CN110250518A - 一种水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法，包括，称取醇溶蛋白，将其溶解于乙醇水溶液中，常温搅拌得到醇溶蛋白溶液，称取卵磷脂，将其溶解于乙醇水溶液中，将植物甾醇溶解，取海藻酸钠，将其溶解于水中，加入到溶液中，磁力或机械搅拌得到混合溶液；加入到PH为4的水中，磁力或机械搅拌，蒸除乙醇，冷冻干燥，得到所述水溶性植物甾醇纳米颗粒。本发明制备的产品包埋率高，产品复溶性好，耐酸碱、离子强度等，能很好的应用于食品、药品中，大大提高了植物甾醇的应用范围。
Description
技术领域
本发明属于纳米颗粒技术领域，具体涉及一种水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法。
背景技术
植物甾醇是植物体内甾醇类化合物的统称，具有类胆固醇结构的功能性脂质。植物甾醇不溶于水，常温下微溶于无水乙醇、丙酮，易溶于氯仿、乙醚、乙酸乙酯以及石油醚等有机溶剂。
植物甾醇作为一种天然活性物质，具有许多特殊的功能特性。研究表明植物甾醇在降低血浆胆固醇、抗癌、抗氧化、抗炎和调节免疫功能等方面有着重要作用。2010年3月卫生部已批准植物甾醇为新资源食品，现行的中国居民膳食营养素参考摄入量建议普通人群植物甾醇的摄入量推荐值为900mg/d。植物甾醇的膳食来源主要包括植物油、水果蔬菜、坚果、谷物等。2007年中国疾控中心研究人员在《中国常见植物食物中植物甾醇的含量和居民摄入量初估》一文中估算我国居民膳食植物甾醇的摄入量仅为322mg/d，与DPIs推荐值相距甚远。因此其市场潜力非常巨大。此外，由于植物甾醇的水不溶性，微溶于有机溶剂，熔点高等特点，大大限制了其在食品中的应用。因此如何提高植物甾醇的水溶解性是扩大其应用的关键性技术。
目前国内外制备的水溶性植物甾醇粒多用水溶性蛋白(大豆分离蛋白、乳清分离蛋白、酪蛋白酸钠等)于植物甾醇等疏水性生物活性物质通过乳化-蒸发技术制备成纳米颗粒，该方法简单，提高了活性物质在水相中的溶解性，但是水溶性蛋白的亲水性，使其不具备较好的缓释作用和长久的稳定性，且冷冻过程会破坏纳米粒结构，导致产品包埋率不高。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。
因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法，其包括，
(1)按照固液比为(0.1～10)：100g/mL的比例称取醇溶蛋白，将其溶解于乙醇水溶液中，常温搅拌得到醇溶蛋白溶液；
(2)按照卵磷脂：蛋白质量比为(0.1～1)：2g/g的比例称取卵磷脂，将其溶解于步骤(1)的乙醇水溶液中，得到卵磷脂-醇溶蛋白乙醇水溶液；
(3)按照固液比为(5～15)：1g/L的比例将植物甾醇溶解于步骤(2)所得的溶液中，得到卵磷脂-醇溶蛋白-植物甾醇乙醇水溶液；
(4)按照固液比为(5～25)：1mg/mL的比例称取海藻酸钠，将其溶解于水中，常温下搅拌得到海藻酸钠溶液；
(5)将步骤(4)所得海藻酸钠溶液按照海藻酸钠溶液：卵磷脂-醇溶蛋白-植物甾醇乙醇水溶液的体积比为1：(1～10)加入到步骤(3)溶液中，磁力或机械搅拌得到混合溶液；
(6)将步骤(5)得到的混合溶液按与水的体积比为1：(5～10)的比例加入到PH为4的水中，磁力或机械搅拌1h获得分散液；
(7)将步骤(6)所得分散液中的乙醇蒸除，冷冻干燥，得到所述水溶性植物甾醇纳米颗粒。
作为本发明所述的水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法的一种优选方案：所述醇溶蛋白，为玉米醇溶蛋白，其分子量25～29kDa。
作为本发明所述的水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法的一种优选方案：所述步骤(1)中，固液比为(2～4)：100g/mL，所述常温搅拌，时间为4～5h。
作为本发明所述的水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法的一种优选方案：所述步骤(1)中，所述乙醇水溶液，乙醇与水的体积比为(75～85)：100。
作为本发明所述的水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法的一种优选方案：所述卵磷脂，为大豆卵磷脂，卵磷脂：蛋白质量比为(0.5～0.7)：2。
作为本发明所述的水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法的一种优选方案：所述步骤(3)中，固液比为(5～10)：1g/L；所述将植物甾醇溶解于步骤(2)所得的溶液中，为40～50℃加热、磁力或机械搅拌下溶解。
作为本发明所述的水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法的一种优选方案：所述步骤(4)中，固液比为(10～12)：1mg/mL；所述的搅拌时间为4.3～5h。
作为本发明所述的水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法的一种优选方案：步骤(5)中，体积比为1：(9～10)；所述的搅拌，转速为800～1200rpm。
作为本发明所述的水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法的一种优选方案：所述步骤(7)中，所述冷冻干燥，时间为24～48h。
作为本发明所述的水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法的一种优选方案：所述步骤(7)中，蒸除乙醇的方法为，45℃、-0.04～0.10MPa真空度下蒸发去除乙醇。
本发明的有益效果：本发明采用醇溶蛋白包埋植物甾醇，利用疏水性蛋白的疏水作用力使的纳米颗粒无需硬化就可以在水相体系中保持完整性；在蛋白溶液中加入卵磷脂，利用蛋白与卵磷脂之间的疏水作用和静电作用，以及卵磷脂溶解形成的磷脂双分子层嵌入蛋白结构中，包埋的甾醇稳定性提高，并且平均粒径减小；发明人发现，加入的水溶性多糖与蛋白之间的静电相互作用解决了植物甾醇水溶性差的问题，并且提高了植物甾醇纳米粒稳定性，还能大大提高产品再复溶性和抗氧化能力。本发明采用难容性蛋白质、卵磷脂、多糖包埋植物甾醇经冻干后制备的纳米颗粒，所选用的材料在食品体系中广泛应用，天然安全，且具有营养价值高、功能性好、安全无毒等优点。此外，与现有技术相比，本发明制备的产品包埋率高，产品复溶性好，耐酸碱、离子强度等，能很好的应用于食品、药品中，大大提高了植物甾醇的应用范围。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为植物甾醇的累积释放随时间的变化图。
图2为添加海藻酸钠和不添加海藻酸钠制得的纳米颗粒耐PH稳定性实验图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
本发明水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法，具体步骤如下：
(1)按照固液比为(0.1～10)：100g/mL的比例称取醇溶蛋白，将其溶解于乙醇水溶液中，常温搅拌得到醇溶蛋白溶液；
本发明醇溶蛋白为玉米醇溶蛋白(分子量25～29kDa)；
(2)按照卵磷脂：蛋白质量比为(0.1～1)：2g/g的比例称取卵磷脂，将其溶解于步骤(1)的乙醇水溶液中，得到卵磷脂-醇溶蛋白乙醇水溶液；
(3)按照固液比为(5～15)：1g/L的比例将植物甾醇溶解于步骤(2)所得的溶液中，得到卵磷脂-醇溶蛋白-植物甾醇乙醇水溶液；
(4)按照固液比为(5～25)：1mg/mL的比例称取多糖，将其溶解于水中，常温下搅拌得到多糖溶液；
所述的多糖为海藻酸钠或壳聚糖(低粘度：＜200mPa.s)；
(5)将步骤(4)所得多糖溶液按照体积比为1：(1～10)的比例加入到步骤(3)溶液中，磁力或机械搅拌得到混合溶液；
(6)将步骤(5)得到的混合溶液按体积比为1：(5～10)的比例加入到PH为4的水中，磁力或机械搅拌1h获得分散液；
(7)将步骤(6)所得分散液中乙醇蒸除，冷冻干燥，得到水溶性醇溶蛋白-植物甾醇纳米颗粒。
步骤(7)中所述混合溶液蒸除乙醇的方式为45℃、-0.04～0.10MPa真空度下蒸发去除；所述的冷冻干燥前，还添加去离子水加到与去除乙醇的混合溶液前相同的质量。
优选的，步骤(1)所述的固液比为(2～4)：100g/mL；所述乙醇水溶液，乙醇与水的体积比为(75～85)：100mL/mL；所述的搅拌时间为3～6h。
优选的，步骤(2)所述的卵磷脂为大豆卵磷脂；卵磷脂：蛋白质量比(0.5～0.7)：2g/g。
优选的，步骤(3)所述的固液比为(5～10)：1g/L；所述的将植物甾醇分散于步骤(2)是在40～50℃加热、磁力或机械搅拌下充分溶解。
优选的，步骤(4)所述的固液比为(10～20)：1mg/mL；所述的搅拌时间为4～6h。
优选的，步骤(5)所述的体积比为1：(2～10)；所述的搅拌转速为800～1200rpm。
优选的，步骤(7)所述的冷冻干燥时间为24～48h。
发明人研究发现，本发明醇溶蛋白-卵磷脂-植物甾醇-海藻酸钠的添加顺序对于制得颗粒的稳定性、粒径大小、复溶性、包埋率、溶解度性能十分重要。本发明采用醇溶蛋白包埋植物甾醇，利用疏水性蛋白的疏水作用力使得纳米颗粒无需硬化就可以在水相体系中保持完整性；在蛋白溶液中加入卵磷脂，利用蛋白与卵磷脂之间的疏水作用和静电作用，以及卵磷脂溶解形成的磷脂双分子层嵌入蛋白结构中，包埋的甾醇稳定性提高，并且平均粒径减小；发明人发现，加入的水溶性多糖与蛋白之间的静电相互作用解决了植物甾醇以及难容蛋白水溶性差的问题，并且提高了植物甾醇纳米粒稳定性，还能大大提高产品再复溶性和抗环境能力。
实施例1：
(1)按照固液比为2：100g/mL的比例称取玉米醇溶蛋白，将其溶解于80％乙醇水溶液中，常温搅拌4h，最后离心去除大颗粒和不溶物，得到玉米醇溶蛋白溶液；
(2)按照卵磷脂：蛋白质量比为0.5：2g/g的比例称取卵磷脂，将其溶解于步骤(1)的乙醇水溶液中，得到卵磷脂-醇溶蛋白乙醇水溶液；
(3)按照固液比为10：1g/L的比例将植物甾醇溶解于步骤(2)所得的溶液中，42℃下搅拌得到醇溶蛋白-卵磷脂-植物甾醇乙醇水溶液；
(4)按照固液比为10：1mg/mL的比例称取海藻酸钠，将其溶解于水中，常温下搅拌5h，磁力或机械搅拌转速800rpm，之后离心去除大颗粒和不溶物，得到海藻酸钠溶液；
(5)将步骤(4)所得海藻酸钠溶液按照体积比为1：10的比例加入到步骤(3)溶液中，磁力或机械搅拌转速800rpm，搅拌2h，得到混合溶液；
(6)将步骤(5)得到的混合溶液按体积比为1：5的比例加入到PH为4的水中，磁力或机械搅拌1h获得分散液，磁力或机械搅拌转速800rpm；
(7)将步骤(6)所得分散液中乙醇在45℃，-0.09MPa真空度下蒸发去除，然后添加去离子水加到与去除乙醇的混合溶液前相同的质量，最后冷冻干燥24h，得到水溶性醇溶蛋白-植物甾醇纳米颗粒。
实施例2：
(1)按照固液比为4：100g/mL的比例称取玉米醇溶蛋白，将其溶解于85％乙醇水溶液中，常温搅拌5h，最后离心去除大颗粒和不溶物，得到玉米醇溶蛋白溶液；
(2)按照卵磷脂：蛋白质量比为0.7：2g/g的比例称取卵磷脂，将其溶解于步骤(1)的乙醇水溶液中，得到卵磷脂-醇溶蛋白乙醇水溶液；
(3)按照固液比为10：1g/L的比例将植物甾醇溶解于步骤(2)所得的溶液中，45℃下搅拌得到卵磷脂-醇溶蛋白-植物甾醇乙醇水溶液；
(4)按照固液比为12：1mg/mL的比例称取海藻酸钠，将其溶解于水中，常温下搅拌4.3h后，离心去除大颗粒和不溶物，得到海藻酸钠溶液；
(5)将步骤(4)所得海藻酸钠溶液按照体积比为1：9的比例加入到步骤(3)溶液中，磁力或机械搅拌转速800rpm，搅拌2h，得到混合溶液；
(6)将步骤(5)得到的混合溶液按体积比为1：5的比例加入到PH为4的水中，磁力或机械搅拌1.2h获得分散液；
(7)将步骤(6)所得分散液中乙醇在45℃，-0.10MPa真空度下蒸发去除，然后添加去离子水加到与去除乙醇的混合溶液前相同的质量，最后冷冻干燥28h，得到水溶性醇溶蛋白-植物甾醇纳米颗粒。
实施例3：
(1)按照固液比为2：100g/mL的比例称取玉米醇溶蛋白，将其溶解于80％乙醇水溶液中，常温搅拌4h，最后离心去除大颗粒和不溶物，得到玉米醇溶蛋白溶液；
(2)按照固液比为10：1g/L的比例将植物甾醇溶解于步骤(1)所得的溶液中，45℃下搅拌得到醇溶蛋白-植物甾醇乙醇水溶液；
(3)按照固液比为10：1mg/mL的比例称取海藻酸钠，将其溶解于水中，常温下搅拌5h后，离心去除大颗粒和不溶物，得到海藻酸钠溶液；
(4)将步骤(3)所得海藻酸钠溶液按照体积比为1：10的比例加入到步骤(2)溶液中，磁力或机械搅拌转速800rpm，搅拌2h，得到混合溶液；
(5)将步骤(4)得到的混合溶液按体积比为1：5的比例加入到PH为4的水中，磁力或机械搅拌1h获得分散液；
(6)将步骤(5)所得分散液中乙醇在45℃，-0.09MPa真空度下蒸发去除，然后添加去离子水加到与去除乙醇的混合溶液前相同的质量，最后冷冻干燥24h，得到水溶性醇溶蛋白-植物甾醇纳米颗粒。
实施例4：
(1)按照固液比为2：100g/mL的比例称取玉米醇溶蛋白，将其溶解于80％乙醇水溶液中，常温搅拌4h，最后离心去除大颗粒和不溶物，得到玉米醇溶蛋白溶液；
(2)按照卵磷脂：蛋白质量比为1：2g/g的比例称取卵磷脂，将其溶解于步骤(1)的乙醇水溶液中，得到卵磷脂-醇溶蛋白乙醇水溶液；
(3)按照固液比为10：1g/L的比例将植物甾醇溶解于步骤(2)所得的溶液中，45℃下搅拌得到卵磷脂-醇溶蛋白-植物甾醇乙醇水溶液；
(4)按照固液比为10：1mg/mL的比例称取海藻酸钠，将其溶解于水中，常温下搅拌6h后，离心去除大颗粒和不溶物，得到海藻酸钠溶液；
(5)将步骤(4)所得海藻酸钠溶液按照体积比为4：10的比例加入到步骤(3)溶液中，磁力或机械搅拌转速1200rpm，搅拌4h，得到混合溶液；
(6)将步骤(5)得到的混合溶液按体积比为1：5的比例加入到PH为6的水中，磁力或机械搅拌3.5h获得分散液；
(7)将步骤(6)所得分散液中乙醇在45℃，-0.09MPa真空度下蒸发去除，然后添加去离子水加到与去除乙醇的混合溶液前相同的质量，最后冷冻干燥40h，得到水溶性醇溶蛋白-植物甾醇纳米颗粒。
实施例5(对照例)：
参照实施例1的步骤，将步骤(1)所述的玉米醇溶蛋白改为麦醇溶蛋白，其余步骤、参数均不变。
实施例6(对照例)：
本实施例与实施例1的区别在于：
(1)按照固液比为1：100g/mL的比例称取卵磷脂，将其溶解于80％乙醇水溶液中，得到卵磷脂乙醇水溶液；
(2)按照卵磷脂：玉米醇溶蛋白质量比为0.5：2g/g的比例称取蛋白，将其溶解于步骤(1)的卵磷脂乙醇水溶液中，得到卵磷脂-醇溶蛋白乙醇水溶液；
(3)按照固液比为10：1g/L的比例将植物甾醇溶解于步骤(2)所得的溶液中，42℃下搅拌得到卵磷脂-醇溶蛋白-植物甾醇乙醇水溶液；
步骤(4)及之后的步骤、参数与实施例1相同。
实施例7(对照例)：
本实施例与实施例1的区别在于：
(1)按照固液比为1：100g/mL的比例称取卵磷脂，将其溶解于80％乙醇水溶液中，离心去除大颗粒和不溶物得到卵磷脂乙醇水溶液；
(2)按照固液比为10：1g/L的比例将植物甾醇溶解于步骤(1)所得的溶液中，42℃下搅拌得到卵磷脂-植物甾醇乙醇水溶液；
(3)按照卵磷脂：玉米醇溶蛋白质量比为0.5：2g/g的比例称取玉米醇溶蛋白，将其溶解于步骤(2)的卵磷脂-植物甾醇乙醇水溶液中，离心去除大颗粒和不溶物得到醇溶蛋白-卵磷脂-乙醇水溶液；
步骤(4)以及之后的步骤、参数与实施例1相同。
实施例8(对照例)：
本实施例与实施例1的区别在于：
(1)按照固液比为2：100g/mL的比例称取玉米醇溶蛋白，将其溶解于80％乙醇水溶液中，常温搅拌4h，最后离心去除大颗粒和不溶物，得到玉米醇溶蛋白溶液；
(2)按照固液比为10：1g/L的比例将植物甾醇溶解于步骤(1)所得的溶液中，42℃下搅拌得到醇溶蛋白-植物甾醇乙醇水溶液；
(3)按照卵磷脂：玉米醇溶蛋白质量比为0.5：2g/g的比例称取卵磷脂，将其溶解于步骤(2)的玉米醇溶蛋白植物甾醇乙醇水溶液中，得到醇溶蛋白-卵磷脂-乙醇水溶液；
步骤(4)以及之后的步骤、参数与实施例1相同。
实施例9(对照例)：
(1)按照固液比为2：100g/mL的比例称取玉米醇溶蛋白，将其溶解于80％乙醇水溶液中，常温搅拌4h，最后离心去除大颗粒和不溶物，得到玉米醇溶蛋白溶液；
(2)按照卵磷脂：玉米醇溶蛋白质量比为0.5：2g/g的比例称取卵磷脂，将其溶解于步骤(1)的玉米醇溶蛋白溶液乙醇水溶液中，得到卵磷脂-醇溶蛋白乙醇水溶液；
(3)按照固液比为10：1mg/mL的比例称取海藻酸钠，将其溶解于水中，常温下搅拌5h后，离心去除大颗粒和不溶物，得到海藻酸钠溶液；
(4)将步骤(4)所得海藻酸钠溶液按照体积比为1：10的比例加入到步骤(2)溶液中，磁力或机械搅拌转速800rpm，搅拌2h，得到海藻酸钠-卵磷脂-玉米醇溶蛋白混合溶液；
(5)按照固液比为10：1g/L的比例将植物甾醇溶解于步骤(4)所得的混合溶液中，42℃下搅拌得到海藻酸钠-卵磷脂-醇溶蛋白-植物甾醇乙醇水溶液；
(6)将步骤(5)得到的混合溶液按体积比为1：5的比例加入到PH为4的水中，磁力或机械搅拌1h获得分散液；
(7)将步骤(6)所得分散液中乙醇在45℃，-0.09MPa真空度下蒸发去除，然后添加去离子水加到与去除乙醇的混合溶液前相同的质量，最后冷冻干燥24h，得到纳米颗粒。
实施例10(对照例)：
参照实施例1的步骤，将步骤(4)所述中的海藻酸钠改为壳聚糖(低粘度：＜200mPa.s)，其余步骤、参数均不变。
实施例11(对照例)：
参照实施例1的步骤，将实施例1的步骤(4)和(5)省略，具体步骤如下：
(1)按照固液比为2：100g/mL的比例称取玉米醇溶蛋白，将其溶解于80％乙醇水溶液中，常温搅拌4h，最后离心去除大颗粒和不溶物，得到玉米醇溶蛋白溶液；
(2)按照卵磷脂：玉米醇溶蛋白质量比为0.5：2g/g的比例称取卵磷脂，将其溶解于步骤(1)的玉米醇溶蛋白溶液乙醇水溶液中，得到卵磷脂-醇溶蛋白乙醇水溶液；
(3)按照固液比为10：1g/L的比例将植物甾醇溶解于步骤(2)所得的溶液中，42℃下搅拌得到卵磷脂-醇溶蛋白-植物甾醇乙醇水溶液；
(4)将步骤(3)得到的混合溶液按体积比为1：5的比例加入到PH为4的水中，磁力或机械搅拌1h获得分散液；
(5)将步骤(4)所得分散液中乙醇在45℃，-0.09MPa真空度下蒸发去除，然后添加去离子水加到与去除乙醇的混合溶液前相同的质量，最后冷冻干燥24h，得到纳米颗粒。
实验结果：
体外模拟肠胃消化实验，精确称取纳米颗粒样品加入到50毫升离心管中，加入10毫升胃蛋白酶-HCl溶液(0.05M HCl中含有2.5mg/mL胃蛋白酶)，加入5颗1cm-3的玻璃珠。将样品在37℃的摇动(100rpm)水浴中温育120min。收集15,30,60,90和120min时的等份消化混合物进行分析，并通过用干冰快速冷冻来终止胃消化。
120分钟后，用1mL 0.5M NaOH和5mL胆汁溶液(30mg/mL胆汁提取物在0.1M PBS缓冲液中，pH＝6.5)和5mL胰酶溶液(2.5mg/mL胰酶在0.1中)中和溶液。随后将样品在37℃的摇动(100rpm)水浴中温育120min。收集消化混合物在30,60,90和120min时的等分试样进行分析，并通过用干冰快速冷冻来终止肠消化。
模拟植物甾醇纳米颗粒在模拟胃液(0～120min)和肠道(120～240min)中植物甾醇的累积释放随时间的变化，如图1所示，图1中，A为实施例1制备的海藻酸钠-玉米醇溶蛋白-卵磷脂植物甾醇纳米颗粒，B为实施例10制备的壳聚糖-玉米醇溶蛋白-卵磷脂植物甾醇纳米颗粒。从图1实验结果可知，海藻酸钠-玉米醇溶蛋白-卵磷脂植物甾醇纳米颗粒较于壳聚糖-玉米醇溶蛋白-卵磷脂植物甾醇纳米颗粒和海藻酸钠-麦醇溶蛋白-卵磷脂植物甾醇纳米颗粒，其在肠道中的释放率显著更高，可达90％，说明选择海藻酸钠作为组分之一显著更优。PH稳定性实验：取适量新鲜纳米分散液稀释后，与等量的10mM柠檬酸-磷酸缓冲液混合，PH计测量调制PH＝2.0-8.0，然后用多角度粒度与高灵敏度Zeta电位粒度仪测得粒径的变化，结果如图2所示。
由图2可知，添加有海藻酸钠的纳米分散液粒径变化较小，有更好的抗PH能力。
多角度粒度与高灵敏度Zeta电位粒度仪测得植物甾醇纳米颗粒干燥前后的粒径、PDI以及Zeta电位大小：植物甾醇纳米分散液稀释适当倍数测定粒径、PDI和电位值，纳米颗粒以适宜浓度溶解、稀释，测量温度设定为25℃,将含纳米分散体的比色皿直接放入模块中进行测量。最终的纳米颗粒大小和多分散性指数计算为两次测量的平均值,每个测量值是5次运行的平均值。
气相质谱联用(GC-MS)测定植物甾醇的含量：将制备的纳米分散液在1，000rpm下离心15min，取上清液200微升于15mL离心管中，加入0.1mg/mL5αg胆甾烷醇0.5mLm作为内标，加入3mL2mol/L的KOH乙醇溶液，85℃皂化1h，冷却后加入2mL水和5mL正己烷，离心，提取上清液收集于离心管中，下清液与5mL正己烷提取两次，合并上清液，水洗，氮吹，BSTFA75℃衍生化30min后，冷却，过膜，气质分析结果，计算甾醇含量。包埋率计算公式如下：
包埋率(％)＝(1-A/B)×100
式中，A：气质测得的甾醇含量，B：纳米分散液中甾醇含量
植物甾醇纳米颗粒水溶解度的测定：取一定量的冻干纳米颗粒溶解于水中，使得样品达到过饱和状态，充分振荡10min,37℃摇床振荡平衡24h后，10000rpm离心10min，取上层清液，GC-MS测定其中植物甾醇含量。
植物甾醇水溶解度＝上层清液中植物甾醇总含量(mg)/溶液总体积(mL)
结果如表1和表2所示：
表1醇溶蛋白、多糖包埋植物甾醇颗粒干燥前后理化性质表征
表2醇溶蛋白、多糖包埋植物甾醇颗粒包埋率和溶解度
| 包埋率(％) | 溶解度(mg/mL) | |
| 实施例1 | 98.62 | 3.125 |
| 实施例2 | 97.68 | 3.048 |
| 实施例3 | 85.23 | 2.017 |
| 实施例4 | 80.14 | 0.568 |
| 实施例5 | 67.31 | 0.153 |
| 实施例6 | 85.14 | 1.578 |
| 实施例7 | 88.45 | 1.635 |
| 实施例8 | 84.36 | 1.047 |
| 实施例9 | - | |
| 实施例10 | 91.35 | 2.139 |
| 实施例11 | 78.59 | 1.287 |
见上表，实施例9将植物甾醇最后加入到溶液中制得的分散液浑浊，说明包埋效果不理想，且根据对比，多糖溶液在最后加入最佳；根据实施例1和实施例5，玉米醇溶蛋白较于麦醇溶蛋白有更好的包埋率和稳定性，玉米醇溶蛋白制备的纳米颗粒包埋率较高，最高可达98.6％，且复溶后粒径变化较小，产品再分散性好；根据实施例6、7得出最佳的投料顺序为醇溶蛋白、卵磷脂、植物甾醇、海藻酸钠，制得的产品质量最优，溶解度可到达3.125mg/mL，将其添加到食品中，可以在很大程度上满足人体每日所需的植物甾醇摄入量。
综上，本发明采用难容性蛋白质、卵磷脂、多糖包埋植物甾醇经冻干后制备的纳米颗粒，所选用的材料在食品体系中广泛应用，天然安全，且具有营养价值高、功能性好、安全无毒等优点。此外，与现有技术相比，本发明制备的产品包埋率高，产品复溶性好，耐酸碱、离子强度等，能很好的应用于食品、药品中，大大提高了植物甾醇的应用范围。
本发明的制备方法所涉及的生产工艺简单、安全，且本发明对所用溶剂进行回收，是一种绿色的生产技术，适用于大规模生产。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法，其特征在于：包括，
(1)按照固液比为(0.1～10)：100g/mL的比例称取醇溶蛋白，将其溶解于乙醇水溶液中，常温搅拌得到醇溶蛋白溶液；
(2)按照卵磷脂：蛋白质量比为(0.1～1)：2g/g的比例称取卵磷脂，将其溶解于步骤(1)的乙醇水溶液中，得到卵磷脂-醇溶蛋白乙醇水溶液；
(3)按照固液比为(5～15)：1g/L的比例将植物甾醇溶解于步骤(2)所得的溶液中，得到卵磷脂-醇溶蛋白-植物甾醇乙醇水溶液；
(4)按照固液比为(5～25)：1mg/mL的比例称取海藻酸钠，将其溶解于水中，常温下搅拌得到海藻酸钠溶液；
(5)将步骤(4)所得海藻酸钠溶液按照海藻酸钠溶液：卵磷脂-醇溶蛋白-植物甾醇乙醇水溶液的体积比为1：(1～10)加入到步骤(3)溶液中，磁力或机械搅拌得到混合溶液；
(6)将步骤(5)得到的混合溶液按与水的体积比为1：(5～10)的比例加入到PH为4的水中，磁力或机械搅拌1h获得分散液；
(7)将步骤(6)所得分散液中的乙醇蒸除，冷冻干燥，得到所述水溶性植物甾醇纳米颗粒。
2.如权利要求1所述的水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述醇溶蛋白，为玉米醇溶蛋白，其分子量25～29kDa。
3.如权利要求1或2所述的水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，固液比为(2～4)：100g/mL，所述常温搅拌，时间为4～5h。
4.如权利要求3所述的水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述乙醇水溶液，乙醇与水的体积比为(75～85)：100。
5.如权利要求1或2所述的水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述卵磷脂，为大豆卵磷脂，卵磷脂：蛋白质量比为(0.5～0.7)：2。
6.如权利要求1或2所述的水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，固液比为(5～10)：1g/L；所述将植物甾醇溶解于步骤(2)所得的溶液中，为40～50℃加热、磁力或机械搅拌下溶解。
7.如权利要求1或2所述的水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中，固液比为(10～12)：1mg/mL；所述的搅拌时间为4.3～5h。
8.如权利要求1或2所述的水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤(5)中，体积比为1：(9～10)；所述的搅拌，转速为800～1200rpm。
9.如权利要求1或2所述的水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤(7)中，所述冷冻干燥，时间为24～48h。
10.如权利要求9所述的水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤(7)中，蒸除乙醇的方法为，45℃、-0.04～0.10MPa真空度下蒸发去除乙醇。
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