CN109770333B - 一种改性壳聚糖修饰的醇溶蛋白酶解物纳米粒子及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种改性壳聚糖修饰的醇溶蛋白酶解物纳米粒子及其制备方法和应用，所述制备方法包括：制备玉米肽‑羧甲基壳聚糖美拉德产物；将芦丁溶于无水乙醇得到芦丁乙醇溶液；然后将芦丁乙醇溶液加入到美拉德产物中，搅拌；真空旋转蒸发后离心，最后冷冻干燥得到纳米粒子。本发明以芦丁为抗氧化剂，玉米肽‑羧甲基壳聚糖美拉德产物为载体，利用反溶剂法制备芦丁‑玉米肽‑羧甲基壳聚糖美拉德产物纳米粒子。纳米粒子呈球形，颗粒大小分布均匀；与普通纳米粒子相比，玉米肽‑羧甲基壳聚糖美拉德产物纳米粒子具有良好的稳定性，在等电点处不会聚集沉淀。
Description
技术领域
本发明属于纳米粒子技术领域，具体涉及一种改性壳聚糖修饰的醇溶蛋白酶解物纳米粒子及其制备方法和应用。
背景技术
天然活性成分(如黄酮、多酚和维生素)具有调节血脂、清除自由基、抑菌等功效，近年来成为学术界研究的热点。但这些活性成分大都微溶或不溶于水，在复杂的食品微结构中的稳定性不足，难以将真正的健康利益传递给消费者。将天然活性成分包埋到纳米级输送体系中是目前解决这一问题普遍采取的方法，例如可以保护不稳定和敏感的活性成分在复杂食品环境中不被降解，将不溶于水的活性物质分散到水相中，改善吸收不良的生物活性物质的生物利用度，最大限度地提高其健康效益。
目前用作包埋输送活性物质的材料大多是来源食品的、易于获得的天然生物材料，这些材料被认为是安全可信的可以应用到食品中，例如多糖、蛋白质和脂肪。此外，天然生物材料与合成材料相比还具有优越的生物相容性和营养价值。其中，蛋白质基纳米粒子可以显著改善低吸收率的生物活性成分的生物利用度而得到了广泛的研究。多种蛋白质，如玉米醇溶蛋白、血清白蛋白、大豆蛋白和酪蛋白等已被用于制备纳米粒子。
芦丁又名芸香苷，是由槲皮素C3位上的羟基和芸香糖(-Glu-Rha)连接而成的双糖苷，属于黄酮类物质中的葡萄糖糖苷。芦丁具有抗氧化及抗自由基作用，可用于心脑血管疾病、肿瘤、炎症等的治疗。由于芦丁不溶于水，使其在作为一种良好的新型抗自由基的食品添加剂添加至食品中时受到了很大的局限。传统的将芦丁包埋制成复合粒子的技术虽然解决了芦丁的溶解度问题，但仍然存在以下问题：一、微球粒径太大，难以分散并悬浮在液体体系中；二、合成可降解纳米粒子材料不易被消费者接受；三、天然纳米粒子材料中：脂质由于其长链结构不能很好的包埋活性成分；蛋白质由于其较强的亲水性需要添加化学交联剂在蛋白和蛋白之间构建共价键来防止纳米粒子结构的崩解，化学交联剂大多有毒，残留有交联剂的蛋白纳米粒子的安全性大大降低。
玉米低聚肽，是以玉米醇溶蛋白(zein)为原料，在蛋白酶的催化作用下水解，再经分离、纯化等过程得到的低分子量寡肽混合物，不仅和zein一样具有自组装性和疏水性，而且亲水性增加，成为可溶性肽，并在较宽的pH值范围内可以溶解。此外，与蛋白质相比，肽作为载体更有利于活性物质的吸收。有研究表明小肽可以被肠道直接吸收，吸收速度比蛋白质和游离氨基酸快2-3倍。但与一般蛋白制备的纳米粒子一样，在等电点附近，纳米粒子会发生聚集沉淀。因为蛋白纳米粒子主要是通过静电排斥稳定，当接近等电点时，这种静电排斥效应会急剧降低，沉淀大量出现。
美拉德反应是指醛、酮、还原糖以及脂肪氧化生成的羰基化合物与胺类、氨基酸、肽、蛋白质的氨基之间的反应。生成的蛋白-多糖产物通常具有更好的乳化性，并且多糖部分所提供的强空间排斥作用可以显著提高蛋白纳米颗粒的稳定性，因此被认为是增强蛋白纳米粒子稳定性的良好稳定剂。美拉德反应是一种自发反应，仅需加热即可发生反应，不需要添加额外的化学物质。
反溶剂法指通过在溶剂中加入反溶剂，使得溶液中溶质的溶解度下降，聚集形成纳米级粒子的方法，原溶剂与反溶剂之一为水。反溶剂法快速简便，制备的粒子粒径小，且对设备要求较低，耗能低，是目前实验室研究制备纳米粒子的主要方法。在反溶剂过程中，溶剂与反溶剂的比例、混合速度以及溶液浓度等因素都会影响反溶剂的效果。此外，反溶剂法制备的纳米粒子在细胞粘附性，组织透过性，延长消化道停留时间以及提高生物利用率方面均比微胶囊有明显的优势。
发明内容
本发明的目的是提供了一种改性壳聚糖修饰的醇溶蛋白酶解物纳米粒子及其制备方法和应用，由于芦丁不溶于水，本发明采用反溶剂法，利用玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物和芦丁在乙醇与水中的溶解度差异制备芦丁-玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物纳米粒子，并对其粒径大小、颗粒形貌、带电性以及与普通纳米粒子的稳定性等进行了分析，为芦丁-玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物纳米粒子综合利用开拓了新的思路。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种改性壳聚糖修饰的醇溶蛋白酶解物纳米粒子的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将玉米肽和羧甲基壳聚糖分别在水中溶解，混合，搅拌发生美拉德反应，所得混合物冷冻干燥后，在干燥器中孵育；然后溶解离心，冷冻干燥后制得玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物；
(2)将所述美拉德产物配制成美拉德产物溶液；将芦丁溶于无水乙醇，得到芦丁乙醇溶液；
(3)将所述芦丁乙醇溶液加入到所述美拉德产物溶液中，搅拌；真空旋转蒸发后离心、冷冻干燥得到改性壳聚糖修饰的醇溶蛋白酶解物纳米粒子。
进一步的：所述步骤(1)中玉米肽与羧甲基壳聚糖质量比为1∶1～1.5。
进一步的：所述步骤(1)美拉德反应的温度为57～62℃。
进一步的：所述步骤(1)美拉德反应的时间为48～50h。
进一步的：所述步骤(2)中美拉德产物溶液的浓度为5mg/ml。
进一步的：所述步骤(3)中美拉德产物与芦丁的质量比为5∶1-25∶1。
进一步的：所述步骤(3)中旋转蒸发的温度45-50℃，时间为10-15min，离心速度为4000-4500r/min，离心时间为10-15min。
本发明还提供了所述的制备方法制得的改性壳聚糖修饰的醇溶蛋白酶解物纳米粒子。
进一步的：所述纳米粒子的粒径分布在155-218nm，纳米粒子的电位分布在-22--26mv之间。
进一步的：所述纳米粒子的包埋率为97.8％～98.8％，荷载率为6.7％～7.1％。
本发明还提供了所述的改性壳聚糖修饰的醇溶蛋白酶解物纳米粒子在制备食品添加剂中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：
(1)本发明以芦丁为抗氧化剂，玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物为载体，利用反溶剂法制备芦丁-玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物纳米粒子。
(2)本发明采用激光粒度仪、透射电子显微镜(TEM)等仪器对纳米颗粒表征结构进行分析，并对其包埋率与荷载率、Nacl浓度稳定性、pH稳定性进行了测定。结果表明，玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物纳米粒子对芦丁有良好的包埋效果，且具有较小的粒径，在溶液中分布均匀；TEM图片显示，纳米粒子呈球形，颗粒大小分布均匀，且与普通纳米粒子相比，粒子表面具有毛绒的突起，认为是具有空间位阻效应的主要原因；与普通纳米粒子相比，玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物纳米粒子具有良好的稳定性，在等电点处不会聚集沉淀。
附图说明
图1为傅里叶红外光谱图，其中a为玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物；b为玉米肽/羧甲基壳聚糖混合物；c为玉米肽。
图2为玉米肽及玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物的DSC图，其中a为玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物；b为玉米肽。
图3为玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物的荧光光谱图，其中a为玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物；b为玉米肽/羧甲基壳聚糖混合物；c为玉米肽。
图4为玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物的紫外光谱图，其中a为玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物；b为玉米肽/羧甲基壳聚糖混合物；c为玉米肽。
图5为随着玉米肽与羧甲基壳聚糖配比的增大，美拉德反应产物的接枝度与褐变指数的变化示意图；
图6为随着反应温度的升高，美拉德反应产物的接枝度与褐变指数的变化示意图；
图7为随着反应时间的增加，美拉德产物的接枝度与褐变指数的变化示意图；
图8为不同反应时间的玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物的乳化活性和乳化稳定性；
图9为电泳分析结果示意图，其中，a为marker的SDS-PAGE图谱，b为玉米肽的图谱，c为玉米肽/羧甲基壳聚糖混合物的SDS-PAGE图谱，d为玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物的图谱；
图10为不同美拉德产物浓度对纳米粒子粒径的影响。
图11为不同美拉德产物浓度对纳米粒子电位的影响。
图12为不同美拉德产物和芦丁比例对纳米粒子粒径的影响。
图13为不同美拉德产物和芦丁比例对纳米粒子电位的影响。
图14为芦丁标准曲线图；
图15为CPH-rutin、CPH/NOCC-rutin和CPH-NOCC-rutinNPs的包埋率和荷载率，其中，不同字母的数据有显着性差异，n＝3，P≤0.05；
图16为纳米粒子的透射电镜图片，其中，A、B：玉米肽-芦丁纳米粒子；C、D：玉米肽/羧甲基壳聚糖-芦丁纳米粒子；E、F：玉米肽-羧甲基壳聚糖-芦丁纳米粒子；A、C和E是低倍数的TEM图像，低倍数为×10.0k；B、D和F是高倍数的TEM图像，高倍数为×20.0k；
图17为荷载芦丁的玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物纳米粒子的SEM图像。
图18为芦丁及复合纳米粒子的红外光谱图。其中a为芦丁，b为荷载芦丁的玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物纳米粒子。
图19为NaCl浓度对CPH-Rutin、CPH/NOCC-Rutin、CPH-NOCC-Rutin和CPH-NOCC NPs产生的NPs平均粒径的影响示意图，其中，a：CPH-芦丁，b：CPH/NOCC-芦丁，c：CPH-NOCC-芦丁，d：CPH-NOCC；
图20为pH值对CPH-Rutin、CPH/NOCC-Rutin、CPH-NOCC-Rutin和CPH-NOCC-Rutin产生的纳米粒子平均粒径的影响示意图，其中，a：CPH-芦丁，b：CPH/NOCC-芦丁，c：CPH-NOCC-芦丁，d：CPH-NOCC。
图21为纳米粒子的抗氧化能力通过DPPH自由基清除能力以及ABTS自由基清除能力示意图；
图22为3种芦丁复合纳米颗粒在50％(体积分数)的乙醇释放介质中都具有缓释特性示意图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例将对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
实施例1
1、材料和仪器
1.1、材料
乙醇、氢氧化钠、盐酸、溴化钾：分析纯，莱阳市康德化工有限公司；
DPPH、ABTS：分析纯，美国Sigma-Aldrich公司；
玉米肽：食品级，中食都庆有限公司；
芦丁：食品级，国药集团化学试剂有限公司。
1.2、实验仪器
AR224CN电子天平：奥豪斯仪器(上海)有限公司；
N-1100旋转蒸发器：上海爱朗仪器有限公司；
TU-1810DASPC紫外分光光度计：北京普析通用有限公司；
IS10型傅里叶红外变换光谱分析仪：美国Nicolet公司；
FD8-3a冻干机：美国SIM；
79-1磁力加热搅拌器：上海双捷实验设备有限公司；
DD5M低速大容量离心机：湖南凯达科学仪器有限公司；
Nano-ZS电位及纳米粒径仪：英国Malvern公司；
ABT-150扫描电镜：日本托邦有限公司；
实验室常规玻璃仪器若干。
1.3、数据处理
所有样品至少平行测试三次，取平均值。使用SPSS17.0软件分析实验数据，并表示为平均值±标准差。在95％的显著水平(p＜0.05)范围内分析显著性。
2、纳米粒子的制备方法
2.1制备玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物
玉米肽(1.00w/v％)和羧甲基壳聚糖(1.00w/v％)分别在纯水中溶解。将完全和水溶解的样品以一定比例混合(CPH：NOCC)搅拌1h。所得混合物经冷冻干燥后，在含有饱和KBr溶液(相对湿度79％)的干燥器中以一定温度孵育一定时间。将反应后的样品溶解离心除去不溶物质后，冷冻干燥即得玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物。
2.2接枝度、褐变指数、乳化性能的测定
(1)接枝度(DG)的测定
美拉德产物的接枝度是在氨基损失的基础上进行计算。用邻苯二甲醛(OPA)法测定样品的游离氨基。将OPA(40mg)溶于1mL甲醇，2.5mL 20％(w/w)十二烷基硫酸钠(SDS)，25mL 0.1mol/L硼砂中，再加入100μL β-巯基乙醇，然后加入纯净水，使体积达到50mL。将OPA试剂(4mL)放置在试管中，注入200μL的美拉德共轭样品溶液，混合均匀。将混合均匀的溶液于35℃下水浴反应2min，于340nm下测定吸光值，并计算接枝度。
DG(％)＝[(A0-A1)/A0]×100；
其中，A0和A1分别代表反应前和反应后样品的吸光值。
(2)褐变指数(BI)的测定
蛋白质与多糖之间的美拉德反应常伴随着褐变。共轭物在420nm处的吸光度可以用来量化美拉德反应的范围。将CPH-NOCC共轭物溶于纯水，配成10mg/mL的溶液，测定其在420nm处的吸光度。
(3)乳化性能的测定
根据Molina等的浊度法对乳化活性(EAI)和乳化稳定性(ESI)进行测定。将样品溶解，配成浓度为5mg/mL的溶液，取15mL溶液与5mL的大豆油混合，采用拍打式均质机均质乳化2min，分别在0min和30min时，从测试管底部取50μL样品，用0.1％(w/v)SDS溶液稀释100倍，在500nm下测定样品的吸光度，以SDS溶液作为空白。EAI和ESI的计算公式如下：
式中，A0和A30分别代表0min和30min的吸光度，DF代表稀释倍数(100)，C代表样品溶液的浓度(g/mL)，φ代表混合液中大豆油的比例(0.25)。
2.3美拉德产物的测定及其影响因素分析
(1)傅里叶红外光谱(FTIR)
将样品粉末与溴化钾按1∶100的比例混合研磨均匀，压片后置于红外光谱仪中进行测定。红外光谱仪的测定温度为25℃，波长扫描范围为4000-400cm-1，分辨率为4cm-1，波长精度为0.01em-1，扫描次数为64次，实验结果见图1。
当蛋白质共价结合糖分子后，一个典型的特征是蛋白质分子中的羟基增加，红外光谱表现为羟基的特征吸收增强，羟基的特征吸收峰有2个，分别是3700-3200cm-1处的-OH伸缩振动吸收峰及1260-1000cm-1处的-C-O伸缩振动吸收峰。从图1中可看出，与玉米肽及玉米肽-羧甲基壳聚糖混合物相比，玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物在3438.11em-1与1358.18cm-1有较强峰。由此可知，玉米肽以共价键的结合形式引入了糖分子。
(2)差示扫描量热分析(DSC)
将5mg左右的玉米肽以及玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德反应物粉末放入铝盘中，压盘，以空铝盘为对照，温度扫描范围为20～120℃；升温速率为10℃/min，保护气氮气流速为30mL/min。
图2为玉米肽及玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物的DSC图。由图2可以看出，未经处理的玉米肽在70℃左右出现了一个吸热峰，这是样品中水分蒸发导致出现了吸热峰；而经过美拉德反应后的产物出现吸收峰的温度比单纯的玉米肽略低，在50℃附近，这是由于美拉德反应使玉米肽的结构发生了一定的变化，从而使其持水能力有所降低。美拉德产物在80℃左右出现了一个放热峰，但是单纯的玉米肽在120℃之后才可能有放热峰出现，这表明玉米肽和羧甲基壳聚糖通过美拉德反应生成了易分解的中间产物，从而使得放热峰提前。
(3)荧光光谱分析
荧光强度可以作为美拉德反应程度的一个指标，当美拉德反应进入到高级阶段时即会形成荧光物质。通过对玉米肽、玉米肽/羧甲基壳聚糖混合物及其美拉德产物的荧光强度的比较，可以进一步反映玉米肽与羧甲基壳聚糖的反应程度。
取冻干后的样品粉末，用pH 7.0、50mmol/L的磷酸盐缓冲液稀释至溶液中蛋白质量浓度达到1mg/mL，激发波长为334nm，狭缝宽度5nm，在波长350～500nm进行检测。荧光光谱如图3所示，当激发波长为334nm时，美拉德产物在410nm处具有特征吸收，与其单体蛋白及混合物相比，最大吸收波长明显红移，且荧光强度明显增强，表明玉米肽与羧甲基壳聚糖发生了美拉德反应。
(4)紫外光谱分析
紫外光谱扫描是一种常用的蛋白质构象研究方法。取冻干后的样品粉末，用pH7.0、50mmol/L的磷酸盐缓冲液稀释至溶液中蛋白质量浓度达到1mg/mL，并以磷酸盐缓冲液为空白，在190～350nm范围内进行扫描。
图4是玉米肽、玉米肽/羧甲基壳聚糖混合物以及玉米肽-羧甲基壳聚糖接枝产物紫外扫描图谱的比较。与玉米肽相比，玉米肽-羧甲基壳聚糖糖基化产物的最大吸收峰向短波方向移动，发生蓝移，原因是糖链的引入使肽链展开，其内部氨基酸的助色基团与糖链产生共轭，进而导致所在电子轨道能级提高，电子跃迁所需能量增加，引起吸收带蓝移。另外，玉米肽-羧甲基壳聚糖糖基化产物在280nm附近紫外吸收强度降低，原因是羧甲基壳聚糖与玉米肽反应进行到高级阶段，使暴露的芳香族氨基酸残基进一步参与糖基化反应，蛋白质空间结构发生了变化。
(5)反应物配比对反应的影响
美拉德反应进程中，不同的底物配比对蛋白和多糖分子间反应基团的键合有一定影响。适当的底物配比对于提高反应速率，减少副反应(如类黑素的生成)的发生有着明显的作用，只有当蛋白和多糖的的配比适当时，才能实现基团之间的最佳比例的键合。这是因为玉米肽与羧甲基壳聚糖之间的共价键合发生于某一组分中，因此可以通过控制玉米肽与羧甲基壳聚糖的配比对反应进行优化。
本发明选择玉米肽：羧甲基壳聚糖(w/w)分别为1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1，60℃反应2天，计算接枝度(DG)和褐变指数(BI)，结果见表1、图5。图5中显示了随着玉米肽与羧甲基壳聚糖配比的增大，反应产物的接枝度与褐变指数的变化。由图可知，玉米肽与羧甲基壳聚糖质量比为1∶1时，接枝度最高，为53％。此时的褐变指数较小，为0.6。说明反应没有进行到更高阶段，类黑素的产生不多。具有高接枝度且较小褐变指数的美拉德产物的乳化性能更好，因此选用配比1∶1为最佳反应配比。
表1玉米肽和羧甲基壳聚糖不同配比下接枝度(DG)和褐变指数(BI)
| 肽：NOCC | DG | BI |
| 1∶2 | 49％ | 0.495 |
| 1∶1 | 53％ | 0.6 |
| 2∶1 | 43％ | 0.786 |
| 3∶1 | 34％ | 0.807 |
| 4∶1 | 23％ | 0.855 |
(2)反应温度对反应的影响
反应温度对蛋白与多糖的美拉德反应具有显著影响，一般温度越高反应速度越快。本发明选择反应温度分别为50、55、60、65℃，玉米肽与羧甲基壳聚糖质量比为2∶1，反应2天，计算接枝度(DG)和褐变指数(BI)，结果见表2、图6。图6可知，随着反应温度的升高，产物的接枝度与褐变指数都呈现显著性增加，分别由19％上升至45％，0.6上升至0.8％。由于反应温度升至60℃和65℃时的接枝度没有显著性差异，且60℃时的褐变程度较小，因此选用60℃为最佳反应温度。
表2不同反应温度下接枝度(DG)和褐变指数(BI)
| 温度 | DG | BI |
| 50℃ | 19％ | 0.609 |
| 55℃ | 26％ | 0.695 |
| 60℃ | 43％ | 0.786 |
| 65℃ | 45％ | 0.8 |
(3)反应时间对反应的影响
反应时间是美拉德反应的重要影响因素，主要影响最终反应物的生成。本发明选择反应时间分别为1、2、3、4天，60℃反应，玉米肽和羧甲基壳聚糖配比为2∶1，结果见表3和图7所示，随着反应时间的增加，美拉德产物的接枝度与褐变指数逐渐增加，分别由17％上升至49％，0.4上升至1.4。虽然反应至3天后，反应产物的接枝度增大，但是其褐变指数增大至1以上，生成大量类黑素，不利于产物的乳化性能，因此选用2天为最佳反应时间。
表3不同反应时间下接枝度(DG)和褐变指数(BI)
| 时间 | DG | BI |
| 1天 | 17％ | 0.431 |
| 2天 | 28％ | 0.786 |
| 3天 | 45％ | 1.182 |
| 4天 | 49％ | 1.475 |
(4)反应产物的乳化性能
表4、图8为不同反应时间的玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物的乳化活性和乳化稳定性。由图8可知，美拉德反应能够显著提高玉米肽的乳化活性和乳化稳定性，由于玉米肽分子中引入了带有亲水基团的羧甲基壳聚糖，有效提高了蛋白质亲水性。此外，玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物的空间结构变的松散，使玉米肽分子内部的疏水基团适当暴露，改善了玉米肽的亲水/疏水平衡，导致界面张力降低，从而提高了玉米肽的乳化性。随着反应时间的增加，美拉德产物的乳化活性和乳化稳定性均逐渐增加。
表4不同反应时间的玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物的乳化活性和乳化稳定性
| 乳化活性EAI | 乳化稳定性ESI | |
| 玉米肽 | 5.15 | 22 |
| 1天 | 8.24 | 26 |
| 2天 | 8.58 | 34 |
| 3天 | 9.95 | 45 |
| 4天 | 10.3 | 48 |
(5)电泳分析
聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是分离蛋白质的常用生化方法，样品的蛋白质分子热变性解聚后与SDS结合形成带负电的蛋白质-SDS复合物，复合物在电泳中的迁移率取决于蛋白质的分子大小，但常规的Tris-甘氨酸-盐酸系统对分子量小于10kD的多肽分离效果差，因此本实验采用分离小分子肽的Tricine-SDS-PAGE方法。使用18％的丙烯酰胺分离胶，5％的丙烯酰胺浓缩胶。将0.25％(w/v)的样品溶液与4×上样缓冲液混合后100℃水浴5min，冷却至室温后取10ul注入胶中。电泳后用考马斯亮蓝R-250染色1h。用10％醋酸对凝胶进行脱色。
SDS-PAGE结果如图9所示。由图可以看出玉米肽/羧甲基壳聚糖混合物的SDS-PAGE图谱(图9c)与玉米肽的谱带相似(图9b)。而玉米肽与羧甲基壳聚糖美拉德产物的谱带却出现明显的变化，在浓缩胶的顶部出现大分子量的条带。这是因为蛋白质与多糖结合后，大分子量的多糖会接枝到蛋白质分子上。大分子量条带的出现说明玉米肽与羧甲基壳聚糖发生了美拉德反应。
2、制备纳米粒子
采用反溶剂法制备荷载芦丁的玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物复合纳米粒子。将一定量的芦丁溶于无水乙醇中，搅拌溶解。将美拉德产物配制成一定浓度的溶液，搅拌1小时。随后将芦丁乙醇溶液加入到美拉德产物溶液中，搅拌1小时。45℃下真空旋转蒸发10min，除去乙醇，4000r/min离心10min除去少量不溶物，之后将上清液真空冷冻干燥24h。冻干后样品在4℃储藏。同时制备荷载芦丁的玉米肽纳米粒子和玉米肽/羧甲基壳聚糖纳米粒子作为对照。将荷载芦丁的玉米肽纳米粒子、玉米肽/羧甲基壳聚糖纳米粒子、玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物纳米粒子分别命名为CPH-rutin NPs、CPH/NOCC-rutin NPs、CPH-NOCC-rutin NPs。
3、纳米粒子的表征结构、包埋率与荷载率、Nacl浓度稳定性、pH稳定性的分析测定
3.1、纳米粒子表征分析(纳米粒子粒径、电位、PDI的测定)
用动态光散射测定纳米粒子在溶液状态下的粒径、电位、PDI。首先取冻干后的样品，配制0.1～0.5％的溶液并在室温下超声处理5min，用移液枪取1mL溶液，沿比色皿边缘一角缓缓注入后，放入测试台中测试，每个样品分别测试三次，取平均值。
表5 CPH-rutin、CPH/NOCC-rutin和CPH-NOCC-rutin NPs的表征
如表5所示，荷载芦丁的玉米肽纳米粒子的平均粒径为151.8nm，PDI相对较小为0.234，表明粒径分布均匀。在不经美拉德反应的玉米肽纳米粒子上涂层羧甲基壳聚糖后，粒径明显增大到180.3nm。粒子的轻微聚集絮凝可能是观察到平均粒径增大的原因。长链多糖与纳米粒子产生热力学上的不相容，推动了纳米粒子聚集在一起。然而，CPH/NOCC-rutinNPs的PDI仍较小，其值为0.265。荷载芦丁的玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物纳米粒子平均粒径为183.0nm，PDI为0.271。然而，与其他一些蛋白质纳米粒子相比，如玉米醇溶蛋白纳米粒子(250nm)和小麦醇溶蛋白醇溶蛋白纳米粒子(300nm)，玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物纳米粒子的粒径更小。
Zeta电位数据表明，所有纳米粒子均具有平均负电荷。与非共轭混合物相比，玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物共轭纳米粒子的zeta电位值显著降低，由-23.3降到-25.3。这与Lesmes和McClements观察到的β-乳球蛋白-葡聚糖美拉德反应包覆的脂滴具有相似的结果。
(1)美拉德产物浓度对纳米粒子粒径、电位的影响
如表6，图10所示，纳米粒子的粒径分布在155-218nm之间，具有显著性变化。随着产物浓度(和芦丁混合之前的美拉德产物的浓度)的增加，纳米粒子的粒径逐渐增大，这是因为随着产物浓度的增大，粒子与粒子之间的碰撞与聚集的几率增大，导致形成的复合纳米粒子的体积增大。由于降低复合粒子的粒径有利于人体吸收，因此选用美拉德产物浓度为5mg/ml。
表6产物浓度对纳米粒子粒径的影响
复合纳米粒子均呈现表面负电荷，且随看产物浓度的增大，复合纳米粒子的电位变化不大，分布在-22--26mv之间。分别为5、10、15、20、25mg/ml，测定纳米粒子的粒径(见表6和图10)和电位(表7和图11)。
表7产物浓度对纳米粒子电位的影响
(2)美拉德产物与芦丁的比例对纳米粒子粒径电位的影响
如表8、图12所示，复合纳米粒子的粒径分布在155-218nm之间，具有显著性差异。随着美拉德产物与芦丁比例的增加，即随着芦丁添加量的减小，复合纳米粒子的粒径有逐渐较小的趋势。
表8美拉德产物与芦丁的质量比对纳米粒子粒径的影响
| 美拉德产物：芦丁(w/w) | 粒径 |
| 5∶1 | 207.7 |
| 10∶1 | 182.5 |
| 15∶1 | 167.8 |
| 20∶1 | 161.2 |
| 25∶1 | 160.4 |
两者的质量比对电位影响不大，分布在-24--27mv之间，见表9和图13。
表9产物与芦丁的质量比对纳米粒子电位的影响
| 美拉德产物：芦丁(w/w) | 电位 |
| 5∶1 | 25 |
| 10∶1 | 27 |
| 15∶1 | 26 |
| 20∶1 | 24 |
| 25∶1 | 22 |
3.2、包埋率与荷载率
由于纳米粒子不溶于无水乙醇，冻干后的样品中游离的芦丁由无水乙醇萃取后测定。准确称取冻干后样品10mg，加入1mL无水乙醇，充分震荡并在10000rpm下离心5min，取出上清。反复三次后将萃取液通过紫外分光光度计法，在芦丁特征吸收峰一波长510nm下测定吸光值，并按照图14的芦丁标准曲线计算得到游离芦丁含量。
芦丁在玉米肽，玉米肽/羧甲基壳聚糖混合物以及玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物中的包埋率与荷载率如图15所示。所有纳米粒子均有较高的包埋率，为97.8％～98.8％。CPH-NOCC-rutinNPs的包埋率(98.8％)显著高于CPH-rutin NPs(97.8％)和CPH/NOCC-rutinNPs(98.4％)。CPH-NOCC-rutinNPs(图15)的包埋率的显著增加也可归因于颗粒尺寸的增加，如图15所示。说明羧甲基壳聚糖与玉米肽的共轭对纳米粒子包埋率具有积极的影响。此外，与荷载芦丁的玉米醇溶蛋白纳米粒子(90％)相比，所有纳米粒子的包埋率都明显提高。这是因为水解改变了分子量，使疏水区域更多的暴露在周围的水相中。因此，芦丁在玉米肽中的高包埋率是因于在经过适当的酶促后，更多的官能团暴露，增强了芦丁与玉米肽之间的相互作用能力。
此外，纳米粒子的荷载率在6.7％～7.1％的范围内变化很大。特别的是，制备的所有纳米粒子的荷载率显著高于荷载芦丁的大豆种子铁蛋白的荷载率(2.98％)。说明玉米肽和羧甲基壳聚糖的结合物或非结合物能有效地转运疏水活性成分。CPH-NOCC-rutin NPs的荷载率(7.1％)显著高于CPH-rutin NPs(6.7％)和CPH/NOCC-rutinNPs(6.8％)。美拉德处理显著提高了玉米肽的荷载能力(P≤0.05)。
3.3、透射电子显微镜(TEM)
通过日立(日本东京)7650透射电子显微镜拍摄纳米粒子的透射电子显微图，加速电压为80kV。将稀释后的样品投到一个碳涂层铜栅格上(400目)。在将栅格装入显微镜前，在室温下将其风干。在随机选择的领域内拍摄纳米粒子的图像。
图16显示了荷载芦丁的三种纳米粒子的透射电镜图(TEM)。美拉德共轭没有导致纳米粒子形状的改变。所制备的纳米粒子在制备过程中均呈球形结构，无团聚，均处于纳米尺度，粒径相对均匀(图16A、C和E)。此外，CPH-rutin NPs(图16B)的尺寸小于CPH/NOCC-rutin NPs(图16D)和CPH-NOCC-rutin NPs(图16F)，这与动态光散射得到的结果相吻合(表1)。共轭粒子(图16F)的表面看起来比非共轭粒子的表面粗糙且不那么圆(图16B、D)。尤其是在共轭粒子的表面出现了毛茸茸的突起(图16F中的红色圆圈)，这些毛茸茸的突起在纳米粒子接近对方时形成强烈的空间排斥作用。颗粒表面的这种差异与颗粒结构中长链多糖排列差异有关。
3.4 SEM
利用扫描电子显微镜观察纳米粒子的表面形貌。将冻干后的样品粉末通过导电胶固定在不锈钢样品台上。在表面喷射上一层金，以避免电子束充电。将喷金后的样品台置于扫描电子显微镜2.00KV下观察粒子的表面微观结构。
图17为荷载芦丁的玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物纳米粒子的SEM图像。由图可以看出，粒子成球形且分布较均匀。
3.5纳米粒子的FIIR测定
纳米粒子FT-IR的试验步骤如下：将溴化钾放入105℃烘箱中烘干以彻底除去水分，按样品和溴化钾1∶100(m/m)量压片测试扫描，扫描范围为4000-400cm-1。
图18是芦丁及复合纳米粒子的红外光谱图。如图所示，芦丁的羟基伸缩振动峰出现在3425.10cm-1，经与玉米肽-羧甲基壳聚糖形成纳米粒子后移动到了3433.78cm-1，这是因为芦丁与美拉德产物之间形成了氢键。此外，可以发现，芦丁在1643.61cm-1、1371.20cm-1的特征峰强度在复合纳米颗粒中消失。这说明在形成复合颗粒的过程中，芦丁美拉德产物之间发生了相互作用，由于芦丁已经被糖基化产物包埋起来，使其特征分子振动峰不明显。
3.6、Nacl强度稳定性分析
将样品稀释10倍，用Nacl溶液调节溶液最终的Na+浓度为0.0-0.25mol/L，用DLS测定其粒径分布。
氯化钠作为一种单价盐，对以生物聚合物为基础的纳米粒子具有很强的失稳作用，特别是在只有静电斥力才能稳定的情况下。钠离子可以在阴离子蛋白颗粒之间形成盐桥。通过将羧甲基壳聚糖与玉米肽分子共轭而增加空间斥力将提高纳米粒子在强氯化钠强度下的稳定性。如预期的那样，CPH-NOCC共轭物产生的NPs(图19c和19d)的平均粒径曲线与CPH和CPH/NOCC混合物(图19a和b)制备的纳米粒子相比更平滑，说明在氯化钠存在下，NOCC与CPH分子的共轭过程提高了NPs的稳定性。毛茸茸的碳水化合物突起(图16F)可能会阻碍这种盐桥的形成。在强Nacl的存在下，羧甲基壳聚糖与玉米肽分子的共轭过程提高了纳米粒子的稳定性。
3.7、pH稳定性分析
将样品稀释10倍后，用NaOH(0.10mol/L)和HCl(0.10mol/L)调节pH值为pH7.0～pH3.0，用动态光散射仪(DLS)测定其粒径分布。
纳米粒子在不同离子强度下的稳定性。将样品稀释10倍，用Nacl溶液调节溶液最终的Na+浓度为0.0-0.25mol/L，用DLS测定其粒径分布。
蛋白质颗粒对pH变化特别敏感。在蛋白质粒子的等电点附近，粒子表面的电荷减少，从而使静电斥力最小化。促进了纳米粒子之间的聚集。蛋白质纳米颗粒主要依靠粒子之间的静电斥力稳定，对pH的变化特别敏感，主要表现在在其等电点附近会强烈失稳，出现聚集。这是因为在蛋白质粒子的等电点附近，粒子表面的电荷急剧减少，从而使静电斥力降低，促进了纳米粒子之间的聚集。在pH4.0左右，普通的玉米肽纳米粒子变得不稳定，出现大粒径的粒子，见图20a，这会严重阻碍这些蛋白质颗粒在许多食品中的应用。用羧甲基壳聚糖涂层玉米肽颗粒后，在pH值4.0左右时的粒径略有减小，但仍存在广泛的聚集现象，见图20b。然而，用玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物制备的纳米粒子(CPH-NOCC-rutin和CPH-NOCC NPs，图20c和d))在pH值降低至等电点附近及以下时，平均粒径并没有明显增加。玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物在pH 4.0等电点附近增强纳米粒子稳定性的优越能力可归因于玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物具有稳定的立体效应，防止了纳米粒子的不稳定。玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物所产生的多毛碳水化合物突起的空间效应(图16F)阻碍了粒子聚集的形成。这些结果表明，玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物是一种稳定食品中纳米包封疏水化合物和载体的有效的天然方法。
3.8抗氧化能力的测定
DPPH法用于测定DPPH自由基清除能力。准确称取10mg冻干后样品，溶于5mL蒸馏水，在室温下超声处理5min。配置40mg/L的DPPH乙醇溶液，避光搅拌。将1mL样品溶液与2mLDPPH溶液混合并震荡，常温避光储存30min，在517nm处测定吸光度值A1。同时将1mL蒸馏水与2mL DPPH溶液混合并震荡，常温避光储存30min，在517nm处测定吸光度值A0。纳米粒子的自由基清除能力通过如下公式计算：
式中：
A0：蒸馏水与DPPH混合后的吸光度值；
A1：样品与DPPH混合后的吸光度。
ABTS法用于测定ABTS自由基的清除能力。准确称取8mg冻干后样品，溶于10mL蒸馏水，在室温下超声处理5min。ABTS自由基是由7mmol/L的ABTS和2.45mmol/L的过硫酸钾混合反应生成，在室温、避光条件下静置12h。使用前，用乙醇稀释该溶液，使其在734nm处吸光值为0.700±0.025。清除自由基的活性测定是以无水乙醇为对照，通过0.2mL的样品溶液和0.2mL的对照溶液与1mL的ABTS微量工作液混合。准确测量6min后吸光值的减少量。ABTS清除率的计算公式如下
式中：
A0：对照的吸光度；
A1：样品的吸光度。
表10抗氧化能力的测定
3.9芦丁复合纳米粒子的释放特性
芦丁在水中的溶解性较差，在水溶液中研究芦丁复合纳米颗粒的释放，会因释放出的芦丁产生聚集，发生沉淀而无法进行透析。在50％(体积分数)的乙醇水溶液中，释放的少量芦丁呈溶解状态，能够将其透析出来，从而便于进行定量分析。试验过程参考Shaikh等的方法并略有改动。具体为：将由玉米肽、玉米肽/羧甲基壳聚糖混合物和玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物分别制备的3种芦丁复合纳米颗粒溶液各取10mL，分别装入截留分子量为8-10kDa的透析袋，封紧袋口。将装有芦丁复合纳米颗粒的透析袋放入90mL透析液(体积分数为50％的乙醇)，于37℃避光并在磁力搅拌下进行透析，在特定时间点(0，0.5，1，1.5，2，3，4，5，6h)更换新的透析液，并利用紫外-可见分光光度计测定不同时间点的透析液在512nm的吸光值，根据标准曲线计算累计释放量。每个样品取2个平行。
累计释放量(％)＝Wi/W0×100％；
式中：Wi为i小时以内芦丁的释放量，mg；W0为透析前样品中芦丁的总量，mg。
纳米粒子的抗氧化能力通过DPPH自由基清除能力以及ABTS自由基清除能力表示，如图21所示。由图可知，没有荷载芦丁的玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物纳米粒子的DPPH自由基清除率与ABTS自由基清除率分别为17.77％、20.18％。这主要是因为玉米肽分子本身具有一定的抗氧化能力，其在与羧甲基壳聚糖共轭后仍具有这种抗氧化能力。随着玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物与芦丁质量比的减小，即芦丁添加量的增加，DPPH自由基清除率与ABTS自由基清除率均显著提高，分别为56.97％、70.11％。由此可以看出，包埋后的芦丁仍然具有抗氧化能力。此外，可以看出，纳米粒子的ABTS自由基清除率要高于DPPH自由基清除率，这是因为与羧甲基壳聚糖共轭后的玉米肽的亲水性增强，更易于ABTS这种水溶性自由基接近，进而形成稳定的物质。
3.10缓慢释放能力分析
芦丁复合纳米颗粒中芦丁的释放特性对于其生理活性的发挥具有重要意义。由于芦丁在生物体内的代谢速率较快，因此控制芦丁的缓慢持续释放对于其活性的发挥至关重要。由图22可知，制备的3种芦丁复合纳米颗粒在50％(体积分数)的乙醇释放介质中都具有缓释特性。随着透析时间的延长，芦丁的累积释放量都逐渐增加，释放速率也都逐渐降低，并趋于平缓。但较单纯的玉米肽以及玉米肽/羧甲基壳聚糖混合物，美拉德产物能够明显地进一步降低芦丁复合纳米颗粒的释放速度，经过6h的透析，芦丁的累积释放率在50％左右，而单独玉米肽制备的芦丁复合纳米颗粒，其累积释放率在60％以上。
表11缓慢释放能力分析
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (4)
1.一种改性壳聚糖修饰的醇溶蛋白酶解物纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
（1）将玉米肽和羧甲基壳聚糖分别在纯水中溶解，混合1 h，搅拌发生美拉德反应，所得混合物冷冻干燥后，在干燥器中孵育；然后溶解离心，冷冻干燥后制得玉米肽-羧甲基壳聚糖美拉德产物；所述玉米肽与羧甲基壳聚糖质量比为1:1；所述美拉德反应的温度为60℃，反应的时间为48 h；
（2）将所述美拉德产物配制成美拉德产物溶液；将芦丁溶于无水乙醇，得到芦丁乙醇溶液；所述美拉德产物溶液的浓度为5mg/ml；
（3）将所述芦丁乙醇溶液加入到所述美拉德产物溶液中，搅拌1 h；45℃真空旋转蒸发10 min后离心、冷冻干燥24 h，得到改性壳聚糖修饰的醇溶蛋白酶解物纳米粒子；所述美拉德产物与芦丁的质量比为5:1-25:1。
2.权利要求1所述的制备方法制得的改性壳聚糖修饰的醇溶蛋白酶解物纳米粒子，其特征在于：所述纳米粒子的粒径分布在155-218nm，纳米粒子的电位分布在-22--26mv之间。
3.根据权利要求2所述的改性壳聚糖修饰的醇溶蛋白酶解物纳米粒子，其特征在于：所述纳米粒子的包埋率为97.8%~98.8%，荷载率为6.7%~7.1%。
4.权利要求2所述的改性壳聚糖修饰的醇溶蛋白酶解物纳米粒子在制备食品添加剂中的应用。
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