CN110934304B - 负载维生素d3改性壳聚糖纳米粒的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种壳聚糖‑阿魏酸接枝共聚物的制备方法：于惰性气体保护下，在壳聚糖溶液中加入H₂O₂溶液和抗坏血酸，再加入阿魏酸于10～25℃反应3～16h；反应产物放入8000～14000Da的透析袋内置于去离子水中进行透析，最后冷冻干燥，得到壳聚糖‑阿魏酸接枝共聚物。本发明还同时提供了一种负载维生素D₃改性壳聚糖纳米粒的制备方法：将pH调节后CS‑FA溶液和pH调节后阿拉伯胶溶液混合，在所得的混合液中加入维生素D₃，然后于10～25℃反应，得负载维生素D₃改性壳聚糖纳米粒。采用本发明的方法能提高纳米粒的热稳定性、储藏稳定性、稀释稳定性以及胃肠液稳定性。

Description

负载维生素D3改性壳聚糖纳米粒的制备方法

技术领域

本发明属于食品工程领域。具体涉及一种负载维生素D₃改性壳聚糖纳米粒的制备方法及所用的壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物(CS-FA)。

背景技术

维生素D₃是人体健康不可或缺的营养素，具有抗癌、预防佝偻病、骨质软化病等多种功能。但其水溶性差，加工及贮藏过程中易受到光照、温度、氧气等因素的影响。

纳米包封技术可将生物活性成分包埋，防止其受到恶劣条件的影响，增加它们在含水体系中的溶解度。此外，包封技术还有助于控制释放以及给予最佳剂量，避免维生素摄入过多可能会引起的副作用。由于脂溶性维生素(如维生素D₃)通常通过被动和主动运输在小肠的特定部位被吸收，因此通过包封维生素D₃可以增强其稳定性，提高其生物利用度。

天然阳离子多糖壳聚糖具有生物相容性好、可降解、安全等特点，已越来越多的应用于食品领域。由于其溶解性低、抗氧化性弱以及加工性能较弱限制了它的应用。壳聚糖化学改性，常见的化学改性方法有羧甲基化、酰化反应、烷基化反应、接枝共聚反应等。但是目前的改性后壳聚糖并不适用于负载维生素D₃的制备。

专利号2016100508836的发明《一种阿魏酸/壳聚糖载维生素B1和维生素B6微胶囊的制备方法及应用》告知：阿魏酸/壳聚糖载维生素B1和维生素B6的微胶囊的应用，能够延长维生素在人体的停留时间，提高维生素的释放率，对于维生素的充分利用具有重大意义，在膳食补充方面具有重要应用价值。壳聚糖和阿魏酸的质量比为1:1。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种负载维生素D₃改性壳聚糖纳米粒的制备方法及所用的壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物(CS-FA)。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物(CS-FA)的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)、将壳聚糖溶于0.8～1.2％(质量浓度，优选1％)的冰醋酸溶液中，得壳聚糖浓度为1g/100ml的壳聚糖溶液；

于惰性气体保护下，在50mL的壳聚糖溶液中加入摩尔浓度为0.2～1.0mol/L的H₂O₂溶液1mL和抗坏血酸0.1～0.5mmol，于10～25℃反应10～30min后，再加入阿魏酸于10～25℃反应3～16h；所述壳聚糖：阿魏酸＝1:0.1～0.5的质量比；

2)、将步骤1)所得的反应产物放入8000～14000Da的透析袋内置于去离子水中，透析(72±12)h(用于除去残留的小分子物质)；将透析所得液(即，透析袋中的截留液)冷冻干燥，得到壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物(CS-FA)。

作为本发明的壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物(CS-FA)的制备方法的改进，所述步骤1)为：

于惰性气体保护下，在50mL的壳聚糖溶液中加入摩尔浓度为0.8mol/L的H₂O₂溶液1mL和抗坏血酸0.4mmol，于10～25℃反应10～30min后，再加入阿魏酸于10～25℃反应12h；所述壳聚糖：阿魏酸＝1:0.4的质量比。

作为本发明的壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物(CS-FA)的制备方法的进一步改进，步骤2)的透析过程中，每隔12h换一次去离子水。

本发明还同时提供了利用CS-FA来制备负载维生素D₃改性壳聚糖纳米粒的方法，包括以下步骤：

①、将壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物(CS-FA)溶于0.8～1.2％(质量浓度，优选1％)的冰醋酸溶液中，得壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物为1mg/mL的CS-FA溶液；调节CS-FA溶液的pH为4.0，得pH调节后CS-FA溶液；

②、将阿拉伯胶溶于去离子水，得阿拉伯胶浓度为0.5mg/mL的阿拉伯胶溶液；调节阿拉伯胶溶液的pH为4.0，得pH调节后阿拉伯胶溶液；

③、按照壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物(CS-FA)：阿拉伯胶＝1:1的质量比，将pH调节后CS-FA溶液和pH调节后阿拉伯胶溶液混合(磁力搅拌30min)，在所得的混合液中加入维生素D₃，然后于10～25℃反应(45±5)min，得负载维生素D₃改性壳聚糖纳米粒；

所述壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物(CS-FA)：维生素D₃＝1:0.2的质量比。

说明：维生素D₃可采用维生素D₃乙醇溶液的形式进行加入。

本发明的有益效果是：

1、采用本发明的方法能提高纳米粒的热稳定性、储藏稳定性、稀释稳定性以及胃肠液稳定性。

2、运用纳米技术包埋营养素，既可以提高其稳定性，又可以借助载体将目标运输到特定位置控制释放。在模拟胃液中控制释放，释放率在21.13％。在模拟肠液中持续释放，释放率在68.74％。

3、本发明通过自由基诱导法将多酚阿魏酸接枝到壳聚糖形成新的接枝共聚物，并与阿拉伯胶反应生成纳米载体用于包埋维生素D₃。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是壳聚糖(CS)、阿魏酸(FA)、壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物(CS-FA)的红外光谱图；

图2是壳聚糖(CS)和壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物(CS-FA)对DPPH·的清除能力对比图；

图3是壳聚糖(CS)和壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物(CS-FA)还原力对比图；

图4是pH对纳米粒平均粒径和PDI的影响图；

图5是改性壳聚糖-阿拉伯质量比对纳米粒平均粒径和PDI的影响图；

图6是维生素D₃添加量对纳米粒平均粒径和PDI的影响图；

图7是负载维生素D₃改性壳聚糖纳米粒的储藏稳定性的对比图；

图8是负载维生素D₃改性壳聚糖纳米粒的热稳定性的对比图；

图9是负载维生素D₃改性壳聚糖纳米粒的稀释稳定性的对比图；

图10是负载维生素D₃改性壳聚糖纳米粒的胃肠液稳定性的对比图；

图11是光照对维生素D3保留率的影响图；

图12是温度对维生素D₃保留率的影响图；

图13是氧气对维生素D₃保留率的影响图；

图14是反应时间对接枝量的影响图；

图15是壳聚糖-阿魏酸质量比对接枝量的影响图；

图16是过氧化氢(H₂O₂)浓度对接枝量的影响图；

图17是抗坏血酸(Vc)浓度对接枝量的影响图；

图18是纳米粒在胃液、肠液中的释放效率对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物的制备，依次进行以下步骤：

1)、称取10.0g壳聚糖，用1％(质量浓度1％)的冰醋酸溶液定容至1000mL，磁力搅拌至壳聚糖完全溶解，得壳聚糖浓度为1g/100ml的壳聚糖溶液。

取50mL的壳聚糖溶液(含壳聚糖500mg)加入100mL的三颈圆底烧瓶中，反应开始前，先用氮气冲洗烧瓶排除瓶内空气，然后于氮气保护下，加入摩尔浓度为0.8mol/L的H₂O₂溶液1mL和抗坏血酸0.4mmol，于25℃反应30min后，再加入200mg阿魏酸于25℃反应12h；

此案例中，壳聚糖：阿魏酸＝1:0.4的质量比；上述反应均处于氮气保护下进行。

2)、将步骤1)所得的反应产物放入8000～14000Da的透析袋内置于去离子水中，每隔12h换一次去离子水，透析72h用于除去残留的小分子物质；将透析所得液(即，透析袋中的截留液)冷冻干燥(于-40℃干燥24小时)，得到壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物(CS-FA)。

用傅里叶红外光谱仪对壳聚糖、阿魏酸、壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物(CS-FA)进行了检测，上述3者的的红外光谱如图1所示。

在壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物的图谱中可看出，原壳聚糖分子链的(1597.45cm^-1)的酰胺Ⅱ带的峰发生了明显的减弱，而酰胺Ⅰ带(1646.63cm^-1)的峰明显的加强了，并且两个峰发生了小幅度的偏移，可能是由于壳聚糖分子链上的氨基与阿魏酸分子上的羧基发生了酰胺反应生成了酰胺键。在CS-FA图谱中1730.90cm^-1位置出现了一个新的峰，对应于C＝O双键的伸缩振动，原因归结于壳聚糖分子链上的羟基和阿魏酸分子的羧基反应生成了酯键。综述所述，说明阿魏酸通过酰胺键和酯键成功的接枝到了壳聚糖。

性能试验1、DPPH·自由基清除能力

实验方法为：称取少量的壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物(CS-FA)溶解于去离子水中稀释成不同浓度(0.1～0.5mg/mL)作为待测样品溶液，取1.0mL待测样品溶液与1.0mL DPPH溶液(浓度为0.2mmol/L)放置于试管中，充分摇匀后室温下避光静置，反应30min后在517nm处测吸光值A_样品。同时测定1.0mL乙醇与1.0mL DPPH·混合溶液的吸光值A_空白，以及1.0mL待测样品溶液与1.0mL乙醇混合溶液的吸光值A_对照，平行测定三次。DPPH·清除率计算公式如下：

以壳聚糖(CS)代替壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物(CS-FA)重复上述实验。所得结果的对比如图2所述。

由图2可知，与壳聚糖相比，阿魏酸接枝改性后的壳聚糖(即，壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物(CS-FA))自由基清除率增加了50％左右，说明将阿魏酸接枝到壳聚糖上能明显提高壳聚糖的抗氧化活性。这也是由于阿魏酸接枝到壳聚糖后会提高其氢原子供给能力，增强它的抗氧化能力。

性能试验2、还原能力分析

实验方法为：壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物(CS-FA)溶解于去离子水中稀释成不同浓度(0.1～0.5mg/mL)作为样品溶液，取1.0mL的样品溶液与1.0mL的1％的铁氰化钾溶液混合均匀，在50℃的水浴条件下加热20min。再向其中加入1.0mL 10％的三氟乙酸(TCA)和0.5mL0.1％的三氯化铁溶液，混合均匀后在700nm处测定其吸光度。

以壳聚糖(CS)代替壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物(CS-FA)重复上述实验。所得结果的对比如图3所述。壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物的还原能力明显高于壳聚糖。

对比例1-1、将实施例1步骤1)中的反应时间由12h分别改成3h，6h，9h，16h，其余等同于实施例1；反应时间对接枝量的影响如图14所述。

接枝量的检测方法为常规技术。例如可采用：称取2mg的样品溶解于4mL的去离子水中，取0.5mL的样品溶液加入0.5mL的福林酚溶液，将其放置于黑暗条件下反应5min后加入1.5mL 15％的Na₂CO₃溶液，室温下振荡2h后在760nm处测定其吸光度。

对比例1-2、将实施例1步骤1)中壳聚糖：阿魏酸的质量比由1:0.4分别改成：1:0.1，1:0.2，1:0.3，1:0.5，其余等同于实施例1。所得结果的对比如图15所述。

对比例1-3、将实施例1步骤1)中H₂O₂溶液的浓度由0.8M分别改成0.2，0.4，0.6、1.0M；其余等同于实施例1。所得结果的对比如图16所述。

对比例1-4、将实施例1步骤1)中抗坏血酸用量由0.4mmol分别0.1，0.2，0.3，0.5mmol；其余等同于实施例1。所得结果的对比如图17所述。

实施例2、负载维生素D₃的改性壳聚糖纳米粒的制备方法，利用实施例1制备而得的壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物(CS-FA)，依次进行以下步骤：

1)、将壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物(CS-FA)溶于浓度(质量浓度)为1％的冰醋酸中，得壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物浓度为1mg/mL的CS-FA溶液；利用盐酸溶液(0.1mol/L)调节CS-FA溶液的pH为4.0，得pH调节后CS-FA溶液；

2)、取阿拉伯胶溶于去离子水，得阿拉伯胶浓度为0.5mg/mL的阿拉伯胶溶液；利用盐酸溶液(0.1mol/L)调节阿拉伯胶溶液的pH为4.0，得pH调节后阿拉伯胶溶液；

3)、按照壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物(CS-FA)：阿拉伯胶＝1:1的质量比，将pH调节后CS-FA溶液和pH调节后阿拉伯胶溶液混合(磁力搅拌30min)，在所得的混合液中加入维生素D₃溶液(维生素D₃乙醇溶液)，然后于25℃反应(45±5)min；得负载维生素D₃改性壳聚糖纳米粒。

壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物(CS-FA)：维生素D₃＝1:0.2的质量比。

维生素D₃溶液的浓度为1mg/ml。

性能试验3、稳定性

3.1、储藏稳定性

将实施例2制备所得的负载维生素D₃改性壳聚糖纳米粒放置在4℃冰箱储藏，每隔7天后取样品测定其平均粒径和PDI值(粒度分布指数)。从图7中可以看出，负载维生素D₃改性壳聚糖纳米粒溶液的平均粒径和PDI值呈一个上升的趋势。在4℃冰箱存放4周后，负载维生素D₃改性壳聚糖纳米粒溶液的粒径从201.1nm增加到了231.7nm，变化了30.6nm；PDI值从0.139增加到了0.197，变化了0.058。说明随着时间的增强，纳米粒的稳定性会受到一定的影响，但是变化不大基本保持稳定。经过4周的储藏并未出现絮状沉淀，说明在储藏过程中负载维生素D₃改性壳聚糖纳米粒溶液分布较为均一，纳米粒具有较好的储藏稳定性，对于其在不同领域具有较高的应用价值。

3.2、热稳定性

将实施例2制备所得的负载维生素D₃改性壳聚糖纳米粒分别放在20℃，40℃，60℃及80℃恒温水浴锅中温育5min看其粒径和PDI的变化。结果如图8所示，在20℃时纳米粒的平均粒径为202.83nm，PDI值为0.197。负载维生素D₃的改性壳聚糖纳米粒粒径和PDI在80℃的时候粒径增加了105.7nm，PDI增加了0.037。这说明加热后，溶液还处于一个稳定的状态，纳米粒耐高温的性质良好，即证明了负载维生素D₃的改性壳聚糖纳米粒具有良好的热稳定性，可以提高它的应用范围。

3.3稀释稳定性

先将实施例2制备所得的负载维生素D₃改性壳聚糖纳米粒冷冻干燥(于-40℃干燥24小时)，然后用水配制成浓度为1mg/ml的纳米粒溶液；再分别稀释2倍、50倍、100倍、150倍、200倍，稀释完毕后即时看其粒径分布图的变化。

由图9得知：当负载维生素D₃的纳米粒从1mg/ml稀释至0.5mg/ml的时候，其纳米粒粒径分布较为均一，表明纳米粒相对稳定，并没有发生解离。当浓度继续稀释的时候，仍然可以检测到纳米粒的存在，但是粒径分布图明显变宽，当稀释浓度到0.005mg/mL的时候纳米粒粒径为417.6nm，PDI值为0.398增加了0.255。说明在一定稀释浓度范围内，纳米粒可保持稳定。

3.4肠胃稳定性研究

实施方法为：将实施例2制备所得的负载维生素D₃改性壳聚糖纳米粒分别放入模拟肠液和模拟胃液中过30min看其粒径分布图的变化，来分析纳米粒在胃肠液中的稳定性。

模拟胃液的配置：称取0.32g胃蛋白酶，0.2g NaCl，溶于25mL的超纯水中，加入0.7mL浓盐酸，用1.0mol/L HCL调整pH至1.2，用超纯水定容至100mL即得模拟胃液。

模拟肠液的配置：称取0.68g磷酸二氢钾溶于25mL超纯水中，加入19mL 0.2mol/LNaOH和40mL超纯水搅拌均匀，然后加入1.0g的复合胰酶，用0.2mol/L NaOH将体系的pH调至7.0，定容至100mL即得模拟肠液。

所得结果如图10。

从图10中可以看出，原纳米粒的粒径分布图很集中，说明纳米粒粒径分布较为均匀。当将纳米粒放入胃液环境后，纳米粒粒径的分布图明显变宽，但是其平均粒径并没有发生很明显的变化，说明纳米粒在进入胃液后在此环境下还是很稳定的。当负载维生素D₃的纳米粒进入到肠液后，可发现粒径分布图范围更宽，而且分布比较分散，测得的平均粒径达到了450.2nm，PDI值达到了0.51。在肠液环境条件下的分布图在大于1000nm处也出现了峰，说明了该溶液体系中已经有聚集物产生。通过对模拟胃肠液环境下负载维生素D₃纳米粒粒径变化的研究，相对肠液环境条件下的纳米粒的粒径分布，其在胃液条件下的稳定性更好。由此可以说明，在一定pH范围内负载维生素D₃纳米粒具有较好的抵抗力，可以较好地经过胃从而到达小肠，进行缓释吸收。

从以上的结果可以看出，负载维生素D₃的改性壳聚糖纳米粒具有良好的热稳定性储藏稳定性和稀释稳定性，在一定的pH范围内有较好的抵抗力，为其之后更广泛的应用提供了一定的基础。

性能试验4、

4.1、维生素D₃包埋率和包载率的测定

将实施例2制备所得的负载维生素D₃改性壳聚糖纳米粒放入到15mL的超滤管(截留分子量3000KDa)进行离心，转速为4500rpm，4℃下离心30min，取过滤后的液体在265nm处用紫外-可见光分光光度计测其吸光度计算未被包埋的维生素D₃含量。计算公式如下：

所得结果为：此时的包载率(11.12％)和包封率(85.23％)较高。

4.2、纳米粒对维生素D₃的保护效果

实验方法为以光照、温度、氧气不同条件下测得的维生素D₃的保留率为指标探究纳米粒对维生素D₃的保护效果。

具体操作如下：取实施例2制备所得的负载维生素D₃的改性壳聚糖纳米粒作为实验组，等量的维生素D₃溶液直接加入到空白纳米粒中作为对照组，每隔5天测维生素D₃的保留率，计算公式如下：

设定温度为25℃、氧气条件为有氧，光照分别设定为室外光照(OL)、室内光照(IL)、室内避光(ID)；所得结果对比如图11所述；

设定光照为室内光照、氧气条件为有氧，温度分别设定为4℃、25℃、60℃；所得结果对比如图12所述；

设定温度为25℃、光照为室内光照，分别设定氧气条件为有氧(Aerobicenvironment)、无氧(Anaerobic environment)；所得结果对比如图13所述。

即，将未包埋的维生素D₃和负载维生素D₃改性壳聚糖纳米粒进行对照研究。在光照、温度、氧气等条件下储存放置30天后测定维生素D₃的保留率，探究纳米粒对维生素D₃的保护效果。结果显示，经纳米粒包埋的维生素D₃相比于未包埋的维生素D₃有较高的保留率，可有效保护维生素D₃提高其稳定性。

性能试验5、模拟胃肠液中的释放行为

实施例2制备所得的负载维生素D₃的改性壳聚糖纳米粒按照1:1的比例加入胃液、肠液并将其充分混匀，将样品放置于37℃的恒温水浴锅中温育0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5h，再将其放入到15mL的超滤管中(截留分子量3000KDa)进行离心，转速为4500rpm，4℃下离心30min后按照上述方法测定维生素D₃累计释放量。

C：t时刻溶液中释放的维生素D₃的浓度；V：t时刻溶液总体积；M：原始纳米粒中维生素D₃的含量；

结果如图18所示。SGF模拟胃液，SIF模拟肠液。

从图18中可以看出，纳米粒在胃液中的释放率明显要低于在肠液中的释放效率。负载维生素D3的纳米粒在0.5h后释放率仅为11.55％，在之后维生素D₃释放率基本平缓，在3.5h后达到最大为为21.13％。在胃液中存在的胃蛋白酶可以水解蛋白质中的肽键得到多肽产物，但是由于纳米粒壁材中改性壳聚糖层是多糖结构，阿拉伯胶由两种成分组成，70％是由多糖组成，剩余的部分是具有高相对分子质量的蛋白质结构，总蛋白质含量仅为2％。因此胃蛋白酶并不能很好的破坏纳米粒自身结构，从而降低了维生素D₃的释放速率。在酸性介质中，改性壳聚糖的正电荷和阿拉伯胶所带的负电荷通过静电相互作用形成稳定的复合物，这种相互作用较为紧密，可以克服壁材的溶胀以及蛋白水解酶的作用。在胃液中低的维生素D3的释放量同样能够减轻纳米粒对胃的副作用。食物在胃液停留时间为3～8h，因此在3.5h后维生素D₃仍然可以和纳米粒有效结合，有利于其进入肠道完成释放利用。在肠液的环境条件下，纳米粒在0.5h内释放的维生素D₃的量为22.36％，随着时间的延长，释放率逐渐增加，在3.5h时达到了68.74％的释放量。这是因为在模拟肠液环境中，碱性环境使得改性壳聚糖去质子化失去正电荷，与阿拉伯胶的交联作用减弱，导致纳米粒发生溶胀，纳米粒结构遭到破坏。而且在肠液环境下，维生素D₃带负电荷和阿拉伯胶存在静电斥力同样也使得维生素D₃的释放量增加。体外释放研究实验表明，纳米粒在模拟肠胃液中对酸碱性有一定的稳定性可以在酸性条件下保护壁材和控制释放，在肠道的pH环境中可以实现持续释放，改性壳聚糖和阿拉伯胶作为一种新型壁材在肠道靶向给药领域可提高其生物利用率。

对比例2-1、将实施例2步骤1)、步骤2)中的2个pH均由4.0分别改成：3.0，3.5，4.5，5.0，其余等同于实施例1。

粒径和PDI(分布系数)的对比如图4所述。根据图4可得知：pH为4.0为纳米粒合成最佳条件。

对比例2-2、将实施例2步骤2)中的CS-FA：阿拉伯胶的质量比由1:1改成3:1、2:1、1:2、1:3；其余等同于实施例1。

粒径和PDI的对比如图5所述。根据图5可得知：CS-FA：阿拉伯胶的质量比为1:1作为纳米粒合成最佳条件。

对比例2-3、

实施例2中，CS-FA溶液的用量为1.5mL、阿拉伯胶溶液的用量为3mL，维生素D₃溶液的用量300uL，此时，CS-FA：维生素D₃的质量比由1:0.2。

将实施例2步骤2)中的维生素D₃溶液的用量由300uL分别改成50uL，100uL，200uL，400uL，500uL，其余等同于实施例1。即，将CS-FA：维生素D₃的质量比也作了相应更改。

粒径和PDI的对比如图6所述。根据图6，可得知：维生素D₃添加量为300uL为纳米粒的最佳合成条件。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (2)

1.负载维生素D₃改性壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

一、将壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物溶于0.8~1.2%的冰醋酸溶液中，得壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物为1 mg/mL的CS-FA溶液；调节CS-FA溶液的pH为4.0，得pH调节后CS-FA溶液；

壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物的制备方法包括以下步骤：

1）、将壳聚糖溶于0.8~1.2%的冰醋酸溶液中，得壳聚糖浓度为1g/100ml的壳聚糖溶液；于惰性气体保护下，在50 mL的壳聚糖溶液中加入摩尔浓度为0.8mol/L的H₂O₂溶液1mL和抗坏血酸0.4mmol，于10~25℃反应10~30 min后，再加入阿魏酸于10~25℃反应12 h；所述壳聚糖：阿魏酸=1:0.4的质量比；

2）、将步骤1）所得的反应产物放入8000~14000 Da的透析袋内置于去离子水中，透析72±12h；将透析所得物冷冻干燥，得到壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物；

二、将阿拉伯胶溶于去离子水，得阿拉伯胶浓度为0.5 mg/mL的阿拉伯胶溶液；调节阿拉伯胶溶液的pH为4.0，得pH调节后阿拉伯胶溶液；

三、按照壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物：阿拉伯胶=1:1的质量比，将pH调节后CS-FA溶液和pH调节后阿拉伯胶溶液混合，在所得的混合液中加入维生素D₃，然后于10~25℃反应45±5min，得负载维生素D₃改性壳聚糖纳米粒；

所述壳聚糖-阿魏酸接枝共聚物：维生素D₃=1:0.2的质量比。

2.根据权利要求1所述的负载维生素D₃改性壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于：所述步骤2）的透析过程中，每隔12 h换一次去离子水。

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