CN112999161A - 一种杜仲京尼平苷酸复合纳米颗粒的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种杜仲京尼平苷酸复合纳米颗粒的制备方法，利用玉米醇溶蛋白独特的自组装特性，以多糖作为稳定剂，利用反溶剂共沉淀法制得玉米醇溶蛋白荷载京尼平苷酸复合纳米颗粒，操作简单、条件温和、成本较低、绿色环保，将京尼平苷酸包埋于蛋白纳米颗粒中，有效的增加其稳定性，改善其溶解度，所制的玉米醇溶蛋白荷载京尼平苷酸复合纳米颗粒粒径均匀，包埋率高，稳定性较好，提高了天然活性成分京尼平苷酸的生物利用率，解决了京尼平苷酸不稳定性和难溶解问题。

Description

一种杜仲京尼平苷酸复合纳米颗粒的制备方法
技术领域：
本发明涉及醇溶蛋白纳米颗粒技术领域，具体涉及一种杜仲京尼平苷酸复合纳米颗粒的制备方法。
背景技术：
京尼平苷酸(Geniposidic acid，GPA)是杜仲皮、叶和雄花中一种重要的天然活性物质，但是由于溶解度和稳定性的影响，在实际应用中往往会受到限制，很大程度影响其生物利用率。将天然的活性成分包埋至纳米级颗粒中是目前解决这一问题常用的方法。该方法可以保护不稳定活性成分在复杂环境中不被降解，将不溶于水的活性成分均匀的分散于水相中，改善活性成分的生物利用度。目前用于包埋天然活性成分的材料大多是来源于天然、安全以及易得的生物材料。天然生物材料具有优越的生物相容性和营养价值。蛋白质基纳米颗粒由于可以改善其稳定性和溶解性，所以可显著提升活性成分的生物利用度。玉米醇溶蛋(Zein)白作为玉米中的主要贮藏蛋白，含量可达50％～60％。Zein属于一种天然的蛋白质，具有良好的生物相容性和可降解性，被认为是安全的食品原料。Zein的结构与其理化特性和自组装机制紧密相关。玉米醇溶蛋白由于其高疏水性特性，自组装形成的胶体颗粒可作为包埋与递送活性物质的载体。玉米醇溶蛋白具有良好的生物相容性、自组装特性，被广泛应用在生物医药领域、纳米输送领域以及食品表面涂膜等领域。而且玉米醇溶蛋白在胃液中不易被消化，因此常用于运载基质包埋活性成分和营养物质，可以抵抗胃部强酸环境及各种酶的作用，使药物等在吸收位点缓释，达到靶向输送的目的。
反溶剂法快速简便，制备粒子粒径较小，且对设备要求较低，能耗较少，是目前实验室制备纳米颗粒的主要方法。在反溶剂过程中，溶剂和反溶剂的比例、混合速度以及溶液浓度等因素都会影响反溶剂的效果，此外，反溶剂法制备的纳米粒子在细胞粘附性，组织渗透性，延长消化到停留时间以及提高生物利用率，而且比微胶囊在这些方面具有明显的优势。
发明内容：
本发明的目的是提供一种杜仲京尼平苷酸复合纳米颗粒的制备方法，利用玉米醇溶蛋白独特的自组装特性，以多糖作为稳定剂，利用反溶剂共沉淀法制得玉米醇溶蛋白荷载京尼平苷酸复合纳米颗粒，操作简单、条件温和、成本较低、绿色环保，将京尼平苷酸包埋于蛋白纳米颗粒中，有效的增加其稳定性，改善其溶解度，所制的玉米醇溶蛋白荷载京尼平苷酸复合纳米颗粒粒径均匀，包埋率高，稳定性较好，提高了天然活性成分京尼平苷酸的生物利用率，解决了京尼平苷酸不稳定性和难溶解问题。
本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种杜仲京尼平苷酸复合纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：取玉米醇溶蛋白溶解于乙醇溶液，充分搅拌，完全溶解，加入京尼平苷酸，京尼平苷酸与玉米醇溶蛋白的质量比为1︰20～1︰100，在密闭环境中继续搅拌，直至澄清；加入多糖溶液，去离子水与玉米醇溶蛋白的体积比为5︰1～30︰1，玉米醇溶蛋白与多糖的质量比为15︰1～1︰15，室温搅拌均匀，通过减压浓缩去除乙醇，离心去除不溶物，调节pH为4，所得样品经真空冷冻干燥,，得到玉米蛋白荷载京尼平苷酸的复合纳米颗粒。
乙醇溶液体积分数为60％～80％(V/V)。所述京尼平苷酸溶液的pH为5～7。
搅拌为磁力搅拌，转速为1000-2000rpm，搅拌时间为0.5～2.0h。
所述多糖包括壳聚糖、阿拉伯胶、果胶和卡拉胶。
减压浓缩采用旋转蒸发，温度为40～50℃，转速40-80rpm。
所述真空冷冻干燥的条件为预冷时间6～12h，预冷温度-20～-40℃，冷冻干燥温度为-40～-60℃，冷冻时间为24～72h。
本发明的有益效果如下：
1、利用玉米醇溶蛋白独特的自组装特性，以多糖作为稳定剂，利用反溶剂共沉淀法制得玉米醇溶蛋白荷载京尼平苷酸复合纳米颗粒，操作简单、条件温和、成本较低、绿色环保，将京尼平苷酸包埋于蛋白纳米颗粒中，有效的增加其稳定性，改善其溶解度，所制的玉米醇溶蛋白荷载京尼平苷酸复合纳米颗粒粒径均匀，包埋率高，稳定性较好，提高了天然活性成分京尼平苷酸的生物利用率，解决了京尼平苷酸不稳定性和难溶解问题。
2、本申请使用的原料玉米醇溶蛋白属于玉米加工的副产物，相对于动物蛋白如乳球蛋白、牛血清蛋白、乳白蛋白，来源广泛，氨基酸组成和结构更特殊，成本低廉，通过控制pH、温度和时间改变分子柔性，利用不同有机介质提供不同极性介质环境从而得到不同的玉米醇溶蛋白纳米颗粒，不需要对蛋白进行额外的加工和修饰，制备过程简单，易于操作，不需要复杂的设备，易于推广。
附图说明：
图1是不同样品对DPPH自由基的清除率。
图2是不同样品对ABTS自由基的清除率。
具体实施方式：
以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：杜仲京尼平苷酸复合纳米颗粒的制备方法
准确称取0.2g玉米醇溶蛋白Zein溶解于10mL 80％(V/V)乙醇溶液，分别加入适量的京尼平苷酸，在25℃条件下，密闭环境中持续搅拌2h，至溶液澄清，所得样品混合溶液玉米醇溶蛋白与京尼平苷酸质量比为100∶1、80∶1、60∶1、40∶1和20∶1。放置于4℃过夜，使其充分水化合反应。配制1.0％果胶溶液在1500rpm磁力搅拌下，将果胶溶液注入含有京尼平苷酸的玉米醇溶蛋白Zein溶液中，继续搅拌10min使其充分混合，使其果胶含量为1.0％。在50℃60r/min下通过旋转蒸发减压浓缩除去乙醇，之后3000g离心5min除去少量不溶物，得到玉米醇溶蛋白Zein复合悬浮液。用1mol/LHCl或NaOH溶液调整溶液pH至4.0。通过真空冷冻干燥得到玉米醇溶蛋白荷载京尼平苷酸复合纳米颗粒。将纳米颗粒的浓度调整为0.5mg/mL，采用纳米粒度仪分析纳米颗粒的粒度和多分散系数。取蛋白纳米颗粒溶液适量置于离心管中，加入5mL甲醇溶液萃取，搅拌15min,充分混匀，经0.22μm有机膜过滤，取滤液经HPLC检测；取适量的复合纳米颗粒加入5mL甲醇，超声处理5min后，过膜，检测滤液中的复合纳米颗粒粒径与包埋率。结果如表1所示。
表1复合纳米颗粒粒径与包埋率实验结果
Figure BDA0002922051040000041
Figure BDA0002922051040000051
实施例2：对杜仲京尼平苷酸复合纳米颗粒的生物利用度进行评价
称取一定量的DPPH样品溶于乙醇，配制浓度为0.05mg/mL。制备待测样品溶液为1.0mg/mL，加入DPPH测试液2.0mL于10mL比色管中，依次加入样品溶液为100μL，再加入95％乙醇定容至6.0mL，混合均匀，避光反应30min，于517nm处检测其吸光度。实验组吸光度记为A1，空白组吸光度记为A0，根据公式计算不同样品对DPPH自由基的清除率。
Figure BDA0002922051040000052
配制4.9mM的过硫酸钾溶液和7.0mM的ABTS溶液，两者等体积混合。室温避光反应12-16h，形成ABTS自由基储备液。利用PBS(10mM，pH为7.40)对ABTS储备液进行稀释，直至在734nm条件下吸光度为0.7±0.02。并用PBS对复合纳米样品进行梯度稀释，得不同浓度的样品溶液。取0.2mL样品分散于4mLABTS自由基溶液中，混合均匀静置6min后，样品于734nm处检测吸光度值。实验组吸光度记为A1，空白组吸光度记为A0，根据公式计算不同样品对ABTS自由基的清除率。
Figure BDA0002922051040000053
由图1、2可知，实施例1玉米醇溶蛋白与京尼平苷酸不同比例制备得到的样品对DPPH和ABTS自由基均具有很好的清除效果，复合纳米颗粒不会影响京尼平苷酸的抗氧化活性，并且随着玉米醇溶蛋白比例的增加，对自由基的清除效果呈上升趋势。这也进一步说明活性物质京尼平苷酸被玉米醇溶蛋白包埋后不影响其抗氧化活性，并且其溶解度、稳定性和分散性均得到明显的改善，进而提高其生物利用率。

Claims (5)

1.一种杜仲京尼平苷酸复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：取玉米醇溶蛋白溶解于乙醇溶液，充分搅拌，完全溶解，加入京尼平苷酸，京尼平苷酸与玉米醇溶蛋白的质量比为1︰20～1︰100，在密闭环境中继续搅拌，直至澄清；加入去离子水或多糖溶液，去离子水与玉米醇溶蛋白的体积比为5︰1～30︰1，玉米醇溶蛋白与多糖的质量比为15︰1～1︰15，室温搅拌均匀，通过减压浓缩去除乙醇，离心去除不溶物，调节pH为4，所得样品经真空冷冻干燥,，得到玉米蛋白荷载京尼平苷酸的复合纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的杜仲京尼平苷酸复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，乙醇溶液体积分数为60％～80％。
3.根据权利要求1所述的杜仲京尼平苷酸复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述多糖包括壳聚糖、阿拉伯胶、果胶和卡拉胶。
4.根据权利要求1所述的杜仲京尼平苷酸复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，减压浓缩采用旋转蒸发，温度为40～50℃，转速40-80rpm。
5.根据权利要求1所述的杜仲京尼平苷酸复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述真空冷冻干燥的条件为预冷时间6～12h，预冷温度-20～-40℃，冷冻干燥温度为-40～-60℃，冷冻时间为24～72h。
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