CN102863556B

CN102863556B - 一种乳糖酸化甘草次酸壳聚糖材料及其制备方法和应用

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Publication number: CN102863556B
Application number: CN201210373371.5A
Authority: CN
Inventors: 程明荣; 何秉; 洪洋; 黄陶承; 顾勇
Original assignee: FIFTH PEOPLE'S HOSPITAL OF SHANGHAI FUDAN UNIVERSITY
Current assignee: FIFTH PEOPLE'S HOSPITAL OF SHANGHAI FUDAN UNIVERSITY
Priority date: 2012-09-27
Filing date: 2012-09-27
Publication date: 2014-09-17
Anticipated expiration: 2032-09-27
Also published as: CN102863556A

Abstract

本发明涉及一种乳糖酸化甘草次酸壳聚糖材料及其制备方法和应用，所述的乳糖酸化甘草次酸壳聚糖材料是选用壳聚糖作为载体，甘草次酸和乳糖酸作为配体，通过N-酰化反应，合成的甘草次酸和乳糖酸共修饰的壳聚糖材料。本发明还提供一种乳糖酸化甘草次酸壳聚糖/5-氟尿嘧啶载药纳米粒子。本发明优点在于：首次合成双配体共修饰的壳聚糖材料，并制成纳米粒子，进行靶向研究；乳糖酸化甘草次酸壳聚糖制备成纳米粒子后，比GA-CTS和CTS具有更强的肝靶向性和肝癌细胞受体介导的主动靶向性，能显著减少在其他脏器的分布，提高了肝癌靶向的可靠性，可以作为一种在医学临床中对肝癌的靶向治疗具有广阔应用前景的载体材料。

Description

一种乳糖酸化甘草次酸壳聚糖材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及高分子药物载体领域，具体地说，是一种乳糖酸化甘草次酸壳聚糖材料及其制备方法和应用。

背景技术

目前，国内外关于肝癌的研究主要集中在单配体修饰的聚合物制备载药（或基因）纳米粒子方面。如，以去唾液酸糖蛋白受体（ASGP-R）介导的肝靶向纳米粒子的研究，显示具有趋肝性，并且对肝癌也有一定的抑制作用，以甘草次酸受体介导的肝主动靶向也有同样的效果。然而这种单个配体修饰的纳米粒子在进行受体—配体相互作用时易受到许多病理及生理条件的变化而变化，从而导致受体介导作用的部分失效，影响靶向治疗的效果。如对于患肝脏疾病的病人，ASGP-R的密度和活性会降低，这是由于血清抑制剂的存在，而导致肝癌细胞的结合量降低大约95%，因此在病理条件下，单纯ASGP-R介导的肝主动靶向将会变得不那么有效。另外，并不是所有的靶向受体都仅仅在靶细胞上过量表达，这会导致单配体修饰纳米粒子与靶向受体结合的不足，Negishi等发现大鼠肝脏中含有最高的甘草次酸受体，而肾脏中也含有少量的甘草次酸受体。因此单个配体修饰的载体材料的低的转运率、有限的被受体特异性识别的能力等，仍是现阶段急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种乳糖酸化甘草次酸壳聚糖材料。

本发明的第二个的目的是，提供一种乳糖酸化甘草次酸壳聚糖材料的制备方法。

本发明的第三个目的是，提供一种乳糖酸化甘草次酸壳聚糖材料的制备方法的应用。

本发明的第四个目的是，提供一种乳糖酸化甘草次酸壳聚糖/5-氟尿嘧啶载药纳米粒子。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种乳糖酸化甘草次酸壳聚糖材料，所述的乳糖酸化甘草次酸壳聚糖材料是选用壳聚糖作为载体，甘草次酸和乳糖酸作为配体，通过N-酰化反应，合成的甘草次酸和乳糖酸共修饰的壳聚糖材料。

所述的乳糖酸化甘草次酸壳聚糖材料的制备方法包括以下步骤：

a、首先称取甘草次酸溶于DMF溶液中，并加入EDC·HCl和NHS进行活化，在磁力搅拌的条件下，将活化的甘草次酸溶液加入到壳聚糖溶液中，并在室温下反应，用丙酮静置沉淀后，再用乙醇、乙醚洗涤沉淀，室温真空干燥即得到甘草次酸壳聚糖材料；

b、将乳糖酸溶于TEMED·HCl溶液中，并加入EDC·HCl和NHS对乳糖酸的羧基进行活化，同时将GA-CTS溶液与被活化的乳糖酸溶液在磁力搅拌的条件下室温反应，溶液置于透析袋中用蒸馏水透析，冷冻干燥得到乳糖酸化甘草次酸壳聚糖材料。

所述的步骤a中甘草次酸壳聚糖合成的条件为：EDC·HCl与GA的摩尔比为0.6-2.4:1，EDC·HCl与NHS的摩尔比为0.4-2.5:1，GA与CTS的摩尔比为0.8-1.5:1，反应时间为1-3 d。

所述的步骤b为将乳糖酸溶于TEMED·HCl溶液中，并加入EDC·HCl和NHS对乳糖酸的羧基进行活化，同时将GA-CTS溶液与被活化的乳糖酸溶液在磁力搅拌的条件下室温反应中72小时后，溶液置于透析袋中用蒸馏水透析4天，每隔24小时更换一次透析液，冷冻干燥得到乳糖酸化甘草次酸壳聚糖材料。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：一种乳糖酸化甘草次酸壳聚糖材料的制备方法，所述的乳糖酸化甘草次酸壳聚糖材料的制备方法包括以下步骤：

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：所述的乳糖酸化甘草次酸壳聚糖材料作为载体材料在制备治疗肝靶向治疗药物中的应用，所述的乳糖酸化甘草次酸壳聚糖的浓度为0.005-0.05 mg/ml。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：一种乳糖酸化甘草次酸壳聚糖/5-氟尿嘧啶载药纳米粒子，所述的载药纳米粒子是由权利要求1-4任一所述的乳糖酸化甘草次酸壳聚糖材料，通过离子交联的方法，制成的载5-氟尿嘧啶的载药纳米粒子。

所述的载药纳米粒子的制备方法：称取乳糖酸化甘草次酸壳聚糖材料溶于醋酸溶液中，并用NaOH调节其pH值后，加入5-氟尿嘧啶于上述溶液中溶解，然后逐滴滴加TPP溶液于上述均匀混合的溶液中，室温低速磁力搅拌进行离子交联反应，并自发形成纳米粒子；将得到的纳米粒子悬浮液以10000转/分离心30分钟，然后用大量去离子水洗残留物，分散后再离心洗涤，然后重新分散在去离子水中，冷冻干燥，保存备用。

本发明优点在于：

1、首次合成双配体（甘草次酸和乳糖酸）共修饰的壳聚糖材料，并制成纳米粒子，进行靶向研究，为新型肝癌靶向给药系统的设计与制备提供理论基础和科学依据，并丰富了肝靶向给药系统的内容，为临床肝癌的靶向治疗奠定实验基础；

2、本发明的乳糖酸化甘草次酸壳聚糖制备成纳米粒子后，比GA-CTS和CTS具有更强的肝靶向性和肝癌细胞受体介导的主动靶向性，能显著减少在其他脏器的分布，提高了肝癌靶向的可靠性，可以作为一种在医学临床中对肝癌的靶向治疗具有广阔应用前景的载体材料。

附图说明

图1. 乳糖酸化甘草次酸壳聚糖的N-酰化反应机理。

图2. GA-CTS在EDC·HCl/NHS交联剂介导下的反应机理。

图3. GCGA的合成路线及机理。

图4. GA-CTS、CTS和GA的红外光谱图。

图5. 通过正交实验设计法合成的九组GA-CTS的红外光谱图。

图6. GCGA、GA-CTS和LA的红外光谱图。

图7. GCGA和CTS的核磁共振氢谱图，其中，★是乳糖酸特征峰，●是壳聚糖的特征峰，▲是甘草次酸的特征峰。

图8. 不同浓度下CTS和GCGA材料对L929细胞由MTT得到的OD值。

图9. FITC标记的CTS、GA-CTS和GCGA纳米粒子的扫描电镜照片。

图10. FITC标记的CTS、GA-CTS和GCGA纳米粒子的粒径分布。

图11. 三种纳米粒子与BEL-7402细胞共孵育2 h的流式细胞仪分析结果，a，无纳米粒子阴性对照组；b，GCGA纳米粒子组；c，GA-CTS纳米粒子组；d，CTS纳米粒子组，GCGA纳米粒子组与GA-CTS有显著显著性差异（P <0.05），与CTS组有高度显著性差异（P <0.01）。

图12. 三种纳米粒子与BEL-7402细胞共孵育4 h 的激光共聚焦显微镜照片。

图13. GCGA纳米粒子分别与BEL-7402和LO2细胞共孵育4 h的流式细胞仪分析结果，其中a，BEL-7402中无GCGA纳米粒子组；b，BEL-7402细胞中GCGA纳米粒子组；c，LO2细胞中无GCGA纳米粒子组；d，LO2细胞中GCGA纳米粒子组。BEL-7402和LO2细胞之间的流式结果具高度有显著性差异（P<0.01）。

图14. GCGA纳米粒子分别与BEL-7402和LO2细胞共孵育4 h的激光共聚焦显微镜照片。

图15. 荧光标记CTS、GA-CTS和GCGA纳米粒子在大鼠体内分布的荧光图像。

图16. CTS、GA-CTS和GCGA载5-Fu纳米粒子的粒径分布。

图17. CTS（A）、GA-CTS（B）和GCGA（C）载5-Fu纳米粒子的扫描电镜图片及其悬浮液静置4 d后拍摄实物照片。

图18. 5-Fu在PBS缓冲溶液中的最大紫外吸收峰和及其标准曲线。

图19. GCGA载5-Fu纳米粒子和纯5-Fu的药物释放。

图20. GCGA载5-Fu纳米粒子可能的结构。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

本发明中：甘草次酸（GA）；乳糖酸（LA）；壳聚糖（CTS）；乳糖酸化甘草次酸壳聚糖（GCGA）；N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）。

实施例1 乳糖酸化甘草次酸壳聚糖的合成及结构表征

本实施例选择壳聚糖（CTS）作为基体材料，甘草次酸（GA）和乳糖酸（LA）作为肝靶向配体，并通过N-酰化反应的方法分两步把甘草次酸和乳糖酸分别接枝到壳聚糖上，达到对肝癌细胞的主动靶向的目的。为了优化反应条件，获得合适的接枝率，本实验设计了四因素三水平L₉(3⁴)正交试验，考查EDC·HCl与NHS物质的量的比、EDC·HCl与GA物质的量的比、GA与CTS物质的量的比以及反应时间对接枝率的影响，用傅立叶红外测试（IR）和核磁共振氢谱（¹H-NMR）验证此双配体修饰的壳聚糖材料是否合成成功，并计算其取代度。然后通过采用图像分析系统测定CTS、甘草次酸壳聚糖（GA-CTS）和乳糖酸化甘草次酸壳聚糖（GCGA）表面的水接触角，为后续纳米粒子的制备与分析奠定研究基础。

1.实验方法

1.1实验试剂与仪器

主要药品：壳聚糖（CTS），脱乙酰度91%，粘性78mPa.s，浙江澳兴生物科技有限公司；甘草次酸（GA），含量≥97%，西安富捷药业有限公司；乳糖酸（LA），含量97% ，美国Sigma-Aldrich公司；二甲基甲酰胺（DMF），分析纯，美国Amresco公司；四甲基乙二胺（TEMED），分析纯，加拿大Bio Basic公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl），含量99.5%，上海共价化学科技有限公司；N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），含量99.6%，上海共价化学科技有限公司。

主要仪器：傅立叶红外光谱仪，核磁共振仪，冷冻干燥机，磁力加热搅拌器，生物医学冷冻柜，生化培养箱，数显恒温水浴锅，pH 计，真空干燥箱，理化干燥箱，分析天平。

1.2材料合成

1.2.1甘草次酸壳聚糖的合成

首先称取一定质量的甘草次酸溶于DMF溶液中，并加入EDC·HCl和NHS进行活化，在磁力搅拌的条件下，将活化的甘草次酸溶液加入到壳聚糖溶液中，并在室温下反应一定时间后，用丙酮静置沉淀后，再用乙醇、乙醚洗涤沉淀，室温真空干燥即得到甘草次酸壳聚糖（GA-CTS）材料。

1.2.2正交试验设计

在材料的合成中考虑到最终产物的需要，在第一步的GA-CTS材料的合成中考察较为合适的氨基取代度，本研究选择四因素三水平L₉(3⁴)正交试验设计，来优化酰胺化反应的工艺条件，对EDC·HCl与NHS物质的量的比、EDC·HCl与GA物质的量的比、GA与CTS物质的量的比以及反应时间对氨基取代度的影响等因素进行了考察。正交试验设计的试验因素与水平如表1所示。

表1 GA-CTS合成中正交试验设计的因素水平表

1.2.3 GCGA材料的合成

GCGA材料是在GA-CTS材料上进一步接枝上乳糖酸，按照GA-CTS合成的正交设计试验中的最佳方案进行GCGA的合成。即将LA溶于TEMED·HCl溶液中，并加入EDC·HCl和NHS对乳糖酸的羧基进行活化。同时将GA-CTS溶液与被活化的乳糖酸溶液在磁力搅拌的条件下室温反应72小时后，溶液置于透析袋中用蒸馏水透析4天，每隔24小时更换一次透析液，冷冻干燥得到GCGA材料。

1.3材料性能的测试与表征

1.3.1氨基取代度的测定（DS）

准确称取100-200 mg已烘干至恒重的甘草次酸壳聚糖样品，加入足量的0.1 mol/L的HCl溶液，搅拌至完全溶解，再加入30 ml的蒸馏水，然后以0.1 mol/L的标准NaOH溶液进行滴定，同时记录下消耗NaOH的体积和溶液的pH值，然后根据所测试的结果作出pH-V_NaOH滴定曲线及其一级微商曲线，找出其突跃点并计算两突跃点间消耗的NaOH溶液体积之差，由下式计算出取代度。

式中，DS：为甘草次酸壳聚糖的取代度；△V（ml）：为两突跃点间消耗的NaOH体积之差；C_NaOH（mol/L）：为NaOH的浓度；16：为氨基的相对分子质量；m（g）：为样品的质量；0.0994：为理论氨基含量。

1.3.2傅立叶红外测试（IR）

将壳聚糖（CTS）、甘草次酸壳聚糖（GA-CTS）以及乳糖酸化甘草次酸壳聚糖（GCGA）等样品的粉末以KBr压片，用Nexus型傅里叶变换红外光谱仪记录各样品的红外光谱图，测量范围为4000-400 cm^-1。

1.3.3核磁共振氢谱测试（¹H-NMR）

为了进一步验证合成所获得的终产物的化学结构，采用核磁共振氢谱的方法分别对壳聚糖（CTS）和乳糖酸化甘草次酸壳聚糖（GCGA）进行测试。其测试分析的方法和条件为：分别将样品溶于氘代盐酸与重水的混合溶液中，以TMS为内标，¹H-NMR的频率设定为600 MHz。甘草次酸和乳糖酸在壳聚糖上的取代程度最终通过其¹H-NMR的特征峰的分配进行计算（mol%）。

1.3.4材料表面润湿角的测定

壳聚糖（CTS）、甘草次酸壳聚糖（GA-CTS）以及乳糖酸化甘草次酸壳聚糖（GCGA）三种材料的亲水性能，采用图像分析系统对材料表面润湿角（水接触角）进行测定。

2.结果与讨论

2.1乳糖酸化甘草次壳聚糖的反应机理

在乳糖酸化甘草次酸壳聚糖（GCGA）的合成过程中，我们采用两步N-酰化合成方法得到。第一步为甘草次酸修饰壳聚糖（GA-CTS）的合成，第二步为乳糖酸修饰甘草次酸壳聚糖（GCGA）的合成。其中甘草次酸（GA）和乳糖酸（LA）为酰化剂，由于其羰基上电子位移的结果，使碳上带有部分正电荷，是一个亲电试剂，反应的中心在羰基碳原子上。壳聚糖作为被酰化物，其氨基中N原子的亲核能力较羟基的O原子为强，具有未共用电子对，是一个亲核试剂。在N-酰化反应的过程中，以亲核试剂壳聚糖为底物，带正电荷的甘草次酸和乳糖酸中的羰基碳原子向壳聚糖氨基N原子上的未共用电子对作亲电进攻，形成过渡态，最后脱去H₂O形成酰胺，其反应过程如图1所示。

羧酸是一个弱酰化剂，未完全脱乙酰的壳聚糖在进行接枝后空间位阻增大会降低反应活性，为了提高N-酰化反应的活性和效率，反应中加入水溶性的EDC·HCl/NHS化学交联剂，其具有无毒、生物相容性良好、产物易清洗等优点，所以在用于羧基与伯胺的N-酰化反应，已在生物化学领域获得广泛的用途，如将半抗原结合于载体蛋白形成免疫抗原、通过与核酸5'位的磷酸基团反应形成氨基反应活性的NHS-酯、在多肽合成中形成酰胺键等。在本研究的两步合成中，通过增加EDC·HCl/NHS，可以将羧基转变为氨基反应活性的NHS酯，这步反应通过将EDC·HCl、含羧基分子以及NHS混合即可实现。然后再和含氨基分子进行反应，即可形成酰胺键。

2.1.1甘草次酸壳聚糖的合成

甘草次酸壳聚糖（GA-CTS）的合成路线及反应机理如图2所示，EDC·HCl首先将甘草次酸（GA）上的羧基（-COOH）进行活化，形成不稳定的氨基反应活性的GA-O-酰基脲中间体（图2，①）。该中间体可以与壳聚糖的氨基（–NH₂）进行反应，通过酰胺健形成这两个化合物的键合物（图2，③）。然而GA-O-酰基脲在水溶液中并不稳定，只能短暂存在，然后则会很快水解并重新释放出羧基基团，又形成了GA（图2，②），因此如果在反应中只加入EDC·HCl，则反应物之间就不能进行有效地交联，水解过程将会和酰胺化反应竞争，大大降低反应效率。通过加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，可以保护活化了的羧基使其变得稳定，从而大大提高EDC·HCl介导的缩合反应的效率，并将GA-O-酰基脲中间体转化为氨基反应活性的NHS酯（GA–CO–O–NHS）（图2，④）。这种氨基反应活性的NHS酯中间体非常稳定，可以与壳聚糖的氨基进行酰化反应，生成稳定的酰胺键（GA–CO–NH–CTS），得到甘草次酸壳聚糖（GA-CTS）（图2，⑤）。

2.1.2乳糖酸化甘草次酸壳聚糖的合成

乳糖酸化甘草次酸壳聚糖的合成机理与上述甘草次酸壳聚糖的合成机理类似，均为N-酰化反应，如图3所示。

2.2甘草次酸修饰壳聚糖的分析

2.2.1甘草次酸壳聚糖的红外谱图

图4为甘草次酸（GA）、壳聚糖（CS）和甘草次酸壳聚糖（GA-CTS）的红外光谱图。其中，在甘草次酸的红外谱图中，1386 cm^-1和1367 cm^-1处出现了齐墩果烷型五环三萜骨架的 A 区和 B 区，此特征峰为C4连接的偕二甲基的C-H面内弯曲振动吸收峰，1664 cm^-1为C11羰基的P-π共轭吸收峰，1706 cm^-1出现的特征峰为C30羧基的吸收峰，在3440 cm^-1出现的强吸收峰为C3羟基的伸缩振动吸收峰。

壳聚糖的红外谱图显示了酰胺键的三个特征吸收峰，即酰胺Ⅰ（1655 cm^-1）、酰胺Ⅱ（1600 cm^-1）和酰胺Ⅲ（1323 cm^-1），弱的酰胺Ⅰ吸收峰和很强的酰胺Ⅱ吸收峰意味着壳聚糖具有高的脱乙酰度。在1155 cm^-1（C–O–C的反对称伸缩振动吸收峰）、1078 cm^-1和1025 cm^-1（C-O伸缩骨架振动)）出现了糖类的特征吸收峰。O-H和N-H的伸缩振动吸收峰出现在3440 cm^-1。2877 cm^-1为C-H的伸缩振动峰。

对比壳聚糖的红外谱图，甘草次酸壳聚糖中的酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ的峰均发生了红移（酰胺键的吸收峰Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ则分别从1655 cm^-1、1600 cm^-1、1323 cm^-1移至1654 cm^-1、1560 cm^-1、1314 cm^-1），并且酰胺Ⅰ的峰变的更加锐利而酰胺Ⅱ的峰强度却变弱，另外，甘草次酸羧基的吸收峰（1706 cm^-1）也随之消失，这些光谱的改变是由于甘草次酸的羧酸基团和壳聚糖的氨基反应形成了酰胺键。

2.2.2甘草次酸壳聚糖合成的正交设计实验

通过正交试验设计L₉(3⁴)的方法，我们合成了甘草次酸壳聚糖，考察了各因素（EDC·HCl︰GA，EDC·HCl︰NHS，GA︰CTS和反应时间）对试验指标（甘草次酸壳聚糖的取代度）的影响。图5为正交试验设计的九组实验产物（GA-CTS）的红外光谱图。从图中可知，九组的实验产物在1500～1600 cm^-1区间都有两个峰，均为酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ。由上节2.2.1的分析，与壳聚糖的红外图谱相比较，接枝甘草次酸后，酰胺键的特征吸收峰均发生了不同程度的改变，说明了甘草次酸已接枝到壳聚糖上。

正交试验设计的结果和极差分析可知，各因素对取代度影响的重要程度的顺序为反应时间＞EDC·HCl︰NHS＞EDC·HCl︰GA＞GA︰CTS；为了在甘草次酸壳聚糖（GA-CTS）合成中获得较高的取代度，由均值分析可知，甘草次酸壳聚糖合成的最佳条件为EDC·HCl与GA的摩尔比为1.2︰1、EDC·HCl与NHS的摩尔比为1︰1、GA与CTS的摩尔比为1︰1、反应时间为3 d。

2.3乳糖酸化甘草次酸壳聚糖的分析

2.3.1红外光谱分析

图6为乳糖酸（LA）、甘草次酸壳聚糖（GA-CTS）和乳糖酸化甘草次酸壳聚糖（GCGA）的红外图谱。与乳糖酸和甘草次酸壳聚糖的红外谱图进行对比，在乳糖酸化甘草次酸壳聚糖的红外光谱中，乳糖酸中的羰基（C=O）伸缩振动特征吸收峰（1740 cm^-1）消失，取而代之的是新增的1726 cm^-1酯键特征吸收峰，3400 cm^-1处的O-H伸缩振动吸收峰也大幅度减弱，甘草次酸壳聚糖在1654 cm^-1的酰胺Ⅰ、1560 cm^-1的酰胺Ⅱ和1315 cm^-1的酰胺Ⅲ特征吸收峰也发生了轻微的红移，分别移到了1640 cm^-1、1550 cm^-1和1312 cm^-1，这些分子间结构的变化说明了乳糖酸成功接枝在甘草次酸壳聚糖中。为了进一步证实甘草次酸和乳糖酸已成功接枝到壳聚糖链上，再通过核磁共振氢谱进行表征。

2.3.2核磁共振氢谱分析

壳聚糖（CTS）和乳糖酸化甘草次酸壳聚糖（GCGA）的核磁共振氢谱（¹H-NMR）见图7。与壳聚糖的谱图相比较，在乳糖酸化甘草次酸壳聚糖的谱图中，出现了一些新的来自于甘草次酸和乳糖酸的特征峰。在化学位移1.410 ppm处出现了强的特征峰，这是甘草次酸角甲基（-CH₃）中的质子所对应的。1.990 ppm处的化学位移为甘草次酸基团中C9处的质子峰（如图7中▲所示），这是由于在甘草次酸中该处是唯一个其邻近的碳均为季碳的叔碳，故其呈现一个特征的单峰信号。3.895 ppm和3.890 ppm的特征峰是乳糖酸基团和壳聚糖主链相连处开环的吡喃葡萄糖的次甲基（-CH(OH)-）中的质子峰（图7中★所示）。壳聚糖的原乙酰胺基团中甲基的质子峰出现在1.906 ppm（图7中●所示）。综上表明，在壳聚糖链的氨基上成功的接枝了甘草次酸和乳糖酸。

根据GCGA ¹H-NMR图中甘草次酸和乳糖酸的特征质子峰的积分面积分别于壳聚糖的特征质子峰的积分面积的比值可以计算出GCGA中甘草次酸（GA）和乳糖酸（LA）的取代度（Degree of Substitution，DS）。经过计算可得接枝到壳聚糖上的甘草次酸和乳糖酸的取代程度分别为13.77 mol%和16.74 mol%。

3.结论

通过N-酰化反应方法首次合成了具有两亲性的乳糖酸化甘草次酸壳聚糖（GCGA），我们认为是以亲核试剂壳聚糖为底物，带正电荷的甘草次酸和乳糖酸中的羰基碳原子向壳聚糖氨基N原子上的未共用电子对作亲电进攻，形成过渡态，最后脱去H₂O形成酰胺，并对催化剂EDC·HCl与NHS的作用机理进行了探讨。

采用FT-IR和¹H-NMR对GCGA的化学结构进行了分析，分析结果表明甘草次酸和乳糖酸接枝成功，并由¹H-NMR中各特征峰的积分，计算得到甘草次酸和乳糖酸的取代度分别为13.77 mol%和16.74 mol%。

通过正交试验的方法研究了各因素在N-酰化反应中对取代度的影响。各因素对取代度影响的重要程度的顺序为：反应时间＞EDC·HCl︰NHS＞EDC·HCl︰GA＞GA︰CTS；甘草次酸壳聚糖合成的最佳条件为：EDC·HCl与GA的摩尔比为1.2︰1、EDC·HCl与NHS的摩尔比为1︰1、GA与CTS的摩尔比为1︰1、反应时间为3 d。

接触角测试的结果显示壳聚糖本身即为一种亲水性材料，其接触角显著大于乳糖酸化甘草次酸壳聚糖，而稍微小于甘草次酸壳聚糖，这些变化归因于接触角不仅与材料表面的亲水性有关（甘草次酸为疏水性，乳糖酸为亲水性），还与其表面的粗糙度有关（甘草次酸、乳糖酸的接枝改变了壳聚糖薄膜表面的粗糙程度），因此接触角受这些综合因素的影响。

实施例2体外细胞实验及大鼠体内分布研究

为了考察乳糖酸化甘草次酸壳聚糖（GCGA）作为药物载体的靶向性及其制成纳米粒子后被肝癌细胞摄取的情况。本实施例先通过MTT法评价该载体材料对L929细胞的毒性。然后将FITC分别接枝到壳聚糖（CTS）、甘草次酸壳聚糖（GA-CTS）和GCGA上，合成了FITC标记的CTS、GA-CTS和GCGA，并由离子交联的方法制备了FITC标记的无配体修饰的CTS纳米粒子、单配体修饰的GA-CTS纳米粒子和双配体修饰的GCGA纳米粒子。用流式细胞分析仪和激光共聚焦显微镜研究BEL-7402人肝癌细胞对FITC标记的CTS、GA-CTS和GCGA纳米粒子的摄取情况，并对比了LO2人正常肝细胞对GCGA纳米粒子的摄取情况，并研究了三种纳米粒子在大鼠体内的分布。

1.实验方法

1.1 实验试剂与仪器

主要药品：壳聚糖（CTS），脱乙酰度91%，粘性78mPa.s，浙江澳兴生物科技有限公司；甘草次酸壳聚糖（GA-CTS），自制（实施例1）；乳糖酸化甘草次酸壳聚糖（GCGA），自制（实施例1）；异硫氰酸荧光素（FITC），分析纯，美国Sigma-Aldrich公司；RPMI 1640培养基干粉培养基，美国Hyclone Labs；噻唑蓝（MTT），分析纯，美国Sigma-Aldrich公司；青链霉素双抗，分析纯，美国Sigma-Aldrich公司；荧光染料Hoechst 33258，分析纯，美国Sigma-Aldrich公司；胎牛血清（FBS），含量99.5%，美国Hyclone Labs；PBS缓冲液，pH=7.2-7.6，博士德生物工程有限公司；二甲基亚砜（DMSO），分析纯，美国AMRESCO 公司；多聚磷酸钠（TPP），含量≥98%，阿拉丁试剂有限公司；人肝癌细胞，BEL-7 402 美国模式培养物集存库；小鼠成纤维细胞，L929，美国模式培养物集存库；人正常肝细胞 LO2，中国科学院细胞文库菌物保藏中心。

本实验所用主要仪器：二氧化碳培养箱，全温振荡培养箱，场发射扫描电子显微镜，动态光散射激光粒度和ZETA电位分析仪，全波长酶标仪，流式细胞分析仪，激光共聚焦显微镜，蔡司双光子共聚焦荧光显微镜，莱卡冰冻切片机，电子秤，低速冷冻离心机，生物超净工作台，生物医学冷冻柜，生化培养箱，pH 计，冷冻干燥机，磁力加热搅拌器，立式高压蒸汽灭菌锅，倒置相差显微镜，理化干燥箱，分析天平。

1.2细胞培养

将L-929小鼠成纤维细胞、BEL-7402人肝癌细胞和LO2人正常肝细胞培养于含有体积分数为10%的胎牛血清（FBS）和体积分数为1%的青链霉素双抗溶液（其中还有100 U/ml的青霉素G和100 μg/mL的链霉素）的RPMI 1640培养基中，置于37 ℃，5% CO₂和相对湿度为95%的二氧化碳培养箱中培养。根据细胞的生长状态，每隔一定的时间进行换液、传代以保证细胞良好生长状态。

1.3细胞毒性测试（MTT）

1.3.1样品的处理

本实施例实验中所用的RPMI 1640培养基为双倍的，并调节其pH为6.8，保证材料在此种培养基中较好的溶解性，以及与MTT实验中单倍培养基相匹配。壳聚糖（CTS）和乳糖酸化甘草次酸壳聚糖（GCGA）分别溶解在0.5%的醋酸溶液中，再用0.5%的醋酸溶液依次稀释成不同的浓度，即0.01，0.05，0.1，0.2，0.5和1 mg/ml，并调节其pH值为6.8，得到原液。然后将原液用等体积的双倍的RPMI 1640培养基（pH=6.8）进行稀释，即得到用于MTT实验的一系列不同浓度（0.005，0.025，0.05，0.1，0.25和0.5 mg/ml）的材料溶液。

1.3.2 MTT实验

取对数生长期的L-929小鼠成纤维细胞，用胰酶消化后加培养液稀释，按每孔8000个的细胞密度接种在96孔培养板中，培养箱中预培养24 h，待细胞贴壁生长后，吸弃培养板中的细胞培养液，分别加入6种不同浓度（0.005，0.025，0.05，0.1，0.25和0.5 mg/ml）的材料溶液，每孔加入量为200 μl，每个剂量设定6个复孔，孵育20 h后，每孔再加入20 μl 5 mg/ml的MTT溶液（用PBS作为溶剂），继续孵育4 h后，吸弃上清液，每孔中加入200 μl的DMSO溶液，终止培养，将培养板水平振荡10 min使结晶物充分溶解。由不含材料溶液在RPMI 1640培养基中（pH=6.8）的细胞作为阴性对照组。用酶标仪测定样品的吸光度（OD值），其中波长为550 nm，参考波长为690 nm。

1.4体外细胞摄取实验

1.4.1荧光标记的CTS、GA-CTS和GCGA的合成

称取一定量的异硫氰酸荧光素（FITC）溶于无水乙醇中，在磁力搅拌的条件下，加入到壳聚糖的溶液中，避光反应3 h。用NaOH溶液调节反应体系的pH值出现沉淀，反复离心并洗涤沉淀，直到上清液没有荧光物质被检测到为止。再将得到的沉淀溶溶解，置于透析袋中（MWCO，8000–14000），用蒸馏水透析3天，每隔24小时更换一次透析液，冷冻干燥，即得到FITC标记的壳聚糖材料，FITC标记的GA-CTS和GCGA材料的合成方法同上。

1.4.2 FITC标记的CTS、GA-CTS和GCGA纳米粒子的制备

称取一定量的 FITC标记的壳聚糖材料，溶于1% (v/v) 的醋酸溶液中，得到FITC标记的壳聚糖溶液，用NaOH溶液调节其pH值，在磁力搅拌条件下，将多聚磷酸钠（TPP）溶液加入上述溶液中，继续反应一段时间后，离心分离出纳米粒子，冷冻干燥，保存在4 ℃的冰箱中。FITC标记的GA-CTS和GCGA纳米粒子的制备方法同上。

1.4.3 FITC标记的CTS、GA-CTS和GCGA纳米粒子的表征

形貌观察：取FITC标记的CTS、GA-CTS和GCGA纳米悬浮液，过滤后滴在锡箔纸上，烘干后用扫描电子显微镜进行形态学观察；粒径分布和zeta电位：取制备后的FITC标记的CTS、GA-CTS和GCGA纳米悬浮液原液，用激光粒度测试仪测定纳米粒子的粒径大小、粒径分布和zeta电位。

1.4.4 纳米粒子的处理

将FITC标记的CTS、GA-CTS和GCGA纳米粒子分别分散在0.01 M的无菌PBS缓冲溶液中，然后用不含血清的细胞培养基稀释成所需的浓度，并将其与细胞共培养，在孵育阶段，用0.01 M的PBS进行清洗，以除去多余的游离纳米粒子。

1.4.5 流式细胞仪检测细胞对纳米粒子的摄取

将BEL-7 402细胞和LO2细胞以每孔2×10⁵个的密度接种于6孔培养板中，孵育24 h，然后分别加入一定量的FITC标记的CTS、GA-CTS和GCGA纳米粒子，继续培养4 h。避光条件下，除去孵育液，用胰酶消化后，将细胞悬浮在0.5 ml的新鲜培养基中，即时用流式细胞仪在激发波长488 nm处检测荧光强度，每个样品被检测细胞数不少于1×10⁴个细胞，没有用纳米粒子处理的细胞作为阴性对照，通过PASW Statistics 18.0分析实验结果，每个实验重复三次。

1.4.6 细胞染色与成像实验

两种类型的细胞（BEL-7 402细胞和LO2细胞）分别接种在6孔板中（每个孔中均放置一个干净的圆形盖玻片），孵育24 h。然后加入新鲜的培养基，其中分别含有不同的FITC标记的纳米粒子（CTS、GA-CTS和GCGA纳米粒子），继续孵育4 h。此后，用4%的多聚甲醛在室温下固定细胞20 min后，将细胞核用荧光染料Hoechst 33258进行染色，并用0.01 M的PBS清洗三次，用小镊子取出盖玻片，并将其放在一个玻璃载玻片上，用甘油缓冲溶液封片后，通过激光共聚焦显微镜观察样品的荧光图像，对荧光标记的纳米粒子的激发波长为488 nm，对荧光染料Hoechst 33258的波长为405 nm，并用NIS元素成像软件对拍下的图像进行叠加处理。

1.5体内分布实验

准备20只60~80 g 购于华中科技大学同济医学院动物实验中心的SD大鼠，随机分为4组，5只/组，第一组为阴性对照组：仅注射等体积的生理盐水；第二组为FITC标记的CTS 纳米粒子组；第三组为FITC标记的GA-CTS 纳米粒子组；第四组为FITC标记的GCGA 纳米粒子组。准确称量SD大鼠体重后，经尾静脉注射药物，4 h后处死，迅速取肝、脾、肾、心、肺、脑和骨骼肌组织，快速冰冻切片，切片厚度为10 μm。切片经4% 的多聚甲醛固定后，予以Hoechst 33258染色5min，并用PBS漂洗三次，立即在共聚焦显微镜下观察绿色荧光分布情况，并对比各组间的荧光变化。

2.结果与讨论

2.1 MTT实验结果分析

壳聚糖（CTS）和乳糖酸化甘草次酸壳聚糖（GCGA）的细胞毒性测试结果如图8所示。当双靶向材料的浓度在0.005-0.05 mg/ml范围内时，细胞相对增值率＞75%（通过公式OD_实验组/OD_对照组计算），毒性评分均为1级，显示无细胞毒性。

2.2 FITC标记的纳米粒子表征与分析

2.2.1纳米粒子的表征

FITC标记的CTS、GA-CTS和GCGA纳米粒子由离子交联的方法制备，研究了其粒径分布和zeta电位，并通过扫面电镜观察其表面形貌。如图9所示，三种纳米粒子呈规则球形，表面有凹凸，分散性好。图10为三种纳米粒子的粒径分布图，其中，FITC标记的GCGA纳米粒子的平均粒径为213.5 nm，小于CTS纳米粒子的平均粒径（248.3 nm），而大于GA-CTS纳米粒子的平均粒径（180.4 nm），造成这种现象的原因可能是因为壳聚糖上接枝的具有疏水性的甘草次酸基团和亲水性的乳糖酸基团与溶液中水分子相互作用的结果。FITC标记的CTS、GA-CTS和GCGA纳米粒子的粒径在100-500 nm均有一个主要的粒径分布范围，其zeta电位分别为45.6 mV、30.6 mV和33.4 mV，这说明所制备的纳米粒子具有较好的稳定性，并且较容易被细胞摄取。

2.2.2 肝靶向纳米粒子的分析

在这项研究中，甘草次酸和乳糖酸均至少具有两个作用。乳糖酸不但作为一个亲水性基团（甘草次酸作为一个疏水性基团），而且还具有肝靶向作用。乳糖酸由于具有亲水性，而甘草次酸由于具有疏水性，作为疏水内核会大量存在于GA-CTS纳米粒子或GCGA纳米粒子的内部，然而这些纳米粒子的表面是否仍然存在甘草次酸基团对于本课题研究的具有肝靶向作用的载体具有至关重要的意义。尽管本研究并没有直接给出GA-CTS纳米粒子或GCGA纳米粒子的表面存在甘草次酸基团的依据，但我们由一些研究可以总结出仍有部分甘草次酸基团分散在GA-CTS纳米粒子或GCGA纳米粒子的表面，这对于具有单靶向作用的GA-CTS纳米粒子和具有双靶向作用的GCGA纳米粒子识别肝细胞表面的甘草次酸受体，达到主动靶向肝脏的目的是十分重要的。Chiu等制备了N-棕榈酰化壳聚糖（NPCS）纳米粒子，并且证实有部分棕榈酰基团存在于微球的表面，它能和细胞膜进行相互作用；Park等把叶酸偶联到甲氧基聚乙二醇/聚己内酯（MPEG/PCL）胶束的疏水部分，也发现具有疏水性的叶酸配体仍然部分暴露在微球的表面；为了研究甘草次酸基团是否存在于甘草次酸修饰海藻酸钠纳米粒子（GA-ALG NPs）的表面，张闯年等先将乙二胺修饰到甘草次酸的羧基上，然后再遇海藻酸钠偶合，制备了GA-ALG NPs，然后通过X射线光电子能谱测定了在GA-ALG NPs表面的氮元素（来自乙二胺中的氮元素）的含量为1.1%，这很好的证实了部分甘草次酸基团仍然存在于GA-ALG NPs的表面。综上所述，本研究中的GCGA或GA-CTS材料制成纳米粒子后表面仍然存在一定量的甘草次酸基团。

2.3 纳米粒子的体外细胞摄取

双配体修饰的纳米粒子—乳糖酸化甘草次酸壳聚糖（GCGA）纳米粒子的表面同时存在甘草次酸（GA）与乳糖酸（LA）两种配体，乳糖酸由于含有半乳糖残基，其在肝实质细胞膜表面过量表达，而且在分化的肝癌细胞膜表面也有表达，因此可通过受体介导的主动靶向作用，引导GCGA纳米粒子富集至肝脏并可靶向至肝癌细胞；甘草次酸对应的受体在癌细胞表面过量表达，显著高于临近的非肿瘤细胞，因而也可以经受体介导将纳米粒子输送至肝癌细胞。所以GA与LA均具有肝癌细胞的亲和作用，从而使纳米粒子在肝癌细胞中的分布显著提高。为了验证GCGA纳米粒子对肝脏癌细胞的靶向性，本研究即以人正常肝细胞LO2和人肝癌细胞BEL-7402为模型，通过流式细胞仪定量的分析BEL-7402人肝癌细胞和LO2人正常肝细胞对GCGA纳米粒子的内吞作用，荧光强度与细胞内吞的纳米粒子的数量成正比，并用共聚焦显微镜进行定性观察。

2.3.1 GCGA纳米粒子的体外高效肝靶向性

BEL-7402细胞对三种荧光标记的纳米粒子的内吞作用用流式细胞分析仪进行定量分析，如图11所示，BEL-7402细胞与双配体修饰的GCGA纳米粒子孵育后的平均荧光强度为37919，该细胞被单配体修饰的GA-CTS纳米粒子处理后的平均荧光强度降到了27137.67，而被无配体修饰的CTS纳米粒子处理后的平均荧光强度降到了更低值，为17763.33（无任何纳米粒子处理的细胞的平均荧光强度＜200，作为对照组），被GCGA纳米粒子处理的BEL-7402细胞的平均荧光强度是GA-CTS纳米粒子的1.43倍，是CTS纳米粒子的2.00倍。相比较CTS和GA-CTS纳米粒子，BEL-7402细胞有更强摄取GCGA纳米粒子的能力， GA-CTS纳米粒子次之。综上分析可知，与无配体修饰的CTS纳米粒子相比，单配体修饰的GA-CTS纳米粒子对肝癌细胞（BEL-7402细胞）有着较强的细胞亲和力，而双配体修饰的GCGA纳米粒子有着最强的亲和力，可获得最大的细胞摄取量，这是由于肝癌细胞膜表面具有甘草次酸和半乳糖（乳糖酸含有半乳糖残基）的受体，有配体修饰的纳米粒子主要通过受体介导的主动转运被肝癌细胞所摄取，而双配体修饰的GCGA纳米粒子有两种配体-受体（ASGP-R和甘草次酸受体）结合的方式，使它有更多的途径通过受体介导的内吞作用进入细胞内，从而提高了肝癌细胞膜表面受体特异性识别配体的几率。

为了进一步的证实双配体修的GCGA纳米粒子对BEL-7402细胞有着更强的亲和性，通过共聚焦显微镜观察FITC标记的纳米粒子作用细胞4 h后的肝癌细胞摄取纳米粒子的情况，图12为BEL-7402细胞与FITC标记的CTS、GA-CTS和GCGA纳米粒子，孵育4 h后的激光共聚焦显微镜扫描照片。由图片清晰可见，细胞摄取4 h后，双配体修饰的GCGA纳米粒子在BEL-7402细胞中可观察到较强的绿色荧光亮点，而且大量纳米粒子被内化进细胞内部，单配体修饰的GA-CTS的纳米粒子有中等强度的绿色荧光亮点，而无配体修饰的壳聚糖纳米粒子仅能看到少量的绿色荧光点，共聚焦显微镜的分析结果与流式细胞仪一致，证实双配体修饰的GCGA纳米粒子具有最强的肝癌细胞靶向性，通过受体介导的内吞作用，内化进细胞。

2.3.2 GCGA纳米粒子的靶向细胞摄取

本节对比研究了BEL-7402人肝癌细胞和LO2人正常肝细胞（有甘草次酸受体缺陷的细胞株）对双配体修饰的GCGA纳米粒子的摄取情况，以深入研究GCGA纳米粒子对肝癌细胞的特异靶向性。如图13所示，与阴性对照组（BEL-7402细胞中无GCGA纳米粒子）相比，含GCGA纳米粒子组中BEL-7402肝癌细胞中的的荧光强度有着显著性的位移，其平均荧光强度为对照组的164.15倍；而LO2正常肝细胞中荧光强度有一个不显著的位移，其平均荧光强度仅是对照组（LO2细胞中无GCGA纳米粒子）的9.08倍，这意味着BEL-7402肝癌细胞摄取GCGA纳米粒子的能力是LO2正常肝细胞的18.08倍，GCGA纳米粒子对人肝癌细胞具有更强的亲和性和特异性，这是由于肝细胞表面存在甘草次酸和半乳糖（乳糖酸含半乳糖残基）受体，而在在病理条件下（如肿瘤），半乳糖受体的结合活性会有所下降，而甘草次酸受体在癌细胞中的表达量要更高，GCGA同时存在这两种具有靶向至肝癌细胞的配体，提高了肝癌细胞靶向的可靠性。

两种细胞的荧光图片用共聚焦显微镜得到，如图14所示，在被FITC标记的GCGA纳米粒子处理后的BEL-7402肝癌细胞中，能够观察到较强的绿色荧光，纳米粒子被大量内化进入细胞，而在LO2正常肝细胞中，只能观察到微弱的荧光信号。以上结果说明，较正常肝细胞，双配体（甘草次酸和乳糖酸）的引入能够极大地增强GCGA与肝癌细胞的亲和性，诱导纳米粒子在肝癌细胞膜表面富集并实现内吞进入细胞。

2.4 CTS、GA-CTS及GCGA纳米粒子静注后在大鼠体内分布研究

将无配体修饰的CTS、单配体修饰的GA-CTS及双配体修饰的GCGA三种纳米粒子悬浮液经大鼠尾静脉注射4 h后，取其肝、脾、肾、心、肺、脑和骨骼肌组织，通过共聚焦荧光显微镜观察大鼠各脏器组织荧光强度的强弱来研究各纳米粒子的生物分布，形态学上说明其肝靶向性。

图15显示了FITC标记的CTS、GA-CTS和GCGA纳米粒子（NPs）静脉注射4 h后，不同组织的荧光显微图像。结果显示，与对照组相比（数据没有显示，对照组为无纳米粒子处理的细胞，荧光图像中没有绿色荧光亮点），除心、脑和骨骼肌外，三实验组的其他组织切片均显示了不同程度的荧光亮点，而心、脑和骨骼肌中基本没有荧光被观察到，这表明CTS、GA-CTS和GCGA纳米粒子基本不被心、脑和骨骼肌吸收，因此对这些组织没有毒副作用。在肝、脾、肾和肺中有不同程度的分布。图中可见三种纳米粒子在肾脏中均有显著的荧光亮点，无配体修饰的CTS纳米粒子有最强的荧光强度，单配体修饰的GA-CTS 纳米粒子有中度的荧光强度，而双配体修饰的GCGA纳米粒子的荧光强度最弱，这意味着这些纳米粒子一部分会很快的代谢到肾脏和尿液中，并排出大鼠体外，这是由于纳米粒子基质的一些特殊性质所致（如生物降解性、粘附性等），另外，纳米粒子的粒径要在适当的范围内，才能避免被肾脏、肺和脾过滤掉，对于粒径分布中的较小的纳米粒子会被过滤掉，并且无配体修饰的纳米粒子被细胞内吞的途径主要取决于其粒径的大小（被动靶向），不具备主动到达靶细胞的能力，而有配体修饰的纳米粒子主要通过相应受体特异性的识别、结合、内化进入细胞，对靶细胞具有高度的识别能力。进一步的发现，在大鼠的脾、肺和肾的组织切片中，无配体修饰的CTS纳米粒子组的荧光强度要稍强于单配体修饰的GA-CTS纳米粒子组，而双配体修饰的GCGA纳米粒子组的荧光强度较后者要更弱，然而，对比大鼠的肝组织切片的荧光图像可以发现一个独特的现象：三种纳米粒子的在肝脏中的荧光强度与脾、肺和肾的相比，呈现一个反向趋势，肝脏摄取能力占据主导地位，即双配体修饰的GCGA纳米粒子的荧光强度却显著增加，强于单配体修饰的GA-CTS纳米粒子，而无配体修饰的CTS纳米粒子的的荧光信号最弱，这表明有配体修饰的GA-CTS和GCGA纳米粒子在动物体内具有很好的肝靶向性，双配体修饰的GCGA纳米粒子较单配体GA-CTS具有更强的趋肝性，这是由于在由受体介导的主动靶向作用中，随着双配体（甘草次酸和乳糖酸）的引入，一种配体的主动靶向作用因某种病理或生理原因受阻时，另一种配体-受体的相互作用会成为主要途径，与肝细胞上的受体进行特异性结合，进而提高了肝靶向的可靠性。

实施例3载药纳米粒子的制备条件优化、理化性质及体外释放研究

1.实验方法

1.1 实验试剂与仪器

主要药品：五氟尿嘧啶（5-Fu），壳聚糖（CTS），甘草次酸壳聚糖（GA-CTS），乳糖酸化甘草次酸壳聚糖（GCGA），多聚磷酸钠（TPP），PBS缓冲液，醋酸（HAc），盐酸（HCl），氢氧化钠（NaOH），透析袋。

主要仪器：全温振荡培养箱，场发射扫描电子显微镜，紫外可见分光光度计，动态光散射激光粒度和ZETA电位分析仪，生物医学冷冻柜，生化培养箱，磁力加热搅拌器，智能磁力搅拌器，冷冻干燥机，pH 计，理化干燥箱，分析天平。

1.2 CTS、GA-CTS和GCGA载5-Fu纳米粒子的制备

通过离子交联的方法制备三种材料的载5-Fu纳米粒子。分别称取一定质量的CTS、GA-CTS和GCGA材料溶于一定体积的醋酸溶液中，并用NaOH调节其pH值后，加入预定质量比的5-FU于上述溶液中溶解。然后逐滴滴加TPP溶液于上述均匀混合的溶液中，室温低速磁力搅拌进行离子交联反应，并自发形成纳米粒子。将得到的纳米粒子悬浮液以10000转/分离心30分钟，然后用大量去离子水洗残留物，分散后再离心洗涤，以除去NaOH和5-Fu等，然后重新分散在去离子水中，冷冻干燥，保存备用。

1.3 纳米粒子的表征

1.3.1 纳米粒子的粒径分析

粒径分布和zeta电位由纳米粒度及zeta电位仪测定，取制备的载药纳米粒子悬浮液原液于比色皿中，将比色皿放入样品池中测定纳米粒子的粒径大小及其粒径分布；用5 ml的注射器吸取纳米粒子悬浮液，注入zeta电位的管道中，进行zeta电位的测定。

1.3.2 纳米粒子的形态学观察

取制备后的纳米粒子悬浮液，低速离心后，用去离子水洗涤再分散，重复三次，然后将分散后的纳米悬浮液滴在锡箔纸上，烘箱中烘干后用扫描电子显微镜进行形貌观察。

1.3.3 纳米粒子载药量的测定

首先绘制5-Fu—HCl的标准曲线：精密称取5-Fu 10 mg，用HCl溶解，并定容至100 ml。然后分别准确吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和4.0 mL的原液于容量瓶中，再用0.1 M 的HCl稀释定容后得到不同浓度的标准液。于此系列浓度中取样，用紫外分光光度计于波长265 nm处测定A值（以HCl溶液作参比），得标准曲线方程。

称取一定量的冻干的载药纳米粒子（或5-Fu），超声分散在HCl溶液中溶解，设定温度为37℃，5小时之后再离心收集上清液，并用去离子水稀释后，通过紫外分光光度计在265 nm 测定其吸光度，由其标准曲线得到对应的5-Fu浓度，然后按以下公式计算其载药量。

载药量=纳米粒中5-FU含量／纳米粒质量×100％

1.4 中心复合设计试验

中心复合设计（central composite design，CCD）是响应曲面法（response surface methodology，RSM）中应用最为广泛的一种试验设计方法，即采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。近年来，由于它能用最少的试验次数提供了最多的实验信息，其在优化实验条件和分析中得到越来越多的研究和应用。本研究中，为了考察GCGA载药纳米粒子的理化性质，以壳聚糖载药纳米粒子为模型，运用中心复合设计优化其制备工艺，以得到的优化条件制备GCGA载药纳米粒子。

1.5 GCGA载5-Fu纳米粒子的体外释放

5-Fu在PBS缓冲溶液中（pH=7.4）的标准曲线的建立：精密称取5-Fu 10 mg，用PBS溶液溶解，并定容至100 mL。然后分别准确吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和4.0 mL，用PBS溶液定容至25 mL。再取样用紫外分光光度计于λ=266 nm处测定A值(以PBS溶液作参比)，得标准曲线方程。

GCGA载5-Fu纳米粒子的制备条件采用由中心复合设计优化的壳聚糖载药纳米粒子的制备工艺。称取20 mg 制备的GCGA载5-Fu纳米粒子于截留分子量为8000-140 00的透析袋，并密封。将透析袋浸泡在装有100 ml的PBS溶液的锥形瓶中。加塞密闭后放入温度为37±1 ℃、振荡速度为100±5次/min的恒温振荡箱中，每隔预定的时间于透析袋外介质中取5ml的溶液，同时补充等量新鲜的PBS缓冲溶液。然后用紫外可见分光光度计测定其吸光度（以纯5-Fu的释放作为对照组）。根据标准曲线计算5-Fu的含量，并按下式计算出药物的累积释放率。

包封率=纳米粒中5-FU含量／5-FU投料量×100％

2.结果与讨论

2.1 GCGA载药纳米粒子的制备

通过中心复合实验优化了壳聚糖载5-Fu纳米粒子的制备，得到其最佳工艺条件为：CTS与TPP的质量比为5︰1，5-Fu与CTS的质量比为1︰1，TPP的浓度为0.05%（w/v），交联时间为50 min。对于GCGA载5-Fu纳米粒子的制备，是以CTS载5-Fu纳米粒子为模型参考设计工艺条件为：CTS︰TPP=5︰1，5-Fu︰CTS=1︰1，TPP的浓度为0.05%（w/v），交联时间为50 min。为了便于参考，同样的条件下制备了GA-CTS载5-Fu纳米粒子。三种载药纳米粒子的实验结果如表2所示：

表2优化条件CTS、GA-CTS和GCGA载5-Fu纳米粒子的实验结果

指标	CTS/5-Fu 纳米粒	GA-CTS/5-Fu 纳米粒	GCGA/5-Fu 纳米粒
				平均粒径 (nm)	318.5	193.7	239.9
分散指数	0.580	0.003	0.040
				Zeta电位 (mV)	+39.7	+27.4	+21.2
载药量(%)	2.21	1.56	3.90

由表2可见，GCGA/5-Fu NPs的平均粒径为239.9 nm，小于CTS/5-Fu NPs的平均粒径（318.5 nm），而大于GA-CTS/5-Fu NPs的平均粒径（193.7 nm），造成这种粒径变化的现象可能是因为壳聚糖上接枝的具有疏水性的甘草次酸基团和亲水性的乳糖酸基团与溶液中水分子相互作用的结果，进而会影响纳米粒子的成核与生长，另外，从粒径分布图16中发现，壳聚糖的粒径分布呈现双峰，这个相似的现象在一些研究也有，这可能是由于低分子量的壳聚糖与TPP交联形成了较小的粒子，即是较短链的壳聚糖能更容易与TPP交联而形成较小的粒子。相反地，GA-CTS和GCGA的粒径分布是单一的，这可能是因为在制备过程中对其进行了纯化而移除了低分子量的壳聚糖衍生物。三种药纳米粒子都具有正电荷（以zeta电位表示），这是由于壳聚糖及其衍生物的氨基质子化形成了NH₃ ⁺。而GA-CTS/5-Fu NPs和GCGA/5-Fu NPs的zeta电位明显低于CTS/5-Fu NPs的zeta电位，这可能是由于甘草次酸和乳糖酸基团的引入，消耗了壳聚糖上一些游离的氨基，导致zeta电位降低。相比较GA-CTS/5-Fu NPs和CTS/5-Fu NPs，GCGA/5-Fu NPs的载药量最高，这可能是由于乳糖酸基团含有大量的羟基（-OH），能与5-Fu广泛地形成氢键，从而增加了5-Fu在GCGA上的吸附量。

扫描电镜的结果如图17，显示三种纳米粒子均呈圆整的球形，有团聚现象，这种粒子之间聚集的现象是在做扫描电镜前制样造成的，而非纳米粒子制备过程中出现的，因为三种纳米粒子的的多分散指数（Polydispersity index）均小于0.7，提示制得的纳米粒子有较好的分散性，并且GA-CTS/5-Fu NPs和GCGA/5-Fu NPs的多分散指数＜0.1，呈现单分散特征，而团聚的产生应该是由于离心后并没有完全分散所致（制样过程中），这与实施例2中FITC标记的三种纳米粒子的制样不同，后者是通过直接过滤后、烘干进行电镜测试，并没有离心，而且其悬浮液静置4 d后并没观察到团聚和沉淀现象，提示纳米粒子悬浮液具有较好的物理稳定性。图17电镜图片显示的纳米粒子的粒径要小于在纳米悬浮液状态下由粒度仪测得的粒径，这是因为粒度仪对粒子的粒径分析在水溶液中进行，反应的是一种水合粒径，CTS/5-Fu、GA-CTS/5-Fu NPs和GCGA/5-Fu NPs在水溶液环境中会有一定的溶胀现象，并且粒子的外周会和周围的水分子形成一个水合层；而电镜测得粒径反应的是一种干态粒子。

2.2 GCGA载药纳米粒子的体外释放特征

本研究采用透析袋扩散法测定GCGA载5-Fu纳米粒子的药物体外释放，以纯5-Fu的释放作为对比。图18为5-Fu在PBS缓冲溶液（pH=7.4）中的浓度-吸光度标准曲线，由图可知呈良好的线性关系（R=0.99996），用于药物释放的测定。

图19所示为GCGA/5-Fu NPs和5-Fu的体外药物释放情况。由图可以看出，纯5-Fu在1.2 h后的累计释放量已达到95%以上，实验发现并不能到达100%，这说明透析袋对5-Fu的释放有一定的影响，透析袋具有屏障作用，会先吸附一部分药物，到达饱和后，药物才会扩散出去。GCGA/5-Fu NPs体外释放情况显示出四个阶段：第一个阶段小量突释阶段（0-0.7 h，累计释放率0-5.6%），这可能是由于在粒子载药制备过程中并未完全清除残留的5-Fu所致；第二阶段平缓阶段（0.7-3.7 h，累计释放率5.6%-7%），微量的释放可能主要是通过扩散进行的；第三阶段为二次突释（3.7-4.7 h，累计释放率7%-28%），我们认为这是由于该纳米粒子特殊性质所致，其可能具有三层结构，如图20所示，内核主要由疏水性的甘草次酸基团组成，由于药物易溶于水，并具有亲水性，因此，核内的药物仅为少量，难溶性的壳聚糖衍生物复杂链形成了内壳层，而亲水性的乳糖酸和部分壳聚糖的支链形成外壳，药物被均匀地包裹在基质的壳层结构中，这一阶段的突释可能是由于亲水性部分形成的基质外壳层率先降解，破坏了5-Fu与聚合物之间的氢键，使以氢键结合在纳米粒子表面区域的药物解吸而快速释放；第四阶段为二次平缓阶段（4.7-30.5 h，累计释放率28%-37%），由于不溶和疏水部分载体材料的逐渐降解、溶蚀，分散在聚合物基质内部的药物，通过壁膜进行扩散引起恒定持续性的释放，当然如果释放时间延长，由于基质的进一步降解，有可能会出现第三个突释阶段。综上分析，GCGA/5-Fu NPs缓释阶段释放时间长，而且较纯5-Fu，在30.5 h的累计释放率仅达到37%，说明GCGA/5-Fu NPs具有一定的缓释作用。

本发明结论：

本发明选用天然可生物降解的壳聚糖（CTS）作为载体，具有肝靶向性的甘草次酸（GA）和乳糖酸（LA）作为配体，通过N-酰化反应，合成甘草次酸和乳糖酸共修饰的壳聚糖（GCGA）材料，并运用MTT法评价了该材料的细胞毒性，经离子交联法制备了荧光标记的纳米粒子，通过体外细胞摄取实验和大鼠的体内分布综合考察了GCGA材料作为纳米粒子的肝癌靶向性和转运机制，采用中心复合设计优化载药纳米粒子的制备条件，探讨纳米粒子粒径和载药量对肝靶向给药系统的影响，并进行了载药纳米粒子的体外释放研究，为以后载药纳米粒子的药理学及药效学研究奠定实验基础。主要内容和结论如下：

（1）以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）作为化学交联剂，首次合成了具有肝癌靶向性的GCGA载体材料，采用傅立叶红外测试（IR）和核磁共振氢谱（¹H-NMR）对GCGA的化学结构进行验证，结果表明，GA和LA通过酰胺键成功连接到CTS，取代度分别为13.77 mol%和16.74 mol%，通过接触角的测定评价了GCGA薄膜表面的润湿性，结果显示，GCGA是一种亲水性较强的具有疏水性GA基团和亲水性LA基团的两亲性材料。

（2）运用MTT法评价了具有肝癌靶向性的GCGA载体材料对于小鼠成纤维细胞的（L929）的毒性，结果显示，GCGA的细胞毒性与其浓度的高低具有一定的关系，GCGA的浓度在0.005-0.05 mg/ml范围内时，无细胞毒副作用。

（3）通过体外细胞摄取实验研究了BEL-7402人肝癌细胞对FITC标记的GCGA、甘草次酸壳聚糖（GA-CTS）和CTS纳米粒子的摄取情况，并探讨了纳米粒子靶向癌细胞的转运机制，实验结果显示，细胞对含双配体的GCGA纳米粒子的摄取量高于单配体GA-CTS纳米粒子，并明显高于无配体CTS纳米粒子，提示含双配体的GCGA纳米粒子进入癌细胞和去唾液酸糖蛋白受体（ASGP-R）及甘草次酸受体介导的内吞作用有关，当一种受体介导的内吞作用因病理生理条件的影响受阻，还有另一种受体介导的主动靶向，从而提高肝癌靶向的可靠性。

（4）研究了BEL-7402人肝癌细胞和LO2人正常肝细胞对FITC标记含双配体的GCGA纳米粒子的摄取量，结果显示，肝癌细胞摄取GCGA纳米粒子的量是LO2正常肝细胞的18.22倍，表明GCGA纳米粒子对肝癌细胞具有更强的亲和性。

（5）将FITC标记的GCGA、GA-CTS和CTS纳米粒子经尾静脉注射到大鼠体内，4 h后用激光共聚焦显微镜观察各组织切片中绿色荧光信号的强度，结果显示，三种纳米粒子在心、脑和骨骼肌中均无荧光信号，而较GA-CTS和CTS纳米粒子，GCGA纳米粒子在脾、肾、肺组织中的荧光强度明显减弱，肝脏中的荧光信号增强，表明双配体的GCGA纳米粒子比单配体的GA-CTS和无配体的CTS纳米粒子具有更强的肝靶向性。

（6）采用中心复合设计试验，以纳米粒子的平均粒径和载药量为考察指标，优化了壳聚糖载5-氟尿嘧啶纳米粒子的制备条件，并研究了各因素对指标的影响，以此为模型，制备了GCGA载5-Fu纳米粒子，扫描电镜结果显示GCGA/5-Fu NPs的形貌均呈圆整球形，平均粒径为239.9 nm（分布范围在100-500 nm），分布均匀（多分散指数为0.04），zeta电位为+21.2 mV，载药量为3.90%（w/v）。

（7）通过透析袋扩散法考察了GCGA载5-Fu纳米粒子的体外释放，结果显示，GCGA纳米粒子能对所包裹的药物模型（5-Fu）进行很好的释放，释放过程大致分为四个阶段，即突释、缓释、二次突释，最后是一个非常缓慢的释放阶段。其缓释效果明显优于纯5-Fu，说明GCGA NPs作为药物控释系统中的载体具有一定的缓释作用和良好的应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种乳糖酸化甘草次酸壳聚糖材料，其特征在于，所述的乳糖酸化甘草次酸壳聚糖材料是选用壳聚糖作为载体，甘草次酸和乳糖酸作为配体，通过N-酰化反应，合成的甘草次酸和乳糖酸共修饰的壳聚糖材料；所述的乳糖酸化甘草次酸壳聚糖材料的制备方法包括以下步骤：

a、首先称取甘草次酸溶于DMF溶液中，并加入EDC·HCl和NHS进行活化，在磁力搅拌的条件下，将活化的甘草次酸溶液加入到壳聚糖溶液中，并在室温下反应，用丙酮静置沉淀后，再用乙醇、乙醚洗涤沉淀，室温真空干燥即得到甘草次酸壳聚糖材料；所述的甘草次酸壳聚糖合成的条件为：EDC·HCl与GA的摩尔比为0.6-2.4:1，EDC·HCl与NHS的摩尔比为0.4-2.5:1，GA与CTS的摩尔比为0.8-1.5:1，反应时间为1-3 d；

b、将乳糖酸溶于TEMED·HCl溶液中，并加入EDC·HCl和NHS对乳糖酸的羧基进行活化，同时将GA-CTS溶液与被活化的乳糖酸溶液在磁力搅拌的条件下室温反应中72小时后，溶液置于透析袋中用蒸馏水透析4天，每隔24小时更换一次透析液，冷冻干燥得到乳糖酸化甘草次酸壳聚糖材料。

2.一种乳糖酸化甘草次酸壳聚糖材料的制备方法，其特征在于，所述的乳糖酸化甘草次酸壳聚糖材料的制备方法包括以下步骤：

3.根据权利要求1所述的乳糖酸化甘草次酸壳聚糖材料作为载体材料在制备治疗肝靶向治疗药物中的应用，所述的乳糖酸化甘草次酸壳聚糖的浓度为0.005-0.05 mg/ml。

4.一种乳糖酸化甘草次酸壳聚糖/5-氟尿嘧啶载药纳米粒子，其特征在于，所述的载药纳米粒子是由权利要求1所述的乳糖酸化甘草次酸壳聚糖材料，通过离子交联的方法，制成的载5-氟尿嘧啶的载药纳米粒子；所述的载药纳米粒子的制备方法：称取乳糖酸化甘草次酸壳聚糖材料溶于醋酸溶液中，并用NaOH调节其pH值后，加入5-氟尿嘧啶于上述溶液中溶解，然后逐滴滴加TPP溶液于上述均匀混合的溶液中，室温低速磁力搅拌进行离子交联反应，并自发形成纳米粒子；将得到的纳米粒子悬浮液以10000转/分离心30分钟，然后用大量去离子水洗残留物，分散后再离心洗涤，然后重新分散在去离子水中，冷冻干燥，保存备用。