カルシウムがなくても、γ、κおよびβカゼインは溶出した（ＦＩ）。α_s2カゼインは塩化カルシウムが３５ｍＭの濃度のところで放出された。７０ｍＭの塩化カルシウム濃度のところで溶出した第三画分（ＦＩＩＩ）はα_s1およびα_s0カゼインを含んでいた。後者（α_s0カゼイン）はα_s1カゼインのマイナー（少量の）形態（ｍｉｎｏｒｆｏｒｍ）にすぎず、メジャー（主たる）形態（ｍａｊｏｒｆｏｒｍ）とは４１位に付加的なリン酸基があることが異なっている。
この方法で得られたα_s1カゼインの純度は９６％より高かった。これ以上の精製段階を必要とせずにこのα_s1カゼインは本方法の後半で使用できた。
【００１４】
Ｂ−α _s1 カゼインのトリプシン加水分解物の調製
ｐＨ８．５、３７℃のアンモニア／蟻酸緩衝液（５７ｍＭ／４３ｍＭ）２５ｍｌ中の０．２％（ｗ／ｖ）の濃度のα_s1カゼインのトリプシン加水分解は、アガロースビーズに固定され（１ｍｌのビーズあたり８０ユニット）Ｎ−トシルＬ−フェニルアラニンクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）で処理された牛膵臓のトリプシンを酵素として使って行われた。酵素濃度はＮα−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンのエチルエステル８．５ユニットと等しくなるよう選ばれ、加水分解時間は１時間と等しくなるよう選ばれ、次いで、＋４℃５分間１８００ｇで遠心された。その後並行して２つの加水分解操作を行うために２つの酵素分画（ｔｗｏｅｎｚｙｍｅａｌｉｑｕｏｔｓ）を用いた。加水分解後の上清は不溶性の酵素を取り除くために遠心し再度一緒に混合された。時々水洗を行いながらエバポレイションを９回行った。こうして最後のエバポレーションをおえて、加水分解物は塩の大部分が取り除かれ最少量の水に溶かされ凍結乾燥され−３０℃で保存された。
【００１５】
Ｃ−アセトニトリルの勾配下、および、無勾配条件下での逆相ＨＰＬＣ分画
ステップＢでえられたカゼイン加水分解物には２段階の精製が行われた。
Ｃ₁−Ｃ₁₈カラムでの精製
精製の第一段階は７０分間でアセトニトリル５％から４０％に至る水系でのアセトニトリルの勾配（トリフルオロ酢酸あるいはＴＦＡ０．１％の存在下で）を用いた２５０ｍｍ×４ｍｍ、１００Å、５μｍのＣ₁₈カラム（ダームストッド（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）、ドイツのメルク）での逆相ＨＰＬＣによるα_s1カゼインのトリプシン加水分解物の分画であった。
ピークは６１分あたり（およそ３２％ｖ／ｖアセトニトリル）で溶出し、他のものも混ざっている状態で（ｆ９１−１００）−ＣＮα_s1ペプチドが集められた。凍結乾燥に先立って、アセトニトリルとＴＦＡが減圧下でとばされた。
【００１６】
Ｃ₂−Ｃ₄カラムによる精製
先に集められたピークは、水系の０．１％ＴＦＡ存在下でアセトニトリル２５％ｖ／ｖの無勾配（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）条件下で１５０ｍｍ×３．９ｍｍ、３００Å、５μｍのデルタパック（ＤｅｌｔａＰａｋ）Ｃ₄カラム（ミッドフォード（Ｍｉｄｆｏｒｄ）、英国のウォータース（Ｗａｔｅｒｓ））を使った逆相ＨＰＬＣで精製された。（ｆ９１−１００）−ＣＮα_s1ペプチドは約１０分で溶出した。該ペプチドは集められて、凍結乾燥された。凍結乾燥物は水に溶かされ、再度凍結乾燥された。
上記ペプチドの性質は高速原子衝撃（ＦＡＢ）や電子衝撃質量分析（測定された分子量は１２６７．１ダルトン）によってや、ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）ら（１１）のニンヒドリン法を用いて決定された該アミノ酸組成によって確認された。
Ｃ₁₈とＣ₄カラムからの溶出の概略はそれぞれ図１と２で示されており、２８０ｎｍでの吸収が縦軸に従ってプロットされており、溶出時間が横軸に沿っている。
【００１７】
実施例２：他の方法による（ｆ９１−１００）−ＣＮα _s1 ペプチドの濃度が高い画分の取得
Ａ−膜遠心によるα _s1 カゼインのトリプシン加水分解物の分画
カゼインのトリプシン加水分解物を手早くプレ精製するために、２０００ダルトンの平均カットオフ閾値をもつ（アミコンＹＭ１）膜上での遠心によって粗い分画が行われた。
実施例１（ステップＢ）で得られた生産物２ｍｇは１ｍｌの超純水に溶かされ、ＭＰＳ−１型アミコン微量分画システムで処理された。遠心時間は４０分か６０分で加速場は３９００ｇであった。
遠心時間の最後で、２つの微量分画システムが遠心分離機から取り除かれ、透過液と残渣がマイクロチューブに保存された。次いで種々のマイクロチューブの内容物は凍結乾燥された。
（ｆ９１−１００）−ＣＮα_s1ペプチドは分子量が小さいので膜を通り抜けてしまい、透過液中で見つかった。
【００１８】
Ｂ−陰イオン交換高性能液体クロマトグラフィー（モノＱ、ＨＲ５／５）によるα _s1 カゼインのトリプシン加水分解物の分画
ＦＰＬＣクロマトグラフィーシステム（アップサラ、スウェーデンのファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を使うことにより、ペプチドをずっと細かく分画することが可能になったが、準調製段階（α_s1カゼインの加水分解物を１ｍｇから２ｍｇの充填）においてであった。
実施例１（ステップＢ）で得られた加水分解物は４５分間でＡ中でのＢの０％から３０％への勾配、次いで３０分間でＡ中でのＢの３０％から１００％への勾配をかけることによって分画された（Ａ：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２０ｍＭ，ｐＨ８．０；Ｂ：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２０ｍＭ，塩化ナトリウム３５０ｍＭでｐＨ８．０）。分子量が小さく電荷を持ったアミノ酸の数が少ない（ｆ９１−１００）−ＣＮα_s1ペプチドは空隙容量（ｄｅａｄｖｏｌｕｍｅ）に相当する画分で溶出してきた。
【００１９】
Ｃ−閾値１８００ダルトンのゲル濾過クロマトグラフィーによるα _s1 カゼインのトリプシン加水分解物の分画
５〜１０ｍｇの加水分解物がバイオゲルＰ２ゲル（アップサラ、スウェーデンのファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））（直径１ｃｍ、高さ４０ｃｍ）にかけられた。溶出は大気圧下で流速５ｍｌ／ｈ〜１０ｍｌ／ｈで超純水を用いて行われた。
こうして２つの画分（Ｆ１とＦ２）が得られた。Ｆ１画分はゲルを素通りしたペプチド類（分子量が１８００ダルトンより大きい）を含んでいて、Ｆ２はゲルによって濾過されたペプチド類を含んでいた（（ｆ９１−１００）−ＣＮα_s1ペプチドを含んでいる）。
【００２０】
薬理学試験
Ａ−ベンゾジアゼピンレセプターへのインビトロでの試験
実験はデュポンドゥネモワー（ＤｕｐｏｎｔｄｅＮｅｍｏｕｒｓ）（ネンクエストＴＭ（ＮＥＮＱＵＥＳＵＴＴＭ）、薬物発見システムＮＥＤ−００２）によって販売されているキットを使って行われた。上記方法は中枢神経系のベンゾジアゼピンレセプターの放射性リガンドとテストされる分子の間での競合に基づいている。もし上記分子がレセプターに対して親和性を持っていたら、その分子がレセプターに固定された放射性を有するリガンドと置き換わる。このようなリガンドの置換はテストされる分子の加えられた濃度の関数であるので該分子のＩＣ５０、すなわち最大の効果の５０％を得ることを可能にする薬理学的な濃度、を決定することができる。
【００２１】
使用されるリガンドは³Ｈ−メチル−フルニトラゼパム（³Ｈ−ｍｅｔｈｙｌ−ｆｌｕｎｉｔｒａｚｅｐａｍ）、つまりレセプターに対する高い特異性（Ｋｉ＝１．２ｎＭ）と低い非特異的吸着性を有するベンゾジアゼピンである。ベンゾジアゼピン（ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ）の中枢神経系の市販されている膜調製品はテストされるサンプルの濃度を上昇させつつ、放射性リガンドの濃度は一定にして保温した（ｉｎｃｕｂａｔｅ）。保温は＋４℃で１時間続けた。温度は故意に低く設定してレセプターと放射性リガンドの会合／解離を制限した。フルニトラゼパム（ｆｌｕｎｉｔｒａｚｅｐａｍ）が半分会合する時間は、０℃で８３４秒で、３５℃で１２秒である（スピース（Ｓｐｅｔｈ）ら（１２））。１時間後に混合物はワットマンＧＦ／Ｂフィルターを通過した。このフィルターは膜と、その上に固定されたリガンド（ベンゾジアゼピン、α_s1カゼインのトリプシン加水分解物のペプチド断片）を保持する。洗浄後、フィルターは閃光液がはいっているシンチレーションカウンターフラスコに入れられた。β線の放射が液体シンチレーションカウンターで計測された。
もしトリチウムでラベルされたリガンドがテストされる分子で置き換えられたら、フィルターに存在する放射能レベルの低下が観察される。
トリチウムでラベルされたリガンドとレセプターの間の非特異的な結合が原因の放射能を取り除くために、テストは膜を保温しながら行われ、トリチウムでラベルされたリガンドはＩＣ５０が測定された分子に対するテストで使われたのと同じ濃度にし、ラベルされていないフルニトラゼパムは５００倍以上の高い濃度にした。全ての部位はラベルしていないフルニトラゼパムで占めらたと考えられるから、残った放射能は非特異的吸着のみによった。
【００２２】
Ｂ値は膜とラベルされたフルニトラゼパムだけ（最大放射能）を使って行われたテストと比較するテストで分子のそれぞれの濃度に対してレセプターに固定された放射能のパーセンテージと等しく定義されうる。テストで加えられた分子の濃度の１０を底とした対数の関数としてＢ／（１００−Ｂ）の１０を底とした対数をプロットすることによって分子のＩＣ５０を決定することが可能である。
ＩＣ５０の値が低いほど、レセプターに対する分子の親和性は高い。α_s1カゼインの未精製の全トリプシン加水分解物に対して、中枢神経系のベンゾジアゼピンンレセプターに関するＩＣ５０の最高値は７８μＭの値まで測定された。
実施例１のステップＣに記載した方法で精製された（ｆ９１−１００）−ＣＮα_s1ペプチドに対して、ＩＣ５０はおよそ８８μＭである。
【００２３】
これらのテストはメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）（６）に従ったペプチド合成によって得られたデカペプチドを用いても実施された。合成されたペプチドのＩＣ５０は天然物由来のデカペプチドの８８μＭと比較して、３７０μＭであることが分かった。
実施例２に記載した方法を適用した場合（ｆ９１−１００）−ＣＮα_s1ペプチドの濃度が高い画分にも活性が見つかった。
【００２４】
Ｂ−ウィスター（ＷＩＳＴＡＲ）ラットにおけるインビボでの試験
Ｂ１−抗痙攣活性
ペンチレンテトラゾールはギャバＡレセプターの塩素チャンネルに作用する分子である。この型のチャンネルを遮断することによって、てんかんの発作に似た症状がおこる。抗てんかん型の分子はペンチレンテトラゾールによってひきおこされるチャンネルの処断を減らすことにより発作に対抗する。
該試験は暗黒時間帯にラットの飼育部屋で行われた。投与されたα_s1カゼインのトリプシン加水分解物（Ｄ１）の量はラットの体重に対して３ｍｇ／ｋｇであった。用いられた投与方法は腹膜内への投与であった。全トリプシン加水分解物は２５％ジメチルイソソルビドエーテル水溶液に溶かされた；この混合物には両親媒性であるという利点がある。ジメチルイソソルビドエーテルは水と混和でき、強度の疎水性の分子を溶かすことが出来るという利点がある。
【００２５】
３つの変数がてんかんの発作の重要性を表すために研究された：
発作の激しさをラシーネ（Ｒａｃｉｎｅ）のスケール（１３）を使って評価した。
段階０：視覚的に確認できる行動上の応答なし。
段階１：該動物が静止することが多くなる。
段階２：頭を揺らす、および／または顎は間代（ｃｌｏｎｉｃ）性の動きをする。
段階３：段階２の状態に加えて後ろ足で立つ。
段階４：段階３の状態に加えて前足が間代性の動きをする。
段階５：完全な発作が始まる。後ろ足で立ち、前足と顔に間代が起こり、バランスを失う。
潜伏時間はペンチレンテトラゾールを投与してから発作の最初の症状が現れるまでの秒数である。
継続時間は最初の発作の症状が現れてから最後の発作の症状までの間の秒数である。
【００２６】
全トリプシン加水分解物によって得られた結果は図３、４および５に示したが、それぞれ以下のとおりである。
激しさ（図３）
潜伏時間（図４）
継続時間（図５）
激しさに関しては、実施されたコントロール（Ｃ１およびＣ２）は比較的一致し、トリプシン加水分解物を使って行われた観察の正当性を証明した。トリプシン加水分解物（３ｍｇ／ｋｇ）を服用することによって、発作の激しさが著しく減少したことが観察された。平均は３．５３±０．４０から２．１３±０．４７に移行した。加水分解物を与えたテストに先立って対照としてコントロールを用いて、ウィルコクソン（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）テストを使って統計的な分析を行うことにより、発作が減少（４０％減少）する方向へＺ＝２．６９（ｐ＜０．０１）であるという顕著な傾向があることが分かった。先のコントロールの段階（レベル）に戻すことによって、加水分解物によるテストの後で行われたコントロールにより加水分解物による激しさの減少が観察されたのはは繰り返しや習慣化の現象のせいでないことが示された。
潜伏期間に関しては、３ｍｇ／ｋｇ服用することにより中央時（ｍｅｄｉａｎｔｉｍｅ）が先立って行われたコントロールにおける１１４秒から２７７秒に変わった。Ｚ＝２．１７（ｐ＜０．０４）で、これはペンチレンテトラゾールを投与してから発作が最初に現れるまでの時間が遅くなる顕著な傾向と一致する。
継続時間については、α_s1カゼインのトリプシン加水分解物を３ｍｇ／ｋｇ投与することが発作の継続時間を減少させたようであった；しかしながらこの減少（６２０±１３０秒から４０４±１２３秒）は顕著ではない（Ｚ＝１．１０）。ペンチレンテトラゾールは発作を弱めさせ、遅らせ、継続時間を短くしたようであるので、投与した物質は防御効果があった。該効果はベンゾジアゼピンのようなギャバ様の作用を潜在的に有している物質の効果に類似している。
【００２７】
Ｂ２−鎮静効果
ラットの不安を測定するために、ラットが新しいものを嫌うことに基づいたペロー（Ｐｅｌｌｏｗ）ら（１４）によって記述された高位の（ｅｌｅｖａｔｅｄ）プラス−迷路（ｐｌｕｓ−ｍａｚｅ）テストが使用された。このプラス−迷路には長さが５０ｃｍで幅が１０ｃｍの４つの分かれ道があった。２本の閉じた分かれ道は２５ｃｍの高さの壁（左側の天井が観察のために開いている）で囲まれており、迷路全体は地面から５０ｃｍの高さにあった。迷路の中央で２本の開いた道と２本の閉じた道が交差していた。薄暗い光の中では、ラットは不安が少ないほど開いた道を探索していく傾向が強く、これは自然下での行動とは一致しない。
【００２８】
ラットが開いた道に入った回数と閉じた道に入った回数とラットが道に入った全体の回数は重要な変数である。それぞれの道に入った状態で経過した時間も測定された。ラットが立ち上がった回数や、ラットが毛づくろいする（不安の兆候）回数や、あるいははじめに開いた道か閉じた道かいずれかの道に入るまでの時間等の他の変数（全２２個）も考慮された。
ラットは迷路の中央に置かれてから５分間観察された。ラットの全行動はビデオカメラに収められ、誤りを避けるためにその進行記録は使われた。
コントロール群として２０匹のラット（ＣＴＲ）、正のコントロール群（ＤＺＰ）として、２ｍｇ／ｋｇのジアゼパムを投与した２０匹のラットに基づいて、３ｍｇ／ｋｇのα_s1カゼインのトリプシン加水分解物を投与した２０匹のラットの群（ＨＴ）が観察された（服用量は痙攣実験により決められた）。
【００２９】
コントロール群（ＣＴＲ）は腹膜内に溶媒のみの投与を受けたが、該溶媒はゼラチンとマンニトール（０．５％／５％）の混合物を水に溶かしたものであった。前記混合物はジアゼパンを懸濁するのに使われたが、ジアゼパンは通常の注射用溶媒（水、塩化ナトリウム９‰、エタノール１０％）には溶けなかった。全ての群のラットはプラス−迷路に行く１時間半前に投与された。実験を始めるために、各ラットは迷路の中央に置かれた。
結果は処置の型ごとの関数として図６、７、および８に示される。；
○開いた道に入った割合（図６）；
○開いた道（ＢＯ）と閉じられた道（ＢＦ）に入った回数（図７）；および
○開いた道に留まった時間（図８）。
【００３０】
ジアゼパムで処置したラット（ＤＺＰ）で実験を行ったときは、道に入った回数の３２．１±５．９％が開いた道であったが、一方コントロールはたった１５．１±３．０％（ｐ＜０．０５）であった。α_s1カゼインのトリプシン加水分解物を投与されたラット（ＨＴ）では、道に入った回数の２９．３±５．３％が開いた道へ入った（ｐ＜０．０５）。ジアゼパン（３．０±０．４）と該加水分解物（２．４±０．４）（コントロール：１．５±０．３）の投与によって増加したのは開いた道に入った回数で、一方閉じられた道に入った回数はあまり変わらなかったことが分かるであろう。
ジアゼパムを投与されたラット（７０．１±１９．９秒；ｐ＜０．０２）はコントロール（１９．３±４．４秒）より長い時間開いた道にいた。α_s1カゼインのトリプシン加水分解物を投与されたラット（３１．１±１０．１秒）がコントロールと比較して開いた道にいた時間が増加したことは統計的な重要性はなかった。
【００３１】
それゆえ、このテストで、主たるパラメーターについてのみ検討すると、α_s1カゼインのトリプシン加水分解物はジアゼパムに匹敵する作用を有するが、効果はジアゼパムより小さいと結論付けられる；これは驚くには値しない、なぜなら未精製の加水分解物を使用したからである。
【００３２】
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【００４６】
【発明の効果】
本発明は、医薬と補助栄養食品の製造のためのベンゾジアゼピン型活性を有するデカペプチドの使用に関する。
本発明は食品蛋白である牛乳蛋白由来のカゼインから得られるものであるために、安全性が高く、医薬以外にも、補助栄養食品に添加して用いたり、食事療法用の食材の利用にも好適である。
【００４７】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】アセトニトリルの勾配を用いたＣ₈カラムからの溶出の概略を表したグラフである。
【図２】無勾配によるＣ₄カラムからの溶出の概略を表したグラフである。
【図３】トリプシン加水分解物を投与したラットの激しさを無投与のものと比較したグラフである。
【図４】トリプシン加水分解物を投与したラットの潜伏時間を無投与のものと比較したグラフである。
【図５】トリプシン加水分解物を投与したラットの継続時間を無投与のものと比較したグラフである。
【図６】処置型ごとの開いた道に入った回数のパーセンテージを表したグラフである。
【図７】処置型ごとの開いた道に入った回数と閉じた道に入った回数を表したグラフである。
【図８】処置型ごとの開いた道に留まった時間を表したグラフである。

Claims

下記のアミノ酸配列（配列表の配列番号１）を持つデカペプチド、または該デカペプチドを含むα_s1カゼインのトリプシン全加水分解物、または該デカペプチドを含む該加水分解物の画分、を有効成分として含有する中枢神経系ベンゾジアゼピン受容体に親和性を有する抗痙攣または抗不安薬：
Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu-Glu-Gln-Leu-Leu-Arg
1 5 10
医薬品として許容される媒体と；活性成分として有効量の下記のアミノ酸配列（配列表の配列番号１）を持つデカペプチド、または該デカペプチドを含むα_s1カゼインのトリプシン全加水分解物、または該デカペプチドを含む該加水分解物の画分とを含有する抗痙攣または抗不安医薬組成物：
Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu-Glu-Gln-Leu-Leu-Arg
1 5 10
抗痙攣または抗不安薬剤を製造するための下記のアミノ酸配列（配列表の配列番号１）を持つデカペプチド、または該デカペプチドを含むα_s1カゼインのトリプシン全加水分解物、または該デカペプチドを含む該加水分解物の画分、の使用。
Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu-Glu-Gln-Leu-Leu-Arg
1 5 10