CN114404448B - 枸杞多糖-蛋白复合物稳定硒纳米颗粒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种枸杞多糖‑蛋白复合物稳定硒纳米颗粒及其制备方法。所述方法通过亚临界水技术处理枸杞中提取的多糖、蛋白质,得到的枸杞多糖‑蛋白质复合物作为模板稳定硒纳米颗粒,具有较好的物理稳定性和再分散性,且对HepG‑2细胞和Caco‑2细胞有明显的抑制作用,适用于保健食品和医疗领域。
Description
技术领域
本发明属于药物制备技术领域,涉及一种枸杞多糖-蛋白复合物稳定硒纳米颗粒及其制备方法。
背景技术
硒纳米颗粒具有抗肿瘤活性,同时具有低毒性的优点,可有效清除体内自由基,提高机体防癌能力。目前通过加热、超声等物理方法制备的硒纳米颗粒容易聚集,稳定性较差,易聚集成为黑色沉淀,不利于人体吸收利用(M.Arruebo,N.Vilaboa,B. Saez-Gutierrez,et al.,Assessment of the evolution of cancer treatment therapies,Cancers 3(3) (2011)3279-330.)。因此,开发高稳定性、低毒性的硒纳米颗粒制剂显得越发紧迫。
为防止纳米硒聚集,多糖、蛋白质、多肽等作为稳定剂已成为当下研究热点。单一的蛋白质和多糖稳定的硒纳米颗粒生物活性和稳定性欠佳。通过蛋白质-多糖复合物来稳定硒纳米颗粒,可以有效地阻止纳米粒子的聚集,从而达到稳定纳米硒的效果,在一定程度上还可以提高纳米硒的生物活性(X.Ding,P.Yao,Soy protein/soy polysaccharidecomplex nanogels:folic acid loading,protection,and controlled delivery,Langmuir,the ACS journal of surfaces and colloids 29(27)(2013)8636-44.)。传统的多糖-蛋白质复合物的制备方法主要有湿热法和干热法,但这些方法存在接枝效率低、反应时间长等缺点,长时间的处理会导致严重的褐变,使反应程度无法控制(X.Y.Zhuo,J.R.Qi,S.W.Yin,et al., Formation of soy protein isolate-dextran conjugates bymoderate Maillard reaction in macromolecular crowding conditions,Journal ofthe science of food and agriculture 93(2) (2013)316-23.)。
亚临界水是温度在100℃以上,临界温度374℃以下仍保持为液体状态的水。亚临界水的极性可以通过调整温度和压力来进行控制。相对于传统制备方式,亚临界水法因其高效、低能耗、环境友好等优点更有利于复合物的形成(T.Powell,S.Bowra,H.J. Cooper,Subcritical Water Processing of Proteins:An Alternative to EnzymaticDigestion, Analytical Chemistry 88(12)(2016)6425-6432.)。然而,由亚临界水制备的多糖和蛋白质复合物稳定的硒纳米颗粒尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种枸杞多糖-蛋白复合物稳定硒纳米颗粒及其制备方法。
实现本发明目的的技术方案如下:
枸杞多糖-蛋白复合物稳定硒纳米颗粒的制备方法,包括以下步骤:
(1)枸杞烘干后磨粉,粉末用乙醇脱脂脱色素,风干;
(2)风干后的枸杞以料液比1:30、g:mL,加入蒸馏水,50℃下水浴搅拌提取,重复提取后合并滤液浓缩;
(3)在浓缩液中加入(NH4)2SO4使混合液中(NH4)2SO4的质量浓度为30%~40%,然后加入正丁醇配制所需三相体系,浓缩液与正丁醇的体积比为100:5~10,搅拌至两相充分混匀,调节温度至35℃~40℃,调节pH至6.0~7.0,离心加速相分离过程,于25℃下静置,分离得到枸杞多糖和枸杞蛋白质溶液,最后冻干得到枸杞多糖(LBP)、枸杞蛋白(LBPr);
(4)按枸杞蛋白和枸杞多糖的质量比为1:1~1:3,将枸杞多糖和枸杞蛋白溶解于去离子水中,得到的混合溶液置于密闭的压力反应釜中,调节温度至120℃后反应20min,得到枸杞多糖-蛋白质复合物(LBPP1);
(5)以抗坏血酸为还原剂,以LBPP1作为稳定剂制备硒纳米颗粒,在枸杞多糖- 蛋白质复合物溶液中加入亚硒酸钠,然后在搅拌下逐滴加入新鲜的抗坏血酸,反应产物经蒸馏水透析后冷冻干燥,得到枸杞多糖-蛋白复合物稳定硒纳米颗粒(LBPP1-SeNPs)。
优选地,步骤(1)中,脱脂脱色素时间为2h,重复次数为3次。
优选地,步骤(2)中,提取时间为30min,重复提取次数为3次;浓缩温度为50℃、浓缩压力为0.07MPa。
优选地,步骤(3)中,离心速度为4000r/min,离心时间为5min,静置60min以上。
优选地,步骤(4)中,枸杞蛋白和枸杞多糖的质量比为1:2。
优选地,步骤(5)中,抗坏血酸与亚硒酸钠的摩尔比为4:1。
优选地,步骤(5)中,透析时使用的透析袋的截留分子量为3500Da,透析时间为48h。
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
(1)本发明通过亚临界水制备得到的枸杞多糖-蛋白复合物,亚临界水处理与传统的加热方法相比,可以增强分子的柔韧性和界面活性,在高温高压状态下获得更多氢键暴露,并能激活多糖中的羰基和蛋白质中的氨基,促进多糖与蛋白质的接枝反应;
(2)本发明制得的枸杞多糖-蛋白复合物,对硒纳米颗粒的生物活性具有协同作用,利用枸杞多糖-蛋白质复合物稳定硒纳米颗粒,不仅会有更多的端羟基和高比表面积,而且蛋白质的氨基基团也容易与纳米材料或细胞膜结合,有利于纳米硒的吸附和稳定,枸杞多糖-蛋白质复合物稳定的硒纳米颗粒可以在4℃、黑暗条件下保存至少40天。
附图说明
图1为枸杞多糖和蛋白质萃取条件的单因素试验结果图,A是硫酸铵浓度对萃取率的影响,B是正丁醇添加量对枸杞多糖和蛋白质萃取率的影响,C是萃取温度对枸杞多糖和枸杞蛋白质萃取率的影响,D是pH对枸杞多糖和蛋白质萃取率的影响;
图2为枸杞蛋白和枸杞多糖浓度变化对LBPP1-SeNPs的粒径影响;
图3A为不同硒纳米颗粒的SEM图(500倍);图3B为不同硒纳米颗粒的SEM图 (2000倍);
图4为不同硒纳米颗粒的TEM图;
图5为不同硒纳米颗粒的粒径(A)、PDI(B)、zeta电位(C);
图6为LBPP1-SeNPs在不同光照条件下的稳定性;
图7为LBPP1-SeNPs在不同温度条件下的稳定性;
图8为LBPP1-SeNPs在不同pH下的稳定性;;
图9为不同硒纳米颗粒对HepG-2细胞(A)及Caco-2细胞(B)的增殖抑制率,不同字母表示存在显著性差异(p<0.05);
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步详细描述。
下述实施例和对比例中,如无特殊说明,采用的原料或试剂均可通过商业购买获得。实验装置或测试方法均为本领域常规使用的设备或方法。
1、材料与试剂:枸杞购自中国甘肃省武威市古浪县枸杞研究所。亚硒酸钠(Na2SeO3,≥97%)、抗坏血酸(VC)购自阿拉丁公司;硫酸铵和正丁醇为分析级,购自中国上海国药化学试剂有限公司;DMEM培养基、胰蛋白酶和3-(4,5)二甲基噻唑(2y1)2, 5二苯四唑脲(MTT)试剂盒购自南京建城生物工程研究所;HepG-2细胞、Caco-2细胞购自南京凯基生物有限公司。
2、实验仪器:RV-10basic旋转蒸发仪(德国IKA公司);CO2培养箱(美国ThermoScientific);酶标仪(Tecan infinite 200pro,Tecan Austria GmbH公司);BM-37XBC倒置显微镜(上海波爱姆光学仪器制造有限公司)。
实施例1
(1)枸杞烘干后磨粉,粉末用乙醇脱脂脱色素,风干。
(2)风干后的枸杞以料液比1:30(g/mL)加入蒸馏水,50℃下水浴搅拌提取30min,连续提取3次,过滤,合并滤液。滤液经50℃、0.07MPa下旋转蒸发仪浓缩。
(3)取100mL浓缩液分别加入(NH4)2SO4,使得混合后的溶液中(NH4)2SO4的质量浓度为10%、20%、30%、40%、50%,然后加入5mL、10mL、15mL、20mL、25mL 的正丁醇配制所需三相体系。磁力搅拌5min使两相充分混匀,调节温度至25℃、30℃、 35℃、40℃、45℃,调节pH至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0,以4000r/min离心5min加速相分离过程,于25℃下静置60min后分离得到枸杞多糖、枸杞蛋白溶液,分别冻干得到枸杞多糖(LBP),枸杞蛋白(LBPr)。其中盐分用蒸馏水透析(MWCO:8-14kD)去除,正丁醇通过旋转蒸发去除回收,分别用苯酚-硫酸法和考马斯亮蓝法测定分离物中多糖、蛋白质含量。
(4)将三相分离法纯化得到的枸杞蛋白、枸杞多糖按一定质量比例(1:1、1:2、1:3、2:1、3:1)溶解于去离子水中,得到混合溶液。将混合溶液置于密闭的压力反应釜中,调节温度至120℃后反应20min,得到枸杞多糖-蛋白质复合物(LBPP1)。
(5)以抗坏血酸为还原剂,以步骤(4)得到的枸杞多糖-蛋白质复合物反应液(LBPP1) 作为稳定剂制备硒纳米颗粒,在反应液中加入10mmol/L的亚硒酸钠溶液,室温搅拌30 min,在磁力搅拌下逐滴加入新鲜的抗坏血酸,抗坏血酸与亚硒酸钠的摩尔比为4:1,反应产物经蒸馏水透析2天后冷冻干燥,得到枸杞多糖-蛋白复合物稳定硒纳米颗粒(LBPP1-SeNPs)。
对比例1
本对比例以枸杞多糖稳定硒纳米颗粒(LBP-SeNPs),具体为:将三相分离法纯化得到的枸杞多糖溶解于去离子水中,配制浓度为2mg/mL的枸杞多糖溶液。以抗坏血酸为还原剂,以枸杞多糖溶液作为稳定剂制备硒纳米颗粒,在溶液中加入10mmol/L的亚硒酸钠室温搅拌30min,在磁力搅拌下逐滴加入新鲜的抗坏血酸,抗坏血酸与亚硒酸钠的摩尔比为4:1,反应产物经蒸馏水透析2天后冷冻干燥,得到LBP-SeNPs。
对比例2
本对比例以枸杞蛋白稳定硒纳米颗粒(LBPr-SeNPs),具体为:将三相分离法纯化得到的枸杞蛋白溶解于去离子水中,配制浓度为2mg/mL的枸杞蛋白溶液。以抗坏血酸为还原剂,以枸杞蛋白溶液作为稳定剂制备硒纳米颗粒,在溶液中加入10mmol/L的亚硒酸钠室温搅拌30min,在磁力搅拌下逐滴加入新鲜的抗坏血酸,抗坏血酸与亚硒酸钠的摩尔比为4:1,反应产物经蒸馏水透析2天后冷冻干燥,得到LBPr-SeNPs。
对比例3
本对比例以传统湿热法制备枸杞多糖-蛋白质复合物稳定硒纳米颗粒,具体为:将三相分离法纯化得到的枸杞多糖、枸杞蛋白按质量比例2:1溶解于去离子水中,得到混合溶液。将混合液置于水浴锅中,调节温度至90℃后反应2h,得到枸杞多糖-蛋白质复合物(LBPP2)。
以抗坏血酸为还原剂,以传统湿热法制备得到的枸杞多糖-蛋白质复合物反应液(LBPP2)作为稳定剂制备硒纳米颗粒,在反应液中加入10mmol/L的亚硒酸钠室温搅拌30min,在磁力搅拌下逐滴加入新鲜的抗坏血酸,抗坏血酸与亚硒酸钠的摩尔比为 4:1,反应产物经蒸馏水透析2天后冷冻干燥,得到LBPP2-SeNPs。
表征实验
1、细胞培养及抗肿瘤能力测定
将HepG-2细胞和Caco-2细胞置于CO2培养箱(37℃,5%CO2)培养,培养至对数期。取细胞100μL接种于96孔板,接种6个平行孔,设立空白对照。细胞贴壁生长后加入不同浓度(50、100、150、200、300、400μg/mL)的LBPP1-SeNPs样品,培养24h,运用MTT法检测不同浓度的样品处理对HepG-2细胞和Caco-2细胞增殖抑制的情况。加5μg/mL的MTT溶液50μL,培养4h后弃去上清,每孔加入150μL的DMSO,摇床震荡30min使结晶溶解,酶标仪测定570nm处的OD值,检测细胞吸光度,计算公式如下:
细胞增殖抑制率=1-A样品/A对照×100%。
2、硒纳米颗粒的再分散性
新鲜制备得到的LBPP1-SeNPs测量粒径,冻干后重新溶解在去离子水中测量粒径,表1显示新鲜制备的LBPP1-SeNPs和冻干后的LBPP1-SeNPs粒径无显著性差异,说明其具有较好的再分散性。
表1
图1是枸杞多糖和蛋白质萃取的单因素试验结果图。图1A是硫酸铵浓度对萃取率的影响,从图中可以看出,随着硫酸铵浓度增加,LBP含量从增加到降低,盐浓度过高会削弱多糖萃取效果,所以选择硫酸铵添加量为30%。图1B是正丁醇添加量对枸杞多糖和蛋白质萃取率的影响。从图中可以看出,随着正丁醇添加量增大,LBP和LBPr的萃取率都呈现先增大后降低的趋势,所以选择正丁醇添加量为10mL。图1C是萃取温度对枸杞多糖和枸杞蛋白质萃取率的影响。从图中可以看出,在较低的温度范围内升高温度有利于萃取体系的萃取效果,但过高的温度会影响LBPr的萃取,所以选择萃取温度为35℃。图1D是pH对枸杞多糖和蛋白质萃取率的影响。从图中可以看出,pH升高对蛋白质的萃取影响较为明显,但也不能过高,所以选择pH为6.0时最为适宜。
图2是枸杞多糖和枸杞蛋白浓度变化对LBPP1-SeNPs稳定性的影响,由图可以看出枸杞蛋白与枸杞多糖的质量浓度比为1:1~1:3时,LBPP1-SeNPs的粒径较小,随着枸杞蛋白含量的增加,LBPP1-SeNPs的粒径会显著增加,所以选择枸杞蛋白与枸杞多糖的质量浓度比为1:2时LBPP1-SeNPs最稳定。
图3是各个样品的扫描电子显微镜图。图3A显示SeNPs的微观形态呈不规则的纤维状堆积状态,表面粗糙有凸起;而LBPP1-SeNPs呈现片状结构,表面相对光滑,层次清晰。两者之间的微观结构和形貌差异较大,图3B是放大2000倍之后的图像,可以看出SeNPs之间相互交联缠绕,结构更加紧密,更容易聚集。而LBPP1-SeNPs的片状结构相对规则,边缘有分支,面积较大且单薄,分支层叠排列。因而交联度变小,使其有较好的分散度。
图4是各个样品在四十天内的投射电镜图和实物图。数码照片显示SeNPs溶液在初始阶段显示橙红色透明状,表示无定型硒纳米颗粒的成功合成;其在40天后容器底部出现黑色沉淀,发生明显聚集。LBPr-SeNPs也发生部分聚集,而LBP-SeNPs、 LBPP1-SeNPs和LBPP2-SeNPs没有出现聚集,分散性良好。
图5为各个样品在40天内粒径、PDI及zeta电位的变化,图5A显示SeNPs粒径变化明显,经过40天从初始的132.8nm增加到了277.2nm。而LBPP1-SeNPs在40天内的粒径变化维持在5.5nm;图5B显示LBPP1-SeNPs的PDI在所有样品当中变化最小;图5C显示40天之后LBPP1-SeNPs的zeta电位值绝对值最高(44mV)。这些结果说明 LBPP1减弱了硒纳米颗粒之间的吸引力,从而增强了SeNPs的分散性和稳定性。也说明 LBP和LBPr等大分子模板的存在对SeNPs的稳定起着至关重要的作用。
图6、图7、图8显示LBPP1-SeNPs可以在黑暗、温度为4℃、pH为6.0条件下储藏至少40天,说明酸碱度、温度、光照等条件对SeNPs的储存稳定性有较大的影响。
图9是LBPP1-SeNPs对肝癌细胞和人结肠癌细胞的增殖抑制率。图中显示随浓度的增加,LBPP1-SeNPs对HepG-2细胞(A)和Caco-2细胞(B)均有抑制作用,且对HepG-2 细胞的抑制作用更为显著(p<0.05)。LBPP1-SeNPs对两种肿瘤细胞的IC50值分别为83.29 μg/mL和170.0μg/mL,说明LBPP1-SeNPs可以作为潜在的抗肿瘤药物。
综上所述,本发明以枸杞为原料,通过水浴搅拌提取枸杞多糖、枸杞蛋白质,三相分离法纯化后以亚临界水制备枸杞多糖-蛋白质复合物;以枸杞多糖-蛋白质复合物稳定硒纳米颗粒,考察单因素(硫酸铵浓度、正丁醇浓度、萃取温度,pH)对枸杞中多糖及蛋白质萃取率的影响,确定了最佳实验条件。本发明通过调节枸杞多糖-蛋白质复合物中枸杞多糖和蛋白质的比例,提高硒纳米颗粒的稳定性。结果表明亚临界水制备得到的枸杞多糖-蛋白复合物修饰后的硒纳米颗粒可以在pH为6.0、温度为4℃、黑暗条件下至少储存40天,并且其具有良好的再分散性和抗肿瘤活性。
Claims (9)
1.枸杞多糖-蛋白复合物稳定硒纳米颗粒的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)枸杞烘干后磨粉,粉末用乙醇脱脂脱色素,风干;
(2)风干后的枸杞以料液比1:30、g:mL,加入蒸馏水,50℃下水浴搅拌提取,重复提取后合并滤液浓缩;
(3)在浓缩液中加入(NH4)2SO4使混合液中(NH4)2SO4的质量浓度为30%~40%,然后加入正丁醇配制所需三相体系,浓缩液与正丁醇的体积比为100:5~10,搅拌至两相充分混匀,调节温度至35℃~40℃,调节pH至6.0~7.0,离心加速相分离过程,于25℃下静置,分离得到枸杞多糖和枸杞蛋白质溶液,最后冻干得到枸杞多糖、枸杞蛋白;
(4)按枸杞蛋白和枸杞多糖的质量比为1:1~1:3,将枸杞多糖和枸杞蛋白溶解于去离子水中,得到的混合溶液置于密闭的压力反应釜中,调节温度至120℃后反应20min,得到枸杞多糖-蛋白质复合物;
(5)以抗坏血酸为还原剂,以枸杞多糖-蛋白质复合物作为稳定剂制备硒纳米颗粒,在枸杞多糖-蛋白质复合物溶液中加入亚硒酸钠,然后在搅拌下逐滴加入新鲜的抗坏血酸,反应产物经蒸馏水透析后冷冻干燥,得到枸杞多糖-蛋白复合物稳定硒纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,脱脂脱色素时间为2h,重复次数为3次。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,提取时间为30min,重复提取次数为3次。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,浓缩温度为50℃、浓缩压力为0.07MPa。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)中,离心速度为4000r/min,离心时间为5min,静置60min以上。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(4)中,枸杞蛋白和枸杞多糖的质量比为1:2。
7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(5)中,抗坏血酸与亚硒酸钠的摩尔比为4:1。
8.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(5)中,透析时使用的透析袋的截留分子量为3500Da,透析时间为48h。
9.根据权利要求1至8任一所述的制备方法制得的枸杞多糖-蛋白复合物稳定硒纳米颗粒。
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Formation of soy protein isolate – dextran conjugates by moderate Maillard reaction in macromolecular crowding conditions;Xiu-Ying Zhuo等;《J Sci Food Agric》;第93卷;316-323 * |
亚临界水中反应参数对ε-聚赖氨酸与葡聚糖美拉德反应的影响;李春林等;《食品工业科技》;第33卷(第2期);261-264 * |
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