CN110638754B - 以脱酰胺化玉米多肽为乳化剂的水包油乳液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药/食品技术领域，具体是脱酰胺化玉米多肽为乳化剂的水包油乳液及其制备方法。本发明的水包油乳液以脱酰胺化玉米多肽为单一乳化剂，油相在所需HLB为6~18范围内选择；油相可以较高浓度溶解疏水药物和/或者营养物，从而将疏水药物和/或者营养物高效负载于乳滴中，可以提高所负载的疏水药物和/或者营养物的口服生物利用度。本发明通过在碱性水溶液中水解玉米蛋白、通过控制水解条件得到具有不同平均分子量和不同平均羧基含量的脱酰胺化玉米多肽，通过调节乳化pH来调节多肽的亲水/疏水性制备具有长期稳定性的乳液。本发明方法简单、高效；所用原料安全、成本低廉。
Description
技术领域
本发明属于医药/食品技术领域，具体涉及一种以脱酰胺化玉米多肽为乳化剂的水包油乳液及其制备方法。
背景技术
很多疏水性药物和营养物由于水溶性和稳定性差而不能很好地被人体吸收，从而限制了这些药物和营养物的有效利用【Nature Reviews Drug Discovery,6(2007),231-248；Food Hydrocolloids,88(2019),146-162】。水包油纳米乳液是递送疏水性药物和营养物的一个普适性体系，并且容易实现大规模生产，凡是能够溶解在油相中的疏水性药物和营养物都可以负载在乳滴内部，从而可以增加疏水性药物和营养物在水溶液中的分散性和稳定性，有效提高疏水药物和营养物的口服生物利用度【Food Hydrocolloids,71(2017),108-117；Food Hydrocolloids,35(2014),19-27；Journal of Controlled Release,149(2011),168-174；Expert opinion on drug delivery,7(2010),445-460；Expert opinionon drug delivery,14(2017),1325-1340】。疏水药物/营养物在油相中的溶解度是影响水包油乳液对疏水药物/营养物有效负载并且影响乳液口服生物利用度的一个关键因素，疏水药物/营养物在油相中要有比较高的溶解度才可以制备出符合口服制剂要求的乳液【Scientia Pharmaceutica,79(2011),705–727】。根据溶解性原则，只有当疏水性溶质的溶解度参数和油相的溶解度参数相近时，疏水性溶质才能够在油相中很好地溶解【ScientiaPharmaceutica,79(2011),705–727】。油相的溶解度参数与其所需的亲水疏水平衡值(所需HLB)相关【Journal of Dispersion Science and Technology,30(2009),328–331】，也就是说，不同的疏水性药物/营养物需要选择相应的所需HLB值的油相才能够很好地溶解。对于乳液而言，当乳化剂的HLB值与油相所需HLB值相匹配时才能够有比较好的乳化能力，乳液才会有比较好的物理稳定性【Journal of Dispersion Science and Technology,11(1990),83-91】。各种具有不同HLB值、不同结构和不同分子量的乳化剂都可以通过化学反应来制备【The Journal of Physical Chemistry Letters,2(2011),914-20；FoodFunction,5(2014),1320-1333；Food Hydrocolloids,(2014),42,5-41】，两种或者多种乳化剂的混合使用往往会有更好的乳化和乳液稳定效果，混合乳化剂可以同时满足较强亲油性和较强亲水性的要求，可以增加界面膜的稳定性【陈宗淇、王光信、徐桂英编：《胶体与界面化学》，高等教育出版社，2001年出版】。在乳化过程中，分子量不同的乳化剂在油水界面上的吸附速率和稳定能力各不相同，大分子和小分子乳化剂的混合使用有可能产生快速吸附和抑制絮凝/合并的效果，得到粒径较小的乳滴【Advances in Colloid and InterfaceScience 251(2018)55-79】。然而，合成乳化剂的生物降解性和生物相容性较差，使用时会对生物体产生一定的毒副作用【Journal of Dispersion Science and Technology,30(2009)1363-1383；Nature,519(2015),92-96】。此外，到目前为止，还没有任何单一乳化剂能够乳化并且稳定油相的所需HLB值在很宽范围内变化的乳液的报道。
玉米蛋白是生产玉米淀粉的副产品，具有抗氧化性、生物降解性和生物相容性等优异性能【Biomaterials,25(2004),4691-4697；Food Hydrocolloids,23(2009),1427-1432】。玉米蛋白富含疏水性氨基酸残基，缺乏碱性和酸性氨基酸残基【Journal ofAgricultural and Food Chemistry,55(2007),439-445；Food Science and TechnologyInternational,16(2010),241-250；Industrial Crops and Products,13(2001),171-192】，因此玉米蛋白能溶于60％～85％的乙醇溶液中而不溶于水【Industrial Crops andProducts,13(2001),171-192；LWT-Food Science and Technology,48(2012),283-290】。通过在酸性水溶液、含酶水溶液、含70％乙醇的酸性溶液或者碱性溶液中的温和脱酰胺反应，玉米蛋白上的天冬酰胺和谷氨酰胺残基转化为天冬氨酸和谷氨酸残基，得到水溶性的脱酰胺化玉米蛋白。与玉米蛋白相比，脱酰胺化玉米蛋白的乳化能力和乳液稳定性都有明显的提高【Food Science and Technology International,16(2010),241-250；Journalof Agricultural and Food Chemistry,55(2007),439-445】。当玉米蛋白在酸性或者碱性溶液中进行比较深度的脱酰胺反应时，玉米蛋白肽链上的酰胺键也会断裂，得到的产物是脱酰胺化的玉米蛋白片断，即脱酰胺化玉米多肽。我们的前期实验证明，在含70％乙醇的碱性溶液中水解玉米蛋白，通过控制水解反应时间可以制备具有不同分子量、不同羧基含量、优良生物相容性和高表面活性的脱酰胺化玉米多肽【Food Hydrocolloids,63(2017),120-129；Colloids and Surfaces A,540(2018),150-157】。由于羧基是pH响应性基团，脱酰胺化玉米多肽的亲水/疏水性可以通过多肽溶液的pH、即羧基的质子化程度来调节。我们利用脱酰胺化玉米多肽作为乳化剂制备了含10％中链甘油三酯的水包油乳液【Colloids andSurfaces A,540(2018),150-157】。在已有的乳化研究中，没有发现脱酰胺化玉米蛋白和脱酰胺化玉米多肽对所需HLB值在很宽范围内变化的不同油相有很好的乳化效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以亲水/疏水性质可调控的脱酰胺化玉米多肽为乳化剂的水包油乳液及其制备方法。
本发明提供的以亲水/疏水性质可调控的脱酰胺化玉米多肽作为乳化剂的水包油乳液，以脱酰胺化玉米多肽作为单一乳化剂，其油相可以在所需HLB值(亲水疏水平衡值)6～18范围内选择，可以溶解疏水药物和/或者营养物，乳液可用于疏水药物和/或者营养物的口服递送。
由于混合乳化剂往往比单一乳化剂具有更好的乳化和乳液稳定效果，本发明首先提供一种制备具有可调控的亲水/疏水性质、分子量分布宽、羧基分布不均匀的脱酰胺化玉米多肽的方法。具体采用在碱性水溶液中水解玉米蛋白的方法制备脱酰胺化玉米多肽。由于在水解过程中没有乙醇，玉米蛋白的疏水链段在溶液中不能很好的伸展，疏水的天冬酰胺和谷氨酰胺残基的暴露程度不同，所制备的多肽比在70％乙醇碱溶液中制备的多肽具有分子量分布更宽、羧基分布更加不均匀的特点。通过调节水解时的玉米蛋白浓度和碱浓度、水解温度、水解时间来调节脱酰胺化玉米多肽的平均分子量和平均羧基含量，水解结束后将水解溶液调节到pH 2.0～3.5，使脱酰胺化玉米多肽上的羧基完全质子化而沉淀出来，得到产物。本发明提供的制备脱酰胺化玉米多肽的具体步骤如下：
(1)将玉米蛋白溶解于碱性水溶液中，其中玉米蛋白的浓度为1～500mg/mL，溶液pH为11～14；
(2)将步骤(1)所制备的玉米蛋白碱性水溶液置于20～70℃条件下进行水解反应，反应时间为0.5～200小时；
(3)水解完成后，将步骤(2)所得到的水解液调节到pH 2.0～3.5，得到脱酰胺化玉米多肽沉淀，将沉淀洗涤干燥后得到脱酰胺化玉米多肽粉末。
本发明中，分子量分布宽、羧基基团分布不均匀的脱酰胺化玉米多肽具有很好的乳化能力，可以乳化所需HLB值在6～18范围内的不同油相，乳液能够保持长期稳定性。本发明的脱酰胺化玉米多肽作为单一乳化剂的水包油乳液的制备方法，具体步骤如下：
(1)将脱酰胺化玉米多肽作为单一乳化剂加入水中，脱酰胺化玉米多肽的浓度为2～100mg/mL，在水溶液中加入碱调节pH至3.5～8.0，使多肽的部分羧基基团去质子化，从而使多肽带有一定的负电荷，得到水相溶液；
(2)将疏水药物和/或者营养物溶解在油相中，油相可以在所需HLB值为6～18范围内选择，以使疏水药物和/或者营养物在油相中有比较高的溶解度，疏水药物和/或者营养物的浓度为0.1～500mg/mL；
(3)将上述步骤(1)制备的水相溶液和步骤(2)制备的油相溶液混合，油相溶液与水相溶液的体积比为1:1～1:20(即1:(1～20))；通过高压均质方法制备水包油乳液，其中高压均质压力为400～1500bar，高压均质时间为2～30分钟；
(4)由于乳液中油相和水相的比重差别，在重力作用下，当乳滴的粒径比较大时乳滴会发生上浮现象，加入具有高黏度、凝胶和假塑性性质的水溶性多糖，如黄原胶、瓜尔胶、刺槐豆胶、果胶等，以增加乳液的粘度，抑制乳滴上浮，使乳液保持均匀；多糖在乳液中的浓度为0～100mg/mL(优选浓度为1～100mg/mL)。
上述制备的脱酰胺化玉米多肽乳液，可用于制备药物制剂、食品等方面。
本发明中，所述的药物/营养物是可以溶解在油相中的疏水药物/营养物，由于油相可以在所需HLB值6～18范围内选择，可以使疏水药物/营养物在油相中有比较高的溶解度，可以提高疏水药物/营养物在乳液中的包埋量和提高疏水药物/营养物的口服生物利用度。
本发明首次采用单一乳化剂制备油相可以在所需HLB值6～18范围内选择的乳液。来源于玉米蛋白的脱酰胺化玉米多肽作为单一乳化剂，所制备的乳液具有优异的生物安全性和可消化性。制备脱酰胺化玉米多肽的方法简单、绿色、高效，可以大规模生产。
附图说明
图1为Z50-36h为乳化剂制备的油相所需HLB值分别为6、11、16的三种乳液的流变学性质-稳态速率扫描曲线。
图2为Z50-36h为乳化剂制备的油相所需HLB值分别为6、11、16的三种乳液的流变学性质-动态应力扫描曲线。
图3为Z50-36h为乳化剂制备的油相所需HLB值分别为6、11、16的三种乳液的流变学性质-动态频率扫描曲线。
图4为Z50-36h为乳化剂制备的油相所需HLB值分别为6、11、16的三种乳液的乳滴粒径。
具体实施方式
实施例1.脱酰胺化玉米多肽的制备。
在搅拌状态下将玉米蛋白加入到去离子水中，玉米蛋白的浓度如表1所示，在每100mL玉米蛋白溶液中加入2g固体NaOH，使溶液中的NaOH浓度达到0.5mol/L；将溶液置于37℃条件下反应6、36或者72小时。反应结束后，立即用5mol/L的HCl将溶液调节到pH 3.0使脱酰胺化玉米多肽沉淀，沉淀用pH 3.0的HCl水溶液洗涤3次后冷冻干燥，得到脱酰胺化玉米多肽粉末样品。采用电导滴定法(DDS-11A数显电导率仪，上海雷磁仪器仪表有限公司)用NaOH标准溶液分析脱酰胺化玉米多肽样品中的羧基含量。采用凝胶渗透色谱法分析脱酰胺化玉米多肽样品的分子量和分子量分布(Mw/Mn)，仪器型号为P230型(Elite,Dalian)，色谱柱为SEC-125column(XIYU Tech,Shanghai)。如表1所示，随着水解时间的增加，玉米蛋白的脱酰胺化程度和肽链的断裂程度增加，Z50-6h，Z50-36h和Z50-72h的重均分子量依次降低，羧基含量依次增加，亲水性依次增加。在同样的水解时间条件下，增加玉米蛋白的浓度使得其水解程度降低，Z10-36h，Z50-36h和Z200-36h的羧基含量依次降低、分子量依次增加。此外，表1显示所制备的脱酰胺化玉米多肽的分子量分布(Mw/Mn)都很大，约为3左右，说明所得到的多肽具有分子量分布宽的特点。在多肽名称的表示式Zx-yh中，x表示玉米蛋白浓度(mg/mL)，y表示水解时间(h)。
表1.在碱性水溶液中水解制备的脱酰胺化玉米多肽的性质(n＝1或者3)
将Z50-6h，Z50-36h和Z50-72h以1.00mg/mL的浓度加入去离子水中，然后在多肽水溶液中加入4mol/L NaOH调节溶液至表2所示的pH值，加入NaCl至终浓度为5mmol/L。用纳米粒度-Zeta电位分析仪(Nano ZS90,Malvern Instruments)测量Z50-6h、Z50-36h和Z50-72h水溶液在各pH条件下的Z-均水合直径、多分散系数、散射光强和ζ-电位。表2的结果表明，Z50-6h在pH≥5.25、Z50-36h和Z50-72h在pH≥5.0的水溶液中可以形成粒径约为200nm左右的纳米粒子。随着pH的增加，散射光强迅速降低并且纳米粒子带有更多的负电荷，表明多肽的羧基去质子化的程度增加，多肽的负电荷增加，亲水性增加，多肽的聚集程度减小，纳米粒子的数目减少。反之，随着溶液pH的降低，由于羧基的质子化，Z50-6h、Z50-36h和Z50-72h所带的负电荷逐渐减少，多肽的疏水性逐渐增加，聚集程度增加甚至出现宏观沉淀。相对于Z50-36h和Z50-72h，Z50-6h由于羧基含量低其疏水性更强，在相同的溶液pH条件下，Z50-6h聚集体的散射光强比Z50-36h和Z50-72h聚集体的散射光强要大很多。由于多肽分子量分布宽和羧基分布的不均匀性，Z50-6h、Z50-36h和Z50-72h聚集体的粒径没有出现随着pH变化而单调变化的趋势。
表2.脱酰胺化玉米多肽在不同pH水溶液中的性质(n＝3)；玉米多肽的浓度为1.00mg/mL
实施例2.用脱酰胺化玉米多肽制备油相所需亲水疏水平衡值(所需HLB)为6的水包油乳液。
采用实施例1方法制备脱酰胺化玉米多肽Z50-6h、Z50-36h和Z50-72h。将Z50-6h、Z50-36h和Z50-72h分别以10mg/mL的浓度分散在20mL去离子水中，加入4mol/L NaOH调节溶液的pH到表3所示的乳化pH值，加入5mL棉籽油(所需HLB＝6)，然后用高速均质机(FJ200-S,上海标本模型厂)以10000rpm的转速均质1分钟得到粗乳液，将粗乳液用高压均质机(AH100D,ATS Engineering Inc.)在800bar压力下均质4分钟得到纳米乳液。将纳米乳液用相同pH的水溶液稀释500倍后测量其粒径、多分散系数和ζ-电位。表3的数据显示，对于所需HLB＝6的油相，Z50-6h、Z50-36h和Z50-72h都有很好的乳化能力，分别在pH 5.5～7.5、4.75～6.0和4.5～6.0范围内形成乳滴粒径约为200nm左右、粒径分布较窄的纳米乳液。此外，由于各多肽所带的负电荷随着乳化pH的增加而增加，乳滴所带的负电荷也随着乳化pH的增加而增加，乳滴粒径随之减小。与Z50-36h和Z50-72h乳液相比，Z50-6h乳液的乳滴粒径和ζ-电位在pH5.5～7.5范围内受pH的影响很小。表1的结果显示，Z50-6h的羧基含量只有Z50-36h羧基含量的44％、Z50-72h羧基含量的38％。表2显示当pH从5.5增加到6.0时，Z50-6h的ζ-电位从-36mV变化到-42mV；当pH从6.0增加到7.5时，Z50-6h的ζ-电位变化很小，说明其大部分的羧基都已经去质子化，羧基的去质子化程度受pH变化的影响不大。因此，在pH 5.5～7.5范围内，乳化pH的变化对Z50-6h乳液的乳滴粒径和ζ-电位的影响都不大。对于Z50-36h和Z50-72h，由于其羧基含量高，分别只能在其羧基部分去质子化的pH 4.75～6.0和pH 4.5～6.0条件下制备乳液；在pH 4.75～6.0和pH 4.5～6.0范围内，Z50-36h和Z50-72h的去质子化程度随pH增加而变化很大(表2)，所以，Z50-36h和Z50-72h乳液的乳滴粒径和ζ-电位受乳化pH的影响比较大。
表3.脱酰胺化玉米多肽在不同乳化pH条件下制备的水包油乳液性质(n＝2)；油相为棉籽油(所需HLB＝6)，油相体积分数为20％，乳化剂在乳液中的终浓度为8mg/mL
将表3中的乳液各取10mL置于带刻度的无菌管中，加盖密封后在4℃冰箱中保存30天，然后记录乳液的外观情况，测量上层乳液的乳滴粒径和多分散系数。表4的数据显示，随着乳化pH的增加，存储30天后的Z50-6h、Z50-36h和Z50-72h乳液的乳滴粒径和粒径分布增加，乳液出现乳析层甚至少量的油层，表明在比较高的pH条件下，多肽所带的负电荷较多，亲水性较强，多肽之间的静电排斥力导致多肽不能在油水界面上紧密排列，乳滴的界面膜不稳定，经过长时间存放后乳液出现了乳滴合并和破乳现象。在pH 4.75和5.0条件下制备的Z50-36h乳液和在pH 4.5和4.75条件下制备的Z50-72h乳液都具有很好的长期稳定性，经过一个月的储存后其粒径和粒径分布的变化都很小，外观也没有变化。在pH 5.5和5.75制备的Z50-6h乳液也具有很好的长期稳定性，虽然乳液的乳滴粒径有所增加，但是乳液仍然保持着均匀的外观。
表4的实验结果证明了采用脱酰胺化玉米多肽为单一乳化剂、在合适的pH范围内制备的油相所需HLB值为6的乳液具有很好的长期稳定性。
表4.表3中的乳液于4℃保存30天后的乳滴粒径和外观情况(n＝2)；油相为棉籽油(所需HLB＝6)，油相体积分数为20％，乳化剂在乳液中的终浓度为8mg/mL
实施例3.用脱酰胺化玉米多肽制备油相所需HLB值为11的水包油乳液。
采用实施例1方法制备脱酰胺化玉米多肽Z50-6h、Z50-36h和Z50-72h。将Z50-6h、Z50-36h和Z50-72h分别以10mg/mL的浓度分散在20mL去离子水中，加入4mol/L NaOH调节溶液的pH到表5所示的乳化pH值，加入5mL质量比为1:1的棉籽油和松节油混合物作为油相，油相的所需HLB为11。然后用高速均质机以10000rpm的转速均质1分钟得到粗乳液，将粗乳液用高压均质机在800bar压力下均质4分钟得到纳米乳液。将纳米乳液用相同pH的水溶液稀释500倍后测量其粒径、多分散系数和ζ-电位。表5的数据显示，对于所需HLB＝11的油相，Z50-6h、Z50-36h、Z50-72h都具有很好的乳化能力，分别在pH 5.5～7.5、pH 4.75～6.0、pH4.5～6.0范围内形成了乳滴粒径小于200nm的乳液。随着乳化pH的增加，Z50-36h和Z50-72h乳液的乳滴所带的负电荷增加，乳滴粒径减小。Z50-6h乳液的乳滴粒径和ζ-电位不随乳化pH的增加而变化，其乳滴粒径明显大于Z50-36h和Z50-72h乳液的乳滴粒径。
表5.脱酰胺化玉米多肽在不同乳化pH条件下制备的水包油乳液性质(n＝2)。油相为质量比为1:1的棉籽油与松节油混合物(所需HLB＝11)，油相体积分数为20％，乳化剂在乳液中的终浓度为8mg/mL。
将表5中的乳液各取10mL置于带刻度的无菌管中，加盖密封后在4℃冰箱中保存30天，然后记录乳液的外观情况，测量上层乳液的乳滴粒径和多分散系数。表6的结果表明，随着乳化pH的增加，存储30天后的Z50-6h、Z50-36h和Z50-72h乳液的乳滴粒径和粒径分布增加，乳液出现乳析层甚至少量的油层，表明在比较高的pH条件下，乳液不稳定。经过一个月的储存后，在pH 5.5制备的Z50-6h乳液、pH 4.75制备的Z50-36h乳液、pH 4.5制备的Z50-72h乳液都具有很好的长期稳定性，其粒径和粒径分布的变化都很小，外观也没有变化。表6的实验结果证明了采用脱酰胺化玉米多肽为单一乳化剂、在合适的pH条件下制备的油相所需HLB值为11的乳液具有很好的长期稳定性。
表6.表5中的乳液于4℃保存30天后的乳滴粒径和外观情况(n＝2)。油相为棉籽油/松节油(w/w＝1)混合物(所需HLB＝11)，油相体积分数为20％，乳化剂在乳液中的终浓度为8mg/mL。
实施例4.用脱酰胺化玉米多肽制备油相所需HLB值为16的水包油乳液。
采用实施例1方法制备脱酰胺化玉米多肽Z50-6h、Z50-36h和Z50-72h。将Z50-6h、Z50-36h和Z50-72h分别以10mg/mL的浓度分散在20mL去离子水中，加入4mol/L NaOH调节溶液的pH到表7所示的乳化pH值，加入5mL松节油作为油相，油相的所需HLB为16。然后用高速均质机以10000rpm的转速均质1分钟得到粗乳液，将粗乳液用高压均质机在800bar压力下均质4分钟得到乳液。将所得到的乳液用相同pH的水溶液稀释500倍后测量其粒径、多分散系数和ζ-电位。表7的数据显示，对于所需HLB＝16的油相，Z50-6h、Z50-36h、Z50-72h都具有很好的乳化能力，分别在pH 5.5～7.5、pH 4.75～6.0、pH 4.75～6.0范围内形成乳液。与实施例2和实施例3中油相所需HLB值为6和11的乳液相比，油相所需HLB值为16的乳液具有不同的性质：乳滴粒径大幅增加，乳滴所带的负电荷随着乳化pH的增加而增加的幅度更大，乳滴粒径随着pH的增加而增加。这些结果表明，油相所需HLB值为16的乳液其油水界面膜的结构与所需HLB值为6和11的乳液有所不同。
表7.脱酰胺化玉米多肽在不同乳化pH条件下制备的水包油乳液性质(n＝2)；油相为松节油(所需HLB＝16)，油相体积分数为20％，乳化剂在乳液中的终浓度为8mg/mL
将表7中的乳液各取10mL置于带刻度的无菌管中，加盖密封后在4℃冰箱中保存30天，然后记录乳液的外观情况，测量上层乳液的乳滴粒径和多分散系数，结果在表8中列出。由于乳滴的粒径比较大，加之松节油的相对密度为0.850～0.870，与水的相对密度差别比较大，因此在重力作用下各乳液储存30天后都出现了乳滴上浮的现象，即都有乳清出现，但都没有出现乳析层。随着乳化pH的增加，存储30天后的Z50-6h、Z50-36h和Z50-72h乳液的乳滴粒径和粒径分布增加，乳液出现了油层并且油层的体积分数增加，表明在比较高的pH条件下，乳液不稳定。除了部分乳滴上浮现象以外，在pH 5.5制备的Z50-6h乳液、pH 4.75制备的Z50-36h和Z50-72h乳液都有比较好的稳定性，经过一个月的储存后其粒径变化比较小，也没有出现乳析层和油层。表8的结果证明了用脱酰胺化玉米多肽为单一乳化剂、在合适的pH条件下制备的油相所需HLB值为16的乳液具有比较好的长期稳定性。
表8.表7中的乳液于4℃保存30天后的乳滴粒径和外观情况(n＝2)。油相为松节油(所需HLB＝16)，油相体积分数为20％，乳化剂在乳液中的终浓度为8mg/mL。
实施例5.不同所需HLB油相的脱酰胺化玉米多肽乳液的流变学性质。
采用Z50-36h做乳化剂，按照实施例2、3和4方法制备三种乳液：乳液的油相分别为棉籽油、质量比为1:1的棉籽油与松节油混合物、松节油，油相的所需HLB值分别为6、11、16。用旋转流变仪(HAAKE MARS III,Thermofisher)对乳液进行流变学表征，模具为圆筒，测试温度为25℃。稳态速率扫描：剪切速率为0.1s-1～100s-1，测试样品的粘度随剪切速率变化的关系；动态应力扫描：剪切频率为0.1Hz，测试样品的G′(储能模量)和G″(损耗模量)与剪切应力变化的关系；动态频率扫描：剪切应力为0.005Pa，测试样品的G′和G″随剪切频率变化的关系。
附图1显示的是三种乳液的稳态速率扫描曲线。三种乳液的粘度都随着剪切速率的增加而逐渐降低，均具有剪切变稀性质；在相同剪切速率下，三种乳液的粘度随着油相所需HLB值的增加而减小，所需HLB值为16的乳液的粘度比其他乳液的粘度要小得多。附图2显示的是三种乳液的动态应力扫描曲线。油相所需HLB值为6和11的乳液的线性粘弹性区域几乎相同，两种乳液的G′均大于G″。对于油相所需HLB值为16的乳液，在仪器能够测试的10-3～1.2×10-1Pa范围内，乳液的G′小于G″，并且G′和G″的数值大幅度小于其他两种乳液。附图3是三种乳液在线性粘弹性区域的动态频率扫描曲线。在图中所示的频率范围内，油相所需HLB值为6和11的乳液随着剪切频率的增加其G′和G″几乎不变，G′大于G″，表明这两种乳液具有弱凝胶性质。油相所需HLB值为16的乳液的G′和G″随着剪切频率的增加而增加，在相同的剪切频率下G′和G″的数值很接近，表明该乳液是粘性类液体体系。
实施例6.在油相所需HLB值为16的脱酰胺化玉米多肽乳液中加入黄原胶抑制乳滴上浮。
按照实施例4方法，制备油相为松节油、油相所需HLB为16的三种乳液：Z50-6h、Z50-36h和Z50-72h为乳化剂，分别在pH 5.5、4.75和4.75进行乳化得到乳液。将黄原胶溶解于去离子水中，然后调节溶液的pH至4.75和5.5，得到浓度为2、5和10mg/mL的黄原胶水溶液。将相同pH值的黄原胶溶液与乳液以1:1体积比混合，得到乳液/黄原胶混合物。将所得到的乳液/黄原胶混合物用相同pH的水溶液稀释500倍后测量其粒径、多分散系数和ζ-电位。表9的数据显示，加入黄原胶以后，乳滴的粒径和ζ-电位变化不大，但是乳滴的粒径分布变化很大。
表9.脱酰胺化玉米多肽乳液和不同浓度黄原胶水溶液1:1(体积比)混合后的混合物性质(n＝2)；油相为松节油(所需HLB＝16)
将表9中的乳液各取10mL置于带刻度的无菌管中，加盖密封后在4℃冰箱中保存30天，然后记录乳液的外观情况，测量上层乳液的乳滴粒径和多分散系数。表10的结果显示，乳液中不同浓度的黄原胶对乳滴粒径的影响没有规律性。当黄原胶的终浓度为1％时，黄原胶促进乳滴上浮，乳液几乎完全分为乳清层和上层乳液，没有出现油层和乳析层。其原因可能是乳液中1％的黄原胶所产生的粘度不能够抑制乳滴运动，反之黄原胶所带的羧酸基团具有脱水作用【Carbohydrate Polymers 132(2015)490–498】，从而促进了乳滴上浮。当黄原胶终浓度增加到2.5％和5％时，乳液的粘度可以抑制乳滴运动，乳液的外观是均匀的，没有出现乳滴上浮、絮凝和出油现象，证明了一定浓度的黄原胶可以增加油相所需HLB为16的脱酰胺化玉米多肽乳液的长期稳定性。
表10.表9中的乳液/黄原胶混合物于4℃保存30天后的乳滴粒径和外观情况(n＝2)；油相为松节油(所需HLB＝16)
实施例7.用脱酰胺化玉米多肽制备油相为橄榄油(所需HLB＝7)的水包油乳液
将Z50-36h以10mg/mL的浓度分散在20mL去离子水中，加入4mol/L NaOH调节溶液的pH到4.75，加入5mL橄榄油，然后用高速均质机以10000rpm的转速均质1分钟得到粗乳液，将粗乳液用高压均质机在800bar压力下均质4分钟得到纳米乳液。将纳米乳液用相同pH的水溶液稀释500倍后测量其粒径、多分散系数和ζ-电位。表11的数据显示，Z50-36h具有很好的乳化橄榄油的能力，乳滴粒径约为200nm左右，粒径分布比较窄。由于橄榄油的所需HLB＝7与棉籽油的所需HLB＝6比较接近，在同样的乳化剂Z50-36h、同样的pH 4.75乳化条件下，油相为橄榄油的乳液性质(表11)与油相为棉籽油的乳液性质(表3)非常相似。
表11.油相为橄榄油(所需HLB＝7)的Z50-36h乳液性质(n＝3)；油相体积分数为20％，乳化剂在乳液中的终浓度为8mg/mL
| 乳化剂 | 乳化pH | 乳滴粒径(nm) | 多分散系数 | ζ-电位(mV) |
| Z50-36 | 4.75 | 204±2 | 0.15±0.02 | -43±1 |
。
实施例8.用油相为橄榄油的脱酰胺化玉米多肽乳液负载β-胡萝卜素以提高β-胡萝卜素的口服生物可给性
将β-胡萝卜素以25mg/mL的浓度分散于橄榄油中，将橄榄油于65℃避光加热20分钟，然后于室温避光搅拌至β-胡萝卜素完全溶解。将Z50-36h以10mg/mL的浓度分散在20mL去离子水中，加入4mol/L NaOH调节溶液的pH到4.75，加入5mL溶解了25mg/mLβ-胡萝卜素的橄榄油，然后用高速均质机以10000rpm的转速均质1分钟得到粗乳液，将粗乳液用高压均质机在800bar压力下均质4分钟得到纳米乳液。将纳米乳液用相同pH的水溶液稀释500倍后测量其粒径、多分散系数和ζ-电位。表12的结果显示，与不含β-胡萝卜素的乳液相比(表11)，含有β-胡萝卜素的Z50-36h乳液的乳滴粒径和粒径分布稍有增加。
表12.负载β-胡萝卜素的Z50-36h乳液性质(n＝3)；油相为溶解了25mg/mLβ-胡萝卜素的橄榄油，油相体积分数为20％，乳化剂在乳液中的终浓度为8mg/mL
| 乳化剂 | 乳化pH | 乳滴粒径(nm) | 多分散系数 | ζ-电位(mV) |
| Z50-36h | 4.75 | 245±13 | 0.24±0.03 | -41±1 |
将上述溶解了β-胡萝卜素的橄榄油溶液和乳液进行体外模拟消化。将胃蛋白酶和NaCl溶于pH 1.2的HCl水溶液中制备模拟胃液，其中胃蛋白酶浓度为3.2mg/mL，NaCl浓度为2.0mg/mL。将胰液素(蛋白酶：214USP.U/mg；淀粉酶：214USP.U/mg；脂肪酶：24.2USP.U/mg)和胆汁盐溶于10mmol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲液(含0.15mol/L NaCl)中制备模拟肠液，其中胰液素浓度为3.2mg/mL，胆汁盐浓度为25mg/mL。将β-胡萝卜素的橄榄油溶液与4倍体积的pH 4.75水溶液混合后再将混合液与模拟胃液等体积混合，将乳液直接与模拟胃液等体积混合，然后将消化溶液置于37℃、振荡频率为100rpm的恒温振荡器(THZ-82A，国华企业)中模拟胃部消化2小时。消化后用1mol/L的NaOH迅速将消化产物调节至pH 7.4，接着将消化产物分别与等体积的模拟肠液混合后置于恒温振荡器中模拟肠道消化2小时。消化结束后，加入125倍的乙醇/三氯甲烷混合溶剂(1/1，v/v)溶解消化产物和释放β-胡萝卜素，然后测量溶液中β-胡萝卜素的紫外-可见光吸收，得到消化产物中β-胡萝卜素的总质量。另外，将消化产物以12000rpm的转速离心45分钟，然后取出中间胶束层溶液，在胶束层溶液中加入125倍的乙醇/三氯甲烷混合溶剂溶解胶束和释放β-胡萝卜素，测量溶液中β-胡萝卜素的紫外-可见光吸收，得到消化产物中存在于胶束中的β-胡萝卜素总质量。通过下面公式计算β-胡萝卜素的口服生物可给性：
表13的数据显示，与制备时的β-胡萝卜素投入量相比，经过消化以后只有约80％的β-胡萝卜素可以被检测出来。根据文献【Food Hydrocolloids 35(2014)19-27】，从乳液或者油相中转移到胆酸胶束中的β-胡萝卜素可以被肠道吸收，这部分β-胡萝卜素称之为口服生物可给性β-胡萝卜素。表13的结果显示，在同样的消化条件下，负载在Z50-36h乳液中的β-胡萝卜素的口服生物可给性是β-胡萝卜素橄榄油溶液的3倍以上，证明了负载在脱酰胺化玉米多肽乳液中的β-胡萝卜素可以增加其口服生物可给性，即可以增加β-胡萝卜素的药效和营养效果。
表13.负载β-胡萝卜素的Z50-36h乳液和溶解了β-胡萝卜素的橄榄油溶液经2小时模拟胃液消化和2小时模拟肠液消化后的性质(n＝3)
Claims (6)
1.一种由亲水/疏水性质可调控的脱酰胺化玉米多肽作为乳化剂的水包油乳液，其特征在于，脱酰胺化玉米多肽为单一乳化剂，油相在所需HLB为6~18的范围内选择，油相可以溶解疏水药物和/或营养物，乳液具有长期稳定性；所述脱酰胺化玉米多肽由下述步骤制备得到：
（1）将玉米蛋白溶解于碱性水溶液中，其中玉米蛋白的浓度为1~500 mg/mL，溶液pH为11~14；
（2）将步骤（1）所制备的玉米蛋白碱性水溶液置于20~70℃条件下进行水解反应，反应时间为0.5~200小时；
（3）水解完成后，将步骤（2）所得到的水解液调节到pH 2.0~3.5，得到脱酰胺化玉米多肽沉淀，将沉淀洗涤干燥后得到脱酰胺化玉米多肽粉末。
2.根据权利要求1所述的水包油乳液，其特征在于，所述的脱酰胺化玉米多肽通过在碱性水溶液中水解玉米蛋白得到，所得到的脱酰胺化玉米多肽具有分子量分布宽、羧基分布不均匀的特点。
3.根据权利要求2所述的水包油乳液，其特征在于，所述的脱酰胺化玉米多肽通过调节水解时的蛋白浓度和碱浓度、水解温度、水解时间来调节脱酰胺化玉米多肽的平均分子量和平均羧基含量。
4.一种如权利要求1所述的水包油乳液的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）将脱酰胺化玉米多肽作为单一乳化剂加入水中，脱酰胺化玉米多肽的浓度为2~100mg/mL，在水溶液中加入碱调节pH至3.5~8.0，使多肽的部分羧基基团去质子化，从而使多肽带有一定的负电荷，得到水相溶液；
（2）将疏水药物和/或者营养物溶解在油相中，所述油相在所需HLB值为6~18范围内选择，以使疏水药物和/或者营养物在油相中有比较高的溶解度，疏水药物和/或者营养物的浓度为0.1~500 mg/mL；
（3）将上述步骤（1）制备的水相溶液和步骤（2）制备的油相溶液混合，油相溶液与水相溶液的体积比为1:（1~20）；通过高压均质方法制备水包油乳液，其中高压均质压力为400~1500 bar，高压均质时间为2~30分钟。
5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，进一步加入具有高黏度、凝胶和假塑性性质的水溶性多糖，以增加乳液的粘度，抑制乳滴上浮，使乳液保持均匀；多糖在乳液中的浓度为1~100 mg/mL。
6.如权利要求1所述的由亲水/疏水性质可调控的脱酰胺化玉米多肽作为乳化剂的水包油乳液在制备药物制剂、食品方面的应用。
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