CN107484939B - 酪蛋白-羧化壳聚糖自组装纳米微胶囊的制备方法及其应用 - Google Patents

酪蛋白-羧化壳聚糖自组装纳米微胶囊的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种新型酪蛋白糖基化产物制备的方法，并且自组装形成新型纳米粒，具体涉及以酪蛋白、一种带电多糖羧化壳聚糖为原料，采用超声干法美拉德反应，将酪蛋白与带电多糖进行接枝反应，再将酪蛋白多糖共聚物在超声环境下得到糖基化自组装纳米微胶囊，并运用于辣椒红色素微胶囊化的食品应用中。新型酪蛋白糖基化产物纳米粒能有效保护PRP提高其热稳定性并延长商品货架期。

Description

酪蛋白-羧化壳聚糖自组装纳米微胶囊的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种酪蛋白-羧化壳聚糖自组装纳米微胶囊的制备方法及胶囊化辣椒红素的制备，属于食品添加剂微胶囊技术领域。
背景技术
辣椒红色素(Paprika red pigment，PRP))又称椒红、椒红素，是从成熟辣椒果皮中提取出来的四萜类天然红色素，具有辣椒香气，但是没有辣味的深红色黏性油状液体。按照国家标准GB2760-2011中规定辣椒红色素为功能性食品着色剂，能够应用于糕点、调味品、肉制品、饮料等食品加工中，并且是不限制用量的。辣椒红色素在使用时稳定性好，上色较为均匀，颜色鲜艳明快，对人体没有丝毫的副作用，不仅如此，辣椒红色素还有预防癌症，延缓衰老及减肥美容的功效。辣椒红色素可以作用于肝脏组织，通过某些特性生理生化机制形成具有预防或抗癌类的制剂的物质。鉴于此，辣椒红色素已经受到国际相关组织的认可，联合国粮农组织(FAO)及世界卫生组织(WHO)将其列为A类色素，在食品加工过程中对其用量不作任何限制。但由于天然辣椒红素为油溶性色素，且在外界的高温、光照及助氧化剂的条件下不稳定，另外，在食品加工中，很难与其他基料混合均匀。而微胶囊技术是把少量物质包裹在聚合物薄膜中的技术，现在微胶囊技术已经广泛应用于药物、食品研发中。微胶囊技术有着极大的优越性：
一、改善芯材的理化性质，应用微胶囊技术很大程度上可以改善被包埋物质的溶解性,将不溶或者难溶于水中的固体粉末或者液体包裹在亲水性胶体内,制成水溶性的干粉,以便于应用和贮藏；二、掩盖不良风味。在食品加工中,借助微胶囊技术,可以去除一些原料的腥臭味和苦味,以改善食品的可食用性和可接受性,提高产品品质；三、对热敏性、光敏性或者易氧化的芯材提供保护。芯材在壁材的包裹下,与外界环境(如pH、氧气、光照、温度等)隔绝,使芯材稳定性大大增加。四、改善芯材的释放特性。微胶囊化产品可以实现靶向性和缓释性,即在设定的地点释放芯材,并且以一定的速度释放芯材,因此在医药上的应用最为深入。微胶囊技术在食品工业中的应用具有重要意义,它可以提高产品附加值,使食品具有更高的食用或者药用价值,延长其商品的架货期，因此在食品工业中的应用正越来越广泛。
应用美拉德反应，不添加任何化学试剂，在控制的条件下，使蛋白质的分子中氨基酸侧链的自由氨基(主要是赖氨酸侧链上的￡一氨基基团)与多糖的还原性羰基末端反应得到共价复合物。蛋白质因能在油水或气液界面上形成吸附层降低界面张力而多在胶体体系中充当乳化剂，多糖则由于其良好的增稠和持水特性而常用作稳定剂。蛋白质多糖共价复合物中多糖的引入是对蛋白质的一种改性或者说是对其功能性质的一种强化。该复合物为我们提供了一种制造新型乳化剂的方法，就乳化性能而言，已有报告指出，这种复合物优于某些小分子乳化剂。除乳化性能非常优越以外，有许多文献报道表明，新合成的糖蛋白在溶解性、热稳定性、抗菌性、抗氧化性等功能特性方面都有不同程度的提高，对一些蛋白质的过敏反应性也有较好的抑制作用，有较大的抵抗外界环境变化的能力，蛋白质-多糖的共价复合物为研究和开发新型食品添加剂提供了一条新的途径。
国内外对蛋白质和多糖进行糖基化接枝的研究方法主要有两种：干法和湿法。干干热法是一种基于固相体系的反应方法,齐军茹等从固相反应的角度来讨论蛋白与多糖干热反应的机理:对于在保持一定相对湿度条件的蛋白与多糖混合物,起始时为蛋白与多糖分子的扩散接触,此时的扩散过程中当多糖分子中的还原性醛基有机会与蛋白质中伯氨基接触时就会发生化学作用,化学反应开始时糖分子与赖氨酸或轻赖氨酸的。一氨基形成可逆的醛亚胺；然后经过Schiff碱上电荷与双键的重排形成糖-蛋白质酮胺结合物等一系列反应生成产物分子。
就蛋白质-多糖共聚物的功能性质已有广泛的研究，是构建脂溶性营养素的理想基质。国内外就蛋白质与糖的湿法美拉德反应产物的乳化性、抗氧化性、抗菌性、清除自由基等性质已有广泛的研究。对于干法反应产物的乳化性、乳化稳定性等的研究也逐渐增多。
自组装技术作为制备纳米微胶囊的一种方法，其材料被认为是21世纪材料科学与工程最重要的领域之一。自组装是指在组装单元之间自发形成有序结构的一种现象。由此可见，自组装系统含有两个基本要素：组装单元和组装单元之间的非共价键的相互作用力。就组装单元来说,天然生物材料，由于其的绿色、安全、良好的导向性好等特征赋予其得天独厚的优势。如不带电荷的多糖通常是通过疏水修饰键接上其他分子后在水中进行自组装,像壳聚糖等带电荷的多糖，可以直接与其他分子通过离子键、金属键、或分子间作用力等非共价键相互作用进行组装，也可以通过化学修饰接上亲水或疏水的分子自行组装。
发明内容
本发明提供了一种新型酪蛋白糖基化产物制备的方法，并且自组装形成新型纳米粒，具体涉及以酪蛋白、一种带电多糖羧化壳聚糖为原料，采用超声干法美拉德反应，将酪蛋白与带电多糖进行接枝反应，再将酪蛋白多糖共聚物在超声环境下得到糖基化自组装纳米微胶囊，并运用于辣椒红色素微胶囊化的食品应用中。
本发明采用的技术方案如下：一种酪蛋白-羧化壳聚糖自组装纳米微胶囊的制备方法，包括下述步骤：
(1)酪蛋白糖基化共聚物的制备：将酪蛋白溶于磷酸盐缓冲液中，室温磁力搅拌，制备成酪蛋白均匀溶液，超声处理；收集样品后加入羧化壳聚糖，混合均匀后冷冻干燥，随后将样品磨成粉，并过120目筛，置于含有饱和溴化钾的反应容器中并将反应温度控制在50℃-70℃，pH为7-8；反应30-40小时后冷却终止反应，即得酪蛋白糖基化共聚物；
(2)将酪蛋白糖基化共聚物溶于pH＝7.4的溶液中，配成共聚物溶液，并加入一定量的叠氮化钠使其终浓度为0.1mg/ml；将配制好的溶液放在20-30℃水浴磁力搅拌2.5-3.5小时，之后转移到3-5℃条件下放置8-12h，使糖基化产物颗粒溶胀充分，在冰浴的条件下，在250w的功率下超声5-7min，则得到酪蛋白-羧化壳聚糖自组装纳米微胶囊。
步骤(1)中的磷酸盐缓冲液的pH为7-8，优选为7.4，制备成酪蛋白均匀溶液的浓度2mg/ml，超声处理为在250w功率下5s-on，5s-off。
步骤(1)中的酪蛋白与羧化壳聚糖的摩尔比0.3-0.8：1，优选为0.5：1，反应容器中的相对湿度为70％-80％，优选为79％。
步骤(1)中将酪蛋白糖基化共聚物溶于水，并用截流分子量100,000的超滤膜反复超滤，收集相对分子质量大于100,000的组分冷冻干燥，即得酪蛋白糖基化共聚物。
步骤(2)中的配置的共聚物溶液的终浓度为1.5-2.5mg/ml，优选为2.0mg/ml。
所述的酪蛋白-羧化壳聚糖自组装纳米微胶囊的制备方法在食品添加剂胶囊化中的应用。
酪蛋白-羧化壳聚糖自组装纳米微胶囊的制备方法在辣椒红素胶囊化中的应用，包括下述步骤：
(1)酪蛋白糖基化共聚物的制备：将酪蛋白溶于pH＝7.4磷酸盐缓冲液中，室温磁力搅拌2.5h，制备成酪蛋白均匀溶液，超声处理；收集样品后加入一定比例羧化壳聚糖，混合均匀后冷冻干燥，随后将样品磨成粉，并过120目筛，置于含有饱和溴化钾的反应容器中并将反应温度控制在50℃-70℃，pH为7-8；反30-40小时后冷却终止反应，即得酪蛋白糖基化共聚物；
(2)将无水乙醇加入辣椒红素中，使得辣椒红素的终浓度为6-10mg/ml，制得辣椒红素-乙醇悬液；将酪蛋白糖基化共聚物溶于pH＝7.4的溶液中，配成共聚物溶液，并加入一定量的叠氮化钠使其终浓度为0.1mg/ml；在共聚物溶液中加入等量的辣椒红素-乙醇悬液，充分混匀，冰浴200w下超声5-8min，形成基于糖基化酪蛋白的胶囊化辣椒红素。
本发明的有益效果：本发明的有益效果：通过超声美拉德反应在酪蛋白上接枝卡拉胶，接枝率达79.84％，再通过自组装得到一种性能更加优良的微胶囊壁材。采用的超声分散法，可将辣椒红色素包裹在一个封闭的环境中，能够有效地保护辣椒红色素并可以更加放心地应用于食品药品领域。与蛋白反应后可以明显提高蛋白的乳化性且有良好的热稳定性、肠胃稳定性、冻干稳定性和储存稳定性。酪蛋白糖基化共聚物能有效包埋辣椒红色素，具有保护和提高热稳定性作用。所以用羧化壳聚糖与酪蛋白进行美拉德反应得到的壁材具有广阔的研究价值。
附图说明
图1是底物配比对接枝度的影响示意图；
图2是相对湿度对接枝度的影响示意图；
图3是反应温度对干法反应的影响示意图；
图4是反应时间对干法反应的影响示意图；
图5是不同反应时间和不同pH条件在溶解度的变化结果示意图；
图6是不同反应时间条件下乳化性的变化结果示意图；
图7是不同糖基化产物浓度对纳米粒径及分布的影响；
图8是不同超声功率对纳米粒径及分布的影响示意图；
图9是超声前后酪蛋白多糖共聚物纳米粒粒径分布图；
图10是NaCl对共价聚合物纳米自组装的影响示意图；
图11是乙醇对共价聚合物纳米自组装的影响示意图；
图12是酪蛋白多糖共聚物和酪蛋白的Zeta电位随溶液pH的变化情况示意图；
图13是酪蛋白多糖共聚物和酪蛋白的粒径分布随溶液pH的变化情况示意图；
图14是辣椒红素标准曲线图；
图15是不同加样量对纳米胶囊的包封率和载药量的影响示意图；
图16是光照对辣椒红色素纳米胶囊的影响示意图；
图17是温度对辣椒红色素纳米胶囊的影响示意图；
图18是食品添加剂对辣椒红色素纳米胶囊的影响；
图19是纳米胶囊在模拟胃液中粒径示意图；
图20是纳米胶囊在模拟胃液中PDI值的变化(b)示意图；
图21是纳米胶囊在模拟肠液PRP累积释放率的变化示意图。
具体实施方式
实施例1
本实施例中酪蛋白-羧化壳聚糖自组装纳米微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
(1)酪蛋白糖基化共聚物的制备：将酪蛋白溶于磷酸盐缓冲液中，磷酸盐缓冲液的pH为7，室温磁力搅拌，制备成酪蛋白均匀溶液，酪蛋白均匀溶液的浓度2mg/ml，在250w功率下5s-on，5s-off下超声处理；收集样品后加入羧化壳聚糖，酪蛋白与羧化壳聚糖的摩尔比0.3：1，反应容器中的相对湿度为70％，混合均匀后冷冻干燥，随后将样品磨成粉，并过120目筛，置于含有饱和溴化钾的反应容器中并将反应温度控制在50℃，pH为7；反应30小时后冷却终止反应，即得酪蛋白糖基化共聚物。
作为优选，一般使用的酪蛋白糖基化共聚物分子量大于100,000，因此，将制备好的酪蛋白糖基化共聚物溶于水，并用截流分子量100,000的超滤膜反复超滤，收集相对分子质量大于100,000的组分冷冻干燥，即得酪蛋白糖基化共聚物。(2)将酪蛋白糖基化共聚物溶于pH＝7.4的溶液中，配成共聚物溶液，配置的共聚物溶液的终浓度为1.5mg/ml，并加入一定量的叠氮化钠使其终浓度为0.1mg/ml；将配制好的溶液放在20℃水浴磁力搅拌2.5小时，之后转移到3-5℃条件下放置8h，使糖基化产物颗粒溶胀充分，在冰浴的条件下，在250w的功率下超声5min，则得到酪蛋白-羧化壳聚糖自组装纳米微胶囊。
实施例2
本实施例中酪蛋白-羧化壳聚糖自组装纳米微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
(1)酪蛋白糖基化共聚物的制备：将酪蛋白溶于磷酸盐缓冲液中，磷酸盐缓冲液的pH为7.4，室温磁力搅拌，制备成酪蛋白均匀溶液，酪蛋白均匀溶液的浓度2mg/ml，在250w功率下5s-on，5s-off下超声处理；收集样品后加入羧化壳聚糖，酪蛋白与羧化壳聚糖的摩尔比为0.5：1，反应容器中的相对湿度为79％，混合均匀后冷冻干燥，随后将样品磨成粉，并过120目筛，置于含有饱和溴化钾的反应容器中并将反应温度控制在60℃，pH为8；反应35小时后冷却终止反应，即得酪蛋白糖基化共聚物。
作为优选，一般使用的酪蛋白糖基化共聚物分子量大于100,000，因此，将制备好的酪蛋白糖基化共聚物溶于水，并用截流分子量100,000的超滤膜反复超滤，收集相对分子质量大于100,000的组分冷冻干燥，即得酪蛋白糖基化共聚物。(2)将酪蛋白糖基化共聚物溶于pH＝7.4的溶液中，配成共聚物溶液，配置的共聚物溶液的终浓度为2.0mg/ml，并加入一定量的叠氮化钠使其终浓度为0.1mg/ml；将配制好的溶液放在25℃水浴磁力搅拌3.0小时，之后转移到3-5℃条件下放置10h，使糖基化产物颗粒溶胀充分，在冰浴的条件下，在250w的功率下超声6min，则得到酪蛋白-羧化壳聚糖自组装纳米微胶囊。
实施例3
本实施例中酪蛋白-羧化壳聚糖自组装纳米微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
(1)酪蛋白糖基化共聚物的制备：将酪蛋白溶于磷酸盐缓冲液中，磷酸盐缓冲液的pH为8，室温磁力搅拌，制备成酪蛋白均匀溶液，酪蛋白均匀溶液的浓度2mg/ml，在250w功率下5s-on，5s-off下超声处理；收集样品后加入羧化壳聚糖，酪蛋白与羧化壳聚糖的摩尔比0.8：1，反应容器中的相对湿度为80％，混合均匀后冷冻干燥，随后将样品磨成粉，并过120目筛，置于含有饱和溴化钾的反应容器中并将反应温度控制在70℃，pH为8；反应40小时后冷却终止反应，即得酪蛋白糖基化共聚物。
作为优选，一般使用的酪蛋白糖基化共聚物分子量大于100,000，因此，将制备好的酪蛋白糖基化共聚物溶于水，并用截流分子量100,000的超滤膜反复超滤，收集相对分子质量大于100,000的组分冷冻干燥，即得酪蛋白糖基化共聚物。(2)将酪蛋白糖基化共聚物溶于pH＝7.4的溶液中，配成共聚物溶液，配置的共聚物溶液的终浓度为2.5mg/ml，并加入一定量的叠氮化钠使其终浓度为0.1mg/ml；将配制好的溶液放在30℃水浴磁力搅拌3.5小时，之后转移到3-5℃条件下放置12h，使糖基化产物颗粒溶胀充分，在冰浴的条件下，在250w的功率下超声7min，则得到酪蛋白-羧化壳聚糖自组装纳米微胶囊。
实施例4
上述方法制备的酪蛋白-羧化壳聚糖自组装纳米微胶囊的制备方法在辣椒红素胶囊化中的应用，包括以下步骤：
(1)酪蛋白糖基化共聚物的制备：将酪蛋白溶于磷酸盐缓冲液中，室温磁力搅拌，制备成酪蛋白均匀溶液，超声处理；收集样品后加入羧化壳聚糖，混合均匀后冷冻干燥，随后将样品磨成粉，并过120目筛，置于含有饱和溴化钾的反应容器中并将反应温度控制在50℃-70℃，pH为7-8；反30-40小时后冷却终止反应，即得酪蛋白糖基化共聚物；
(2)将无水乙醇加入辣椒红素中，使得辣椒红素的终浓度为6-10mg/ml，制得辣椒红素-乙醇悬液；将酪蛋白糖基化共聚物溶于pH＝7.4的溶液中，配成共聚物溶液，并加入一定量的叠氮化钠使其终浓度为0.1mg/ml；在共聚物溶液中加入等量的辣椒红素-乙醇悬液，充分混匀，冰浴200w下超声5-8min，形成基于糖基化酪蛋白的胶囊化辣椒红素。
1.酪蛋白糖基化产物酪蛋白-羧化壳聚糖的制备中的影响因素
1.1底物配比对接枝度的影响
反应温度控制在60℃，酪蛋白与羧化壳聚糖的反应时间为36h，相对湿度均为79％，pH值7.4。底物配比对接枝度的影响如图1所示。
1.2相对湿度对接枝度的影响
通过不同饱和盐溶液来控制不同的相对湿度，将蛋白多糖混合物，分别置于不同相对湿度(26％，40％，65％，79％)干燥器中，反应温度控制在60℃，酪蛋白-羧化壳聚糖反应时间为36h，底物配比1:3，pH值7.4。相对湿度对接枝度的影响如图2所示。
1.3反应温度对干法反应的影响
本研究将Cas-CC底物配比控制在1：2，相对湿度均为79％，pH值7.4。选取不同温度(40℃，60℃，80℃)的产物检测其接枝度及褐变程度，结果如下图3。
1.4反应时间对干法反应的影响
本研究将Cas-CC底物配比控制在1：2，相对湿度均为79％，pH值7.4。选取不同时间(6h，12h，24h，36h，48h，72h)的产物检测其接枝度及褐变程度，结果如下图4。
1.5不同反应时间和不同pH条件在溶解度的变化
酪蛋白-羧化壳聚糖在不同反应时间和不同pH条件在溶解度的变化结果如图5。
1.6不同反应时间条件下乳化性的变化
酪蛋白-羧化壳聚糖在不同反应时间条件下乳化性的变化结果如图6。
由图1-6可以得出，酪蛋白糖基化产物酪蛋白-羧化壳聚糖的制备方法的最佳条件，最佳条件见表1。
表1酪蛋白糖基化产物酪蛋白-羧化壳聚糖的制备方法的最佳条件
Figure GDA0002954420540000071
2.糖基化产物自组装纳米粒的制备
2.1不同糖基化产物浓度、不同超声功率对纳米粒径及分布的影响
分别测试不同糖基化产物浓度、不同超声功率对纳米粒径及分布的影响。见图7、8，超声前后酪蛋白多糖共聚物纳米粒粒径分布见图9。
2.2 NaCl对共价聚合物纳米自组装的影响
取6个相同的碘量瓶，分别加入2mg/ml酪蛋白多糖共聚物溶液20ml，然后分别称取一定量的NaCl加入到碘量瓶中，使NaCl终浓度为0M，0.05M，0.1M，1M，2M，3M，充分混合后放置2h，在冰浴条件下，以功率为200w超声6min。超声后的样品在4℃下放置一段时间测量粒径和浊度，结果如图10。
2.3乙醇对共价聚合物纳米自组装的影响
取6个相同的碘量瓶，分别加入2mg/ml糖基化产物溶液20ml，然后分别量取一定量的乙醇加入到碘量瓶中，使乙醇终浓度为10％，20％，30％，40％，50％，60％，充分混合后放置2h，在冰浴条件下，以功率为200w超声6min。超声后的样品在4℃下放置一段时间测量粒径和浊度，结果如图11。
2.4 Zeta电位随溶液pH的变化情况
酪蛋白多糖共聚物和酪蛋白的Zeta电位随溶液pH的变化情况，如图12所示。
2.5粒径分布随溶液pH的变化情况
酪蛋白多糖共聚物和酪蛋白的粒径分布随溶液pH的变化情况如图13。
由图9-13可以看出糖基化产物自组装纳米粒的制备方法的最佳条件，最佳条件见表2。
表2糖基化产物自组装纳米粒的制备方法的最佳条件
Figure GDA0002954420540000081
3.负载辣椒红素纳米粒的制备及应用
3.1负载辣椒红素超声纳米粒的制备
首先将15ml无水乙醇加入一定量的辣椒红素中，使得辣椒红素的终浓度为8mg/ml，在功率为200w条件下超声6min，使辣椒红素在无水乙醇中分散均匀，制得辣椒红素-乙醇悬液，备用。取20ml的糖基化产物溶液，不超声(按照3.3.1方法配置)，在等量的酪蛋白溶液中分别加入已经制备好的辣椒红素-乙醇悬液10μl，30μl，60μl，100μl，300μl，600μl，充分混匀，冰浴200w下超声6min，形成包埋有辣椒红素的糖基化产物纳米粒。
3.2步骤
3.2.1红辣椒标准曲线的制作
(1)准确称取0.100g的辣椒红素，溶于正己烷溶液中并定容于100mL，取10.0mL稀释液定容于100.0mL，即得到浓度0.1mg/mL的辣椒红素标准溶液。
(2)辣椒红素标准曲线的绘制
分别取色素标准溶液0.0，0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0mL，于七支10mL的比色管中，相当于辣椒红素的含量分别为：0.0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8mg，再用正己烷溶液定容至10mL，在460nm波长下测定各组吸光度，以辣椒红素含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线如图14所示。
3.2.2不同加样量对纳米胶囊的包封率和载药量的影响
计算包封率和载药量需要测定体系中辣椒红素的总量和被包埋的辣椒红素含量，计算公式如下：
包封率＝纳米粒中辣椒红素包埋量/样品中辣椒红素总量×100％
载药量＝纳米粒中辣椒红素包埋量/纳米粒的总量×100％
其中
样品中辣椒红素总量：
每组取出5ml加有不同量辣椒红素的超声体系样品，加入到25ml小烧杯中，分别在磁力搅拌条件下，加入相同体积的无水乙醇和500μl 1M氢氧化钠，充分混合后，加入一定量的正己烷萃取，至水相为无色，合并正己烷，在450nm处，用UNICO紫外-可见光分光光度计测正己烷相的吸光度值。
纳米粒中辣椒红素包埋量的测定：
将加有不同量的辣椒红素-糖基化纳米溶液过0.45μm滤膜，过膜后的每组样品取5ml加入到小烧杯中，分别在磁力搅拌条件下，加入相同体积的无水乙醇和500μl 1M氢氧化钠，充分混合后，加入一定量的正己烷萃取，至水相为无色，合并正己烷，在450nm处，用UNICO紫外-可见光分光光度计测正己烷相的吸光度值，结果如图15所示。
从图中可以看出，酪蛋白多糖共聚物对PRP的包埋率均呈现先增大后减小的趋势。当PRP加入量为200μl时而酪蛋白-羧化壳聚糖在PRP加入量为300μl时包埋率达到最大，为82.6％。继续增加PRP加入量，其包封率随之降低。这可能是因为超声之后的PRP乙醇分散液以分子形式存在，以分子形式的存在的PRP倾向于结合到酪蛋白多糖纳米胶囊的的疏水微区中。因此随着PRP加入量的增大，溶解在乙醇中的分子形式的PRP随之增多，结合在纳米胶囊疏水区的量也增多，包埋率也就是随之升高，而一定量的纳米粒的结合位置有限，继续增加PRP的加入量，因不能继续与纳米胶囊疏水区结合，导致计算所得包埋率减少。因此在最佳PRP加入量后继续增加加入量，其呈现下降趋势。
3.2.3光照对辣椒红色素纳米胶囊的影响
取4个相同的容量瓶，分别加入50ml的辣椒红素纳米胶囊溶液，放置在：室外自然光，室内自然光，室内日光灯，室内避光的条件下储存。每隔1天按照3.2.2中的方法测定纳米胶囊中辣椒红素的含量，并按照上述公式计算保留率，结果如图16所示。
从图中可以明显看出，被纳米胶囊包埋后的PRP在光照的条件在更稳定。其保留率均高于PRP。在室外光照的条件下贮藏6周被酪蛋白羧化壳聚糖所包埋PRP的保留率为83.3％，而未被包埋的PRP保留率仅剩45.7％。且在室内避光储存6周后，酪蛋白羧化壳聚糖PRP纳米胶囊的保留率为89.2％，而未包埋的PRP存放6周后包埋率降至为67.8％。说明酪蛋白多糖共聚物对PRP具有光保护作用，可以明显增加其稳定性。延长其贮藏期限。这种光保护作用是由于酪蛋白可以吸收和散射大部分光照，避免光对PRP的破坏作用，从而提高了其稳定性，防止色素长时间被光照加速分解，提高了色素的生物可给性和利用率。
3.2.4温度对辣椒红色素纳米胶囊的影响
取4个相同的容量瓶，分别加入50ml的辣椒红素纳米胶囊溶液，分别放置在温度为4℃、25℃、60℃的环境下储存。每隔1天按照3.2.2中的方法测定纳米胶囊中辣椒红素的含量，并按照上述公式计算保留率，结果如图17所示。
对于热敏性生物活性物质来说，温度对其影响较为显著。正如图17所示，其为在不同温度下PRP纳米胶囊和PRP保留率变化。在60℃保存6周后，被酪蛋白羧化壳聚糖所包埋PRP的保留率为83.2％，在室温25℃贮藏6周后保留率为85.8％，在冰箱中4℃贮藏6周后保留率分别可达到为90.5％。而未被包埋的PRP在60℃、25℃和4℃条件在贮藏6周后其保留率分别为38.5％、54.3％、70.02％。结果证明本研究所制备酪蛋白多糖纳米微胶囊可以有效的保护内核的PRP，防止PRP的热降解的发生，从而能够大大提高PRP的热稳定性，在食品和药品生产加工以及保藏运用中发挥巨大作用。
3.2.5食品添加剂对辣椒红色素纳米胶囊的影响
每隔1天按照3.2.2中的方法测定纳米胶囊中辣椒红素的含量，并按照上述公式计算保留率。加入0.1％的食品级防腐剂山梨酸钾、苯甲酸钠。避光，4℃，无氧条件下贮藏。每隔1天按照3.2.2中的方法测定纳米胶囊中辣椒红素的含量，并按照上述公式计算保留率，结果如图18所示。
本研究所制备的PRP纳米微胶囊可应用于食品，图18为常用食品添加剂对PRP保留率的影响。以不加食品添加剂(苯甲酸钠、山梨酸钾)PRP纳米微胶囊和未包埋的PRP分别为对照组1和对照组2。图中可以看出相对于对照组1，加入苯甲酸钠的PRP，其保留率由57.2％降至49.2％，加入山梨酸钾的PRP，其保留率由57.2％降至50.3％。而加入苯甲酸钠和山梨酸钾的PRP的包埋率与对照组1的保留率并没有发生明显变化。说明食品添加剂的加入对PRP纳米微胶囊的稳定性基本无影响。这种保护作用是由于糖基化产物与PRP结合后，内核的PRP是被保护起来，因而降低了PRP与外界发生化学反应。糖基化产物覆盖在PRP表面，这种物理阻碍作用能防止光、热等介质以及食品添加剂对其产生影响。
4.体外模拟生物利用率
分别将备好的糖基化纳米胶囊(酪蛋白-羧化壳聚糖纳米胶囊，浓度为2mg/ml)按1:1的比例至于模拟肠液中。混合后进行消化反应4h。取20ml反应后的混合溶液。5000r/min离心25min后，溶液分为三层，除去顶部油相和下层沉淀物质，取中间的胶束相溶液，加入正己烷，振荡充分混合，多次萃取至胶束相无色，合并上层有机相，在450nm处测定吸光值。利用PRP标准曲线计算游离PRP的含量。
Figure GDA0002954420540000101
其中，
C1：4h消化反应后中间相中PRP的浓度
C0：0h消化反应溶液中PRP的浓度
如图19所示，为纳米胶囊在模拟胃液中粒径(a)和PDI值的变化(b)，图中可以明显看出，物理混合物的粒径和PDI值均随孵育时间的延长迅速增大，Mix-Cas-CC的平均粒径从498.6nm增至1073.6nm，PDI值从0.47增至1.0。物理混合物在模拟胃液消中，因胃蛋白酶的剪切，其结构被破坏，酪蛋白聚集沉淀，导致经体系部分粒径增加，同时伴随着PRP的大量释放，且使得粒径分布更加不均匀，PDI值增加。而与物理混合物胶束相比，Cas-CC-Capsule粒径和PDI值仅有小幅度增加。释Cas-CC-Capsule粒径从289.6nm增至528.5nm，PDI值从0.153增大到0.46。因而，Cas-CC-Capsule在模拟胃液中具有相对较好的稳定性。
如图20所示，为纳米胶囊在模拟肠液PRP累积释放率的变化。图中可以明显看出混合物(Mix-Cas-CC)与共聚物纳米胶囊(Cas-Ca-Capsule和Cas-CC-Capsule)在1h内对PRP存在明显突释现象。1h后其释放逐渐缓慢并趋向于稳定，从结果中可以看出，共聚物纳米胶囊PRP最终释放总量率高于混合物。Mix-Cas-CC最终释放总量为73.2％，Cas-CC-Capsule最终释放总量达到78.6％。这说明共聚物的形成及包埋并未对PRP在肠液中得释放产生影响。这归因于羧基端肽键，存在于胰蛋白酶选择性水解蛋白质中精氨酸或赖氨酸残基。胰蛋白酶首先作用于共聚物纳米胶囊表面的K-酪蛋白，将其位于116-117位的赖氨酸残基的羧基端肽键切断后形成不同分子量的多肽，导致共聚物结构被破坏，纳米胶囊解体，核内的ɑ-酪蛋白和β-酪蛋白暴露，进一步与胰蛋白酶作用，最后共聚物被完全水解，核内PRP得到完全释放。由此可见，纳米胶囊表面所接枝的多糖形成的界面层对胰复合酶基本无阻碍作用。从而最大限度地保存内核物质的活性，减少外界环境因素的影响。有效提高了PRP的生物可给性。采用生物大分子构建良好的纳米载体用于增加营养素的溶解性和稳定性，从而最终提高营养素的生物利用率。

Claims (6)

1.一种酪蛋白-羧化壳聚糖自组装纳米微胶囊的制备方法，其特征在于包括下述步骤：
(1)酪蛋白糖基化共聚物的制备：将酪蛋白溶于pH7.4磷酸盐缓冲液中，室温磁力搅拌2.5h，制备成酪蛋白均匀溶液，超声处理；收集样品后加入一定比例羧化壳聚糖，混合均匀后冷冻干燥48h，随后将样品磨成粉，并过120目筛，置于含有饱和溴化钾的反应容器中并将反应温度控制在50℃-70℃，pH为7-8；反应30-40小时后冷却终止反应，即得酪蛋白糖基化共聚物；
(2)将酪蛋白糖基化共聚物溶于pH＝7.4的溶液中，配成共聚物溶液，并加入一定量的叠氮化钠使其终浓度为0.1mg/ml；将配制好的溶液放在20-30℃水浴磁力搅拌2.5-3.5小时，之后转移到3-5℃条件下放置8-12h，使糖基化产物颗粒溶胀充分，在冰浴的条件下，在250w的功率下超声5-7min，则得到酪蛋白-羧化壳聚糖自组装纳米微胶囊。
2.根据权利要求1所述的酪蛋白-羧化壳聚糖自组装纳米微胶囊的制备方法，其特征在于：步骤(1)中的酪蛋白与羧化壳聚糖的摩尔比0.3-0.8：1，反应容器中的相对湿度为70％-80％。
3.根据权利要求1所述的酪蛋白-羧化壳聚糖自组装纳米微胶囊的制备方法，其特征在于：步骤(1)中将酪蛋白糖基化共聚物溶于水，并用截流分子量100,000的超滤膜反复超滤，收集相对分子质量大于100,000的组分冷冻干燥，即得酪蛋白糖基化共聚物。
4.根据权利要求1所述的酪蛋白-羧化壳聚糖自组装纳米微胶囊的制备方法，其特征在于：步骤(2)中的配置的共聚物溶液的终浓度为1.5-2.5mg/ml。
5.权利要求1所述的酪蛋白-羧化壳聚糖自组装纳米微胶囊的制备方法在食品添加剂胶囊化中的应用。
6.一种酪蛋白-羧化壳聚糖自组装纳米微胶囊的制备方法在辣椒红素胶囊化中的应用，其特征在于包括下述步骤：
(1)酪蛋白糖基化共聚物的制备：将酪蛋白溶于磷酸盐缓冲液中，室温磁力搅拌，制备成酪蛋白均匀溶液，超声处理；收集样品后加入羧化壳聚糖，混合均匀后冷冻干燥，随后将样品磨成粉，并过120目筛，置于含有饱和溴化钾的反应容器中并将反应温度控制在50℃-70℃，pH为7-8；反30-40小时后冷却终止反应，即得酪蛋白糖基化共聚物；
(2)将无水乙醇加入辣椒红素中，使得辣椒红素的终浓度为6-10mg/ml，制得辣椒红素-乙醇悬液；将酪蛋白糖基化共聚物溶于pH＝7.4的溶液中，配成共聚物溶液，并加入一定量的叠氮化钠使其终浓度为0.1mg/ml；在共聚物溶液中加入等量的辣椒红素-乙醇悬液，充分混匀，冰浴200w下超声5-8min，形成基于糖基化酪蛋白的胶囊化辣椒红素。
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