CN108066277B - 基于叶酸靶向的复合多糖凝胶的制备及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于叶酸靶向的复合多糖凝胶的制备方法，属生物高分子技术领域。采用偶联剂修饰酸性多糖，偶联叶酸，通过原位释放法制备三组分复合多糖凝胶，具有互穿交联网络结构，机械强度高。复合多糖凝胶具有基于肿瘤细胞表面叶酸受体识别的体外释药靶向性。本发明制备方法偶联效果好、转化率高，复合多糖凝胶可负载各类抗肿瘤药物，拓展了天然高分子的应用范围。

Description

基于叶酸靶向的复合多糖凝胶的制备及应用
技术领域
本发明属生物高分子技术领域，涉及一种叶酸功能化多糖复合凝胶的制备及和应用，具体说是基于叶酸靶向的复合多糖凝胶负载抗肿瘤药物及其应用。
背景技术
多糖是一种天然高分子化合物，有很好的黏性，具有溶胶-凝胶转变的能力，多糖分子链上含有多种官能团，如羟基、羧基和氨基等，能够与其他化合物上的官能团发生反应，作为负载药物的载体应用于给药系统。海藻酸钠被广泛的应用于药物释放领域，但是海藻酸钠水凝胶的机械强度较低，容易降解，严重限制了在药物释放领域的应用范围，因此与其他高分子聚合物形成复合凝胶能够提高其水凝胶的机械强度和网络交联密度，有利于海藻酸钠在给药系统中的应用。R. You等用水溶性壳聚糖与海藻酸钠在无酸介质中交联形成多功能水凝胶颗粒，装载珠血红蛋白（Hb）的效率达到接近100%（International Journalof Biological Macromolecules, 2015, 79:498）。P. Severino等利用一种阳离子模型药硫酸多粘菌素B（PLX）与海藻酸钠按一定的比例交联得到载药凝胶纳米粒，海藻酸钠-硫酸多粘菌素的细胞毒性要低于PLX（Colloids & Surfaces B Biointerfaces, 2015, 129:191）。D. S. Seeli等通过钡离子将瓜尔豆胶和海藻酸钠交联制备得到凝胶珠（ggs-sa），可避免在胃酸性环境中药物的释放，能够将药物运送到结肠进行药物释放（InternationalJournal of Biological Macromolecules, 2016, 91:45）。P. R. Sarikae等将阳离子改性明胶（CG）和海藻酸钠通过静电络合作用自组装制备得到复合聚电解质复合物（PEC）纳米粒子，用于封装的天然抗氧化剂姜黄素，其包封率达到69%，对MCF-7细胞具有一定的抑制作用（Carbohydrate Polymers, 2016, 148:354.）。
在肿瘤组织中，叶酸受体（folate receptor，FR）是一种糖基化磷脂酰肌醇连接的膜糖蛋白，有三个亚型：-α、-β和-γ，其中-α和-β亚型在许多快速分裂癌症细胞表面过度表达，但很少在正常细胞表面表达。因此，可利用 FR对叶酸及其类似物的转运机制和在细胞表面的高表达性，将叶酸作为一种介导叶酸途径的靶向配体。J. Emami等制备了生育酚琥珀酸壳聚糖-聚乙二醇叶酸（TS-CS-PEG-FA-PTX）载体，用于紫杉醇（PTX）受体靶向胶束给药系统（International Journal of Biological Macromolecules, 2015, 80:29）；J.Pillai等人制备了叶酸偶联丙烯酸-聚乙二醇水凝胶（FA-PAA-PEG），通过酰胺化反应将聚合物与叶酸相连。姜黄素包裹叶酸偶联的交联的丙烯酸聚合物水凝胶具有较高的叶酸偶靶向性（Journal of Nanobiotechnology, 2014, 12:25）；专利CN 101361982 A公开了一种叶酸偶联壳聚糖的制备方法，通过酰胺化反应制备偶联叶酸的壳聚糖；专利CN 102949727B公开了一种靶向性抗肿瘤药物和基因共载体材料的制备和应用，将叶酸与壳聚糖偶联，再与氧化石墨烯连接并季铵化，利用叶酸的靶向性及石墨烯对负载药物的pH响应性，制备肿瘤靶向和基因共载智能给药体系；专利CN 104983689 A公开了一种叶酸-壳聚糖-EGCG纳米粒的制备方法，同样采用酰胺反应将壳聚糖和叶酸偶联，进一步制备纳米微球。目前天然高分子多糖和叶酸的偶联，普遍采用壳聚糖的胺基和叶酸的羧基进行酰胺化反应，但是，对于中性多糖、尤其是酸性多糖和叶酸的共价结合较为困难，这极大的限制了叶酸-多糖复合体系的制备及相关材料的开发。
发明内容
鉴于上述内容，本发明的目的是提供一种基于叶酸靶向复合多糖凝胶的制备，另一目的在于提供该凝胶材料负载抗肿瘤药物及其靶向释放作用。
一、叶酸靶向复合多糖凝胶的制备
1. 胺化海藻酸的制备：
将海藻酸钠加入无水甲酰胺中，加入0.5mol/L的盐酸，在70~80℃下搅拌至完全溶解，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐（EDC）搅拌20~30 min，冷却至室温。之后将此混合溶液以30~50滴/min的速度滴加到乙二胺中，在25~30℃下反应18~24h，反应结束后用丙酮洗涤5~8遍，抽滤，滤饼在50~60℃、0.06~0.08 MPa下真空干燥8~12 h得胺化海藻酸。
上述海藻酸钠的粘度为200±20 mpa.s，海藻酸钠和无水甲酰胺的质量体积比为4~5mg/mL，无水甲酰胺和盐酸的体积比为20~25:1，海藻酸钠和EDC的质量比为0.8~1:1，海藻酸钠和乙二胺的质量体积比为0.1~0.2g/mL，丙酮和反应混合液的体积比为1:0.5~1:1。
2. 胺化海藻酸和叶酸的偶联：
将胺化海藻酸在40~60℃下搅拌至完全溶解在无水甲酰胺中。将叶酸加入到二甲基亚砜（DMSO）中，室温下避光搅拌至完全溶解，加入EDC和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），搅拌1~2 h后加入到上述制备好的胺化海藻酸无水甲酰胺溶液中，并加入4-二甲氨基吡啶（DMAP），在避光的条件下、30-40℃反应40~48 h，反应完毕后将反应物装入截留分子量8000~14000Da的透析袋中流水透析24~48 h，去离子水透析18~24 h，透析完毕后袋内物减压浓缩至原体积的1/30~1/40，在浓缩液中加入丙酮（丙酮含量占总体积的70~80%）沉淀，减压抽滤，滤饼在60~70℃、0.06~0.08 MPa下真空干燥10~14 h得偶联叶酸的海藻酸。
所述胺化海藻酸和无水甲酰胺的质量体积比为2~3mg/mL，叶酸和DMSO的质量体积比为10~12mg/mL，EDC、NHS、DMAP、叶酸和胺化海藻酸的摩尔比为4:4:4:1:0.9。
3. 复合凝胶的制备：
将碳酸钙微粒加入到海藻酸钠水溶液中，与葫芦巴多糖水溶液和偶联叶酸的海藻酸水溶液混合，搅拌均匀后加入葡萄糖酸内酯水溶液，在2000~3000 rpm的转速下搅拌60~120 s，静置5~15 min，得复合凝胶。
所述碳酸钙微粒的粒径为800-1000 nm，海藻酸钠与碳酸钙微粒的质量比为1:0.06~1:0.1，海藻酸钠水溶液（质量浓度1%）、偶联叶酸的海藻酸水溶液（质量浓度1%）和葫芦巴多糖水溶液（质量浓度0.5%）的体积比为3:2:1，葫芦巴多糖的重均分子量为2.235×106 g/mol、分子量分布为1.1，微孔碳酸钙和葡萄糖酸内酯的摩尔比为1:1。
二、复合多糖凝胶的表征及体外靶向释药测定
本发明通过元素分析、固体13C NMR分析、溶胀度、载药量、流变性能测定和体外抑制肿瘤细胞增殖实验，对制备的靶向复合多糖凝胶的结构和靶向释药性进行分析和说明：
1. 氮含量的测定
采用元素分析仪对样品的氮含量进行测定，载气为高纯氦气，测试炉温980℃，采用硫酸钠作为标品绘制工作曲线。
胺化海藻酸的氮含量为6.27~8.46%，偶联叶酸的海藻酸氮含量为16.98~18.01%。
2. 固体13C NMR测定
采用固体核磁共振技术对样品的结构进行表征，共振频率为150.9MHz，接触时间2ms，脉冲延迟3 s，四甲基硅烷作为内标。
图1为海藻酸钠（A）、胺化海藻酸（B）和偶联叶酸的海藻酸（C）的固体13C NMR图谱。由图1A可以看出，海藻酸钠在174.1 ppm处出现了羧酸碳的化学位移，经过胺化修饰后，胺化海藻酸在38.4 ppm出现了亚甲基的化学位移，164.7 ppm出现了酰胺碳的化学位移（图1B），说明乙二胺和海藻酸通过酰胺键连接。偶联叶酸后（图1C），亚甲基（32.2 ppm）得以保留，酰胺碳信号增强（163.7 ppm），新出现了与芳杂环相连的亚甲基碳信号（44.6 ppm），150ppm附近为典型的芳环碳的化学位移，证实了叶酸通过胺基和海藻酸偶联。
3. 复合凝胶的溶胀度测定
精确称取一定量的干凝胶（Wa）放入小烧杯中，浸入pH7.4缓冲溶液中，达到设定的时间后取出溶胀的凝胶，用滤纸拭去表面吸附的水后，准确称取湿凝胶的质量(Wt)，测定不同时间下凝胶的溶胀率，计算水凝胶的溶胀度（q），其公式如下：
q(%)=
Figure 129463DEST_PATH_IMAGE001
×100%
图2为复合多糖凝胶的溶胀度。由不同多糖链组成的三维网络凝胶，在10 min左右达到溶胀平衡。
4. 复合凝胶的载药量测定
以甲氨蝶呤（MTX）作为模型药物，将冷冻干燥后的载药复合凝胶（Wb）装入透析袋中（截留分子量8000~14000 Da），浸入到NaOH（0.1 mol/L）溶液中，待完全崩解后。用紫外分光光度计在299 nm波长处测定MTX的吸光度。用标准曲线计算药物总质量（Wa）。药物负载率的计算公式为：
药物负载率（%）=
Figure 889608DEST_PATH_IMAGE002
×100%
测定的复合凝胶载药量为9.596 mg/g。
5. 复合凝胶的流变性能测定
采用动态剪切流变仪进行稳定剪切流动性测试，测试温度25℃，两版间距1 mm。
图3为海藻酸钠对照凝胶和本申请的复合多糖凝胶的表观粘度。两种凝胶都在非牛顿稳定区，复合多糖凝胶的表观粘度大于单纯使用海藻酸钠制备的凝胶。这是由于葫芦巴多糖具有很高的表观粘度，能够显著增加凝胶网络中分子间的结缠，复合凝胶中的海藻酸钠羧基和偶联叶酸海藻酸中未占据的羧基与钙离子交联，通过高分子量葫芦巴多糖的互穿作用，在原位形成凝胶的过程中，大大增强了复合凝胶的网络结构密度和强度，有利于药物的的负载和释放。
6. 复合载药凝胶体外对HepG2和A549细胞的靶向抑制作用
取对数生长期的细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，并用含10%新生牛血清的DMEM培养基制成浓度5×104个/mL的单细胞悬液，不断摇动细胞悬液使细胞数均匀，以1 mL/孔接种于12孔培养板，置CO2培养箱内在37℃、饱和湿度、5%CO2条件下培养。
培养24 h后细胞贴壁，换含10%新生牛血清的完全培养基，加入载药凝胶，培养6h，使培养基中MTX的终浓度分别为50、100、150、200和250 μg/mL每孔，每孔加入CCK-8溶液100μL，37℃下继续培养1 h。用酶标仪在450 nm处测吸光值（OD），以空白组调零。按下列公式计算抑制率：
抑制率（%）=
Figure 156642DEST_PATH_IMAGE003
×100%
实验组设置如下：
空白对照组：仅含有培养基，不加任何药物；
MTX对照组：直接加入MTX；
海藻酸钠载药凝胶对照组（SA-MTX）：制备质量浓度1%的海藻酸水溶液，在不含有葫芦巴多糖水溶液和偶联叶酸的海藻酸水溶液的条件下，按照发明内容步骤3，制备海藻酸钠载药凝胶；
靶向载药复合凝胶组（Composite-MTX）：本发明制备的复合凝胶负载MTX；
游离叶酸-靶向载药复合凝胶组（FA-Composite-MTX）：向靶向载药复合凝胶中添加游离叶酸，与肿瘤细胞上过表达的叶酸受体结合，占据该受体，测定抑制率，证明偶联叶酸凝胶材料是否有对叶酸受体的靶向识别性。
图4和图5分别为培养6h、不同药物浓度下复合多糖载药凝胶对 HepG2人肝癌细胞和A549人肺癌细胞的抑制作用。可以看到，和其他给药组相比，Composite-MTX各浓度组均呈现出显著差异（P<0.05)，且均具有最低的IC50值，说明本发明制备的载体材料能够在给药浓度50~250 μg/mL范围内对HepG-2和A549细胞呈现更加明显的抑制作用。同时，FA-Composite-MTX组的IC50值显著增高，进一步证明了游离叶酸占据肿瘤细胞上的叶酸受体，影响了对复合多糖凝胶中偶联叶酸的识别，进而限制MTX通过叶酸受体途径进入肿瘤细胞。这一结果证实了在相同给药浓度下，本发明制备的复合多糖载体材料显示更好的抑制作用是因为材料中偶联的叶酸对肿瘤细胞上叶酸受体的靶向识别作用的结果，说明通过本发明技术工艺制备的多糖复合凝胶载药体系具有靶向给药性，可用作抗肿瘤药物的载体。
本发明的有益效果：
1、本发明通过偶联剂将叶酸和酸性多糖偶联，各反应步骤有较高的转化效率，制备了具有较高叶酸含量的改性天然高分子；
2、综合利用海藻酸钠、葫芦巴多糖和偶联叶酸的海藻酸各自的特性，通过原位释放钙离子的方法，制备了具有三组分聚合物互穿交联网络结构的复合凝胶，机械强度高，有利于负载和释放药物。
3、制备的复合多糖凝胶具有基于肿瘤细胞表面叶酸受体识别的体外释药靶向性。拓展了天然多糖的应用范围。
附图说明
图1海藻酸钠（A）、胺化海藻酸（B）和（C）偶联叶酸的海藻酸的固体13C NMR图谱。
图2复合多糖凝胶的溶胀度。
图3为凝胶粘度（η）随剪切速率的变化。
图4不同药物浓度下复合多糖载药凝胶对 HepG2人肝癌细胞的抑制作用（6h）；a P<0.05 aa P<0.01 aaa P<0.001与空白对照相比；b P<0.05 bb P<0.01 bbb P<0.001与甲氨蝶呤组相比；c P<0.05 cc P<0.01 ccc P<0.001与海藻酸钠载药组相比；d P<0.05 dd P<0.01ddd P<0.001游离叶酸-复合载药凝胶组相比。
图5不同药物浓度下复合多糖载药凝胶对A549人肺癌细胞的抑制作用（6h）；a P<0.05 aa P<0.01 aaa P<0.001 与空白对照相比；b P<0.05 bb P<0.01 bbb P<0.001 与甲氨蝶呤组相比；c P<0.05 cc P<0.01 ccc P<0.001 与海藻酸钠载药组相比；d P<0.05 dd P<0.01ddd P<0.001与游离叶酸-复合载药凝胶组相比。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明中叶酸靶向复合多糖凝胶的制备方法作进一步的说明。
实施例1
一种基于叶酸靶向复合多糖凝胶的制备，包括：
（1） 胺化海藻酸的制备：
将0.2g海藻酸钠加入50mL无水甲酰胺中，加入0.5mol/L的盐酸2mL，在70℃下搅拌至完全溶解，加入EDC 0.2g搅拌30 min，冷却至室温。之后将此混合溶液以40滴/min的速度滴加到1mL乙二胺中，在30℃下反应20h，反应结束后用53mL丙酮洗涤7遍，抽滤，滤饼在50~60℃、0.06~0.08 MPa下真空干燥8~12 h得胺化海藻酸，氮含量为6.27%。
（2）胺化海藻酸和叶酸的偶联：
将0.1g胺化海藻酸在60℃下搅拌至完全溶解在40mL无水甲酰胺中。将0.22g叶酸加入到20mL DMSO中，室温下避光搅拌至完全溶解，加入0.382g EDC和0.232g NHS，搅拌1 h后加入到上述制备好的胺化海藻酸无水甲酰胺溶液中，并加入0.244g DMAP，在避光的条件下、30℃反应48h，反应完毕后将反应物装入截留分子量8000~14000 Da的透析袋中流水透析36h，去离子水透析24h，透析完毕后袋内物减压浓缩至原体积的1/35，在浓缩液中加入丙酮（丙酮含量占总体积的70%）沉淀，减压抽滤，滤饼在65℃、0.08 MPa下真空干燥10 h得偶联叶酸的海藻酸，氮含量为16.98%。
（3）复合凝胶的制备：
将0.06g碳酸钙微粒（粒径1000 nm）加入到300mL海藻酸钠水溶液（1wt%）中，与100mL葫芦巴多糖水溶液（0.5wt%）和200mL偶联叶酸的海藻酸水溶液（1wt%）混合，搅拌均匀后加入0.11g葡萄糖酸内酯，在2500 rpm的转速下搅拌100 s，静置10 min，得复合多糖凝胶。
实施例2
一种基于叶酸靶向复合多糖凝胶的制备，包括：
（1） 胺化海藻酸的制备：
将0.2g海藻酸钠加入40mL无水甲酰胺中，加入0.5mol/L的盐酸2mL，在80℃下搅拌至完全溶解，加入EDC 0.25g搅拌20 min，冷却至室温。之后将此混合溶液以30滴/min的速度滴加到2mL乙二胺中，在25℃下反应18h，反应结束后用66mL丙酮洗涤5遍，抽滤，滤饼在50℃、0.08 MPa下真空干燥8 h得胺化海藻酸，氮含量为8.03%。
（2）胺化海藻酸和叶酸的偶联：
将0.1g胺化海藻酸在40℃下搅拌至完全溶解在50mL无水甲酰胺中。将0.22g叶酸加入到22mL DMSO中，室温下避光搅拌至完全溶解，加入0.382g EDC和0.232g NHS，搅拌1.5h后加入到上述制备好的胺化海藻酸无水甲酰胺溶液中，并加入0.244g DMAP，在避光的条件下、30℃反应48h，反应完毕后将反应物装入截留分子量8000~14000 Da的透析袋中流水透析24h，去离子水透析18h，透析完毕后袋内物减压浓缩至原体积的1/40，在浓缩液中加入丙酮（丙酮含量占总体积的80%）沉淀，减压抽滤，滤饼在60℃、0.07 MPa下真空干燥14 h得偶联叶酸的海藻酸，氮含量为17.04%。
（3）复合凝胶的制备：
将0.1g碳酸钙微粒（粒径800 nm）加入到300mL海藻酸钠水溶液（1wt%）中，与100mL葫芦巴多糖水溶液（0.5wt%）和200mL偶联叶酸的海藻酸水溶液（1wt%）混合，搅拌均匀后加入0.18g葡萄糖酸内酯，在3000 rpm的转速下搅拌60 s，静置15 min，得复合多糖凝胶。
实施例3
一种基于叶酸靶向复合多糖凝胶的制备，包括：
（1） 胺化海藻酸的制备：
将0.2g海藻酸钠加入50mL无水甲酰胺中，加入0.5mol/L的盐酸2mL，在75℃下搅拌至完全溶解，加入EDC 0.25g搅拌25min，冷却至室温。之后将此混合溶液以50滴/min的速度滴加到2mL乙二胺中，在30℃下反应24h，反应结束后用106mL丙酮洗涤8遍，抽滤，滤饼在55℃、0.06 MPa下真空干燥10 h得胺化海藻酸，氮含量为8.46%。
（2）胺化海藻酸和叶酸的偶联：
将0.1g胺化海藻酸在50℃下搅拌至完全溶解在33mL无水甲酰胺中。将0.22g叶酸加入到20mL DMSO中，室温下避光搅拌至完全溶解，加入0.382g EDC和0.232g NHS，搅拌2 h后加入到上述制备好的胺化海藻酸无水甲酰胺溶液中，并加入0.244g DMAP，在避光的条件下、40℃反应48h，反应完毕后将反应物装入截留分子量8000~14000 Da的透析袋中流水透析48h，去离子水透析20h，透析完毕后袋内物减压浓缩至原体积的1/30，在浓缩液中加入丙酮（丙酮含量占总体积的70%）沉淀，减压抽滤，滤饼在70℃、0.06 MPa下真空干燥12 h得偶联叶酸的海藻酸，氮含量为18.01%。
（3）复合凝胶的制备：
将0.08g碳酸钙微粒（粒径1000 nm）加入到300mL海藻酸钠水溶液（1wt%）中，与100mL葫芦巴多糖水溶液（0.5wt%）和200mL偶联叶酸的海藻酸水溶液（1wt%）混合，搅拌均匀后加入0.14g葡萄糖酸内酯，在2000 rpm的转速下搅拌120 s，静置5 min，得复合多糖凝胶。

Claims (9)

1.一种基于叶酸靶向复合多糖凝胶的制备方法，包括以下工艺步骤：
（1） 胺化海藻酸的制备：将海藻酸钠加入无水甲酰胺中，加入0.5mol/L的盐酸，在70~80℃下搅拌至完全溶解，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐，搅拌20~30min，冷却至室温；之后将上述混合溶液以30~50滴/min的速度滴加到乙二胺中，在25~30℃下反应18~24h，反应结束后用丙酮洗涤5~8遍，抽滤，滤饼真空干燥得胺化海藻酸；
（2）胺化海藻酸和叶酸的偶联：将胺化海藻酸在40~60℃下搅拌至完全溶解在无水甲酰胺中；将叶酸加入到二甲基亚砜中，室温下避光搅拌至完全溶解，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌1~2 h后加入到上述制备好的胺化海藻酸无水甲酰胺溶液中，并加入4-二甲氨基吡啶，在避光的条件下、30-40℃反应40~48 h，反应完毕后将反应物装入截留分子量8000~14000 Da的透析袋中流水透析24~48 h，去离子水透析18~24 h，透析完毕后袋内物减压浓缩至原体积的1/30~1/40，在浓缩液中加入丙酮，其中，丙酮含量占总体积的70~80%，减压抽滤，滤饼真空干燥得偶联叶酸的海藻酸；
（3）靶向复合多糖凝胶的制备：将碳酸钙微粒加入到海藻酸钠水溶液中沉淀，与葫芦巴多糖水溶液和偶联叶酸的海藻酸水溶液混合，搅拌均匀后加入葡萄糖酸内酯，在2000~3000rpm的转速下搅拌60~120 s，静置5~15 min，得复合多糖凝胶。
2.如权利要求1所述一种基于叶酸靶向复合多糖凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述海藻酸钠的粘度为200±20 mpa.s，海藻酸钠和无水甲酰胺的质量体积比为4~5mg/mL，无水甲酰胺和盐酸的体积比为20~25:1，海藻酸钠和EDC的质量比为0.8~1:1，海藻酸钠和乙二胺的质量体积比为0.1~0.2g/mL，丙酮和反应混合液的体积比为1:0.5~1:1。
3.如权利要求1所述一种基于叶酸靶向复合多糖凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，胺化海藻酸和无水甲酰胺的质量体积比为2~3mg/mL，叶酸和二甲基亚砜的质量体积比为10~12mg/mL，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、4-二甲氨基吡啶、叶酸和胺化海藻酸摩尔比为4:4:4:1:0.9。
4.如权利要求1所述一种基于叶酸靶向复合多糖凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述碳酸钙微粒的粒径为800-1000 nm，海藻酸钠与碳酸钙微粒的质量比为1:0.06~1:0.1，质量浓度为1%海藻酸钠水溶液、质量浓度为1%偶联叶酸的海藻酸水溶液和质量浓度为0.5%葫芦巴多糖水溶液的体积比为3:2:1，葫芦巴多糖的重均分子量为2.235×106 g/mol、分子量分布为1.1，碳酸钙微粒和葡萄糖酸内酯的摩尔比为1:1。
5.如权利要求1所述一种基于叶酸靶向复合多糖凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（1）中制备的胺化海藻酸，氮含量能达到8.46%。
6.如权利要求1所述一种基于叶酸靶向复合多糖凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（2）中制备的偶联叶酸的海藻酸，氮含量能达到18%。
7.如权利要求1所述一种基于叶酸靶向复合多糖凝胶的制备方法，其特征在于：制备的复合多糖凝胶在10min达到溶胀平衡，负载甲氨蝶呤的量能达到9.596 mg/g。
8.如权利要求1所述一种基于叶酸靶向复合多糖凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，制备的复合多糖凝胶有较好的机械强度，在剪切率为1（1/s）时，表观粘度能达到23.4 Pa.s。
9.如权利要求1所述一种基于叶酸靶向复合多糖凝胶的制备方法，其特征在于：制备的复合多糖凝胶负载甲氨蝶呤，具有体外靶向释药特性，且在药物浓度50-250μg/mL的范围内，对HepG2和A549肿瘤细胞的IC50值分别能达到81.3 μg/mL和180.5 μg/mL。
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