CN114983969A - 一种纳米粒子复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于纳米材料及其制备技术领域，涉及一种纳米粒子复合物及其制备方法，包括运载体蛋白、稳定剂、活性物质、润湿剂和反润湿剂；运载体蛋白为富硒黑豆蛋白或玉米醇溶蛋白，活性物质异荭草素、白藜芦醇、β‑胡萝卜素或姜黄素，稳定剂为果胶、阿拉伯胶或壳聚糖，润湿剂为70％乙醇溶液；所述反润湿剂为超纯水。本发明提供的纳米粒子复合物生物利用率高、活性物质的释放精度和速率均大幅提高，水溶性好。能够抑制细胞毒性，对DPPH和ABTS+具有抗氧化的能力，能够用于食品行业和医药领域中。

Description

一种纳米粒子复合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于纳米材料及其制备技术领域，涉及一种纳米粒子复合物及其制备方法和应用。
背景技术
随着学者对天然活性物质研究的不断深入，虽然发现天然活性物质具有众多的功能活性，但是研究还发现部分天然活性物质存在水溶性差、生物利用率低、很难被人体吸收等缺陷，从而限制天然活性物质在食品行业中的应用；同时还发现部分天然活性物质化学性质不稳定，容易光解等，导致其在有光的环境下其生物活性大大降低，限制了其在医药行业中的应用。
近年来有研究发现，利用蛋白质及多糖构建纳米营养递送载体，能提高食品活性物质稳定性及生物利用率。纳米营养递送载体是一种直径小于1000nm，可以输送营养物质的纳米体系，主要包含纳米粒子、纳米乳液、胶束、水凝胶、脂质体和纳米聚合物等类型。
纳米粒子营养递送体系与其他营养递送系统相比具有巨大的优势：1)具有尺寸效应和体内分布特异性。纳米载体体积更加微小，能够直接作用于体内某些蛋白质和细胞，控制营养物质的释放位置，提高营养物质的生物利用率；2)具有缓释效果，改善胃肠道吸收；通过设计纳米递送体系的结构，可控制营养成分的释放速度，满足人体对营养物质的持续需求；3)可以增强营养物质的透过性，进而充分发挥营养成分的功能活性；4)可以提高活性物质的稳定性，从而提高其可利用率。
但是目前研究报道的纳米营养递送体系存在包封率和负载量均较低、突释现象显著等问题，从而限制了纳米营养递送载体的实际应用。
发明内容
针对背景技术中存在的生物利用率低以及突释现象显著的技术问题，本发明提供一种纳米粒子复合物及其制备方法，生物利用率高、活性物质的释放精度和速率均大幅提高，水溶性好。
本发明提供的纳米粒子复合物，能够抑制细胞毒性，对DPPH和ABTS+具有抗氧化的能力，能够用于食品行业和医药领域中。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种纳米粒子复合物，包括运载体蛋白、稳定剂、活性物质、润湿剂和反润湿剂；所述运载体蛋白、活性物质和稳定剂的质量比为10：1～10：5～1；所述运载体蛋白与润湿剂的质量体积比为1g：20ml；所述润湿剂和反润湿剂体积比为1：40ml。
所述运载体蛋白为富硒黑豆蛋白或玉米醇溶蛋白。
所述活性物质异荭草素、白藜芦醇、β-胡萝卜素或姜黄素。
所述稳定剂为果胶、阿拉伯胶或壳聚糖。
所述润湿剂为70％乙醇溶液；所述反润湿剂为超纯水。
一种所述的纳米粒子复合物的制备方法，包括以下步骤：
1)按照所述的比例准备各原料；
2)将步骤1)的润湿剂与运载体蛋白混合，搅拌均匀得到蛋白原液；
3)取步骤1)的活性物质和步骤2)的蛋白原液混合，温度40℃～50℃下搅拌均匀，得到活性物质-蛋白混合液；所述活性物质-蛋白混合液中，活性物质的质量浓度为0.055g/ml；
4)将步骤1)的稳定剂与步骤1)的部分反润湿剂，按照用量比1g：5ml混合，温度40℃～50℃下搅拌均匀制备成稳定剂原液；
5)取步骤2)的蛋白原液和步骤3)的活性物质-蛋白混合液依次加入剩余的反湿润剂中，分散均匀后，再继续加入步骤4)的稳定剂原液，搅拌均匀，调节pH为4±0.2，3000r/min离心10min，去除大颗粒反应物后经冷冻干燥得到纳米粒子复合物；所述纳米粒子复合物中，运载体蛋白与稳定剂的质量比为1：2。
一种所述的纳米粒子复合物及纳米粒子复合物的消化液在抑制细胞毒性方面的应用。
一种所述的纳米粒子复合物及纳米粒子复合物的消化液在提高活性物质生物利用率方面的应用。
一种所述的纳米粒子复合物及纳米粒子复合物的消化液在清除DPPH自由基方面的应用。
一种所述的纳米粒子复合物及纳米粒子复合物的消化液在清除ABTS+自由基方面的应用。
本发明的有益效果是：
1、本发明提供的纳米粒子复合物，具有尺寸小、比表面积大、亲水性能较好的优点，为活性物质在体内的释放提供了纳米级的反应空间，巨大的比表面积能够大幅提高活性物质的释放精度和释放速率，提高活性物质的生物利用率；还具有良好的生物安全性，可以作为其他生物利用度较低的活性物质的载体。
3、本发明提供的纳米粒子复合物是将活性物质负载于运载体蛋白/稳定剂上，能提高活性物质的生物利用率，能增加活性物质的水溶性，更加容易被人体吸收，对于活性物质具有更好的保护作用，能更好的发挥活性物质的功效；此外纳米粒子复合物，在经过胃肠道消化后，生物利用率也得到提升。尤其是采用异荭草素制成的纳米粒子复合物，在经过胃肠道消化后，生物利用率可达95％，与单纯异荭草素的生物利用率(75％)相比，其生物利用率得到显著提高。
3、本发明提供的纳米粒子复合物能够很好地抑制细胞毒性，具有良好的生物安全性；实验发现，纳米粒子复合物胃肠道消化后的消化液同样能够抑制细胞毒性，而且具有抗氧化能力，对DPPH自由基和ABTS+自由基有很好的清除作用，能够在食品行业和医药领域中应用。
4、本发明提供的纳米粒子复合物，制备过程简单，条件温和，容易实现复合物产业化生产。
附图说明
图1为玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子及异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物的合成图；
图2为异荭草素及异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物的紫外吸收光谱图；
图3为异荭草素及异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物的傅里叶红外光谱图；
图4为异荭草素及异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物的扫描电镜图；
图5为异荭草素及异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物对CaCo-2细胞活力的作用；
图6为异荭草素及异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物经消化后对CaCo-2细胞活力的作用；
图7异荭草素的高效液相色谱图；
图8为异荭草素及异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物胃消化模拟后的生物利用率；
图9为异荭草素及异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物肠道消化模拟后的生物利用率；
图10为异荭草素及异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物模拟体内吸收利用的生物利用率对比图；
图11为异荭草素及异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物胃消化模拟后对DPPH的抗氧化作用；
图12为异荭草素及异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物肠道消化模拟后对DPPH的抗氧化作用；
图13为异荭草素及异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物胃消化模拟后对ABTS+的抗氧化作用；
图14为异荭草素及异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物肠道消化模拟后对ABTS+的抗氧化作用。
具体实施方式
现结合附图以及实施例对本发明做详细的说明。
本发明提供的纳米粒子复合物，包括运载体蛋白、稳定剂、活性物质、润湿剂和反润湿剂。
本发明中，运载体蛋白为富硒黑豆蛋白或玉米醇溶蛋白。活性物质异荭草素、白藜芦醇、β-胡萝卜素或姜黄素。稳定剂为果胶、阿拉伯胶或壳聚糖；润湿剂为70％乙醇溶液；反润湿剂为超纯水。
本发明选取的原料具有以下特性和功能，具体如下。
富硒黑豆蛋白：黑豆是豆科大豆属植物大豆的黑色种子，富硒黑豆是一种硒含量相对丰富的黑豆；黑豆中的营养元素极为丰富，含有优质蛋白质、维生素、蛋黄素、核黄素、黑色素等，其中，蛋白质含量高达36％～40％，具有抗氧化、降低胆固醇、缓解疲劳，辅助降血脂等功能；硒元素是大多数微生物、动物及人类所需的必要微量元素，由于土壤中硒分布不均，引起硒元素缺乏，硒蛋白食品是一种良好的补充方式，环境中的硒元素可通过植物的生物转化富集在植物体内，且生物利用率较高。
玉米醇溶蛋白：玉米醇溶蛋白是从玉米中提取的一类醇溶性蛋白质，作为一种天然的生物大分子材料，不溶于水，能不同程度的溶于50％～90％乙醇溶液溶于高浓度碱液，分子结构含有大量的疏水氨基团和极性氨基团。玉米醇溶蛋白其独特溶解性和特有的两亲性，在外界环境的诱导下可以发生自组装形成具有包埋运载功能的纳米粒子，作为食品活性成分和药物输送载体，但在其等电点附近粒子的疏水性强，静电作用力弱，易发生聚集，沉淀，对其应用造成了极大限制。
阿拉伯胶：阿拉伯胶是一种具有低蛋白质结构的多支链多糖，能通过非共价键相与蛋白质发生络合，可以使载体蛋白的网络结构得到强化，提高蛋白质的稳定性，提高其耐酸碱盐性。有蛋白质骨架的高分子多糖溶解度高、粘度低在很大的pH值范围内均可以很好地稳定酪蛋白酸钠和牛乳蛋白。
果胶：果胶是一类广泛存在于植物细胞壁的初生壁和细胞中间片层的杂多糖，果胶主要是一类以D-半乳糖醛酸(D-Galacturonic Acids，D-Gal-A)由a-1,4-糖苷键连接组成的酸性杂多糖，除D-Gal-A外，还含有L-鼠李糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖等中性糖，此外还含有D-甘露糖、L-岩藻糖等多达12种的单糖，不过这些单糖在果胶中的含量很少。果胶作为一种高档的天然食品添加剂和保健品，可广泛应用于食品、医药保健品和一些化妆品中。果胶可以通过pH进行改性，作为纳米颗粒稳定剂，可以很好的控制包埋药品的释放。
壳聚糖：壳聚糖为天然高分子，是天然多糖甲壳素脱除部分乙酰基的产物，来源丰富，价格低廉，具有无毒、抑菌性、生物相容性、细胞亲和性和可降解性等优点，并且是蛋白纳米粒子优良的稳定剂，可以为蛋白提供空间位阻作用及静电稳定效应，有效防止蛋白在等电点附近或干燥后发生聚集。
异荭草素：(3’,4’,5,7-四羟基黄酮-6-O-β-D-吡喃葡糖糖苷或木犀草素6-C-葡萄糖苷)，是一种黄酮化合物，分子式为C21H20O11，分子量为448.38；异荭草素固体是淡黄色粉末，在山楂、苦菜、西番莲等植物中广泛存在，具有抗氧化、抑制肝癌细胞增殖、抗菌、抗炎等功效，但其存在水溶性差，易光解的特点，造成异荭草素的稳定性差，生物利用率低等，将其负载于蛋白纳米颗粒上，可提高异荭草素的生物利用率。
白藜芦醇：白藜芦醇是一种天然的植物多酚，广泛存在于各种植物种，如花生，葡萄皮，蓝莓等；白藜芦醇是植物在抵抗寄生虫和其他不利条件，如紫外线辐射，化学物质损伤等所产生的抗毒素，大量研究表明，白藜芦醇具有很强的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗衰老、保护肝脏、抗癌等，但其容易受到外界环境干扰而化学降解，且水溶性差，造成单纯白藜芦醇的生物可利用率低，利用纳米输送体系，负载白藜芦醇有利于克服这些缺点，提高白藜芦醇的可利用度。
β-胡萝卜素：类胡萝卜素是人体必需的饮食成分，人类无法自身合成，需要外源补充，β-胡萝卜素作为维生素A前体的主要摄取来源，具备较高的抗氧化活性，同时还具有保护细胞、防止组织免受自由基破坏、预防癌症降低心血管疾病，皮肤病，癌症、眼科疾病的风险等功效，β-胡萝卜素中共轭多不饱和双键的存在,使其在室温下不溶于水，微溶于油并且结构极不稳定，在光照、有氧和较高温度(>50℃)下，容易出现降解和异构化等，造成其生物利用率低，从而大大限制了其在食品领域及医学领域的应用。
姜黄素：姜黄色素是从姜黄根茎中提出的一种天然性多酚类物质，可作为着色剂广泛用于饮料、糕点、冰淇淋等食品中，是最有开发价值的天然食用黄色素之一，此外，与合成的添加剂相比。姜黄色素还具有更广泛的生物活性。但姜黄色素在水中的溶解度很低，仅为11nq/mL，生物利用率低，影响其生物功效不利于其在水溶性食品中的应用。而在中性，碱性条件以及光照下姜黄素会快速降解丧失其鲜喜的色泽，因此可以利用纳米封装技术对姜黄素包埋，提高其活性成分的水溶性及生物利用率，阻止活性成分因各种外在因素造成的化学或生物降解，屏蔽异味并改善物质的风味，还可以控制活性成分特定环境下的释放速度。
乙醇：在常温常压下是一种易挥发的无色透明液体，低毒性，纯液体不可直接饮用，乙醇能与水以任意比互溶，能与氯仿、乙醚、甲醇、丙酮和其他多数有机溶剂混溶。乙醇分子中羟基的极性使得很多离子化合物可溶于乙醇中，非极性的烃基使得乙醇也可溶解一些非极性的物质，例如玉米醇溶蛋白在70％乙醇中有良好的溶解度。
基于上述各物质的功效，本发明提供的纳米粒子复合物中，运载体蛋白、活性物质和稳定剂的质量比为10：1～10：5～1；运载体蛋白与润湿剂的质量体积比为1g：20ml；润湿剂和反润湿剂体积比为1ml：40ml。在此范围内形成的纳米粒子复合物能提高活性物质的生物利用率。
本发明提供的纳米粒子复合物的制备方法，包括以下步骤：
1)按照上述比例准备各原料；
2)将步骤1)的润湿剂与运载体蛋白混合，搅拌均匀得到蛋白原液；
3)取步骤1)的活性物质和步骤2)的蛋白原液混合，温度40℃～50℃下搅拌均匀，得到活性物质-蛋白混合液；所述活性物质-蛋白混合液中，活性物质的质量浓度为0.055g/ml；
4)将步骤1)的稳定剂与步骤1)的部分反润湿剂，按照用量比1g：5ml混合，温度40℃～50℃下搅拌均匀制备成稳定剂原液；
5)取步骤2)的蛋白原液和步骤3)的活性物质-蛋白混合液依次加入剩余的反湿润剂中，分散均匀后，再继续加入步骤4)的稳定剂原液，搅拌均匀，调节pH为4±0.2，3000r/min离心10min，去除大颗粒反应物后经冷冻干燥得到纳米粒子复合物；所述纳米粒子复合物中，运载体蛋白与稳定剂的质量比为1：2。
本发明提供的纳米粒子复合物，尺寸小，比表面积大，为活性物质在体内的释放提供纳米级的反应空间，能够大幅提高活性物质的释放精度和释放速率，提高活性物质生物利用率，抑制细胞毒性；且制备的纳米粒子复合物水溶性较好，更加容易被人体吸收，在经过胃肠道的消化后，消化液提高活性物质的生物利用率；消化液也能够抑制细胞毒性，且对自由基DPPH和ABTS+均有很好的清除作用，具有明显的抗氧化能力。
以下面以几组具体的实施例说明本发明提供的纳米粒子复合物的优越性。
实施例1
本实施例提供的纳米粒子复合物，包括运载体蛋白、稳定剂、活性物质、润湿剂和反润湿剂。
本实施例中，运载体蛋白为玉米醇溶蛋白，稳定剂为阿拉伯胶，活性物质为异荭草素，润湿剂为70％乙醇溶液，反润湿剂为超纯水。
本实施例中，各原料的质量分数为：玉米醇溶蛋白与润湿剂的用量比为1g：20ml。
本实施例中，活性物质-蛋白纳米颗粒复合物的制备方法包括以下步骤：
1)准备相应质量的各个原料；
2)润湿剂(70％乙醇溶液)与运载体蛋白(玉米醇溶蛋白)按照20ml：1g的用量比混合，搅拌30min得到蛋白原液；
3)取步骤2)的蛋白原液与活性物质(异荭草素)混合，混合时运载体蛋白与异荭草素的质量比为10g：1g，在40℃条件下，搅拌60min，混合均匀得到活性物质-蛋白混合原液，即异荭草素-玉米醇溶蛋白混合液；
4)将稳定剂(阿拉伯胶)与反润湿剂(超纯水)按照1g：5ml混合，在40℃下，搅拌60min，混合均匀得到稳定剂原液；
5)将步骤2)的蛋白原液及步骤3)的活性物质-蛋白混合液依次加入剩余的反润湿剂中，分散均匀，将步骤4)中的稳定剂原液分别加入到两个分散体系中，搅拌60min，混合均匀并调整体系的pH为4，在3000r/min速度下离心10min，去除分散体系中的大颗粒物质后冷冻干燥，得到异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物，其中，运载体蛋白与稳定剂的质量比为1：2。
本实施例中，步骤2)的蛋白原液中，玉米醇溶蛋白质量浓度为5％。
本实施例中，步骤3)异荭草素-玉米醇溶蛋白混合液中，异荭草素质量浓度为0.055g/ml(蛋白原液：异荭草素＝10ml：1g)，阿拉伯胶的质量浓度为20％。
参见图1，分别为异荭草素-玉米醇溶蛋白混合液以及异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物反应过程中的实物图。
实施例2～实施例9
实施例2～实施例9中，与实施例1不同的是，原料的配比不同，具体参见表1；其余均相同。
表1实施例2～9提供的原料配比
Figure BDA0003688076820000071
Figure BDA0003688076820000081
实施例2～实施例9提供的纳米粒子复合物制备方法与实施例1相同。
实施例10～实施例12
实施例10、实施例11以及实施例12与实施例1不同的是活性物质分别用白藜芦醇、β-胡萝卜素或姜黄素替换，对应得到白藜芦醇-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物、β-胡萝卜素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物和姜黄素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物。
实施例13～实施例16
实施例13与实施例1不同的是，运载体蛋白可替换为富硒黑豆蛋白，得到异荭草素-富硒黑豆蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物。
实施例14与实施例10不同的是，运载体蛋白可替换为富硒黑豆蛋白，得到白藜芦醇-富硒黑豆蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物。
实施例15与实施例11不同的是，运载体蛋白可替换为富硒黑豆蛋白，得到β-胡萝卜素-富硒黑豆蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物。
实施例16与实施例12不同的是，运载体蛋白可替换为富硒黑豆蛋白，得到姜黄素-富硒黑豆蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物。
上述实施例中，稳定剂还可替换为果胶或壳聚糖。运载体蛋白：稳定剂在10：1～2：1范围内任意选择；玉米醇溶蛋白：异荭草素在10：1～1：1范围内任意选择。
为了验证本发明的纳米粒子复合物的性能，进行以下试验验证。
说明：说明书附图中，ISO表示异荭草素，Zein/GA表示玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米颗粒；Zein/GA-ISO表示异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物；Zein/GA-ISO-NPS中的NPS表示纳米颗粒。
试验1
选择玉米醇溶蛋白、阿拉伯胶及异荭草素作为纳米颗粒制备的原料。
实验组：实施例1制备的异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物
对照组1：纯异荭草素
上述两个组别的物质分别进行紫外光谱检测得到紫外谱图，参见图2。
上述两个组别的物质分别进行紫外和傅里叶红外光谱检测，和傅里叶红外光谱图，参见图3。
由图2和图3可知，异荭草素的红外光谱在3334.53cm-1和2956.98cm-1处有其独特的峰，属于异荭草素的O-H和C-H基团，C＝O、C＝C和芳香C＝C的峰值分别出现在1615.12、1304.83和1451.43cm-1处。异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物的红外光谱显示了所有的特征性峰在各自的位置，吸光度发生一定程度的变化。证明，异荭草素成功负载到了玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子上，形成异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物。
试验2
选择玉米醇溶蛋白、阿拉伯胶及异荭草素作为纳米颗粒制备的原料。
实验组：实施例1制备的异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物。
对照组：按照实施例1方法制备的玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子。
上述两组样品分别采用透射电镜仪器，得到透射电镜图，结果如图4所示。
参见图4可知，异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物呈圆球状。通过比较，发现在相同的放大视野下，玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子要略小于异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物颗粒，更容易被吸收利用。
试验3纳米粒子复合物及其消化液的生物安全性试验
以异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物及其消化液为例。
实验组：实施例1制备的异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物。
对照组1：游离的异荭草素
对照组2：实施例1制备的玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子
空白对照组。
采用CCK-8试剂盒测定对照组1、对照组2和实验组及这几组物质经胃肠道消化后的消化液对CaCo-2人克隆结肠癌细胞的细胞活力，试验时，分别取相同浓度的各组物质作用在CaCo-2人克隆结肠癌细胞，测定细胞活力，结果如图5所示。
由图5可知，异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物作用后，CaCo-2人克隆结肠癌细胞的细胞活力为137.99％，异荭草素作用后，CaCo-2人克隆结肠癌细胞的细胞活力为126.86％，表明异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物对CaCo-2人克隆结肠癌细胞的细胞活力没有影响，异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物不会对CaCo-2人克隆结肠癌细胞产生毒性，说明本发明制备的异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物具有良好生物安全性。
进一步的，分别取游离异荭草素、异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物经肠、胃消化后的消化液作用在CaCo-2人克隆结肠癌细胞后，细胞活力，结果参见图6所示。
由图6可知，游离异荭草素经胃消化后的消化液作用在CaCo-2人克隆结肠癌细胞后，细胞活力为133.78％，异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物经胃消化后的消化液作用在CaCo-2人克隆结肠癌细胞后，细胞活力为133.41％。
游离异荭草素经肠消化后的消化液作用在CaCo-2人克隆结肠癌细胞后，细胞活力为162.89％，异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物经肠消化后的消化液作用在CaCo-2人克隆结肠癌细胞后，细胞活力为165.3％，即本发明所制备的纳米粒子复合物颗粒在经过胃、肠道的消化作用后仍具有良好的生物安全性。
试验4纳米粒子复合物的生物利用率
以异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物为例。
实验组：实施例1制备异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物
对照组：异荭草素
模拟体外胃液消化阶段：将冻干的纳米粒子复合物和单纯异荭草素粉末分别溶解在超纯水中形成两份溶液，然后再分别与模拟胃液(用HCl调节pH至1.2的超纯水，含有50mmol/L的NaCl和3.2mg/mL胃蛋白酶)等比例混合，并用NaOH溶液将所得混合物调节至pH为2.5，放入37℃的恒温摇床中以100rpm转速保温消化，分别于0min、30min、60min、90min和120min时取出样品，并将样品放入90℃恒温水浴锅里终止消化。终止消化后的样品均4000r/min离心20min，取上清液，待测。
模拟体外肠液的消化阶段：按模拟胃液步骤消化2h后，取出样品，调节pH至7.0，加入0.1875g胆盐、0.144g胰酶，于37℃、110r/min恒温搅拌消化，整个模拟肠液消化阶段以恒定pH滴定仪自动滴定(CNaOH＝0.05mol/L)，使消化液pH值始终维持在7.0，从加入胰酶开始计时，于30min、60min、120min、180min时，把样品迅速放入90℃水浴锅5min终止消化。终止消化后的样品均4000r/min离心20min，取上清液，待测。
利用高效液相色谱在一定条件下，得到ISO特征峰，结果见图7A所示；测定峰面积，建立异荭草素标准品的标准曲线，结果如图7B所示。通过建立高效液相色谱的ISO标准曲线，计算ISO在模拟胃肠道消化液中的浓度，以得到ISO及Zein/GA-ISO纳米颗粒复合物的生物利用率。
以测定消化液中异荭草素的浓度，利用以下公式，分别计算肠液消化液和胃消化液中的异荭草素的生物利用率，结果参见图8、图9和图10。
异荭草素的生物利用率(％)＝消化液中异荭草素浓度/消化前异荭草素的浓度
由图8和图9可知，异荭草素及异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物的生物利用率图可知，在不同的时间段，模拟胃液中纳米颗粒负载的异荭草素释放率均大于单纯异荭草素在模拟胃液中的释放率(p<0.05)。模拟消化2小时后，异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物中释放的异荭草素的浓度67.12％约为单纯异荭草素浓度57.37％的1.17倍，造成这种差异的原因首先是经过前期研究表明，异荭草素本身的水溶性较差，而复合后的异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物水溶性相较于单纯异荭草素有所提高，因此，该复合纳米粒子在模拟胃液中有较好的溶解度；其次，利用激光粒度仪测定纳米粒子的粒径约为200nm，属于纳米级，具有极高的表面积，增加了异荭草素在模拟胃液中的分散程度，导致经过胃消化后异荭草素纳米粒子的可利用率显著高于单纯的异荭草素。而整个胃液消化阶段，玉米醇溶蛋白纳米颗粒负载的异荭草素的释放率达到了67.12％，表明在PH为2的酸性条件下，纳米颗粒的蛋白发生了一定程度的水解，同时由于阿拉伯胶具有稳定性，导致在120min消化过程内异荭草素释放率趋于稳定，且未完全释放。
在模拟小肠消化阶段，同胃液消化阶段结果相似，纳米颗粒中异荭草素的释放率高于游离异荭草素的释放率(p<0.05)，模拟肠液消化30min时，纳米颗粒负载的异荭草素释放率由67％提高到了85％，这是由于在中性PH条件下玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子与异荭草素的静电作用力减弱，使得纳米颗粒中的玉米醇溶蛋白更容易被胰蛋白酶水解，造成异荭草素释放量的逐渐增加。参见图10可知，当肠消化180min时，纳米粒子复合物的生物利用率可达95％，单纯异荭草素的生物利用率(75％)。说明，异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物显著提高了游离异荭草素的生物利用率，可使得发挥异荭草素更好的功能活性。
试验5纳米粒子复合物模拟消化后对DPPH自由基的清除作用
以异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物为例。
实验组：实施例1制备的经胃肠道模拟消化的异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物
对照组：经模拟胃、肠道消化后的异荭草素
前期实验发现，经过胃肠道模拟消化后的异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子的生物利用率高达95％，但经过消化后其抗氧化性如何仍需重新评价。DPPH是一种有机氮自由基，带有单个电子，异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子及游离异荭草素可以通过与其结合达到清除的目的。
分别将经过模拟胃液、肠液消化后的异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子及异荭草素稀释成0倍、1倍、2倍，4倍，待用。
分别取50μL不同浓度的样品溶液，加入到200μL的DPPH乙醇溶液中，充分混合，避光反应30min后，分别在517nm处测定其吸光度，空白组用超纯水代替样品液，对照组用无水乙醇代替DPPH乙醇溶液，计算DPPH自由基清除率，结果如图11和图12所示。
DPPH自由基清除率(％)＝(1-(样品吸光度-对照组吸光度)/空白组吸光度)×100％
参见图11和图12可知，在胃液中，未经稀释的异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子消化液及游离异荭草素消化液对DPPH自由基的清除率分别为86.88％与82.25％，在肠道中，未经稀释的异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子消化液及游离异荭草素消化液对DPPH自由基的清除率分别为57.5％和53.25％。试验结果表明，消化后的异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子对DPPH自由基的清除率呈现剂量-效应关系，且相同浓度下，异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米颗粒消化液的DPPH自由基清除率均高于游离异荭草素的DPPH自由基清除率。
结果表明经过胃肠道消化后的异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子对DPPH自由基仍然具有较强的抗氧化活性。
试验6纳米粒子复合物模拟消化后对ABTS+自由基的清除作用
以异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物为例。
实验组：实施例1制备的经胃、肠道模拟消化的异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物
对照组：经模拟胃、肠道消化后的异荭草素
ABTS+自由基水溶液呈蓝绿色，当溶液中存在抗氧化剂时，ABTS+自由基会与其反应使溶液褪色，褪色程度反应该抗氧化剂抗氧化活性的大小。
将试验5稀释好的溶液分别取50μL加入到200μL的ABTS+溶液中，避光反应6min后在734nm处测其吸光度。空白组用超纯水代替样品液，对照组用超纯水代替ABTS+溶液。ABTS+自由基清除率按如下公式计算：
ABTS+自由基清除率(％)＝(1-(样品吸光度-对照组吸光度)/空白组吸光度)×100％
根据上述分别计算ABTS+自由基清除率，结果参见图13和图14。
参见图13和图14可知，随着稀释倍数的增加，经消化后的异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物对ABTS+的抗氧化活性明显降低，呈现剂量-效应关系，当稀释倍数为0时，经胃液消化后的异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子对ABTS+的清除率为90.11％，经胃液消化后的游离异荭草素对ABTS+的清除率为85.95％；经肠液消化后的异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子对ABTS+的清除率为81.2％，经肠液消化后的游离异荭草素对ABTS+的清除率为69.06％。
由此可见，经过胃消化后和肠道消化后的异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物对ABTS+的清除能力强于消化后游离的异荭草素。
因此，本发明的异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物可用来抑制细胞毒性，对细胞毒性的抑制效果显著，具有良好的生物安全性；同时，经过消化后的异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物显著提高了异荭草素的生物利用率，可以达到95％，且对DPPH和ABTS+自由基仍具有良好的清除效果，具有良好的抗氧化活性，可以使得异荭草素更好地应用在医药领和食品领域。
上述纳米粒子复合物的性能试验是以异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物为例实现的，当所选用实施例2～实施例16提供的纳米粒子复合物以及本发明提供的其它纳米粒子复合物进行安全性试验、生物利用率试验、消化后对DPPH自由基的清除试验以及消化后对ABTS+自由基的清除试验，其效果与异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米粒子复合物的实验结果相近。表明本发明提供的包括运载体蛋白、稳定剂、活性物质、润湿剂和反润湿剂的纳米粒子复合物；进一步的，运载体蛋白为富硒黑豆蛋白或玉米醇溶蛋白；活性物质异荭草素、白藜芦醇、β-胡萝卜素或姜黄素；稳定剂为果胶、阿拉伯胶或壳聚糖，润湿剂为70％乙醇溶液；所述反润湿剂为超纯水，制备而成的纳米粒子复合物生物利用率高、活性物质的释放精度和速率均大幅提高，水溶性好，能够抑制细胞毒性，对DPPH和ABTS+具有抗氧化的能力，能够用于食品行业和医药领域中。

Claims (10)

1.一种纳米粒子复合物，其特征在于，包括运载体蛋白、稳定剂、活性物质、润湿剂和反润湿剂；所述运载体蛋白、活性物质和稳定剂的质量比为10：1～10：5～1；所述运载体蛋白与润湿剂的质量体积比为1g：20ml；所述润湿剂和反润湿剂体积比为1：40ml。
2.根据权利要求1所述的纳米粒子复合物，其特征在于，所述运载体蛋白为富硒黑豆蛋白或玉米醇溶蛋白。
3.根据权利要求1所述的纳米粒子复合物，其特征在于，所述活性物质异荭草素、白藜芦醇、β-胡萝卜素或姜黄素。
4.根据权利要求1所述的纳米粒子复合物，其特征在于，所述稳定剂为果胶、阿拉伯胶或壳聚糖。
5.根据权利要求1所述的纳米粒子复合物法，其特征在于，所述润湿剂为70％乙醇溶液；所述反润湿剂为超纯水。
6.一种如权利要求1所述的纳米粒子复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)按照权利要求1所述的比例准备各原料；
2)将步骤1)的润湿剂与运载体蛋白混合，搅拌均匀得到蛋白原液；
3)取步骤1)的活性物质和步骤2)的蛋白原液混合，温度40℃～50℃下搅拌均匀，得到活性物质-蛋白混合液；所述活性物质-蛋白混合液中，活性物质的质量浓度为0.055g/ml；
4)将步骤1)的稳定剂与步骤1)的部分反润湿剂，按照用量比1g：5ml混合，温度40℃～50℃下搅拌均匀制备成稳定剂原液；
5)取步骤2)的蛋白原液和步骤3)的活性物质-蛋白混合液依次加入剩余的反湿润剂中，分散均匀后，再继续加入步骤4)的稳定剂原液，搅拌均匀，调节pH为4±0.2，3000r/min离心10min，去除大颗粒反应物后经冷冻干燥得到纳米粒子复合物；所述纳米粒子复合物中，运载体蛋白与稳定剂的质量比为1：2。
7.一种如权利要求1所述的纳米粒子复合物及纳米粒子复合物的消化液在抑制细胞毒性方面的应用。
8.一种如权利要求1所述的纳米粒子复合物及纳米粒子复合物的消化液在提高活性物质生物利用率方面的应用。
9.一种如权利要求1所述的纳米粒子复合物及纳米粒子复合物的消化液在清除DPPH自由基方面的应用。
10.一种如权利要求1所述的纳米粒子复合物及纳米粒子复合物的消化液在清除ABTS+自由基方面的应用。
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