CN109678924B - 负载药物或营养物的玉米多肽纳米粒子及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药/食品技术领域，具体为负载药物或者营养物的脱酰胺化玉米多肽纳米粒子及其制备方法。本发明提供脱酰胺化玉米多肽的方法：在含有乙醇的碱性溶液中水解玉米蛋白，然后调节溶液pH到中性后通过蒸馏除去乙醇，再调节溶液pH到酸性使脱酰胺化玉米多肽沉淀出来，或者直接在碱性水溶液中水解玉米蛋白，通过调节溶液pH到酸性使脱酰胺化玉米多肽沉淀出来，得到中间产物；进一步以脱酰胺化玉米多肽为载体，通过pH响应、无有机溶剂的自组装制备得到高效负载药物和营养物的脱酰胺化玉米多肽纳米粒子；该纳米粒子可作为药物和营养物口服制剂，提高药物和营养物的口服生物利用度。本发明方法简单、高效、节能；所用原料安全、成本低廉。

Description

负载药物或营养物的玉米多肽纳米粒子及其制备方法
技术领域
本发明属于医药/食品技术领域，具体涉及一种负载药物或者营养物的脱酰胺化玉米多肽纳米粒子及其制备方法和应用。
背景技术
很多药物和营养物由于水溶性或者稳定性差而不能很好地被人体吸收，从而限制了这些药物和营养物的有效利用【Nature Reviews Drug Discovery,6(2007),231-248】。在制药和食品工业，表面活性剂被广泛地用来增加药物和营养物的水溶性和在人体内的吸收【Journal of Pharmaceutical Technology,Research and Management,1(2013),11-36；Journal ofDispersion Science and Technology,30(2009),1363-1383】。表面活性剂具有两亲性的分子结构，各种具有不同亲水/疏水性质的表面活性剂都可以通过化学反应来制备【The Journal of Physical Chemistry Letters,2(2011),914-20】。然而，合成表面活性剂的生物降解性和生物相容性较差，使用时会对生物体产生一定的毒副作用【Nature,519(2015),92-96；Journal of Dispersion Science and Technology,30(2009),1363-1383；Journal of Cleaner Production,150(2017),127-134；Biochimicaet Biophysica Acta,1508(2000),235-251】。许多具有两亲性的可食用蛋白质分子，如酪蛋白、大豆蛋白等，具有安全、营养、低成本等优势【Trends in Food Science&Technology,17(2006),272-283】，是食品工业常用的表面活性剂【Food Hydrocolloids,45(2015),301-308；Journal of Agricultural and Food Chemistry,53(2005),2022-2027】。但是，蛋白质是大分子，其疏水基团位于分子或者聚集体内部，通常只有在超声或者高压均质等高能条件下才能暴露出来与疏水性药物或者营养物相结合【Trends in Biotechnology,34(2016),496-505】，这限制了食品蛋白质在增加药物和营养物水溶性方面的应用。
玉米蛋白是生产玉米淀粉的副产品，具有抗氧化性、生物降解性和生物相容性等优异性能【Biomaterials,25(2004),4691-4697；Food Hydrocolloids,23(2009),1427-1432】。但是玉米蛋白的氨基酸组成不平衡，其赖氨酸和色氨酸含量低，不能满足营养要求，从而限制了在食品中的应用【Journal of Applied Polymer Science,131(2014),40696】。玉米蛋白富含疏水性氨基酸残基，如亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺，缺乏碱性和酸性氨基酸残基【Journal of Agricultural and Food Chemistry,55(2007),439-445；Food Science and Technology International,16(2010),241-250；IndustrialCrops and Products,13(2001),171-192】，因此玉米蛋白能溶于60％～80％的乙醇溶液而不溶于水【Journal of Agricultural and Food Chemistry,58(2010),587-593】。玉米蛋白的天冬酰胺和谷氨酰胺残基可以通过蛋白酶的酶解反应或者通过酸性或者碱性条件下的水解反应转化为天冬氨酸和谷氨酸残基，得到脱酰胺化玉米蛋白，由此可以增加玉米蛋白的水溶性【Biochimica et Biophysica Acta,1764(2006),1110–1118；Food Scienceand Technology International,16(2010),241-250；Journal of Agricultural andFood Chemistry,58(2010),587-593】。另一方面，蛋白酶解和水解反应也使玉米蛋白肽链上的酰胺键断裂，得到脱酰胺化的玉米蛋白片断，即脱酰胺化玉米多肽。我们的前期实验证明，在含70％乙醇的碱性水溶液中水解玉米蛋白，通过控制水解时间可以得到具有不同分子量和不同羧基含量的脱酰胺化玉米多肽，多肽的亲水/疏水性可以通过蛋白的水解时间和多肽溶液的pH来调节，是一个具有优良生物相容性、生物降解性和高表面活性的体系【Food Hydrocolloids,63(2017),120-129；Colloids and Surfaces A,540(2018),150-157】。虽然在70％乙醇碱溶液中水解玉米蛋白的方法比蛋白酶水解法更为经济，该方法的不足之处是水解反应结束后要通过旋转蒸发将乙醇除去才能对脱酰胺化玉米多肽进行纯化，这显然不利于大规模制备脱酰胺化玉米多肽，限制了脱酰胺化玉米多肽的应用。因此，需要发展一种更为简单高效的脱酰胺化玉米多肽的制备方法。
具有两亲性的脱酰胺化玉米多肽可以通过疏水作用负载疏水性药物和营养物。据【Food&Function,6(2015),2636-2645】报道，将姜黄素乙醇溶液滴加到酶解法制备的脱酰胺化玉米多肽水溶液中可以得到负载姜黄素的玉米多肽纳米粒子，但是该方法制备的纳米粒子其姜黄素含量很低，只有0.1mg/mL，并且引入了有机溶剂。到目前为止，还没有以脱酰胺化玉米多肽为载体，在不引入有机溶剂的条件下实现对药物和营养物的高效负载以增加药物和营养物的水溶性和生物利用度的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种绿色、高效的负载药物或者营养物的脱酰胺化玉米多肽纳米粒子及其制备方法和应用。
本发明首先提供一种制备具有可调控的亲水/疏水性质的脱酰胺化玉米多肽的方法，采用下述方法之一种：
方法1，在含有乙醇的碱性溶液中水解玉米蛋白，水解结束后将溶液调节到中性除去乙醇，然后将溶液调节到pH 2.0～3.5，使脱酰胺化玉米多肽上的羧基基团质子化，从而使多肽形成沉淀，得到产物；
方法2，在碱性水溶液中水解玉米蛋白，水解结束后将溶液直接调节到pH 2.0～3.5，使脱酰胺化玉米多肽沉淀出来，得到产物。
方法1在含有乙醇的碱性溶液中水解玉米蛋白制备脱酰胺化玉米多肽，具体流程为：
(1)将玉米蛋白溶解于乙醇-水碱性溶液中，其中玉米蛋白的浓度为1～500mg/mL，乙醇浓度为60～90％(v/v)，溶液pH为11～14；
(2)将流程(1)所制备的玉米蛋白乙醇碱性溶液置于20～60℃条件下进行水解，水解时间为0.5～200小时；
(3)水解完成后，将流程(2)所得到的水解液调节到pH 6～9，通过旋转蒸发除去乙醇，然后将溶液调节到pH 2.0～3.5，得到脱酰胺化玉米多肽沉淀。
方法2在碱性水溶液(不含乙醇)中水解玉米蛋白制备脱酰胺化玉米多肽，具体流程为：
(1)将玉米蛋白溶解于碱性水溶液中，其中玉米蛋白的浓度为1～500mg/mL，溶液pH为11～14；
(2)将流程(1)所制备的玉米蛋白碱性水溶液置于20～60℃条件下进行水解，水解时间为0.5～200小时；
(3)水解完成后，将流程(2)所得到的水解液直接调节到pH 2.0～3.5，得到脱酰胺化玉米多肽沉淀。
这两种方法由于水解溶剂不同，玉米蛋白在相同水解条件下所得到的产物有所不同，第二种方法制备的多肽其脱酰胺化程度更高、分子片段更长。我们的结果证明，在没有乙醇的条件下直接在碱性水溶液中水解玉米蛋白也可以制备脱酰胺化玉米多肽，该方法更为简单、绿色、高效，成本更低，可以用来大规模制备脱酰胺化玉米多肽。
本发明提供的负载药物或者营养物的脱酰胺化玉米多肽纳米粒子的制备方法，具体步骤为：
(一)制备具有可调控的亲水/疏水性质的脱酰胺化玉米多肽；(二)利用脱酰胺化玉米多肽制备负载药物和营养物的脱酰胺化玉米多肽纳米粒子。其中：
(一)制备具有可调控的亲水/疏水性质的脱酰胺化玉米多肽；如上所述；
(二)利用脱酰胺化玉米多肽制备负载药物和营养物的脱酰胺化玉米多肽纳米粒子，是通过一个没有有机溶剂、只经过pH调节的绿色自组装过程高效负载带有弱酸基团的药物和营养物，具体流程如下：
(1)将脱酰胺化玉米多肽和药物或者营养物共同加入水中，脱酰胺化玉米多肽的浓度为2～30mg/mL，药物或者营养物的浓度为0.5～20mg/mL；
(2)加入碱(例如NaOH等)将溶液调节到pH 8.0～12.5，使脱酰胺化玉米多肽和药物或者营养物溶解；
(3)加入酸(例如HCl等)将溶液调节到pH 4.5～7.0，然后搅拌0.5～5小时，即得到负载药物或者营养物的脱酰胺化玉米多肽纳米粒子。
本发明中，所述的药物和营养物，是带有弱酸基团的药物和营养物，其在碱性溶液中去质子化而溶解，在中性或者弱酸性溶液中质子化而不溶解。例如姜黄素、叶酸、布洛芬等，在碱性(pH8.0～12.5)条件下，去质子化的脱酰胺化玉米多肽和姜黄素、叶酸或者布洛芬等药物或者营养物共同溶解在水溶液中，然后加酸将溶液调节到pH 4.5～7.0，即可得到高效负载药物或者营养物的脱酰胺化玉米多肽纳米粒子。在中性或者弱酸性(pH 4.5～7.0)条件下，脱酰胺化玉米多肽由于部分质子化使得其疏水性增加，药物/营养物也由于质子化而增加了疏水性，脱酰胺化玉米多肽和药物/营养物通过疏水作用力形成纳米粒子从而将药物/营养物高效负载在纳米粒子中。纳米粒子带有比较多的负电荷因而使得其在水溶液中具有很好的分散性和稳定性。本发明的负载药物或者营养物的脱酰胺化玉米多肽纳米粒子可以保护所负载的药物和营养物不被分解，可以提高药物和营养物的口服生物利用度。
本发明中，制备负载药物/营养物的脱酰胺化玉米多肽纳米粒子的方法简单、绿色、高效，整个制备过程中可以不使用有机溶剂和油相，也不需要超声、高压均质等高能设备并且节约能源，所使用的原料天然、安全、成本低廉，纳米粒子不需要纯化。利用本发明方法制备的纳米粒子可以作为口服药物制剂以提高药物的药效，也可以作为营养物添加剂在食品和饮料中加以应用。
本发明中，脱酰胺化玉米多肽作为载体负载姜黄素，纳米粒子中的姜黄素与多肽的质量比可以达到姜黄素/多肽＝1/3，这比已经报道的姜黄素/载体≤1/9要高出许多【Food&Function,6(2015),2636-2645；Journal of Colloid and Interface Science,351(2010),19-29；Biomacromolecules,14(2013),672-82；Biomaterials,31(2010),6597-6611；European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics,117(2017),132-140】，证明了脱酰胺化玉米多肽具有很好的加溶疏水药物和营养物的能力，是一个优异的表面活性剂体系。
附图说明
图1为CUR/A-6.0、CUR/A-6.0S、姜黄素与EZ50-36h(多肽编号A)混合物、单独EZ50-36h、单独姜黄素的傅里叶红外光谱图。
具体实施方式
下面通过实施例进一步描述本发明。
实施例1.多肽制备方法1：在含有乙醇的碱性水溶液中水解制备脱酰胺化玉米多肽
在搅拌状态下将玉米蛋白以50mg/mL的浓度加入到400mL含70％(v/v)乙醇的水溶液中，接着在溶液中加入8g固体NaOH，使溶液中NaOH浓度达到0.5mol/L；将溶液置于37℃反应36h，反应结束后，立即用5mol/L的HCl将溶液调节到pH 7.0，用旋转蒸发除去乙醇，然后用5mol/L的HCl将溶液调节到pH 3.0使脱酰胺化玉米多肽沉淀。收集沉淀，将沉淀用pH 3.0的HCl洗涤3次，然后加入约100mL水，用2mol/L的NaOH将溶液调节到pH 9.0，待沉淀完全溶解后冷冻干燥，得到脱酰胺化玉米多肽粉末样品EZ50-36h。
采用电导滴定法(DDS-11A数显电导率仪，上海雷磁仪器仪表有限公司)用NaOH标准溶液分析玉米蛋白和EZ50-36h样品中的羧基含量。采用邻苯二酚发光法通过紫外-可见分光光度计(ShimadzuUV-2550)分析玉米蛋白和EZ50-36h样品中的氨基含量。采用凝胶渗透色谱法分析玉米蛋白和EZ50-36h样品的分子量和分子量分布，仪器型号为P230型(Elite,Dalian)，色谱柱为SEC-125column(XIYU Tech,Shanghai)，柱温25℃，流动相为三氟乙酸/乙腈/水(0.1/45/55，体积比)，流速0.5mL/min，检测波长220nm，多肽分子量标准为189、451、1450、6500和12500Da(XIYU Tech,Shanghai)。
表1.玉米蛋白性质。
样品名称 Mol<sub>COOH</sub>/g Mol<sub>NH2</sub>/g 重均分子量 M<sub>w</sub>/M<sub>n</sub>
Zein 7.2×10<sup>-4</sup>±3×10<sup>-5</sup> 6.9×10<sup>-5</sup>±1×10<sup>-6</sup> 1.00×10<sup>4</sup> 2.84
。
表2.在70％乙醇碱性水溶液中水解制备的脱酰胺化玉米多肽的性质(n＝3)。
Figure BDA0001907674450000051
与表1中的玉米蛋白结果相比，在含70％乙醇和0.5mol/L NaOH的溶液中水解36h后，得到的EZ50-36h样品的羧基和氨基含量增加，分子量变小，证明了玉米蛋白发生了脱酰胺化反应和降解反应，得到了脱酰胺化玉米多肽。此外，所得到的脱酰胺化玉米多肽是一个混合物，分子量分布为2.06。
实施例2.多肽制备方法2：在碱性水溶液中水解制备脱酰胺化玉米多肽
在搅拌状态下将玉米蛋白加入到去离子水中，玉米蛋白的浓度如表3所示，在每100mL溶液中加入2g固体NaOH，使溶液中的NaOH浓度达到0.5mol/L；将溶液置于37℃反应6、36或者72h，反应结束后，立即用5mol/L的HCl将溶液调节到pH 3.0使脱酰胺化玉米多肽沉淀。沉淀用pH 3.0的HCl洗涤3次后冷冻干燥，得到各种脱酰胺化玉米多肽粉末样品。
表3.在碱性水溶液中水解制备的脱酰胺化玉米多肽的性质(n＝1或3)。
Figure BDA0001907674450000061
表3的数据显示，在同样的水解时间条件下，增加玉米蛋白的浓度使得蛋白的水解程度降低，即脱酰胺化玉米多肽的羧基含量降低、分子量增加、产率增加。此外，增加玉米蛋白的浓度还使得脱酰胺化玉米多肽的分子量分布增加，即多肽的不均一性增加。在同样的玉米蛋白浓度条件下，增加水解时间导致多肽中的羧基和氨基含量增加、分子量减小、产率降低，说明随着水解时间的增加，玉米蛋白的脱酰胺化程度和肽链的断裂程度增加，所得到的脱酰胺化玉米多肽的分子量更小，亲水性更强。表2和表3的数据显示，在同样的玉米蛋白浓度和经过同样的水解时间，水解溶剂的不同导致氨基和羧基含量以及分子量不同，采用没有乙醇的水解方法制备的多肽其脱酰胺化程度更高，但是肽链的断裂程度降低，多肽的不均一性增加。
实施例3.用方法1制备的多肽制备负载姜黄素的纳米粒子
采用实施例1方法制备脱酰胺化玉米多肽EZ50-36h(多肽编号A)。在搅拌状态下将EZ50-36h粉末以10mg/mL的浓度加入到去离子水中，接着将姜黄素(CUR)固体以5mg/mL的浓度加入到溶液中，然后加入4mol/L的NaOH将溶液调节到pH12.0，在室温下搅拌30min使姜黄素完全溶解后立即用1mol/L的HCl将溶液调节到pH 7.0、6.5、6.0、5.5或者5.0，继续搅拌3h后，得到负载姜黄素的脱酰胺化玉米多肽纳米粒子。将所得到的纳米粒子分为2部分，一部分不做处理，另一部分用探头超声仪(Scientz-IID，宁波新芝生物科技股份有限公司)进行超声，超声功率为855W，超声时间共计2min(超声5s，间歇5s)。
取40μL上述纳米粒子溶液，用含70％乙醇的5mmol/L pH 6.0磷酸缓冲液梯度稀释1000倍，使纳米粒子溶解并释放出所负载的姜黄素，用紫外-可见分光光度计测量稀释的溶液在430nm的吸收，根据在同样条件下测量的姜黄素标准工作曲线得到纳米粒子溶液中的姜黄素实际含量，利用下面公式计算纳米粒子溶液中的姜黄素保留率：
Figure BDA0001907674450000071
取0.1mL上述纳米粒子溶液，加入1mL乙酸乙酯萃取溶液中的自由姜黄素，将混合溶液涡旋1min，待溶液完全分层后取0.08mL上层有机相，用乙酸乙酯稀释50倍后测量在417nm的吸收，根据姜黄素乙酸乙酯溶液标准工作曲线计算用乙酸乙酯萃取出的姜黄素含量，利用下面公式计算纳米粒子的姜黄素负载率：
Figure BDA0001907674450000073
将上述纳米粒子用相同pH值的水溶液稀释100倍后加入NaCl，NaCl的终浓度为5mmol/L，然后用纳米粒度-Zeta电位分析仪(Nano ZS90,Malvern Instruments)表征其粒径、多分散系数和ζ-电位。
表4.用含70％乙醇碱性溶液水解制备的脱酰胺化玉米多肽作为载体得到的负载姜黄素的纳米粒子的性质(n＝3)。样品中姜黄素初始浓度为5mg/mL，多肽浓度为10mg/mL。
Figure BDA0001907674450000072
姜黄素在碱性溶液中会发生分解，因此在制备过程中要尽量缩短姜黄素在pH12.0条件下的溶解时间。在本实施例条件下，表4数据显示有2％～11％的姜黄素在制备过程中发生了分解。表4数据还显示，将EZ50-36h和姜黄素的混合溶液从pH 12.0调节到pH5.5～7.0都可以制备负载姜黄素的纳米粒子，纳米粒子的姜黄素负载率在60％～76％之间。值得注意的是，纳米粒子溶液中没有出现自由姜黄素沉淀。也许，这24％～40％的姜黄素位于纳米粒子的表面，在通过涡流萃取姜黄素的过程中被乙酸乙酯溶解，从而造成分析得到的姜黄素负载率低于实际姜黄素负载率。纳米粒子都带有比较多的负电荷，这意味着纳米粒子具有比较强的静电排斥力，可以很好地分散在水溶液中。将不同pH条件下制备的纳米粒子进行超声后，纳米粒子的粒径、多分散系数和ξ-电位都有所减小，姜黄素的负载率有所提高，表明纳米粒子在超声过程中进行了重排。另一方面，超声并没有使纳米粒子的性质有很大的变化，没有超声的纳米粒子也能够有效地负载姜黄素。相对于其他pH，在pH 6.0条件下制备得到的纳米粒子的粒径比较小，姜黄素的负载率比较高。
实施例4.用方法2制备的多肽制备负载姜黄素的纳米粒子
采用实施例2方法制备脱酰胺化玉米多肽Z50-6h、Z50-36h和Z50-72h。在搅拌状态下将Z50-6h、Z50-36h或者Z50-72h粉末以10mg/mL的浓度加入到去离子水中，接着将姜黄素固体以5mg/mL的浓度加入到溶液中，然后加入4mol/L的NaOH调节溶液pH到12.0，室温下搅拌30分钟使姜黄素完全溶解后立即用1mol/L的HCl将溶液调节至pH 5.0或者6.0，继续搅拌3h后，得到负载姜黄素的脱酰胺化玉米多肽纳米粒子。将所得到的纳米粒子分为2部分，一部分不做处理，另一部分用探头超声仪进行超声，超声功率为855W，超声时间共计2min(超声5s，间歇5s)。
按照实施例3中的方法表征上述纳米粒子的姜黄素保留率、姜黄素负载率、粒径、分散系数和ζ-电位。
表5中的数据显示，在制备过程中有3％～9％的姜黄素发生了分解。对Z50-6h、Z50-36h和Z50-72h这3个多肽样品而言，pH 6.0是比pH 5.0更好的纳米粒子制备条件，在pH6.0制备的纳米粒子具有更高的姜黄素负载率、更小的粒径和粒径分布，纳米粒子表面所带的负电荷也有所增加。将pH 6.0条件下制备的纳米粒子进行超声后，纳米粒子的粒径、多分散系数和ξ-电位都有所减小，姜黄素的负载率有所提高。另一方面，超声并没有使纳米粒子的性质有很大的变化，没有超声的纳米粒子也能够有效地负载姜黄素。
表4和表5的结果表明，在同样的制备条件下，用两种不同水解液制备得到的脱酰胺化玉米多肽，例如EZ50-36h(多肽编号A)和Z50-36h(多肽编号F)在pH 6.0条件下制备的纳米粒子CUR/A-6.0和CUR/F-6.0具有相同的ξ-电位和姜黄素负载率，但是CUR/F-6.0的粒径和粒径分布比CUR/A-6.0要小一些。这些结果证明，使用更简单的方法，即在碱性水溶液中水解制备的多肽作为载体，可以制备出粒径和粒径分布更小的载药或者载营养物纳米粒子。
表5.用碱性水溶液水解制备的脱酰胺化玉米多肽作为载体得到的负载姜黄素的纳米粒子的性质(n＝3)。样品中姜黄素初始浓度为5mg/mL，多肽浓度为10mg/mL。
Figure BDA0001907674450000081
Figure BDA0001907674450000091
实施例5.负载姜黄素的纳米粒子在4℃条件下的储存稳定性
将实施例3表4中所显示的负载姜黄素的纳米粒子于4℃冰箱中避光保存101天，然后按照实施例3中的方法测量纳米粒子的粒径、多分散系数、ζ-电位和姜黄素含量，根据下面公式计算纳米粒子在存储过程中的姜黄素保存率：
Figure BDA0001907674450000092
除了CUR/A-5.0和CUR/A-5.0S之外，与表4中新鲜制备的纳米粒子相比，表6的数据显示，于4℃避光保存101天后，纳米粒子的粒径、多分散系数和ζ-电位都没有明显变化，姜黄素在存储过程中的分解率为3％～9％，这些结果证明纳米粒子具有很好的存储物理稳定性和化学稳定性。表6的数据还表明，在纳米粒子的制备过程中是否超声对纳米粒子的存储稳定性没有显著影响。
表6.表4中的纳米粒子于4℃避光保存101天后的性质。样品中姜黄素初始浓度为5mg/mL，多肽浓度为10mg/mL。
Figure BDA0001907674450000093
Figure BDA0001907674450000101
实施例6.负载姜黄素的纳米粒子经稀释后在25℃条件下的储存稳定性
配制以下5个样品进行姜黄素稳定性表征：样品1和2是分别将按照实施例3制备的CUR/A-6.0和CUR/A-6.0S用pH 6.0的水溶液稀释125倍至姜黄素浓度为40μg/mL；样品3是将0.2mg/mL的姜黄素DMSO溶液用pH 6.0的水溶液稀释5倍至姜黄素浓度为40μg/mL；样品4是将0.2mg/mL的姜黄素DMSO溶液用pH 6.0的水溶液稀释5倍至姜黄素浓度为40μg/mL后立即减压除去溶液中溶解的空气，然后充入氩气；样品5是将0.2mg/mL的姜黄素DMSO溶液用pH6.0的水溶液稀释至姜黄素浓度为80μg/mL，然后与160μg/mL的pH 6.0的EZ50-36h(多肽编号A)溶液等体积混合。
将上述5个样品分别置于25℃不避光保存48小时后，各取出0.5mL溶液分别与3.5mL含70％乙醇的5mmol/L pH 6.0磷酸缓冲液混合，使溶液中的纳米粒子和姜黄素溶解，然后用紫外-可见分光光度计测量在430nm处的吸收，得到存储后各样品的姜黄素浓度，与新鲜样品中的姜黄素实际浓度进行比较计算出纳米粒子在存储过程中的姜黄素保存率。
表7的结果表明，自由姜黄素不稳定，于25℃不避光保存48小时后，有51％的自由姜黄素已经分解；而在除去氧气的自由姜黄素溶液中，只有19％的姜黄素分解，表明溶液中溶解的氧气是使姜黄素分解的主要原因。负载姜黄素的脱酰胺化玉米多肽纳米粒子CUR/A-6.0和CUR/A-6.0S可以很好地抑制所负载的姜黄素分解，其姜黄素分解率分别只有10％和8％。在自由姜黄素溶液中加入自由的脱酰胺化玉米多肽也可以很好地抑制姜黄素分解，在二者的混合溶液中姜黄素的分解率为15％，略高于纳米粒子中的姜黄素分解率，大大低于自由姜黄素溶液中的姜黄素分解率。这些结果证明了脱酰胺化玉米多肽具有很好的抗氧化作用，可以保护溶液中的药物和营养物不被氧化分解。
表7.各种姜黄素样品在25℃不避光保存48小时后的姜黄素保存率。各样品中姜黄素初始浓度为40μg/mL，样品1、2、5中EZ50-36h(多肽编号A)浓度为80μg/mL。
Figure BDA0001907674450000102
Figure BDA0001907674450000111
实施例7.负载姜黄素的纳米粒子在37℃条件下的储存稳定性
按照实施例3制备负载姜黄素的纳米粒子CUR/A-6.0和CUR/A-6.0S，将每一个纳米粒子溶液分为2部分，一部分维持溶液pH 6.0，另一部分将溶液pH调节到7.4，将各溶液置于37℃、在避光或不避光的条件下保存30天后，用实施例5的方法表征各溶液中的姜黄素保存率。
表8的数据显示，无论在pH 6.0或者7.4、避光或者不避光条件下存储30天后，纳米粒子中的姜黄素分解率最高只有12％，这进一步证明了脱酰胺化玉米多肽纳米粒子对所负载的姜黄素有很好的保护作用。
表8.负载姜黄素的纳米粒子在pH6.0或7.4条件下于37℃避光或不避光保存30天后的姜黄素保存率。样品中姜黄素初始浓度为5mg/mL，多肽浓度为10mg/mL。
Figure BDA0001907674450000112
实施例8.负载姜黄素的纳米粒子经冷冻抽干后在水溶液中的再分散性质
按照实施例3中的方法制备负载姜黄素的纳米粒子CUR/A-6.0和CUR/A-6.0S，然后将纳米粒子溶液冷冻干燥，得到CUR/A-6.0和CUR/A-6.0S粉末。将新鲜得到的CUR/A-6.0和CUR/A-6.0S粉末样品和置于4℃冰箱中避光保存32天后的CUR/A-6.0和CUR/A-6.0S粉末样品分别加入到pH 6.0的水溶液中，用手振荡后得到多肽终浓度为10mg/mL的冻干-再分散CUR/A-6.0和CUR/A-6.0S溶液。用实施例3中的方法表征纳米粒子的粒径和姜黄素负载率，用实施例5中的方法表征纳米粒子的姜黄素保存率。
对于CUR/A-6.0和CUR/A-6.0S样品，表9的数据显示，将新鲜制备的冻干样品和经4℃避光保存32天后的冻干样品重新分散在pH 6.0水溶液中得到的溶液，其粒径和姜黄素负载率均与表4中新鲜制备的纳米粒子溶液很接近，这证明了纳米粒子具有非常好的冻干再分散性质。所负载的姜黄素在冻干和冻干后的保存过程中几乎没有分解，这对于纳米粒子的保存和实际应用是非常有益的。
表9.在4℃避光保存0天和32天后的CUR/A-6.0和CUR/A-6.0S冻干粉末样品重新分散在pH 6.0水溶液中形成的纳米粒子溶液的性质。
Figure BDA0001907674450000121
实施例9.傅立叶红外光谱表征
准备以下样品用于傅里叶红外光谱表征：1)商品姜黄素固体样品；2)将按照实施例1制备的EZ50-36h(多肽编号A)溶解在水中，然后将溶液调节到pH 6.0后冷冻干燥，得到EZ50-36h冻干粉末；3)将姜黄素固体与EZ50-36h冻干粉末混合，质量比为1/2；4)按照实施例8制备CUR/A-6.0和CUR/A-6.0S冻干粉末。将上述样品分别与KBr粉末充分混合后压成薄片，在傅里叶变换红外光谱仪(Nicolet 6700，Thermofisher)上扫描得到透射光谱，分辨率4cm-1，累积扫描次数128次。
单独玉米蛋白和单独姜黄素振动吸收峰的归属可见参考文献【FoodHydrocolloids,88(2019),50-57；Food Hydrocolloids,85(2018),75-85；InternationalJournal of Quantum Chemistry,102(2005),1069-1079】。附图1的红外光谱图显示，形成纳米粒子以后，EZ50-36h的NH伸缩振动峰从3504cm-1移动到了3405cm-1，酰胺II带NH面内弯曲振动峰从1542cm-1移动到了1578cm-1；姜黄素在3510cm-1的酚羟基伸缩振动峰消失，1155cm-1峰(烯醇侧苯环CCH面内弯曲振动和骨架CCH面内弯曲振动)移动至1168cm-1，857cm-1峰(骨架CCH面外弯曲振动和苯环CCH面外弯曲振动)移动到847cm-1。以上结果证明脱酰胺化玉米多肽和姜黄素之间通过氢键和疏水相互作用力结合，形成负载姜黄素的脱酰胺化玉米多肽纳米粒子。此外，CUR/A-6.0和CUR/A-6.0S的红外光谱图几乎相同，证明超声过程没有显著影响脱酰胺化玉米多肽和姜黄素之间的相互作用。参见图1。
实施例10.用方法2制备的多肽制备负载叶酸的纳米粒子
按照实施例2中的方法制备脱酰胺化玉米多肽Z50-6h、Z50-36h和Z50-72h。在搅拌状态下将Z50-6h、Z50-36h或者Z50-72h粉末以10mg/mL的浓度加入到去离子水中，接着将叶酸(FOL)固体以1mg/mL的浓度加入到溶液中，然后加入4mol/L的NaOH调节溶液到pH11.2，搅拌20分钟使叶酸完全溶解后立即用1mol/L的HCl将溶液调节至pH 5.0或者6.0，继续搅拌3h后，得到负载叶酸的脱酰胺化玉米多肽纳米粒子。将所得到的纳米粒子分为2部分，一部分不做处理，另一部分用探头超声仪进行超声，超声功率为855W，超声时间共计2min(超声5s，间歇5s)。
取0.3mL上述纳米粒子溶液置于超滤管中(截留分子量100kDa)，在4℃条件下以12000rpm转速离心20min，取出0.1mL超滤液用10mmol/LpH 7.4磷酸缓冲液稀释10倍后，用多功能微孔板检测仪(Cytation3,BioTek)测量溶液在350nm处的紫外吸收；根据溶解在10mmol/LpH 7.4磷酸缓冲液中的叶酸标准工作曲线计算超滤液中的叶酸含量。利用下面的公式计算各种负载叶酸的脱酰胺化玉米多肽纳米粒子的叶酸负载率：
Figure BDA0001907674450000131
按照实施例3中的方法表征上述纳米粒子的粒径、多分散系数和ζ-电位。
表10的数据显示，在pH 5.0条件下制备的纳米粒子可以负载90％以上的叶酸，但在pH6.0条件下制备的纳米粒子不能有效负载叶酸。对叶酸而言，Z50-36h在pH5.0具有合适的亲水性/疏水性，因此由Z50-36h在pH5.0制备的纳米粒子具有93％叶酸负载率、比较小的粒径和比较多的表面负电荷。
表10.用碱性水溶液水解制备的脱酰胺化玉米多肽作为载体得到的负载叶酸的纳米粒子的性质。样品中叶酸初始浓度为1mg/mL，多肽浓度为10mg/mL。
Figure BDA0001907674450000132
实施例11.用方法2制备的多肽制备负载布洛芬的纳米粒子
按照实施例2中的方法制备脱酰胺化玉米多肽Z50-6h、Z50-36h和Z50-72h。在搅拌状态下将Z50-6h、Z50-36h或者Z50-72h粉末以10mg/mL的浓度加入到去离子水中，接着将布洛芬(IBU)固体以2mg/mL的浓度加入到溶液中，加入4mol/L的NaOH调节溶液到pH11.6，搅拌40分钟使布洛芬完全溶解后立即用1mol/L的HCl将溶液调节至pH 5.0或者6.0，继续搅拌3h后，得到负载布洛芬的脱酰胺化玉米多肽纳米粒子。将所得到的纳米粒子分为2部分，一部分不做处理，另一部分用探头超声仪进行超声，超声功率为855W，超声时间共计2min(超声5s，间歇5s)。
取0.3mL上述纳米粒子溶液置于超滤管中(截留分子量100kDa)，在4℃条件下以12000rpm转速离心20min，取出0.1mL超滤液用10mmol/LpH 7.4磷酸缓冲液稀释10倍后，用多功能微孔板检测仪(Cytation3,BioTek)在250nm激发、280nm发射条件下测量溶液的荧光值。根据溶解在10mmol/LpH 7.4磷酸缓冲液中的布洛芬标准工作曲线计算超滤液中的布洛芬含量。利用下面公式计算各种负载布洛芬的脱酰胺化玉米多肽纳米粒子的布洛芬负载率：
Figure BDA0001907674450000141
按照实施例3中的方法表征上述纳米粒子的粒径、多分散系数和ζ-电位。
表11中的数据显示，在pH 5.0条件下制备的纳米粒子可以有效负载布洛芬，但在pH6.0条件下制备的纳米粒子不能有效负载布洛芬。对布洛芬而言，由于Z50-36h和Z50-72h在pH5.0具有合适的亲水性/疏水性，因此由Z50-36h和Z50-72h在pH5.0制备的纳米粒子具有较高的布洛芬负载率、较小的粒径和较多的表面负电荷。
表11.用碱性水溶液水解制备的脱酰胺化玉米多肽作为载体得到的负载布洛芬的纳米粒子的性质。样品中布洛芬初始浓度为2mg/mL，多肽浓度为10mg/mL。
Figure BDA0001907674450000142
Figure BDA0001907674450000151
实施例12.小鼠口服负载姜黄素的纳米粒子对提高姜黄素血药浓度的评价
按照实施例3制备负载姜黄素的纳米粒子CUR/A-6.0和CUR/A-6.0S。将姜黄素分散在1％吐温20水溶液中制备姜黄素浓度为5.0mg/mL的姜黄素/吐温20悬浮液(使用时新鲜制备)。
随机将ICR雄鼠(25g)分为3组，每组35只，给药前禁食过夜，可自由进水。按照50mg/kg的姜黄素剂量对小鼠进行灌胃。给药后，分别在0.5h、1.0h、2.0h、4.0h、6.0h、24.0h和48.0h时间点从小鼠眼眶取血0.5mL至EDTA处理后的离心管，然后以5000rpm转速离心10min，取出上层血浆置于-60℃冰箱保存待用。每组在每个时间点取血的小鼠数量为5只。
取0.15mL血浆与0.35mL乙腈混合，涡流1min后以10000rpm转速于4℃离心15min，然后取上清液用高效液相色谱(HPLC,Agilent 1260)测试其姜黄素浓度。HPLC测试条件：流动相为三氟乙酸/乙腈/水(0.1/50/50，体积比)，检测波长420nm，流速1.0mL/min，柱温25℃。另外，将0.35mL已知浓度的姜黄素乙腈溶液与0.15mL空白血浆混合，用上面同样的方法进行涡流、离心、取上清液进行HPLC测试，根据姜黄素的峰面积绘制标准曲线。通过标准曲线，计算各组样品在各时间点的姜黄素血药浓度。
表12的数据显示，与姜黄素/吐温20悬浮液实验组相比，CUR/A-6.0和CUR/A-6.0S实验组的生物利用度分别为279％和250％，表明纳米粒子能显著提高姜黄素的口服生物利用度。此外，CUR/A-6.0和CUR/A-6.0S实验组具有相似的姜黄素口服生物利用度，表明在纳米粒子的制备过程中，超声等高能步骤不是必要的，不经过超声制备的纳米粒子也可以有效地提高姜黄素的口服生物利用度。
表12.小鼠口服CUR/A-6.0、CUR/A-6.0S、姜黄素/吐温20(CUR/Tween20)悬浮液后的药代动力学参数(n＝5)。
Figure BDA0001907674450000152

Claims (1)

1.一种负载药物或者营养物的脱酰胺化玉米多肽纳米粒子的制备方法，其特征在于，具体步骤为：（一）制备具有可调控的亲水/疏水性质的脱酰胺化玉米多肽；（二）利用脱酰胺化玉米多肽制备负载药物和营养物的脱酰胺化玉米多肽纳米粒子；其中：
（一）制备具有可调控的亲水/疏水性质的脱酰胺化玉米多肽，采用下述方法之一种：
方法1，在含有乙醇的碱性溶液中水解玉米蛋白，水解结束后将溶液调节到中性除去乙醇，然后将溶液调节到pH 2.0～3.5，使脱酰胺化玉米多肽上的羧基基团质子化，从而使多肽形成沉淀，得到产物；具体流程为：
（1）将玉米蛋白溶解于乙醇-水碱性溶液中，其中玉米蛋白的浓度为50 mg/mL，乙醇浓度为70%（v/v），NaOH浓度达到0.5 mol/L；
（2）将流程（1）所制备的玉米蛋白乙醇碱性溶液置于37℃条件下进行水解，水解时间为36小时；
（3）水解完成后，将流程（2）所得到的水解液调节到pH 7，通过旋转蒸发除去乙醇，然后将溶液调节到pH 3，得到脱酰胺化玉米多肽沉淀；
方法2，在碱性水溶液中水解玉米蛋白，水解结束后将溶液直接调节到pH 2.0～3.5，使脱酰胺化玉米多肽沉淀出来，得到产物；具体流程为：
（1）将玉米蛋白溶解于碱性水溶液中，其中玉米蛋白的浓度为10～200 mg/mL，NaOH浓度达到0.5 mol/L；
（2）将流程（1）所制备的玉米蛋白碱性水溶液置于37℃条件下进行水解，水解时间为6～72小时；
（3）水解完成后，将流程（2）所得到的水解液直接调节到pH 3，得到脱酰胺化玉米多肽沉淀；
（二）利用脱酰胺化玉米多肽制备负载药物和营养物的脱酰胺化玉米多肽纳米粒子，具体流程如下：
（1）将脱酰胺化玉米多肽和药物或者营养物共同加入水中，脱酰胺化玉米多肽的浓度为10 mg/mL，姜黄素的浓度为5 mg/mL；
（2）加入碱将溶液调节到pH 12，使脱酰胺化玉米多肽和药物或者营养物溶解；
（3）加入酸将溶液调节到pH 6，然后搅拌3小时，即得到负载药物或者营养物的脱酰胺化玉米多肽纳米粒子；
所述的药物和营养物，是带有弱酸基团的药物和营养物，其在碱性溶液中去质子化而溶解，在中性或者弱酸性溶液中质子化而不溶解。
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