CN115737596A - 一种共载姜黄素-白藜芦醇醇溶蛋白颗粒及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于蛋白质复合物纳米颗粒制备技术领域，具体涉及一种共载姜黄素‑白藜芦醇醇溶蛋白颗粒及制备方法，该颗粒为姜黄素和白藜芦醇通过分子相互作用力结合整体外部包裹醇溶蛋白的核壳结构，将醇溶蛋白和所载的活性物质共同溶于碱性溶液中，稳定剂也溶于碱性溶液中，然后将醇溶蛋白‑活性物质混合液加入到稳定剂中进行搅拌，随后调节pH至中性，形成载活性物质的醇溶蛋白颗粒，具有操作简便，稳定性好，且适合大规模生产的特点，可用于食品，医药，化妆品和保健品等领域。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质复合物纳米颗粒制备技术领域，具体涉及一种共载姜黄素-白藜芦醇醇溶蛋白颗粒及制备方法。
背景技术
众所周知，多酚是一类广泛的植物次生代谢产物，包括许多单体的化合物，在食物和膳食补充剂中含量丰富。这些化合物对健康的促进作用，如良好的抗氧化活性，预防心血管疾病和治疗癌症，已经被许多学术界和工业界的科学家记录在案。近年来，关于多酚在健康衰老中的作用，特别是在神经退行性变和认知改善方面的研究有了很大的进展。然而，相当多的多酚是高度疏水(不溶于水)，半衰期短，化学不稳定，经常导致口服生物利用度差。水溶性差的问题可以通过将它们封装在设计良好的运载工具中来解决。在这种情况下，纳米颗粒更小的表面使封装的多酚暴露在较低的环境压力水平下，缓释特性有助于维持稳定的血液浓度，减少毒副作用，从而获得更高的口服生物利用度和增强的治疗效果。
pH循环法已经广泛用于醇溶蛋白纳米颗粒的制备，以及越来越多的研究者利用pH循环法制备醇溶蛋白纳米颗粒用于姜黄素的封装。2016年以pH循环法首次应用在醇溶蛋白复合纳米颗粒的制备上，发展至今，多种黄酮类化合物已经实现了有效的包封，然而至今未发现对白藜芦醇的装载。我们前期的研究发现单载白藜芦醇的醇溶蛋白颗粒存在包封率低和储存稳定性差的缺点。
发明内容
本发明的目的是解决上述现有技术的不足，提供一种结构简单、稳定性高、包埋率高的共载姜黄素-白藜芦醇醇溶蛋白颗粒及制备方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种共载姜黄素-白藜芦醇醇溶蛋白颗粒，其特征在于该颗粒为姜黄素和白藜芦醇通过分子相互作用力结合整体外部包裹醇溶蛋白的核壳结构。
本发明所述的颗粒尺寸为50−120 nm，多分散性小于0.3。
一种共载姜黄素-白藜芦醇醇溶蛋白颗粒的制备方法，其特征在于该制备方法的具体步骤如下：
（1）、将醇溶蛋白、白藜芦醇和姜黄素共同加入到碱性溶液中，搅拌至完全溶解得到混合液A；
（2）、取水溶性稳定剂加入到碱性溶液中搅拌至完全溶解得到混合液B；
（3）、将步骤（1）中混合液A在搅拌条件下加入步骤（2）中的混合液B中，通过搅拌形成混合液C；
（4）、加入酸调节步骤（3）得到的混合液C调节pH至中性，形成的分散液离心去除大颗粒和未包封的活性物质，获得共载姜黄素-白藜芦醇醇溶蛋白溶液，干燥后得到共载姜黄素-白藜芦醇醇溶蛋白颗粒。
本发明所述的步骤（1）中所述的醇溶蛋白为植物提取或市售常规醇溶蛋白，醇溶蛋白的浓度范围为0.2%~4%（w/v）。
本发明所述的步骤（1）中所述的白藜芦醇浓度范围为0.01~2%（w/v），姜黄素浓度范围为0.01~2%（w/v）。
本发明所述的水溶性稳定剂包括干酪素钠、乳清分离蛋白、白蛋白和大豆分离蛋白中的一种或多种，水溶性稳定剂浓度范围为0.05~5%（w/v）。
本发明所述的步骤（3）中混合液A相和混合液B相按照体积比计算，即混合液A相比混合液B相为1：1~8的比例范围。
本发明所述的步骤（4）中的酸为有机或者无机酸，包括但不限定于盐酸，硫酸，柠檬酸和植酸。
本发明所述的步骤（1）和步骤（2）中所述的碱性溶液为氢氧化钠溶液。
本发明所述的步骤（1）中首先在碱性溶液中溶解醇溶蛋白，然后在碱性的醇溶蛋白中添加姜黄素和白藜芦醇。
本发明由于采用上述结构和制备方法，具有结构简单、稳定性高、包埋率高等优点。
附图说明
图1是实施例中载活性物质醇溶蛋白颗粒红外分析图。
图2是实施例中醇溶蛋白颗粒的XRD图。
图3是实施例中醇溶蛋白颗粒中活性物质的体外释放图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进一步说明：
如附图所示，一种共载姜黄素-白藜芦醇醇溶蛋白颗粒，其特征在于该颗粒为姜黄素和白藜芦醇通过分子相互作用力结合整体外部包裹醇溶蛋白的核壳结构。
进一步，所述的颗粒尺寸为50−120 nm，多分散性小于0.3。
一种共载姜黄素-白藜芦醇醇溶蛋白颗粒的制备方法，其特征在于该制备方法的具体步骤如下：
（1）、将醇溶蛋白、白藜芦醇和姜黄素共同加入到碱性溶液中，搅拌至完全溶解得到混合液A；
（2）、取水溶性稳定剂加入到碱性溶液中搅拌至完全溶解得到混合液B；
（3）、将步骤（1）中混合液A在搅拌条件下加入步骤（2）中的混合液B中，通过搅拌形成混合液C；
（4）、加入酸调节步骤（3）得到的混合液C调节pH至中性，形成的分散液离心去除大颗粒和未包封的活性物质，获得共载姜黄素-白藜芦醇醇溶蛋白溶液，干燥后得到共载姜黄素-白藜芦醇醇溶蛋白颗粒。
进一步，所述的步骤（1）中所述的醇溶蛋白为植物提取或市售常规醇溶蛋白，醇溶蛋白的浓度范围为0.2%~4%（w/v）。
进一步，所述的步骤（1）中所述的白藜芦醇浓度范围为0.01~2%（w/v），姜黄素浓度范围为0.01~2%（w/v）。
进一步，所述的水溶性稳定剂包括干酪素钠、乳清分离蛋白、白蛋白和大豆分离蛋白中的一种或多种，水溶性稳定剂浓度范围为0.05~5%（w/v）。
进一步，所述的步骤（3）中混合液A相和混合液B相按照体积比计算，即混合液A相比混合液B相为1：1~8的比例范围。
进一步，所述的步骤（4）中的酸为有机或者无机酸，包括但不限定于盐酸，硫酸，柠檬酸和植酸。
进一步，所述的步骤（1）和步骤（2）中所述的碱性溶液为氢氧化钠溶液。
进一步，所述的步骤（1）中首先在碱性溶液中溶解醇溶蛋白，然后在碱性的醇溶蛋白中添加姜黄素和白藜芦醇。
上述所述的醇溶蛋白具有多种氨基酸组成，组装形成的颗粒具有不同疏水区域，可以实现对活性物质进行极性诱导包埋。姜黄素与醇溶蛋白形成非共价键改变了醇溶蛋白构型有助于白藜芦醇的包埋。
本发明主要是针对醇溶蛋白纳米颗粒包埋白藜芦醇具有稳定性差和包埋率低的问题，利用共载姜黄素得方法提高白藜芦醇的包埋率和稳定下，提高药物的稳定性靶向性和生物利用度。
本发明利用醇溶蛋白，白藜芦醇和姜黄素在碱性条件下溶解并形成分子间相互作用力，而在中性条件下聚合，并利用生物大分子之间的作用力，采用pH-循环法制备了共载白藜芦醇-姜黄素醇溶蛋白颗粒。优点在于由于姜黄素的存在，醇溶蛋白构型发生变化，构型变化使得醇溶蛋白更有利于对白藜芦醇的包埋。本发明提供的纳米粒子可作为药物或者功能因子的保护和递送。
实施例1
将1 g玉米醇溶蛋白溶于100 mL 25 mmol/L氢氧化钠水溶液中，搅拌至完全溶解，之后过滤去除不溶物。在100mL玉米醇溶蛋白中分别加入400 mg姜黄素和400 mg白藜芦醇，通过搅拌至完全溶解。将牛血清白蛋白溶于25 mmol/L氢氧化钠溶液中浓度为8 mg/mL。之后将100 mL醇溶蛋白溶液在800 rpm加入到250 mL含有牛血清白蛋白的水溶液中，继续搅拌5 min后获得分散液。随后采用0.5M柠檬酸调节pH至6.5，继续搅拌十分钟形成共载姜黄素-白藜芦醇的醇溶蛋白-牛血清白蛋白胶体溶液。5000 rmp下离心7 min去除大颗粒和未包封的活性物质（姜黄素和白藜芦醇）得到纳米分散溶液，干燥后得到共载姜黄素-白藜芦醇醇溶蛋白颗粒。
实施例2
将1 g玉米醇溶蛋白溶于100 mL pH 12.0的水溶液中，搅拌至完全溶解，之后过滤去除不溶物。在100mL玉米醇溶蛋白中分别加入400 mg白藜芦醇，通过搅拌至完全溶解。将牛血清白蛋白溶于25 mmol/L氢氧化钠溶液中浓度为8 mg/mL。之后将100 mL醇溶蛋白溶液在800 rpm加入到250 mL含有牛血清白蛋白的水溶液中，继续搅拌5 min后获得分散液。随后采用0.5M柠檬酸调节pH至6.5，继续搅拌十分钟形成载白藜芦醇的醇溶蛋白-牛血清白蛋白胶体溶液。5000 rmp下离心7 min去除大颗粒和未包封的活性物质（白藜芦醇）得到纳米分散溶液，干燥后得到共载姜黄素-白藜芦醇醇溶蛋白颗粒。
实施例3
将1 g玉米醇溶蛋白溶于100 mL 25 mmol/L氢氧化钠水溶液中，搅拌至完全溶解，之后过滤去除不溶物。在100mL玉米醇溶蛋白中分别加入500 mg姜黄素和300 mg白藜芦醇，通过搅拌至完全溶解。将牛血清白蛋白溶于25 mmol/L氢氧化钠溶液中浓度为7 mg/mL。之后将100 mL醇溶蛋白溶液在800 rpm加入到250 mL含有牛血清白蛋白的水溶液中，继续搅拌5 min后获得分散液。随后采用1M柠檬酸调节pH至6.5，继续搅拌十分钟形成共载姜黄素-白藜芦醇的醇溶蛋白-牛血清白蛋白胶体溶液。5000 rmp下离心7.0 min去除大颗粒和未包封的活性物质（姜黄素和白藜芦醇）得到纳米分散溶液，干燥后得到共载姜黄素-白藜芦醇醇溶蛋白颗粒。
实施例4
将1 g玉米醇溶蛋白溶于100 mL 25 mmol/L氢氧化钠水溶液中，搅拌至完全溶解，之后过滤去除不溶物。在100mL玉米醇溶蛋白中分别加入300 mg姜黄素和500 mg白藜芦醇，通过搅拌至完全溶解。将牛血清白蛋白溶于25 mmol/L氢氧化钠溶液中浓度为6 mg/mL。之后将100 mL醇溶蛋白溶液在800 rpm加入到250 mL含有牛血清白蛋白的水溶液中，继续搅拌5 min后获得分散液。随后采用1M柠檬酸调节pH至6.5，继续搅拌十分钟形成共载姜黄素-白藜芦醇的醇溶蛋白-牛血清白蛋白胶体溶液。5000 rmp下离心7 min去除大颗粒和未包封的活性物质（姜黄素和白藜芦醇）得到纳米分散溶液，干燥后得到共载姜黄素-白藜芦醇醇溶蛋白颗粒。
实施例5
将1 g玉米醇溶蛋白溶于100 mL 25 mmol/L氢氧化钠水溶液中，搅拌至完全溶解，之后过滤去除不溶物。在100mL玉米醇溶蛋白中分别加入300 mg姜黄素和500 mg白藜芦醇，通过搅拌至完全溶解。将干酪素钠溶于25 mmol/L氢氧化钠溶液中浓度为3 mg/mL。之后将100 mL醇溶蛋白溶液在800 rpm加入到500 mL含有干酪素钠的碱水溶液中，继续搅拌5 min后获得分散液。随后采用1M柠檬酸调节pH至6.5，继续搅拌十分钟形成载白藜芦醇-姜黄素的醇溶蛋白-干酪素钠胶体溶液。5000 rmp下离心7 min去除大颗粒和未包封的活性物质（姜黄素和白藜芦醇）得到纳米分散溶液，干燥后得到共载姜黄素-白藜芦醇醇溶蛋白颗粒。
实施例6
将1 g玉米醇溶蛋白溶于100 mL 25 mmol/L氢氧化钠水溶液中，搅拌至完全溶解，之后过滤去除不溶物。在100mL玉米醇溶蛋白中分别加入500 mg白藜芦醇，通过搅拌至完全溶解。将干酪素溶于25 mmol/L氢氧化钠溶液中浓度为3 mg/mL。之后将100 mL醇溶蛋白溶液在800 rpm加入到500 mL含有干酪素钠的水溶液中，继续搅拌5 min后获得分散液。随后采用1M柠檬酸调节pH至6.5，继续搅拌十分钟形成载白藜芦醇的醇溶蛋白-干酪素钠胶体溶液。5000 rmp下离心7 min去除大颗粒和未包封的活性物质（姜黄素和白藜芦醇）得到纳米分散溶液，干燥后得到共载姜黄素-白藜芦醇醇溶蛋白颗粒。
实施例7
将1 g玉米醇溶蛋白溶于100 mL 25 mmol/L氢氧化钠水溶液中，搅拌至完全溶解，之后过滤去除不溶物。在100mL玉米醇溶蛋白中分别加入400 mg姜黄素和400 mg白藜芦醇，通过搅拌至完全溶解。将大豆分离蛋白溶于25 mmol/L氢氧化钠溶液中浓度为3 mg/mL。之后将100 mL醇溶蛋白溶液在800 rpm加入到500 mL含有干酪素钠的水溶液中，继续搅拌5min后获得分散液。随后采用1M柠檬酸调节pH至6.5，继续搅拌十分钟形成载白藜芦醇-姜黄素的醇溶蛋白-大豆分离蛋白胶体溶液。5000 rmp下离心7 min去除大颗粒和未包封的活性物质（姜黄素和白藜芦醇）得到纳米分散溶液，干燥后得到共载姜黄素-白藜芦醇醇溶蛋白颗粒。
实施例8
将1 g玉米醇溶蛋白溶于100 mL 25 mmol/L氢氧化钠水溶液中，搅拌至完全溶解，之后过滤去除不溶物。将牛血清白蛋白溶于25 mmol/L氢氧化钠溶液中浓度为3 mg/mL。之后将100 mL醇溶蛋白溶液在800 rpm加入到500 mL含有干酪素钠的水溶液中，继续搅拌5min后获得分散液。随后采用1M柠檬酸调节pH至6.5，继续搅拌十分钟形成空载的醇溶蛋白-牛血清白蛋白胶体溶液。5000 rmp下离心7 min去除大颗粒和未包封的活性物质（姜黄素和白藜芦醇）得到纳米分散溶液，干燥后得到共载姜黄素-白藜芦醇醇溶蛋白颗粒。
实施例9
将1 g玉米醇溶蛋白溶于100 mL 25 mmol/L氢氧化钠水溶液中，搅拌至完全溶解，之后过滤去除不溶物。将牛血清白蛋白溶于25 mmol/L氢氧化钠溶液中浓度为3 mg/mL。在100mL玉米醇溶蛋白中分别加入400 mg姜黄素，搅拌至完全溶解。之后将100 mL醇溶蛋白溶液在800 rpm加入到500 mL含有干酪素钠的水溶液中，继续搅拌5 min后获得分散液。随后采用1M柠檬酸调节pH至6.5，继续搅拌十分钟形成空载的醇溶蛋白-牛血清白蛋白胶体溶液。5000 rmp下离心7 min去除大颗粒和未包封的活性物质（姜黄素和白藜芦醇）得到纳米分散液。
表1为上述不实施例中纳米颗粒中白藜芦醇的储存稳定溶液，干燥后得到共载姜黄素-白藜芦醇醇溶蛋白颗粒。
表1：
从上表1中可以看出：当进行白藜芦醇单载时，其包埋率低储存温度性差。共载姜黄素能显著提高白藜芦醇的包埋率和储存稳定性。
上述包埋率是通过胶体中载入的活性物质与总投入活性物质的比值进行测定。载入的活性物质是用二甲亚砜溶解上清，然后利用HPLC测定
。
储存稳定性测试是将载活性物质的胶体分散液置于4℃条件下，两个月后测定上清中活性物质的浓度。活性物质的储存保留率是通过储存两个月后活性物质的浓度与初使（新制备）浓度的比值得到。
实施例10
相同条件下，制备的空载的玉米醇溶蛋白-牛血清白蛋白纳米颗粒、载姜黄素的玉米醇溶蛋白-牛血清白蛋白纳米颗粒、载白藜芦醇的玉米醇溶蛋白-牛血清白蛋白纳米颗粒、载姜黄素-白藜芦醇的玉米醇溶蛋白-牛血清白蛋白纳米颗粒四种颗粒。
图1是实施例10中四个产品的红外色谱分析测定复合蛋白颗粒的构型变化，从图1中可看出红外表征发现当进行单载姜黄素或者白藜芦醇时，玉米醇溶蛋白-牛血清白蛋白颗粒的羟基（3200cm-1），酰胺
区（1640 cm-1）和酰胺
（1530cm-1）吸收峰发生位移，说明载入的姜黄素或者白藜芦醇与蛋白颗粒发生氢键和疏水作用使得蛋白构型发生变化，该构型的变化使得蛋白颗粒变得适宜装载白藜芦醇。共载姜黄素-白藜芦醇发现蛋白的酰胺区发生更大的变化，这证明了上面的猜测。
图2是自由活性物质和颗粒活性物质的X射线衍射图，分别为姜黄素、白藜芦醇、实施例10中载姜黄素的玉米醇溶蛋白-牛血清白蛋白纳米颗粒、实施例10中载白藜芦醇的玉米醇溶蛋白-牛血清白蛋白纳米颗粒、实施例10中载姜黄素-白藜芦醇的玉米醇溶蛋白-牛血清白蛋白纳米颗粒的自由活性物质和颗粒活性物质的X射线衍射图。结果证明了载入蛋白颗粒使得自由活性物质从原来的晶体状态转变为非晶体状态，这有助于活性物质的吸收。
图3是活性物质从玉米醇溶蛋白颗粒中释放曲线。分别为白藜芦醇从实施例10中的载姜黄素-白藜芦醇的玉米醇溶蛋白-牛血清白蛋白纳米颗粒的释放、姜黄素从载姜黄素纳米颗粒中的释放、姜黄素从实施例10中的载姜黄素-白藜芦醇的玉米醇溶蛋白-牛血清白蛋白纳米颗粒的释放，结果表明白藜芦醇释放速度大于姜黄素，这是白藜芦醇与蛋白的相互作用力强度低导致的，单载白藜芦醇具有较低的包埋率和储存稳定性差也说明了这一现象。进行共载时，白藜芦醇的载入对姜黄素的释放几乎没有大的影响，说明共载是一种有效的提高白藜芦醇包埋效果的方式。
本发明中除了实施例中采用的玉米醇溶蛋白外其他的植物提取或市售常规醇溶蛋白都能制备出本专利的产品，而且水溶性稳定剂包括干酪素钠、乳清分离蛋白、白蛋白和大豆分离蛋白中的一种或多种，步骤（4）中的酸为有机或者无机酸，包括但不限定于盐酸，硫酸，柠檬酸和植酸，碱性溶液可为除了氢氧化钠溶液之外的碱性溶剂，都能制备出本专利的产品，得到的颗粒尺寸为50−120 nm，多分散性小于0.3，也能满足本专利得到的产品的质量要求。
Claims (10)
1.一种共载姜黄素-白藜芦醇醇溶蛋白颗粒，其特征在于该颗粒为姜黄素和白藜芦醇通过分子相互作用力结合整体外部包裹醇溶蛋白的核壳结构。
2.根据权利要求1所述的一种共载姜黄素-白藜芦醇醇溶蛋白颗粒，其特征在于所述的颗粒尺寸为50−120 nm，多分散性小于0.3。
3.一种共载姜黄素-白藜芦醇醇溶蛋白颗粒的制备方法，其特征在于该制备方法的具体步骤如下：
（1）、将醇溶蛋白、白藜芦醇和姜黄素共同加入到碱性溶液中，搅拌至完全溶解得到混合液A；
（2）、取水溶性稳定剂加入到碱性溶液中搅拌至完全溶解得到混合液B；
（3）、将步骤（1）中混合液A在搅拌条件下加入步骤（2）中的混合液B中，通过搅拌形成混合液C；
（4）、加入酸调节步骤（3）得到的混合液C调节pH至中性，形成的分散液离心去除大颗粒和未包封的活性物质，获得共载姜黄素-白藜芦醇醇溶蛋白溶液，干燥后得到共载姜黄素-白藜芦醇醇溶蛋白颗粒。
4.根据权利要求3所述的一种共载姜黄素-白藜芦醇醇溶蛋白颗粒的制备方法，其特征在于所述的步骤（1）中所述的醇溶蛋白为植物提取或市售常规醇溶蛋白，醇溶蛋白的浓度范围为0.2%~4%（w/v）。
5.根据权利要求3所述的一种共载姜黄素-白藜芦醇醇溶蛋白颗粒的制备方法，其特征在于所述的步骤（1）中所述的白藜芦醇浓度范围为0.01~2%（w/v），姜黄素浓度范围为0.01~2%（w/v）。
6.根据权利要求3所述的一种共载姜黄素-白藜芦醇醇溶蛋白颗粒的制备方法，其特征在于所述的水溶性稳定剂包括干酪素钠、乳清分离蛋白、白蛋白和大豆分离蛋白中的一种或多种，水溶性稳定剂浓度范围为0.05~5%（w/v）。
7.根据权利要求3所述的一种共载姜黄素-白藜芦醇醇溶蛋白颗粒的制备方法，其特征在于所述的步骤（3）中混合液A相和混合液B相按照体积比计算，即混合液A相比混合液B相为1：1~8的比例范围。
8.根据权利要求3所述的一种共载姜黄素-白藜芦醇醇溶蛋白颗粒的制备方法，其特征在于所述的步骤（4）中的酸为有机或者无机酸，包括但不限定于盐酸，硫酸，柠檬酸和植酸。
9.根据权利要求3所述的一种共载姜黄素-白藜芦醇醇溶蛋白颗粒的制备方法，其特征在于所述的步骤（1）和步骤（2）中所述的碱性溶液为氢氧化钠溶液。
10.根据权利要求3所述的一种共载姜黄素-白藜芦醇醇溶蛋白颗粒的制备方法，其特征在于所述的步骤（1）中首先在碱性溶液中溶解醇溶蛋白，然后在碱性的醇溶蛋白中添加姜黄素和白藜芦醇。
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