CN113980149A - 一种霍山石斛多糖纳米硒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种霍山石斛多糖纳米硒及其制备方法。所述制备方法包括如下步骤:向霍山石斛多糖的水溶液中加入抗坏血酸与亚硒酸钠,经还原反应即得;所述水溶液中,所述霍山石斛多糖的浓度为0.1~0.4mg/ml;所述还原反应的温度为30℃~40℃。相对于霍山石斛多糖,本发明方法制备得到的霍山石斛多糖纳米硒的抗氧化性显著增强,如清除DPPH自由基和OH自由基的能力,因此可用于制备抗氧化性产品。
Description
技术领域
本发明属于纳米硒制备技术领域,特别涉及一种霍山石斛多糖纳米硒制备方法。
背景技术
硒是人体必需的微量元素,其存在形式有无机硒和有机硒两种,常见的无机硒主要是亚硒酸钠和硒酸钠。有机硒是硒蛋白和硒多糖,硒元素具有清除自由基、保护细胞、拮抗毒性、提高人体免疫功能的作用。但是硒的生物活性剂量范围较窄,营养剂量范围小。过量会导致硒中毒,使用时剂量难以控制。大量的研究表明,将有机硒、无机硒转变为红色纳米硒后,具有良好的生物活性和低毒性。纳米硒是一种高效低毒的单质硒形态,选择来源广泛、生物兼容性优良。多糖、蛋白质等是用于控制纳米颗粒生长有效纳米载体,用生物活性多糖作为纳米硒的修饰剂能够明显提高纳米硒的稳定性、生物相容性及多种生物活性。因此,利用天然多糖作为修饰剂制备均匀分散、粒度较小、毒性小,且生物活性高的纳米硒已成为当下研究热点。
霍山石斛含有霍山石斛多糖、生物碱、霍山石斛酚、微量元素、氨基酸等多种药用成分,其中多糖是霍山石斛中最主要的活性成分之一,现代药理学研究结果证明,霍山石斛多糖有着提高机体免疫力、预防治疗糖尿病、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、抗菌消炎等功能。因此霍山石斛多糖是一种有效、无毒的天然化合物,因此有必要研究霍山石斛作为纳米硒修饰剂的应用效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种霍山石斛多糖纳米硒的制备方法,霍山石斛多糖经过硒化改性后,抗氧化性能显著增强。
本发明所提供的霍山石斛多糖纳米硒的制备方法,包括如下步骤:
向霍山石斛多糖的水溶液中加入抗坏血酸与亚硒酸钠,经还原反应即得。
上述的制备方法中,所述水溶液中,所述霍山石斛多糖的浓度为0.1~0.4mg/ml,优选0.2mg/ml,此时,A410/A490(表征纳米硒颗粒粒度变化的依据,比值越大,胶体颗粒的粒径越小,当比值不变时,胶体的粒径不再发生变化)最大。
上述的制备方法中,所述还原反应的温度为30℃~55℃,优选30℃~40℃,更优选40℃,经实验发现,当反应温度高于50℃时,A410/A490下降,而且静置24h后有大量沉淀出现,说明温度过高下生成的胶体,不利于霍山石斛多糖-纳米硒胶体溶液的稳定。
上述的制备方法中,所述还原反应的时间为2~4h,优选3h。
上述的制备方法中,所述抗坏血酸与所述亚硒酸钠的摩尔比为3:1,此时所述抗坏血酸过量,以给反应体系提供足够的还原环境,避免制备的纳米硒被环境氧化。
相对于霍山石斛多糖,本发明方法制备得到的霍山石斛多糖纳米硒的抗氧化性显著增强,如清除DPPH自由基和OH自由基的能力,因此可用于制备抗氧化性产品。
附图说明
图1和图2为不同霍山石斛多糖浓度时得到的霍山石斛多糖纳米硒的A410/A490。
图3为不同反应温度时得到的霍山石斛多糖纳米硒的A410/A490。
图4为在50~70℃的条件下反应得到的体系静置24h后的图片。
图5为不同Vc与亚硒酸钠的配比时得到的霍山石斛多糖纳米硒的A410/A490。
图6为不同反应时间时得到的霍山石斛多糖纳米硒的A410/A490。
图7为本发明制备得到的霍山石斛多糖纳米硒的TEM。
图8为霍山石斛多糖纳米硒与霍山石斛多糖对DPPH的清除能力
图9为霍山石斛多糖纳米硒与霍山石斛多糖对OH的清除能力。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中采用的霍山石斛多糖是按照下述方法制备得到的:
步骤1、将霍山石斛于电热恒温鼓风干燥箱中50℃下烘干4h,使用高速多功能粉碎机粉碎,得到粒度为90~150μm的霍山石斛粉末。
步骤2、称量10.0g霍山石斛粉末放入350mL耐压瓶中,按照1:20(g/mL)的料液比加入蒸馏水。
步骤3、将耐压瓶放入集热式恒温加热磁力搅拌器中,设置提取温度为150℃,提取时间3h,重复提取2次。
步骤4、将提取液在台式高速离心机中于4000r/min下离心10min,循环水式多用真空泵抽滤,合并两次滤液。
步骤5、将滤液在旋转蒸发仪上减压浓缩至原溶液的1/3,室温下缓慢的加入无水乙醇至终体积70%,中途不断搅拌,将该溶液于4℃下静置12h,离心后,取沉淀再溶于蒸馏水(1:4,v/v)中。
步骤6、使用Sevag试剂法脱蛋白(多糖溶液:Sevage=5:1,Sevage试剂中,氯仿:正丁醇=4:1,v/v),放入磁力搅拌振摇,去除溶液中的蛋白乳浊液和下层有机溶液,收集上层多糖溶液。重复以上脱蛋白步骤5~7次,直至中间层无白色蛋白乳浊液出现时停止。
步骤7、脱去多糖溶液中残留的Sevag试剂,用活性炭脱色。
步骤8、将多糖溶液装入分子截留量为3500Da的透析袋中,去离子水透析48h,去除杂质,纯化多糖。
步骤9、将多糖溶液放入真空冷冻干燥机,在-45℃下冷冻干燥90h,完全冻干后取出,得到亚临界水提取法制备的初步纯化的霍山霍山石斛多糖。
下述实施例中,根据胶体溶液的双波长法,选取410nm、490nm作为样品的测定波长,以A410/A490的值作为表征纳米硒颗粒,粒度变化的依据,比值越大,胶体颗粒的粒径越小,当比值不变时,胶体的粒径不再发生变化。
实施例1、霍山石斛多糖纳米硒的制备
向霍山石斛多糖的水溶液中加入抗坏血酸与亚硒酸钠,经还原反应得到霍山石斛多糖纳米硒,下面考察各反应条件对该反应中纳米硒的影响。
一、多糖浓度对纳米硒的影响
采用不同浓度(0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL和1mg/mL)进行硒化改性,不同浓度时反应体系的A410/A490如图1所示。可以看出,当霍山石斛多糖浓度为0.2mg/ml时,A410/A490最大为1.43。
为了验证上述结果,采用0.1和0.3mg/mL两种浓度进行,结果如图2所示,可以看出,0.1mg/mL和0.3mg/mL的A410/A490值低于0.2mg/mL。
二、反应温度对纳米硒的影响
不同反应温度时,反应体系的A410/A490如图3所示,可以看出,整体的趋势是30~40℃先上升,50~70℃下降,当温度在50、60、70℃时,不仅A410/A490下降,静置24h后有大量沉淀出现(如图4),说明温度过高下生成的胶体,不利于霍山石斛多糖-纳米硒胶体溶液的稳定。
三、抗坏血酸与亚硒酸钠的比例对纳米硒的影响
理论上,Vc与亚硒酸钠是按照2:1的摩尔比发生反应的,为了给反应体系提供足够的还原环境,避免制备的纳米硒被环境氧化,向体系中添加稍过量的Vc,选择3:1作为Vc和亚硒酸钠的配比。
由图6可知,反应时间对A410/A490的影响并不大,就本次试验结果,3h时A410、A490的值最大分别为:0.365,0.256,说明此时生成的霍山石斛多糖-纳米硒稳定性较强,因此选择反应时间为3h。
经上述实验,确定最优条件为:霍山石斛多糖浓度0.2mg/mL、反应温度40℃、VC:Na2SO3=3:1,反应时间3h,在该条件下得到的霍山石斛多糖纳米硒的TEM如图7所示,在透射电镜下观察霍山石斛多糖纳米硒(图7(C)-图7(D)),这些黑色颗粒就是被霍山石斛多糖吸附、包裹的纳米硒,与霍山霍山石斛多糖(图7(A)-图7(B))相比,霍山石斛多糖纳米硒颗粒是一种表面光滑的球状体,其粒径在60~110nm之间。
实施例2、霍山石斛多糖纳米硒的抗氧化性
一、清除DPPH的能力
取0.05、0.1、0.5、1、2、4、6、8、10mg/ml的多糖溶液各500μL,各加入5×10-5mol/L的DPPH溶液500μL,摇匀,室温避光静置30min,以蒸馏水代替样品液为空白,测定其在517nm处的吸光度,以Vc为对照品。按下式计算各个样品对DPPH自由基的清除率(%)。
DPPH自由基清除率(%)=[A0-(AX-AX0)]/A0×100%;
A0:蒸馏水+DPPH溶液的吸光值;
AX:多糖样品液+DPPH溶液的吸光值;
AX0:多糖样品液+无水乙醇(与DPPH溶液体积相同)的吸光值;
结果如图8所示,可以看出,当霍山石斛多糖纳米硒浓度高于4mg/mL时候,其对DPPH自由基清除率大于霍山石斛多糖;当霍山石斛多糖纳米硒浓度高于8mg/mL时,其对DPPH自由基清除率与阳性对照Vc一致,都达到100%。
二、清除OH的能力
在反应体系中依次加入4.5×10-3mol/L的FeSO4溶液0.4mL,4.5×10-3mol/L水杨酸-乙醇溶液0.4mL,及0.4mL的不同浓度的多糖样品溶液(0.05、0.1、0.5、1、2、4、6、8、10mg/mL),最后加入3×10-3mol/L的H2O2溶液0.8mL,启动反应,37℃水浴反应0.5h,在510nm下测定各浓度样品的吸光度,空白组以相同体积蒸馏水代替样品溶液,以同浓度抗坏血酸(Vc)溶液做对照,按下式计算样品对·OH的清除率(%)。
·OH清除率(%)=[A0-(AX-AX0)]/A0×100%;
A0:蒸馏水+FeSO4溶液+水杨酸-乙醇溶液+H2O2溶液的吸光值;
AX:多糖样品液+FeSO4溶液+水杨酸-乙醇溶液+H2O2溶液的吸光值;
AX0:多糖样品液+FeSO4溶液+水杨酸-乙醇溶液的吸光值+蒸馏水的吸光值(蒸馏水体积与H2O2溶液等体积)
结果如图9所示,可以看出,在检测范围内(霍山石斛多糖和霍山石斛多糖纳米硒浓度为0~10mg/mL),霍山石斛多糖纳米硒清除OH能力,都大于霍山石斛多糖。
综上所述,霍山石斛多糖纳米硒的抗氧化活性高于霍山石斛多糖。
Claims (8)
1.一种霍山石斛多糖纳米硒的制备方法,包括如下步骤:
向霍山石斛多糖的水溶液中加入抗坏血酸与亚硒酸钠,经还原反应即得。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述水溶液中,所述霍山石斛多糖的浓度为0.1~0.4mg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于:所述还原反应的温度为30℃~55℃。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法,其特征在于:所述还原反应的时间为2~4h。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法,其特征在于:所述抗坏血酸与所述亚硒酸钠的摩尔比为3:1。
6.权利要求1-5中任一项所述方法制备的霍山石斛多糖纳米硒。
7.权利要求6所述霍山石斛多糖纳米硒在制备抗氧化性产品中的应用;
所述抗氧化性产品能够清除DPPH自由基和OH自由基。
8.一种抗氧化产品,其活性成分为权利要求6所述霍山石斛多糖纳米硒。
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