CN109480270B - 具有pH响应性的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种具有pH响应性的Boc‑组氨酸‑羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的制备方法，包括以下步骤：将活化的Boc‑组氨酸溶液缓慢加入到预溶的羧甲基壳聚糖溶液中，再加入PYP，制成均匀的混合溶液；将所得的混合溶液超声处理，干燥后获得Boc‑组氨酸‑羧甲基壳聚糖接枝物质；将所得Boc‑组氨酸‑羧甲基壳聚糖接枝物质和去离子水混合并搅拌，最终获得溶胀后的Boc‑组氨酸‑羧甲基壳聚糖接枝物质；利用溶胀后的Boc‑组氨酸‑羧甲基壳聚糖接枝物质制备获得Boc‑组氨酸‑羧甲基壳聚糖自组装纳米微胶囊。本发明还提出所得Boc‑组氨酸‑羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊在VD3胶囊化中的应用，包埋率高。
Description
技术领域
本发明涉及食品营养素纳米胶囊领域，具体涉及一种具有pH响应性的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的制备方法及胶囊化VD3的制备方法。
背景技术
VD3通常广泛的用于日常的膳食补充剂，是最基本的一类人体必需营养物，但是由于其自身性质的不稳定，在空气中不稳定，易氧化，需避光避氧低温储存，脂溶性差，在肠胃环境中结构会遭到破坏等，影响了VD3的应用。目前市场上关于VD3的产品大致上有滴剂、注射液、片剂等，将VD3包埋制成微囊或微球有利于其储存稳定性，且可以作为营养强化剂或食品添加剂来达到改善健康的目的。
羧甲基壳聚糖是一种水溶性壳聚糖衍生物，有许多特性，如抗菌性强，具有保鲜作用，是一种两性聚电解质等。羧甲基壳聚糖是近年来出现的一种化工合成物，在医药、化工、环保、食品及保健品方面都有重要的意义。羧甲基壳聚糖是一种阴离子衍生物，羧甲基壳聚糖也可像羧甲基甲壳素的制备那样，在碱的存在下用氯乙酸与之反应而得到，但羧甲基甲壳素的羧甲基是在糖残基的C6-OH上发生取代，有少量羧甲基在C3-OH上发生取代，生成的是O-羧甲基甲壳素，因此，羧甲基壳聚糖在保留了壳聚糖的优良特性的基础上表现出改善的水溶性，提高的凝胶形成能力和增强的生物活性，例如生物相容性、生物可降解性、低免疫原性、抗微生物活性和抗氧化活性。羧甲基壳聚糖可在任何pH值的水溶液中充分溶解，同时，它的生物可降解速度也更快于壳聚糖。另外，綾甲基壳聚糖结构中较多的氨基、接基等官能团为化学修饰提供了保障，可应用范围也就大大拓展。
自组装技术作为制备纳米微胶囊的一种方法，其材料被认为是21世纪材料科学与工程最重要的领域之一。根据G.W.Whitesides对自主张的概括。自组装是指在组装单元之间自发形成有序结构的一种现象。由此可见，自组装系统含有两个基本要素：组装单元和组装单元之间的非共价键的相互作用力。就组装单元来说,天然生物材料，由于其的绿色、安全、良好的导向性好等特征赋予其得天独厚的优势。与传统的微胶囊相比，纳米微胶囊具有更好的靶向性和缓释效果。微胶囊技术在食品中的应用使食品营养素能更方便、安全地应用，使食品的加工、新产品的开发更为方便，从而在色香味型营养保健以及安全等方面提升了产品的质量。
现有期刊《25羟基维生素D3一聚乳酸微球的制备及其对骨髓间充质干细胞增殖的影响》提出一种包埋维生素D3的方法，但其不能实现ph响应缓释，不适用服用维生素D3的情况。
综上，需要对现有技术进行改进。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种具有pH响应性的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的制备方法及其应用。
为解决上述技术问题，本发明提出一种具有pH响应性的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质：
将活化的Boc-组氨酸溶液加入(可缓慢加入，加入时间约为20s～40s)到预溶的羧甲基壳聚糖溶液中，再加入催化剂PYP，制成均匀的混合溶液；
所述的Boc-组氨酸与羧甲基壳聚糖的摩尔比为1:0.5～2.5；
所述的Boc-组氨酸与PYP(4-吡咯烷基吡啶)的摩尔比为1mol：0.3～0.4mmol；
将所得的混合溶液于40～70℃下超声震荡30～50min(超声功率为250～400w)，干燥(于-20℃冷冻干燥24h)后获得Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质；
S2、制备Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自组装纳米微胶囊：
2.1、将步骤S1所得Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质加入去离子水，于20～30℃下磁力搅拌4～8h，获得溶胀后的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质；
2.2、将步骤2.1所得溶胀后的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质在0～5℃条件下放置10～14h，之后在冰浴(0℃)的条件下进行超声处理6～12min(超声功率为150～230w)，干燥后(于-20℃冷冻干燥24h)获得Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自组装纳米微胶囊。
作为本发明具有pH响应性的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的制备方法的改进：
所述的Boc-组氨酸与羧甲基壳聚糖的摩尔比为1：2；
所述的Boc-组氨酸与催化剂PYP的摩尔比为1mol：0.33mmol。
作为本发明具有pH响应性的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的制备方法的进一步改进：
所述步骤S1中，将所得的混合溶液于50℃下超声震荡40min(超声功率为300w)，干燥后获得Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质。
作为本发明具有pH响应性的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的制备方法的进一步改进：
所述步骤2.1中，Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质与去离子水的质量体积比为0.9～1.1mg：1mL。
作为本发明具有pH响应性的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的制备方法的进一步改进：
所述步骤2.2中，超声处理8min(超声功率为200w)。
作为本发明具有pH响应性的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的制备方法的进一步改进：
所述活化的Boc-组氨酸溶液的配制方法为：
将Boc-组氨酸溶于去离子水中，加入CDI(N,N'-羰基二咪唑)，然后在40～60℃的水浴锅中反应2～4h后结束反应，获得活化的Boc-组氨酸溶液；
每1mol Boc-组氨酸配用9～11mL的去离子水；
所述的Boc-组氨酸与CDI的摩尔比为1mol：3～4mmol。
作为本发明具有pH响应性的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的制备方法的进一步改进：
所述预溶的羧甲基壳聚糖溶液的配制方法为：
向羧甲基壳聚糖(干燥的羧甲基壳聚糖)中加入超纯水，然后以500±50rpm/min搅拌10～14h，获得预溶的多糖溶液备用；
每1mol羧甲基壳聚糖配用3～6mL的超纯水。
为解决上述技术问题，本发明还提出一种利用上述方法制备获得的具有pH响应性的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的用途：用于胶囊化VD3。
作为本发明具有pH响应性的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的用途的改进：
在漩涡震荡的条件下，向溶胀后的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质中逐滴滴加VD3溶液(1～2min内滴加完成)，充分混匀后在冰浴(0℃)的条件下6～12min(超声功率为150～230w)，干燥后(于-20℃冷冻干燥24h)获得包埋有VD3的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊；
所述Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质与VD3溶液的质量体积比为1mg：9～11uL；
所述VD3溶液的浓度为5～30ug/mL。
作为本发明具有pH响应性的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的用途的进一步改进：
在漩涡震荡的条件下，向溶胀后的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质中逐滴滴加VD3溶液(1～2min内滴加完成)，充分混匀后在冰浴(0℃)的条件下8min(超声功率为200w)，干燥后(于-20℃冷冻干燥24h)获得包埋有VD3的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊；
所述Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质与VD3溶液的质量体积比为1mg：10uL；
所述VD3溶液的浓度为25ug/mL。
针对现有技术，本发明的技术优势是：
本发明通过酯化反应在天然多糖(羧甲基壳聚糖)上接枝Boc-组氨酸，使得天然多糖(羧甲基壳聚糖)具有pH响应，再通过自主装得到一种性能更加优良的微胶囊壁材。
本发明羧甲基壳聚糖与组氨酸反应后可以明显提高羧甲基壳聚糖的pH响应性，且具有良好的热稳定性、唾液及肠胃稳定性和储存稳定性。
本发明Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊能有效包埋VD3，包埋率最大达到75.33％，具有保护和提高热稳定性作用，具有pH定点释放性能。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是底物配比对所得BOC-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质含氮量的影响示意图；
图2是反应温度对所得BOC-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质含氮量的影响示意图；
图3是反应时间对所得BOC-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质含氮量的影响示意图；
图4是反应超声功率对所得BOC-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质含氮量的影响示意图；
图5是BOC-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质的质子缓冲能力示意图；
图6是pH对BOC-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质的zeta电位的影响示意图；
图7是羧甲基壳聚糖与BOC-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质的流变性能测试结果图(图a为粘度与剪切速率示意图，图b为储能模量和耗能模量示意图)；
图8是不同超声时间对Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的粒径及分布的影响示意图；
图9是不同超声功率对Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的粒径及分布的影响示意图；
图10是VD3标准曲线示意图；
图11是不同VD3溶度对VD3包埋率的影响示意图；
图12是负载VD3的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊在模拟胃液、肠液及唾液中缓释性质研究示意图；
图13是Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊对VD3体外缓释性能影响示意图；
图14是pH对负载VD3的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的体外缓释性能影响示意图；
图15是温度对负载VD3的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的体外缓释性能影响示意图；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1、具有pH响应性的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质：
将活化的Boc-组氨酸溶液缓慢加入(30s内加入完毕)到预溶的多糖溶液(羧甲基壳聚糖溶液)中，再加入催化剂PYP(0.049g,0.33mmol)，制成均匀的混合溶液；
将超声仪探头插入混合溶液的液面下2cm，在超声功率为300w，反应温度为50℃条件下反应40min，获得反应物。
Boc-组氨酸与羧甲基壳聚糖的摩尔比为1:2；
Boc-组氨酸与催化剂PYP(4-吡咯烷基吡啶)的摩尔比为1mol:0.33mmol；
将所得反应物放入-20℃冷冻干燥箱中冷冻干燥24h，获得Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质(全文中简称为接枝物)放入试剂瓶中保存；
Boc-组氨酸活化步骤：取一只50mL圆底烧瓶，将称好的0.95g Boc-组氨酸(1mol)溶于10mL去离子水中，取CDI(N,N'-羰基二咪唑，0.54g,3.3mmol)加入到该圆底烧瓶中，然后将该圆底烧瓶在50℃的水浴锅中反应3h后结束反应，使Boc-组氨酸得到活化，获得活化的Boc-组氨酸溶液。
多糖溶液的预溶步骤：本发明采用的多糖为羧甲基壳聚糖，将羧甲基壳聚糖在40℃条件下真空干燥12h，然后取1.84g羧甲基壳聚糖(2mol)，置于带有搅拌子的50mL锥形瓶中，然后加入10mL超纯水，然后以500rpm/min搅拌12h，获得预溶的多糖溶液备用。
S2、制备Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自组装纳米微胶囊：
2.1、准确称取步骤S1所得Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质5mg，将其溶于5mL去离子水中，配成浓度为1mg/mL的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质水溶液。将配制好的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质水溶液放在25℃磁力搅拌器中，磁力搅拌6小时，使Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质溶胀，获得溶胀后的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质；
2.2、将步骤2.1所得溶胀后的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质在4℃条件下放置过夜(12h)。之后在冰浴(0℃)的条件下进行超声处理，超声功率为200w，超声时间为8min，将所得产物放入-20℃冷冻干燥箱中冷冻干燥24h，获得Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自组装纳米微胶囊。
注：说明书中以CAS表示羧甲基壳聚糖，以His-CAS表示Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质。
实施例2、实施例1所得Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的在VD3胶囊化中的应用，包括以下步骤：
在漩涡震荡的条件下，向实施例1步骤2.1制备所得溶胀后的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质中逐滴滴加50uL VD3溶液(25ug/mL)，1～2min内滴加完成，充分混匀后在冰浴(0℃)的条件下于超声功率200w下超声8min，将所得产物放入-20℃冷冻干燥箱中冷冻干燥24h，获得包埋有VD3的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊，下文中简称为负载VD3纳米粒。
注：包埋率为75.33％。
实验1、Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质制备中的影响因素：
在改变单一变量的前提下，根据实施例1步骤S1中制备方法，分别测试不同底物配比、不同反应温度、不同反应时间、不同超声功率对所得Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质含氮量的影响。
注：本发明通过Vario EL III型元素分析仪对Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质中的N元素进行百分含量分析，通过含氮量的提高量进而判断Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质的最佳合成条件。
1.1、底物配比对所得接枝物含氮量的影响：
底物配比是指步骤S1中Boc-组氨酸与羧甲基壳聚糖的摩尔比；
控制反应温度为50℃，反应时间为40min，超声功率为300w，测试不同底物配比对所得接枝物含氮量的影响(即，仅改变底物配比)，测试结果如图1所示。
由图1可知，当底物配比为2时所得接枝物的含氮量最高，即，Boc-组氨酸与羧甲基壳聚糖的摩尔比为1:2时最佳。
1.2、反应温度对所得接枝物含氮量的影响：
将Boc-组氨酸与羧甲基壳聚糖的摩尔比固定为1:2，控制反应时间为40min，超声功率为300w，测试不同反应温度对所得接枝物含氮量的影响(即，仅改变反应温度)，测试结果如图2所示。
由图2可知，反应温度为50℃时所得接枝物的含氮量最高。
1.3、反应时间对所得接枝物含氮量的影响：
将Boc-组氨酸与羧甲基壳聚糖的摩尔比固定为1:2，控制反应温度为50℃，超声功率为300w，测试不同反应时间对所得接枝物含氮量的影响(即，仅改变反应时间)，测试结果如图3所示。
由图3可知，反应时间为40min时所得接枝物的含氮量最高。
1.4、超声功率对所得接枝物含氮量的影响：
将Boc-组氨酸与羧甲基壳聚糖的摩尔比固定为1:2，控制反应温度为50℃，反应时间为40min，测试不同超声功率对所得接枝物含氮量的影响(即，仅改变超声功率)，测试结果如图4所示。
由图4可知，超声功率为300w时所得接枝物的含氮量最高。
1.5、BOC-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质在不同pH环境下的质子缓冲能力：
His-CAS0.5，His-CAS1，His-CAS2几种接枝物的质子缓冲能力如图5所示。
注：His-CAS0.5代表Boc-组氨酸与羧甲基壳聚糖的摩尔比为1:0.5；
His-CAS1代表Boc-组氨酸与羧甲基壳聚糖的摩尔比为1:1；
His-CAS2代表Boc-组氨酸与羧甲基壳聚糖的摩尔比为1:2；
注：本实验通过Hcl溶液作为缓冲溶液。
由图5可知，由His-CAS2的质子缓冲能力最佳。
注：上述BOC-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质的质子缓冲能力通过pH计进行测定的，测定方法为现有技术，故不再此处详细告知。
1.6、pH对CAS及His-CAS的Zeta电位的影响：
羧甲基壳聚糖(CAS)及BOC-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质(His-CAS，实施例1制备获得)在不同pH环境下的zeta电位测定结果如图6所示。
注：上述CAS与His-CAS在不同pH环境下的Zeta电位通过Zeta电位仪进行测定，测定方法为现有技术，故不再此处详细告知。
1.7、CAS及His-CAS的流变性能测试:
羧甲基壳聚糖(CAS)及BOC-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质(His-CAS，实施例1制备获得)流变性能的测定结果如图7所示。
注：如图7中G’表示储能模量，G”表示耗能模量
上述CAS与His-CAS的流变性能通过流变仪进行测定，测定方法为现有技术，故不再此处详细告知。
实验2、Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的制备过程的影响因素：
在改变单一变量的前提下，根据实施例1步骤S2中制备方法，分别测试不同超声时间、不同超声功率对所得Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的影响。
2.1、超声功率对Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的粒径及分布影响：
实施例1步骤S2中，在冰浴的条件下于超声功率200W超声不同时间，所得Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的粒径及分布如图8所示。
2.2、超声时间对Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的粒径及分布影响：
实施例1步骤S2中，在冰浴的条件下于不同超声功率下超声8min，所得Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的粒径及分布如图9所示。
注：Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的粒径越小越好，但是必须集中分布，故当超声功率200W下超声8min最佳，
实验3、负载VD3纳米粒的制备及应用：
3.1、VD3标准曲线的制作：
准确称取10mg的VD3标准样品，溶于5mL乙醇溶液中，使其完全溶解，之后将其转移至10mL棕色容量瓶中，并用乙醇将其定容至10mL，即得到浓度1mg/mL的VD3标准储备溶液。
VD3标准曲线的绘制：从配置好的标准储备液中分别取VD3标准溶液0.3mL，0.25mL，0.2mL，0.15mL，0.025mL，0.01mL，5uL，2.5uL溶液，于8支10mL的比色管中，用乙醇稀释至刻度，相当于VD3的浓度分别为：30ug/mL，25ug/mL，15ug/mL，10ug/mL，5ug/mL，2.5ug/mL，1ug/mL，0.5ug/mL，0.25ug/mL的VD3标准溶液，在265nm波长下测定各组标准溶液的吸光度值，以VD3浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，结果如图10所示。
3.2、VD3包埋率的测定：
在溶胀后的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质和VD3超声后，其体系中不仅有包埋VD3的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自组装纳米微胶囊的存在，还有未被包埋的VD3的存在。计算包载率(即，负载率)和包封率(即，包埋率)需要测定超声体系中VD3的总量和被包埋的VD3含量，计算公式如下：
包载率＝(总VD3质量-上清液中VD3质量)/纳米粒质量×100％
包封率＝(总VD3质量-上清液中VD3质量)/总VD3质量×100％
按照实施例2的步骤，利用溶胀后的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质(即，实施例1步骤2.1制备所得)对6组不同浓度的VD3溶液进行包埋，获得对应超声体系样品，即，含包埋VD3的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自组装纳米微胶囊和未被包埋的VD3的混合悬浮液。
6组VD3溶液的浓度分别设为5ug/mL、10ug/mL、15ug/mL、20ug/mL、25ug/mL、30ug/mL；
包埋完成后，从每组取出10mL超声体系样品，放入10mL离心管中，放入离心机中，进行高速离心，离心转速为1200rad/min，温度为4℃，包埋VD3的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自组装纳米微胶囊通过高速离心沉到管壁，在265nm处，用UNICO紫外-可见光分光光度计测上清液中游离的VD3吸光度值，结果如图11所示。
从图11中可以看出，随着维生素D3浓度的增大，His-CAS对维生素D3的包埋率呈现出先增大后减小的趋势，在His-CAS在维生素D3浓度为25ug/mL时包埋率最大(75.33％)，在维生素D3浓度为25ug/mL时，负载率基本保持不变。包埋率出现先增加后减少趋势的原因可能是因为在His-CAS用量一定的情况下，微胶囊对维生素D3的包埋具有饱和性，微胶囊对维生素D3的结合位置有限，当维生素D3浓度达到一定时对其包埋达到饱和，再继续增大VD3的添加浓度，包埋率反而会出现下降的趋势，而负载率基本保持不变。本发明以25mL/l为包埋浓度，此时的时包埋率最大(75.33％)相对较高，既充分利用所加入的His-CAS，又能包埋相对多的VD3，能实现后期更好地应用。
实验4、体外模拟生物利用率：
4.1、VD3累计释放量的测定方法：
按1：1体积比分别向负载VD3的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖纳米胶囊水溶液(浓度为1mg/mL)中加入模拟人工胃液、肠液及唾液进行反应；开始反应后，分别在第0、0.5、1、1.5、2.5、3、3.5h时取5mL反应溶液，测量该反应溶液的VD3含量，并计算累计释放量。
注：负载VD3的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖纳米胶囊水溶液由实施例2所得Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖纳米胶囊和去离子水制备获得。
C：t时刻溶液中释放的VD3的浓度；
V：t时刻混合溶液体积；
M：初始时刻Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖纳米胶囊中VD3的总量；
具体实验步骤如下：
负载VD3的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖纳米胶囊水溶液(浓度为1mg/mL)按1：1的体积比分别置于模拟胃液、肠液及唾液中，于37℃的恒温水浴锅内进行保温，并分别于保温的第0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5h，取样5mL的样品，按照上述VD3累计释放量的测定方法测定VD3累计释放量并作图。通过缓释指标分析胃蛋白酶、胰蛋白酶及α-淀粉酶对糖负载VD3的Boc-组氨酸-多糖纳米胶囊的消化作用，结果如图15所示。
4.1.1、在模拟人工唾液中，负载VD3的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖纳米胶囊的缓释释放速度非常缓慢，累积释放至1.5h时，VD3的释放率基本平缓，累积释放至3.5h时，释放率达到最大值23.7％。
造成上述情况的原因为人体唾液中所存在的酶是唾液淀粉酶，唾液淀粉酶是唾液腺所分泌的一种水解酶，属于α淀粉酶的一种，作用于直链淀粉、糖原等α-1,4-葡聚糖，水解α-1,4-糖苷键的酶。唾液淀粉酶难以破坏His-CAS的自身结构，从而降低了载VD3的缓释释放速率。
4.1.2、在模拟人工胃液(pH为1.5)中，负载VD3的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖纳米胶囊的缓释释放速度和模拟人工肠液相似，累积释放至1.5h时，VD3释放率基本平缓，累积释放至3.5h时，释放率达到最大值25.9％。
一般食物在胃液停留时间为3～4h，由图12可知，在3.5h内只有少量的VD3被释放，因此在胃液中保留3.5h后的负载VD3的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖纳米胶囊，其中的VD3仍能与His-CAS能有效结合，维持包埋状态，从而有利于VD3顺利进入肠道完成缓释释放。
4.1.3、在模拟人工肠液中(p H为7.4)，负载VD3的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖纳米胶囊的缓释释放率在最初阶段(0～0.5h)释放迅速，在1h内对VD3存在明显突释现象，第2.5h后缓释释放速率减慢。在体外累积释放持续时间达3.5h时，缓释释放率达到最大值85.5％。
上述分析说明负载VD3的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖纳米胶囊被口服后，不被唾液淀粉酶及胃酸破坏，直至到在小肠液的弱碱性环境中能够缓释释放，从而提高其生物利用度。同时体外释放实验进一步研究表明，pH响应His-CAS在模拟胃液，肠液及唾液中有着良好的控释行为，这些性质使其在药物缓释领域，特别是在肠道靶向给药领域拥有巨大的应用前景。
4.2、超声酯化改性羧甲基壳聚糖对VD3体外缓释性能影响：
设置对照组：即，以羧甲基壳聚糖代替Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质，按照实施例2负载VD3，获得负载VD3的羧甲基壳聚糖纳米胶囊；
分别取5mL负载VD3的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖纳米胶囊(实施例2制备获得)和负载VD3的羧甲基壳聚糖纳米胶囊，再分别添加5mL pH值为7.4的人工模拟肠液，随后在37℃条件下水浴加热，于第0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5h测定VD3累计释放量并作图，结果如图13所示。
注：图13中CAS表示负载VD3的羧甲基壳聚糖纳米胶囊；His-CAS表示负载VD3的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖纳米胶囊。
由图13中CAS对应曲线可知，仅羧甲基壳聚糖作为缓释微球时，在缓释释放前1h容易出现爆释负载物，从而导致释放速率的严重不稳定影响缓释效果，随着缓释时间的延长，缓释基本稳定，3.5h后，缓释释放率达到74.8％。
由图13中His-CAS对应曲线可知，以Boc-组氨酸对羧甲基壳聚糖进行改性后的产物His-CAS能够有效地改善羧甲基壳聚糖的物化性能和缓释特性，经过时间的延长，缓释释放率增加，3.5h后，释放率达到86.5％。实验结果说明了His-CAS的缓释效果优于CAS，即，通过超声酯化改性的方法能够较好的提高羧甲基壳聚糖对VD3的缓释效果。
4.3、pH对VD3体外缓释性能影响：
人体小肠液环境中的pH值一般为7.4左右，在某些外界影响条件下例如进食前后会发生波动，通过改变pH条件测试pH对负载VD3的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖纳米胶囊的缓释性能的影响：
取5个相同的10mL比色管，分别加入5mL负载VD3的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖纳米胶囊，再分别向其中添加5mL pH值为8、7.4、7.0、6.5、5.8的人工模拟肠液，在37℃条件下水浴加热10min，测定VD3累计释放量并作图结果如图14所示。
由图14可知，负载VD3的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖纳米胶囊在pH＝7和pH＝7.4的人工模拟肠液中对VD3的释放率远高于在pH＝8、pH＝6.5和pH＝5.8的人工模拟肠液溶液中的释放率。释放时间进行到3.5h时，负载VD3的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖纳米胶囊在pH＝8的人工模拟肠液溶液中释放率达到43.4％、在pH＝7.4的人工模拟肠液溶液中释放率达到86.4％、在pH＝7的人工模拟肠液溶液中释放率达到87.5％、在pH＝6.5的人工模拟肠液溶液中释放率达到56.5％、在pH＝5.8的人工模拟肠液溶液中释放率达到41.2％。
造成上述情况的原因为His-CAS的pH响应特性。在pH＝7和pH＝7.4时，His-CAS结构中的羧甲基重复单元的大部分羧甲基都被离子化，以羧酸根形式存在，His-CAS带负电，同种电荷的羧酸根离子之间有很强的排斥作用，使His-CAS分子链向四周伸展，分子链上的羧酸根阴离子可以和水分子以氢键形式结合，引起His-CAS的溶胀，同时羧酸根基团间的排斥作用增加了His-CAS表面上微孔结构的尺寸，VD3可由这些增大的微孔中，从His-CAS内部扩散至pH＝7和pH＝7.4的介质中，完成缓释释放过程。
而His-CAS的微孔溶胀程度则可以控制其释放速率。pH＝6.5或pH＝5.8时，His-CAS颗粒表面主要以羧基形式存在，相邻的羧基之间形成氢键，使得His-CAS分子结构收缩，表面的孔径变小，有效地阻止了VD3的溶出。
上述实验结果表明，负载VD3的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖纳米胶囊在模拟人工肠液溶液(pH＝7和pH＝7.4)中能释放的相对较完全，提高了VD3的生物利用率，为包载其他相似的物质提供理论支撑，也证明用于包埋VD3的His-CAS具有pH依赖特性。
4.4、温度对VD3体外缓释性能影响：
由于VD3属于易挥发物质，在VD3缓释过程中的温度控制对缓释效果及时间有着至关重要的作用。为探究温度特别是在人体温度37℃下的VD3缓释微球的缓释性能，做以下实验：取4个相同负载VD3的10mL比色管，分别加入5mL负载VD3的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖纳米胶囊，并向其中添加5mL pH值为7.4的人工模拟肠液，将其分别在4℃、10℃、37℃、50℃温度条件下保温10min，测定VD3累计释放量并作图，结果如图15所示。
由图15可知，在50℃及37℃时VD3的释放速率最快，10℃次之，4℃条件下释放速率最慢，累积释放速率低于人体温度接近60％，这是由于在低温条件下，胰蛋白酶活力较低，抑制了VD3的释放，VD3缓释微胶囊的释放率几乎可忽略不计；当体外温度达到50℃时，虽然此时的温度高于37℃，但是胰蛋白酶并没有失活，同时会提高VD3分子运动速率，VD3分子从微胶囊所特有的框架结构中释放需要克服分子间作用力，此过程需要吸热，随着体外温度的升高，分子的无规则运动越剧烈，VD3释放速率会加快，但温度越高活性，影响VD3释放速率。同时，观察到，在50℃及37℃温度环境下，VD3缓释释放速率接近，说明在人体温度环境下VD3可以很好地进行缓释。
对比例、分别以魔芋胶、果胶、羧化壳聚糖、β-环糊精、壳聚糖代替实施例1中的羧化壳聚糖，其余等同于实施例1，获得相应的BOC-组氨酸-多糖接枝物质；并以所得的BOC-组氨酸-多糖接枝物质代替实施例2中的BOC-组氨酸-羧化壳聚糖接枝物质，其余等同于实施例2，获得负载VD3的Boc-组氨酸-多糖纳米胶囊。
各BOC-组氨酸-多糖接枝物质含氮量测试结果如表1所示：
表1
由表1可知，羧甲基壳聚糖接枝Boc-组氨酸合成的多糖物质具有相对较高的含氮量。其他多糖物质接枝Boc-组氨酸分子后，所得接枝物质的含氮量相对较低，因此，本实验筛选羧甲基壳聚糖这种天然多糖通过酯化反应来接枝反应来接枝Boc-组氨酸对多糖进行改性，进而得到接枝物质。
各BOC-组氨酸-多糖接枝物质负载VD3的包埋率，以及各负载VD3的Boc-组氨酸-多糖纳米胶囊在模拟胃液、肠液及唾液环境下缓释3.5h后释放率如表2所示：
表2
综上，用羧甲基壳聚糖与Boc-组氨酸进行酯化反应得到的壁材具有广阔的研究价值。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (8)
1.具有pH响应性的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的制备方法，其特征是包括以下步骤：
S1、制备Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质：
将活化的Boc-组氨酸溶液加入到预溶的羧甲基壳聚糖溶液中，再加入4-吡咯烷基吡啶，制成均匀的混合溶液；
所述的Boc-组氨酸与羧甲基壳聚糖的摩尔比为1:0.5～2.5；
所述的Boc-组氨酸与4-吡咯烷基吡啶的摩尔比为1mol：0.3～0.4mmol；
将所得的混合溶液于40～70℃下超声震荡30～50min，干燥后获得Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质；
所述活化的Boc-组氨酸溶液的配制方法为：
将Boc-组氨酸溶于去离子水中，加入N,N’-羰基二咪唑，然后在40～60℃的水浴锅中反应2～4h后结束反应，获得活化的Boc-组氨酸溶液；
每1mol Boc-组氨酸配用9～11mL的去离子水；
所述的Boc-组氨酸与N,N’-羰基二咪唑的摩尔比为1mol：3～4mmol；
S2、制备Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自组装纳米微胶囊：
2.1、将步骤S1所得Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质加入去离子水，于20～30℃下磁力搅拌4～8h，获得溶胀后的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质；
2.2、将步骤2.1所得溶胀后的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质在0～5℃条件下放置10～14h，之后在冰浴的条件下进行超声处理6～12min，干燥后获得Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自组装纳米微胶囊。
2.根据权利要求1所述的具有pH响应性的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的制备方法，其特征是：
所述的Boc-组氨酸与羧甲基壳聚糖的摩尔比为1：2；
所述的Boc-组氨酸与4-吡咯烷基吡啶的摩尔比为1mol：0.33mmol。
3.根据权利要求2所述的具有pH响应性的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的制备方法，其特征是：
所述步骤S1中，将所得的混合溶液于50℃下超声震荡40min，干燥后获得Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质。
4.根据权利要求1～3任一所述的具有pH响应性的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的制备方法，其特征是：
所述步骤2.1中，Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质与去离子水的质量体积比为0.9～1.1mg：1mL。
5.根据权利要求4所述的具有pH响应性的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的制备方法，其特征是：
所述步骤2.2中，超声处理8min。
6.根据权利要求5所述的具有pH响应性的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的制备方法，其特征是：
所述预溶的羧甲基壳聚糖溶液的的配制方法为：
向羧甲基壳聚糖中加入超纯水，然后以500±50rpm搅拌10～14h，获得预溶的多糖溶液备用；
每1mol羧甲基壳聚糖配用3～6mL的超纯水。
7.包埋有VD3的具有pH响应性的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的制备方法，其特征是：
S1、制备Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质：
将活化的Boc-组氨酸溶液加入到预溶的羧甲基壳聚糖溶液中，再加入4-吡咯烷基吡啶，制成均匀的混合溶液；
所述的Boc-组氨酸与羧甲基壳聚糖的摩尔比为1:0.5～2.5；
所述的Boc-组氨酸与4-吡咯烷基吡啶的摩尔比为1mol：0.3～0.4mmol；
将所得的混合溶液于40～70℃下超声震荡30～50min，干燥后获得Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质；
所述活化的Boc-组氨酸溶液的配制方法为：
将Boc-组氨酸溶于去离子水中，加入N,N’-羰基二咪唑，然后在40～60℃的水浴锅中反应2～4h后结束反应，获得活化的Boc-组氨酸溶液；
每1mol Boc-组氨酸配用9～11mL的去离子水；
所述的Boc-组氨酸与N,N’-羰基二咪唑的摩尔比为1mol：3～4mmol；
S2、制备包埋有VD3的具有pH响应性的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自组装纳米微胶囊：
2.1、将步骤S1所得Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质加入去离子水，于20～30℃下磁力搅拌4～8h，获得溶胀后的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质；
2.2、在漩涡震荡的条件下，向溶胀后的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质中逐滴滴加VD3溶液，充分混匀后在冰浴的条件下超声6～12min，干燥后获得包埋有VD3的具有pH响应性的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊；
所述Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质与VD3溶液的质量体积比为1mg：9～11μL；
所述VD3溶液的浓度为5～30μg/mL。
8.根据权利要求7所述的包埋有VD3的具有pH响应性的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊的制备方法，其特征是：
在漩涡震荡的条件下，向溶胀后的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质中逐滴滴加VD3溶液，充分混匀后在冰浴的条件下超声8min，干燥后获得包埋有VD3的具有pH响应性的Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖自主装纳米微胶囊；
所述Boc-组氨酸-羧甲基壳聚糖接枝物质与VD3溶液的质量体积比为1mg：10μL；
所述VD3溶液的浓度为25μg/mL。
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