CN105434348B - 一种抗脑癌的藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗脑癌的藻蓝蛋白‑葡聚糖‑虫草素胶束及其制备方法和应用。所述藻蓝蛋白‑葡聚糖‑虫草素胶束是先采用美拉德反应的方法将藻蓝蛋白接枝到葡聚糖上，形成藻蓝蛋白‑葡聚糖复合物；再通过自组装的机理，将虫草素包裹到藻蓝蛋白里面，自组装形成胶束制备得到。本发明提供的上述藻蓝蛋白‑葡聚糖‑虫草素胶束能够穿过血脑屏障到达肿瘤处，对脑癌细胞具有显著的抑制作用，而且药物能够缓慢释放，在血液中的留存作用时间较长，使其最终能在肿瘤组织处被动积累。另外，制备该胶束的材料均来源于天然有效成分，合成过程没有加入任何有机溶剂，具有良好的生物相容性和生物可降解性，在脑癌的治疗应用方面具有很大的潜力和前景。

Description

一种抗脑癌的藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束及其制备方法和 应用

技术领域

本发明属于医药材料技术领域。更具体地，涉及一种能够抑制脑癌细胞生长的藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束及其制备方法和应用。

背景技术

脑肿瘤即颅内肿瘤，是指原发性和转移性肿瘤的异质群体，中枢神经系统是危及生命的疾病，其特点是存活率极低。全球原发行脑肿瘤的年发病率是大约为24000例，是一种种类繁多的且通常会使患者治后不愈，留下后遗症。脑肿瘤的转移是另一个重要的类中枢神经系统疾病，主要从系统性癌症肺癌、乳腺癌和皮肤癌转移至脑部。转移性脑部肿瘤发病率较高，在美国年发病率约为100000～170000例。

目前，恶性脑肿瘤治疗方法包括手术切除、放疗、和化疗及复合疗法，这些方法可以极大的延长患者的生存时间。此外，大脑解剖和成像技术的进步也为脑肿瘤的早期检测、诊断测试、手术计划以及术后评估起了至关重要的作用。但是，尽管在脑肿瘤的诊断和治疗方法上已经付出了极大的努力，但是脑肿瘤的治愈仍然是神经肿瘤的一大挑战，其主要原因有：（1）大脑结构的复杂性；（2）脑肿瘤的多样化和侵入性；（3）无法辨别肿瘤边缘和肿瘤扩散的性；（4）药物治疗上的经验积累不足；（5）化疗产生耐药性。不同于其他组织，脑部组织由血脑屏障（Blood-Brain Barrier，BBB）保护，血脑屏障可以阻止内生的有害物质和外来物质随血液流入，但同时这也成为脑肿瘤治疗的主要限制因素。研究表明，只有血液中小分子的亲脂性物质，电中性分子以及一些分子量在400～600的营养素可以被动扩散到脑部。因此，要想脑癌提高药物的治疗的疗效，就必须要使药物有效通过血脑屏障到达患处。

另外，国内外有文献报道，藻蓝蛋白对肿瘤细胞具有直接的杀伤与抑制作用。Schwartz等首先发现藻蓝蛋白对癌细胞有抑制作用，预示着藻蓝蛋白有抗肿瘤潜力；Nishanth等研究了其抗肝癌活性；Subhashin等研究了其对白血病的治疗作用。但是，尚未证明其对脑癌的作用如何，而且藻蓝蛋白分子量较大，很难与细胞直接作用，限制了其在抗癌中的应用。同时，虫草素是一种腺苷类物质，是蛹虫草的主要生物活性成分，具有药理特性。相比普通化学抗癌药物，虫草素作为一种天然中草药成分，对正常机体的毒副作用小，同时具有抗肿瘤、抗癌细胞转移、免疫调节、抗氧化等作用 。Chen等已经证明虫草素对大鼠神经胶质瘤细胞系的杀伤作用。虽然虫草素已经被证实对脑癌细胞有抑制作用，但Lu发现虫草素在体内24 h就完全代谢，这也成为虫草素直接应用于脑肿瘤治疗的最大限制因素。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有脑肿瘤治疗技术和药物的不足，提供一种新型的脑癌治疗药物材料，本发明通过美拉德反应将葡聚糖接枝到藻蓝蛋白上形成复合物，再应用自组装机理将虫草素包裹在里面形成胶束，成功的合成了分散性好、尺寸较小的藻蓝蛋白胶束；该胶束能够穿过血脑屏障到达肿瘤处，对脑癌细胞具有抑制作用，而且药物能够缓慢释放，在血液中的留存作用时间较长，使其最终能在肿瘤组织处被动积累，有很大的潜力应用于脑癌的治疗。

本发明的目的是提供一种能够抑制脑癌细胞生长的藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束。

本发明另一目的是提供上述藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束的制备方法。

本发明的再一目的是提供上述藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种抗脑癌的藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束，是首先采用美拉德反应的方法将藻蓝蛋白接枝到葡聚糖上，形成藻蓝蛋白-葡聚糖复合物；再通过自组装的机理，将虫草素包裹到藻蓝蛋白里面，自组装形成胶束制备得到。

其中优选地，制备上述胶束所用的葡聚糖和藻蓝蛋白的质量比为0.25～4：1。

更优选地，所述葡聚糖和藻蓝蛋白的质量比为2～4：1。

最优选地，所述葡聚糖和藻蓝蛋白的质量比为4：1。

另外，优选地，所述美拉德反应的条件为50～70℃反应24～60h。

更优选地，所述美拉德反应的条件为60℃反应48 h。

优选地，制备上述胶束所用的藻蓝蛋白和虫草素的质量比为10～30：1。

更优选地，所述藻蓝蛋白和虫草素的质量比为20：1。

优选地，制备上述胶束所用葡聚糖的分子量为65～75KD。

更优选地，所述葡聚糖的分子量为70KD。

作为一种优选的可实施方案，上述藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束的具体制备方法包括如下步骤：

S1.按照葡聚糖：藻蓝蛋白=0.25～4：1的质量比，将藻蓝蛋白和葡聚糖混合，加入去离子水，超声震荡至葡聚糖和藻蓝蛋白均完全溶解；

S2.将步骤S1所得混合溶液的pH值调节至3～4.5，然后将混合溶液冷冻干燥；

S3.将步骤S2冷冻干燥所得的固体放在装有饱和KBr溶液的密闭容器中，置于50～70℃下进行美拉德反应24～60h，反应产物即为藻蓝蛋白-葡聚糖复合物；

S4.将藻蓝蛋白-葡聚糖复合物加去离子水溶解，得到藻蓝蛋白-葡聚糖共价结合物溶液，再按照藻蓝蛋白：虫草素=10～30：1的质量比，向溶液中加入虫草素，超声振荡4 h以上，即制得藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束。

其中，优选地，步骤S2所述混合溶液的pH值调节至3.8。

优选地，步骤S2所述冷冻干燥的条件为：-50℃，真空1.0Pa。

优选地，步骤S3所述密闭容器中的相对湿度为70～85%。

更优选地，步骤S3所述密闭容器中的相对湿度为79%。

优选地，步骤S4所述去离子水的添加量以得到藻蓝蛋白浓度为15～30mg/ml的藻蓝蛋白-葡聚糖共价结合物溶液为准。

更优选地，步骤S4所述去离子水的添加量以得到藻蓝蛋白浓度为20 mg/ml的藻蓝蛋白-葡聚糖共价结合物溶液为准。

优选地，步骤S4所述超声振荡的时间为4～10h。

本发明首次利用藻蓝蛋白和葡聚糖制备出复合物，再将虫草素包裹其中，成功制得一种抗脑癌的新型药物，该药物能够穿过血脑屏障到达肿瘤处，对脑癌细胞具有抑制作用，而且药物能够缓慢释放，在血液中的留存作用时间较长，使其最终能在肿瘤组织处被动积累，有很大的潜力应用于脑癌的治疗。

因此，上述藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束在制备抗脑癌药物中的应用也在本发明的保护范围之内。

本发明利用葡聚糖和藻蓝蛋白合成新型的藻蓝蛋白胶束，利用这一新兴的纳米材料作为药物载体，具有低毒性和高载药率的特点，具有以下优势：首先，可以有效改善难溶性药物的吸收，改善药物循环；其次，具有较高的载药能力，而且可以实现药物的缓慢释放，延长药物作用时间；另外，还可以可有效提高药物效应，减轻毒副作用，提高血药浓度，同时提高药物的稳定性以及实现药物靶向输送。而且，胶束具有亲水的外壳和疏水的内核，因此具有良好的溶解性、高药物包载率、低细胞毒性以及可以有效的避免药物被单核巨噬细胞吞噬，在脑癌的治疗上有很大的优势。

胶束的形成过程主要依靠自组装原理，但是现有技术中，胶束的合成材料大多为一些聚合物，通常在胶束的合成过程中，会加入大量的有机溶剂，导致胶束本身带有很大的细胞毒性，影响其生物学效应。在本发明中，我们选择了一种天然蛋白质藻蓝蛋白，与葡聚糖通过美拉德反应结合在一起形成复合物。葡聚糖由多个葡萄糖分子间通过α（l，6）糖苷键聚合而成的多糖，含有丰富的羟基，易溶于水，有良好的生物相容性和生物可降解性。经过葡聚糖修饰的藻蓝蛋白在水中可以自组装成胶束结构，具有类似PEG的长循环性质，因而在生物医药领域葡聚糖具有很好的应用价值。在制备藻蓝蛋白-葡聚糖复合物的过程中，我们只加入了水为溶剂，通过美拉德反应使糖和蛋白结合在一起。美拉德反应也不同于其他的有机化学反应，在反应过程中同样没有添加任何有机化学试剂，这就为本发明合成的藻蓝蛋白胶束的应用奠定了生物学基础。在形成胶束的第二步，我们加入了虫草素为抗脑癌药物，通过非共价键与藻蓝蛋白结合，自组装形成最终的包裹药物的胶束。

具体地，本发明的研究分为三大部分：首先通过美拉德反应将葡聚糖接枝到藻蓝蛋白上形成复合物，然后，通过红外光谱、SDS-PAGE电泳、接枝度、粒径分布、Zeta电位、透射电镜、释放动力学等一系列方法，对藻蓝蛋白-葡聚糖复合物进行了定性表征，证明了我们成功的将葡聚糖修饰到藻蓝蛋白上面，并采用OPA法定量对接枝度进行了定量的表征。第二步是在确定藻蓝蛋白接枝到葡聚糖上之后，利用葡聚糖-藻蓝蛋白复合物对虫草素进行包裹，通过自组装机理形成藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束。在对胶束的表征上，我们通过动态光散射检测粒径分布和Zeta电位，筛选出葡聚糖与藻蓝蛋白的最佳比例。通过透射电镜，我们可以清楚的看到胶束的形态及分布，其粒径在50～80nm（当纳米粒子的直径小于200nm时，可以有效通过血脑屏障），因此可以通过血脑屏障，而且对于小尺寸的胶束来说，可以有效的避免肾排斥，延长了胶束在血液中的作用时间，使其最终能在肿瘤组织处被动积累。最后，在合成胶束成功后，我们研究了合成的藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束在细胞水平的抗脑癌作用，通过台盼蓝染色、定量的细胞计数、以及流式细胞术等实验手段，证明了藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束对脑癌细胞的生长具有抑制作用，可用于脑癌的治疗。这也将成为纳米材料用于脑癌治疗的新方法，对于该疾病的治疗研究有很大的指导意义。

本发明具有以下有益效果：

本发明制备的藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束能够穿过血脑屏障到达肿瘤处，对脑癌细胞具有显著的抑制作用，而且胶束的中作为载体的藻蓝蛋白对人体具有抗癌保健作用，同时包裹的天然抗癌药物虫草素的胶束对脑瘤细胞有很好的抑制作用。更重要的是，本发明克服了虫草素在体内24 h就完全代谢的问题，将虫草素包裹在胶束里面，经载体运输到达脑肿瘤处，还可以实现药物的缓慢释放，在血液中的留存作用时间较长，使其最终能在肿瘤组织处被动积累。

本方面制备藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束所用材料均来源于天然有效成分，且合成过程没有加入任何有机溶剂，具有良好的生物相容性和生物可降解性，在脑癌的治疗应用方面具有很大的潜力和前景。

另外，本方面选取葡聚糖接枝藻蓝蛋白并包裹虫草素形成胶束，将藻蓝蛋白作为载体参与胶束的合成，提高了藻蓝蛋白的应用潜力，同时将虫草素包裹在胶束里面，扩大了虫草素在脑癌治疗方面的应用范围，为有效治疗脑癌提供了一条新的途径。

本发明的制备方法可以有效包封抗癌药物，并增加其抗肿瘤活性，减缓药物释放速度。藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束合成成功，不仅为藻蓝蛋白与虫草素的应用提供了新思路，也为脑癌的研究和治疗提供了新的方向。

附图说明

图1为藻蓝蛋白-葡聚糖复合物的合成示意图。

图2为利用傅立叶转换红外光谱仪对藻蓝蛋白、葡聚糖以及干燥处理后的藻蓝蛋白-葡聚糖复合物表征的红外谱图；a为藻蓝蛋白的红外谱图，b为葡聚糖的红外谱图，c为葡聚糖与藻蓝蛋白比例为1：1的反应合成的美拉德反应产物。

图3为藻蓝蛋白（P）、葡聚糖（D）、藻蓝蛋白/葡聚糖混合物（P/D）和藻蓝蛋白-葡聚糖复合物（P-D）的SDS-PAGE电泳图。

图4为邻苯二甲醛法分析藻蓝蛋白上葡聚糖的接枝度。

图5为藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束的粒径分布。

图6为藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束的Zeta电位测量结果。

图7为藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束的透射电镜图。

图8为藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束的体外缓释性能测试结果。

图9为各处理组台盼蓝染色后的细胞照片。

图10为各处理组细胞存活率统计结果。

图11为流式细胞术检测C6细胞凋亡的结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

以下实施例中所用材料为：

（1）细胞株：大鼠脑胶质瘤细胞细胞（C6细胞系）由中国科学院深圳先进技术研究所提供，经本实验室传代培养。

（2）主要试剂：藻蓝蛋白（Phycocyanin），购自浙江台州宾美生物科技有限公司；葡聚糖（Dextran），购自广州鹏辰生物科技有限公司；虫草素（Cordycepin），购自广州威佳生物科技有限公司；胰酶、高糖DMEM培养基均为GIBCOBRL公司产品；新生小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司； 24 孔聚苯乙烯组织培养基板为美国Corning康宁公司产品。

（3）仪器：德国LEO公司场发射扫描电镜LEO 1530 VP，Nikon显微镜，日本Olympus公司光学倒置显微镜，Sigma32184高速冷冻离心机，Thermo CO₂培养箱，江苏省金坛市医疗仪器厂78-1磁力搅拌器，HV-85 高压灭菌器，无菌操作台，广州科桥实验技术设备有限公司恒温水浴锅等。

实施例1 藻蓝蛋白-葡聚糖复合物的制备

1、制备藻蓝蛋白-葡聚糖复合物

藻蓝蛋白-葡聚糖复合物的合成示意图如附图1所示。具体地，方法如下：

S1.取5支试管称量5份、每份20mg的藻蓝蛋白分别加入试管中，分别称量5mg、10mg、20mg、40mg、80mg分子量为70KD葡聚糖，分别加入5支试管中，使试管中葡聚糖与藻蓝蛋白的比例分别为0.25：1，0.5：1，1：1，2：1，4：1；

S2.每支试管加入1ml去离子水，超声震荡至葡聚糖和藻蓝蛋白均完全溶解；

S3.将溶液的pH值调节到3.8，然后将混合溶液冷冻干燥；

S4.将冷冻干燥的固体放在装有饱和KBr溶液的密闭容器中（相对湿度为79%），置于60℃下进行美拉德反应48 h；美拉德反应产物即为藻蓝蛋白-葡聚糖复合物。

将美拉德反应产物用去离子水溶解，同样每支试管加入1ml的去离子水配成溶液，将所得样品溶液置于4℃冰箱中保存。

2、藻蓝蛋白-葡聚糖复合物的表征

（1）傅里叶红外光谱检测

分别将藻蓝蛋白、葡聚糖以及干燥处理后的藻蓝蛋白-葡聚糖复合物放入研钵中，加入一定量的KBr，研磨均匀使混合物研磨到粒度小于2μm，以免散射光影响，之后放入干燥机中进行干燥处理，在油压机上用10MPa左右的压力将混合物压成透明薄片，上机测定。

结果如附图2所示，图中，谱图a在1657cm^-1有一强的吸收峰，是藻蓝蛋白上的C=O伸缩振动；在1546 cm^-1有一强吸收峰，是藻蓝蛋白上的酰胺亚基N-H的弯曲振动。谱图b在1649的吸收峰为葡聚糖上的C=O的伸缩振动。谱图c相比谱图a 和谱图b，在1546 cm^-1处有弱吸收峰是由于葡聚糖的接枝在藻蓝蛋白上面减弱了原谱图a中1546 cm^-1处的N-H的弯曲振动。这就说明了葡聚糖与藻蓝蛋白发生了N-H反应，从而说明我们的美拉德反应合成是成功的。

（2）SDS-PAGE电泳技术定性表征

为了进一步验证葡聚糖是否已经成功接枝在藻蓝蛋白上，我们将不同配比的葡聚糖和藻蓝蛋白进行美拉德反应后的产物进行十二烷基硫酸钠一聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)定性表征。SDS-PAGE考马斯亮蓝蛋白染色是利用染色液与蛋白通过范德华力结合，适用于蛋白的微量染色。

1）制备10 ml的10%分离胶，加入SDS-PAGE专用的玻璃板夹层中，加入1 ml去离子水驱赶气泡，同时使液面平整，室温下静置约30min。分离胶完全凝聚后，吸出分离胶上层的水，用滤纸吸干残余水。配制6ml的5%浓缩胶，加入分离胶上层，室温静置2 h，以使胶片中的成分完全凝聚。

2）准备电泳样品：配制浓度均为1.0mg/ml的藻蓝蛋白溶液、葡聚糖溶液、藻蓝蛋白/葡聚糖混合溶液、美拉德反应产物溶液，然后分别与上样缓冲液等体积混合，置于100°C水浴加热20分钟，以使蛋白完全变性。组装好JM-250小型电泳仪，将玻璃板插入电泳槽里，加入电泳缓冲液，再向每个样品槽里加入15μl样品，蛋白质标记槽中加入 6μl的蛋白Maker。开始电泳时，电压调至60V。当电泳蓝线越过分离胶与浓缩胶的界线时，电压调为210V，直至电泳结束。分离玻璃板中的胶片，进行蛋白染色。

3）蛋白染色的胶片采用考马斯亮蓝R-250溶液常温下染色4小时，然后用蛋白脱色液(10%的甲醇与乙酸溶液)脱色。脱色时注意少量多次，直至胶片颜色显白色。

结果如附图3所示，条带从右到左分别为：藻蓝蛋白（P）、葡聚糖（D）、藻蓝蛋白/葡聚糖混合物（P/D）、蛋白Marker（M）以及葡聚糖与藻蓝蛋白分别0.25：1、0.5：1、1：1、2：1、4：1不同质量比的美拉德反应产物。

通过SDS-PAGE蛋白染色我们可以看到，在分子量40～130范围内，藻蓝蛋白（P）、葡聚糖（D）、藻蓝蛋白/葡聚糖混合物（P/D）均没有出现明显的条带，而在美拉德反应的产物（藻蓝蛋白-葡聚糖复合物，P-D）存在明显的条带和弥散现象，这说明我们的美拉德反应是成功的。

（3）OPA法定量表征葡聚糖接枝度

为了进一步确定葡聚糖接枝在藻蓝蛋白上，我们采用OPA法来定量表征有多少的葡聚糖成功接枝在藻蓝蛋白上面。OPA法最早是由Roth发明来测定氨基酸的含量，随后Simons和Johnson对OPA与伯胺的反应进行了进一步的研究。邻苯二甲醛的醛基和蛋白质等含氨基的化合物，在碱性环境（pH 9.5）和强还原剂存在下，醛与氨基反应生成希夫碱，在波长340 nm出有紫外吸收，可以用紫外-可见分光光度计来测量。

准确称取80 mg邻苯二甲醛固体，溶于2ml乙醇中。再配制50ml的0.1M Na₂B₄0₇溶液（pH9.5）硼酸缓冲液。将硼酸缓冲液和邻苯二甲醛溶液转移至100 ml容量瓶中，加入10%SDS溶液10ml和0.2ml β-疏基乙醇，之后加水定容。注意每次使用的OPA溶液都是新鲜配制的。将美拉德反应制备的产物溶于水配制成藻蓝蛋白浓度为1.0 mg/ml的溶液。将0.1ml和2.9ml的OPA试剂混合均匀，置于紫外-可见分光光度计中进行340 nm处的动力学测试，记录3分钟时混合液的吸光度。我们以同样方法测定不同浓度梯度的藻蓝蛋白的吸光度值。同样用BSA作为标样，在相同测试条件下得到工作曲线，工作曲线中BSA浓度范围为0～300μg/ml。

结果如附图4所示，通过测定美拉德反应前后藻蓝蛋白上自由氨基数目的改变量，来计算葡聚糖的接枝度，我们同样设定了葡聚糖与藻蓝蛋白不同配比分别为0.25：1、0.5：1、1：1、2：1、4：1探究葡聚糖的量对美拉德反应的影响。由于美拉德反应的特殊性，使得藻蓝蛋白与葡聚糖的接枝不均匀，并没有规律分布。但是我们可以看出每组的接枝度均在70%以上，证明美拉德反应合成成功。

实施例2 藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束的制备

1、制备方法

将实施例1制备的藻蓝蛋白-葡聚糖复合物（美拉德反应产物）加去离子水溶解，得到藻蓝蛋白浓度为20 mg/ml的藻蓝蛋白-葡聚糖共价结合物溶液。称量5份、每份1 mg的虫草素，然后将虫草素加入藻蓝蛋白-葡聚糖共价结合物溶液中，超声振荡4 h以上，即制得不同浓度的藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束。

2、藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束的表征

（1）粒径分布

为了探究葡聚糖的量对藻蓝蛋白胶束粒径大小的影响，我们将葡聚糖与藻蓝蛋白按照质量比分别为0.25：1、0.5：1、1：1、2：1、4：1经过美拉德反应合成产物，再加入相同浓度的虫草素自组装形成的胶束，稀释100倍。然后用Nano ZS型激光纳米粒度仪测定粒径。

结果如附图5所示，通过动态光散射测量仪可以看到不同比例合成出的产物粒径的大致分布，测得在葡聚糖与藻蓝蛋白质量比为4：1时的粒径大小最均匀合适，其粒径分布在100nm左右，由于动态光散射测量的粒径为粒子的水合粒径，其测量值会比真实值偏大30nm～40nm。于是可以得出我们合成的胶束粒子粒径大约分布在60nm左右，因此可以通过血脑屏障。

（2）Zeta电位

将葡聚糖与藻蓝蛋白质量比分别为0.25：1、0.5：1、1：1、2：1、4：1经过美拉德反应后的合成产物，加入相同浓度的虫草素自组装形成的胶束，稀释100倍。然后用Nano ZS型激光纳米粒度仪测定电位。ζ-电位反映纳米粒子或大分子物质表面净电荷量。

结果如附图6所示，通过动态光散射测量仪可以看到，随着葡聚糖比例的增加，合成胶束的电位逐渐趋进于零，明净电荷为零的葡聚糖充分包裹在最外面形成胶束。在葡聚糖与藻蓝蛋白质量比为2：1和4：1时，电势值最接近零点。

（3）透射电镜

通过对胶束粒子的粒径分布表征以及ζ-电位表征，我们发现当葡聚糖和藻蓝蛋白质量比为4：1（以下没有明确说明比例均为4：1的质量比）美拉德反应后与虫草素自组装形成的胶束是最优的。于是我们选取葡聚糖与藻蓝蛋白质量比为4：1经美拉德反应后，加入虫草素形成的胶束，对该组胶束进行形态学观察。

制备的胶束稀释1000倍，充分超声震荡，使其分布均匀。然后用移液枪将胶束滴加在铜网上。为使更多的胶束粒子吸附在铜网上，可以用滤纸从下面吸去多余的溶液，反复多次。最后滴加一滴于铜网上，置于红外灯下烘干，使溶剂挥发。将制得的TEM铜片样品置于JEM-2100型透射电子显微镜观察拍照。透射电镜（TEM，JEM-2100HR 显微镜，200keV 电子动能）测定胶束形貌。

结果如附图7所示，通过透射电镜我们可以看到，产品的粒径在50～80nm之间，这与通过动态光散射测得的粒径结果相符合。并且可以清楚的看到产品中有胶束状存在。

（4）体外缓释性能

体外释放性能是评价胶束应用潜力的一项很重要的质量指标。由于肿瘤细胞间隙大，细胞表面的pH比正常血液和组织的pH值约5.0左右。因此我们检测藻蓝蛋白胶束在pH5.0、37℃下的释放速率。

由于虫草素分子量约251Da，使用截留分子量为300的透析袋。剪取长度约10 cm的透析袋，煮沸l0min后，用二次水冲洗。制备10ml浓度为1.0 mg/ml胶束溶液，配制0.05M的pH5.0醋酸缓冲液，准备好1个干净的500 ml大烧杯，加入400 ml醋酸缓冲液。吸取l0ml的胶束溶液，以37℃、200 rpm的速度磁力搅拌下透析，在特定取样品时间，取出透析液4 ml，同时补加等体积的新鲜醋酸缓冲液溶液。然后通过高效液相色谱仪检测虫草素的含量，测得不同时间点处虫草素峰面积，代入标准虫草素曲线方程，计算出虫草素释放量，折算出虫草素不同时间的累计释放百分比（%）。以透析时间为横坐标，相应时间点累积释放百分比（%）为纵坐标作图，绘制pH=5.0下的释放动力学曲线。

结果如附图8所示，从图中可以看出，虫草素的释放分为突释期和缓释期。突释期出现在透析的前2个小时，可能是由于少量虫草素吸附在胶束表面，导致释放较快。而后藻蓝蛋白胶束包裹的虫草素缓慢释放，在释放24小时后到达最大量。

实施例3 藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束的抗癌应用

1、C6细胞培养

实验所用C6细胞系由中国科学院深圳先进技术研究所提供。细胞在培养瓶中增殖培养至80%后，以16000/孔的密度接种至24孔板上，培养1，2天，以进行后续实验。细胞培养条件为：含10%新生牛血清的高糖DMEM培养基，37℃，5.0% CO₂。

2、台盼蓝染色与细胞计数

（1）为了验证藻蓝蛋白胶束对C6脑癌细胞抑制作用的研究，我们选择台盼蓝染色与细胞计数的方法。

设置了6组实验，分别是：（a）空白对照组、（b）葡聚糖组、（c）藻蓝蛋白组、（d）虫草素组、（e）藻蓝蛋白与虫草素混合组、（f）藻蓝蛋白胶束组（藻蓝蛋白胶束组即为藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束组）。

将细胞以16000/孔的密度接种至24孔板上，培养一到两天，使细胞充分贴壁生长，而后向各组中加入相同浓度的相应药物进行继续培养。

（2）台盼蓝是细胞活性染料，常用于检测细胞是否存活。活细胞不会被染成蓝色，而死细胞会被染成淡蓝色。为了定性证明藻蓝蛋白胶束对C6脑癌细胞抑制作用，将上述各组加入了相同浓度的相应药物继续培养24h后的培养物，弃去培养基，进行台盼蓝染色。

首先，称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4℃保存。使用时，用PBS稀释至0.4%。为了能清楚的拍下细胞，我们先加台盼蓝染液，台盼蓝溶液与PBS以9：1混合混匀染色5min。然后用荧光显微镜拍下细胞染色形态。

结果如附图9所示，从图中我们可以看出f组的细胞被染色的最多。证明了本发明制备的藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束对C6脑癌细胞具有显著的抑制作用。

（2）为了进一步定量分析每组细胞存活率的大小，进行了细胞统计。为进行细胞计数，我们用胰酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，并作适当稀释。在三分钟内，分别计数活细胞和死细胞。在镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。

统计细胞活力：细胞存活率（%）= 活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%

结果如附图10所示，同样证明了f组的细胞存活率最低，其细胞存活率为18.5%。由此证明了本发明制备的藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束对C6脑癌细胞具有显著的抑制作用。同时，由细胞计数的结果可以看出，e组是相同浓度的藻蓝蛋白和虫草素混合后，其对细胞抑制率结果比c组和d组只加藻蓝蛋白和虫草素的组更低。因此我们推测，当只有藻蓝蛋白和虫草素混合而并没有形成胶束时，是产生了拮抗作用，导致两种均有抗癌作用的物质都降低了其抗癌效果。而当用葡聚糖修饰藻蓝蛋白包裹虫草素形成胶束后，其抗癌效果显著增高。

3、流式细胞术检测细胞凋亡

将处于对数生长期的C6细胞，以5×10⁵个/孔的细胞密度接种到24孔培养板中。然后加入新鲜DMEM培养基，设置a组为空白组，b组加入10μl藻蓝蛋白溶液，c组加入20μl的藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束溶液。在37℃继续培养细胞48h。收集细胞，离心去除培养基。向每个样管里面加入200 μl的Binding buffer混匀，再加入5μl Annexin V-FITC，室温下避光孵育10min；离心弃去上清，加入200 μl的Binding buffer混匀，并加入5μl的PI，直接用细胞流式仪检验细胞的凋亡情况。

C6细胞用藻蓝蛋白胶束处理48h后，收集细胞并进行双染，用流式细胞仪测定细胞凋亡，如附图11所示，与对照组正常状态细胞为87.49%相比，当用藻蓝蛋白胶束处理以后，正常的C6细胞下降到5.98%，说明藻蓝蛋白胶束对脑癌C6细胞的有显著的抑制作用。同样的，b组的藻蓝蛋白与虫草素的混合液中正常细胞为77.49%，其效果远远不如c组的藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素组。这与我们通过细胞计数得到的结果相符合，更加印证了可能藻蓝蛋白与虫草素混合后产生了拮抗作用，而形成藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束后，其抗癌效果明显增加。

Claims (9)

1.一种抗脑癌的藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束，其特征在于，是首先采用美拉德反应的方法将藻蓝蛋白接枝到葡聚糖上，形成藻蓝蛋白-葡聚糖复合物；再通过自组装的机理，将虫草素包裹到藻蓝蛋白里面，自组装形成胶束制备得到；其中，所述葡聚糖和藻蓝蛋白的质量比为0.25～4：1。

2.根据权利要求1所述的藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束，其特征在于，所述葡聚糖和藻蓝蛋白的质量比为2～4：1。

3.根据权利要求2所述的藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束，其特征在于，所述葡聚糖和藻蓝蛋白的质量比为4：1。

4.根据权利要求1所述的藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束，其特征在于，所述美拉德反应的条件为50～70℃反应24～60h。

5.根据权利要求1所述的藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束，其特征在于，所述藻蓝蛋白和虫草素的质量比为10～30：1。

6.根据权利要求1所述的藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束，其特征在于，所述葡聚糖的分子量为65～75KD。

7.权利要求1～6任一所述藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.按照葡聚糖：藻蓝蛋白=0.25～4：1的质量比，将藻蓝蛋白和葡聚糖混合，加入去离子水，超声震荡至葡聚糖和藻蓝蛋白均完全溶解；

S2.将步骤S1所得混合溶液的pH值调至3～4.5，然后将混合溶液冷冻干燥；

S3.将步骤S2冷冻干燥所得的固体放在装有饱和KBr溶液的密闭容器中，置于50～70℃下进行美拉德反应24～60h，反应产物即为藻蓝蛋白-葡聚糖复合物；

S4.将藻蓝蛋白-葡聚糖复合物加去离子水溶解，得到藻蓝蛋白-葡聚糖共价结合物溶液，再按照藻蓝蛋白：虫草素=10～30：1的质量比，向溶液中加入虫草素，超声振荡4 h以上，即制得藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束。

8.根据权利要求7所述的制备方法制备得到的藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束。

9.权利要求1～6任一所述或权利要求8所述藻蓝蛋白-葡聚糖-虫草素胶束在制备抗脑癌药物中的应用。