CN104273521A - 一种基于糖基化酪蛋白的茶多酚纳米胶囊及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于糖基化酪蛋白的茶多酚(表没食子儿茶素没食子酸酯，EGCG)纳米胶囊，可抑制高浓度多酚导致的酪蛋白聚集与沉淀。本发明的步骤如下：将酪蛋白与葡聚糖干热处理后超滤去除游离的反应物制得糖基化酪蛋白，将其与EGCG物理混合，即得结合有EGCG的纳米胶囊。本发明制得的纳米胶囊对EGCG的包封率最高可达90％，平均粒径为70～140nn，贮藏10天后EGCG的保留率为60％～70％，贮存期间粒径变化较小，且在EGCG载量较高的情况下仍能维持体系的均一分散状态，无絮状沉淀生成。本发明显著提高了酪蛋白与EGCG的结合率，可作为EGCG等多酚类物质的纳米载体，广泛应用于食品、保健品等行业。
Description
技术领域
一种基于糖基化酪蛋白的茶多酚纳米胶囊及其制备方法，本发明属于功能性保健食品纳米胶囊技术领域。
背景技术
茶多酚，又名茶单宁、儿茶酸，属多酚类物质，是茶叶中所含有的一类多羟基酚类化合物的总称。茶多酚中最重要成分是黄烷醇类的多种儿茶素，其中没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是含量最高也是最为重要的一种组分，具有高效的抗氧化、抗菌、抗癌、抗辐射、提高机体免疫力等作用。然而由于EGCG分子结构中存在多个酚羟基，导致其易受光、氧、水分、重金属等作用而降解，且脂溶性较弱，稳定性差，并且在碱性溶液中活性大大降低，故在实际应用中常常受到限制。目前普遍采用微胶囊技术对活性物质进行包埋，不仅能有效避免贮运环境中光、氧等因素的不利影响，增强活性物质在货架期和生物体内的稳定性，同时微胶囊结构的缓释作用能延长该物质的生物半衰期，实现靶向运输，从而提高生物利用率，强化其生理活性。
现有研究过程中使用有机溶剂，或者非食品级合成聚合电解质，成为食品主要的安全性问题。开发简单、安全且具有高效传输系统的纳米胶囊，是目前的研究热点。基于天然蛋白的纳米载体，既具有良好的生物相容性和生物降解性，又具有纳米尺寸效应，适合作为营养物质载体，所以有着良好的应用前景。其中，酪蛋白可通过自组装形成胶束，其外亲水、内疏水结构可用于输送水溶性、脂溶性物质，是营养物质的天然载体。而多酚与富含脯氨酸的蛋白有很强的亲和性，在水溶液中与其结合形成可溶或者不可溶复合物，因此是EGCG较为理想的载体。然而天然酪蛋白在等电点附近溶解性差，且对EGCG的载量不高，高浓度的EGCG使酪蛋白凝聚沉淀从而无法获得具有良好稳定性的纳米胶囊。通过美拉德反应定向接枝获得的糖基化酪蛋白赋予其更加卓越的界面性质，并且在低于酪蛋白临界胶束浓度条件下可通过自组装形成胶束，接枝多糖的无规线团结构特质有效改善了酪蛋白的物理稳定性，因此在较高EGCG载量下，不会生成大的聚集体，并且良好的贮藏稳定性。与此同时，相比于天然酪蛋白，糖基化酪蛋白对EGCG的载量显著提高。因此可将其作为构建EGCG等水溶性营养素的更为理想的载体。
发明内容
本发明的目的是提供一种对酪蛋白的糖基化改性方法，使酪蛋白对EGCG的结合率和贮藏稳定性显著提高。选择美拉德定向接枝的糖基化酪蛋白为壁材，成分简单，体系性质稳定，实现了EGCG的保护和贮藏。
本发明的技术方案是，具有高结合率和良好贮藏稳定性的EGCG纳米胶囊，由以下成分组成：
芯材为EGCG；壁材分别为酪蛋白、糖基化酪蛋白；其中，芯材与壁材的摩尔比为0∶1～256∶1；所述的糖基化酪蛋白为酪蛋白与葡聚糖干热美拉德反应定向接枝产物经超滤分离去除未参与反应的酪蛋白与葡聚糖制得；所述的葡聚糖相对分子质量为200,000。
本发明所采用的另一技术方案是，上述纳米胶囊的制备方法，按以下步骤进行：
a.采用干热美拉德反应定向接枝制备糖基化酪蛋白：将酪蛋白和葡聚糖(w/w＝1/7)溶于pH7.0，0.2mol/L磷酸盐缓冲液中获得酪蛋白浓度为8g/L的溶液，然后冷冻干燥；将干燥后的样品磨细，过120目筛，反应(60℃，相对湿度为78％，pH7.0)12～24h；超滤(膜的截留分子量为100kDa)去除未参与糖基化反应的酪蛋白及葡聚糖，即得糖基化酪蛋白。
b.采用物理混合法制备EGCG纳米胶囊：常温下将酪蛋白及上述糖基化酪蛋白溶于0.2mol/L、pH7.0的磷酸盐缓冲液中，其中酪蛋白浓度均为1g/L；将溶有不同浓度的EGCG的醋酸盐缓冲液(pH4.5)与蛋白溶液以1∶19(v/v)混合，辅以搅拌1～10min(转速为400～800r/min)，即得EGCG纳米胶囊。
c.采用高效液相色谱法及动态光散射法分析EGCG纳米胶囊的贮藏稳定性：将不同芯壁摩尔比的EGCG-酪蛋白、EGCG-糖基化酪蛋白纳米胶囊分别充满N2，并于4℃冰箱中贮藏若干天，利用高效液相色谱法及动态光散射法分析其保留率及平均粒径变化率。
本发明中，相较于EGCG-酪蛋白纳米胶囊，EGCG-糖基化酪蛋白纳米胶囊的壁芯摩尔比有显著提高，且高浓度EGCG不会造成糖基化蛋白的聚集和沉淀，因此体系仍呈现澄清透明状。纳米胶囊的平均粒径在80～150nm之间，包埋率高于90％，且EGCG-糖基化酪蛋白纳米胶囊在贮藏10天期间的保留率及粒径变化率均优于EGCG-酪蛋白纳米胶囊。对酪蛋白通过美拉德反应进行糖基化修饰，不仅改善了酪蛋白的水溶性、乳化性，而且有效提高了对EGCG的载量和体系的贮存稳定性。
粒径的测定：采用动态光散射粒度仪测定，测定温度25℃。
包封率的测定：取纳米胶囊500μL，用2mL的离心超滤管(截留分子量3K)进行离心，优化离心条件为2000×g，常温下离心30min。采用高效液相色谱法测定游离EGCG含量，流动相为甲醇+0.1％乙酸，色谱柱为C18反相柱(5μm，39×150mm，Atlantis，Waters，美国)。
附图说明
图1为实施例2制备的EGCG-酪蛋白纳米胶囊在贮藏期间的平均粒径变化及EGCG的保留率随时间的变化。
图2为实施例3制备的EGCG-糖基化酪蛋白纳米胶囊在贮藏期间的平均粒径变化及EGCG的保留率随时间的变化。
具体实施方式
实施例1
准确称取酪蛋白0.8g、葡聚糖(相对分子质量20,000)5.6g溶于100mL0.2mol/L的磷酸盐缓冲液中，搅拌，制成酪蛋白质量浓度为8g/L的均匀溶液，冷冻干燥24h。干燥后的样品磨细，过120目筛，置于培养皿中，用刺孔的铝箔封口后进行反应(60℃，相对湿度为78％，pH为7.0)反应20h时后冷却终止反应。用截流分子量为100kDa的超滤膜反复超滤三次去除未反应的酪蛋白及多糖，收集大于100kDa的组分冷冻干燥，即得糖基化酪蛋白。
实施例2
将天然酪蛋白溶于磷酸盐缓冲液中(酪蛋白含量为8g/L)，搅拌若干小时后，离心并取上层清液，最终确定酪蛋白含量为1g/L。将溶于pH4.5醋酸盐缓冲液的不同浓度的EGCG分别与酪蛋白溶液混合(v/v，1∶19)，混合1min(转速为600r/min)即得EGCG-酪蛋白纳米胶囊。测得平均粒径75～150nm，包封率27％～85％。
实施例3
将上述糖基化蛋白溶于磷酸盐缓冲液(酪蛋白含量为1g/L)。将溶于pH4.5醋酸盐缓冲液的不同浓度的EGCG分别与糖基化酪蛋白溶液混合(v/V，1∶19)，混合1min(转速为600r/min)即得EGCG-糖基化酪蛋白纳米胶囊。测得平均粒径70～140nm，包封率50％～90％。
实施例4
本实例为对本发明的EGCG纳米胶囊的贮藏稳定性试验。
将2mL不同芯壁摩尔比的EGCG-酪蛋白纳米胶囊、EGCG-糖基化酪蛋白纳米胶囊分别充满N2，并置于4℃冰箱中保藏10天左右，平行取样6份。贮藏0、1、2、4、8、10天期间，利用高相液相色谱法和动态光散射法分析EGCG的保留率及纳米胶囊的平均粒径变化率。
包封率及保留率由以下公式测定：
实验结果：贮藏10天期间，酪蛋白和糖基化酪蛋白对EGCG的结合均有所下降，并且随着时间的延长，EGCG-酪蛋白纳米胶囊对EGCG的保留率下降明显，而糖基化酪蛋白对EGCG的保留率下降缓慢，对EGCG的结合能够保持相对稳定，对EGCG起保护作用。随着EGCG/酪蛋白摩尔比的增加，体系平均粒径增加，并且最终形成絮凝和沉淀；而随着EGCG/糖基化酪蛋白摩尔比的增加，体系平均粒径有所增加，但是体系仍然保持澄清透明状，说明经葡聚糖修饰的酪蛋白在高浓度的EGCG存在的条件下依然保持稳定，结合量也相对增加。因此，糖基化酪蛋白作为EGCG的载体能有效改善酪蛋白作为载体时对EGCG结合量低的缺点，贮藏时间延长，并且在贮藏期间更为稳定，拓宽了酪蛋白在纳米载体中的应用。
Claims (5)
1.一种茶多酚(没食子儿茶素没食子酸酯，EGCG)纳米胶囊，由以下成份组成：芯材为EGCG；壁材为葡聚糖修饰的糖基化酪蛋白；其中，芯材与壁材的摩尔比为0∶1～256∶1。
2.按照权利要求1所述的EGCG纳米胶囊，其特征在于，所述的葡聚糖修饰的糖基化酪蛋白为干热美拉德反应定向接枝产物经超滤分离制得。
3.按照权利要求1所述的EGCG纳米胶囊，其特征在于，所述的葡聚糖相对分子质量为20,000。
4.一种权利要求1所述EGCG纳米胶囊的制备方法，其特征在于，该方法按以下步骤进行：
a.采用物理混合制备EGCG-酪蛋白纳米胶囊：常温下将酪蛋白溶于0.2mg/mL、pH7.0磷酸盐缓冲液中，其中蛋白浓度为1.0mg/mL；将溶于醋酸盐缓冲液(pH4.5)中不同浓度的EGCG和酪蛋白溶液以体积比1∶19混合1～10min(转速为400～800r/min)，即得EGCG-酪蛋白纳米胶囊。
b.采用干热美拉德反应定向接枝制备糖基化酪蛋白：将酪蛋白和葡聚糖(1/7，m/m)溶于磷酸盐缓冲液中获得酪蛋白浓度为8g/L的溶液，然后冷冻干燥；将干燥后的样品磨细，过120目筛，反应(60℃，相对湿度为78％，pH7.0)12～24h；采用超滤装置(膜的截留分子量为100kDa)去除未反应的酪蛋白及葡聚糖，即得糖基化酪蛋白。
c.采用物理混合制备EGCG-糖基化酪蛋白纳米胶囊：方法同a。
5.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于，该体系可有效包埋EGCG，和EGCG-酪蛋白纳米胶囊相比，糖基化酪蛋白可与高浓度的EGCG仍形成稳定的纳米复合物，并且具有更高的结合率及贮藏稳定性。
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