CN112225827A - 一种灰树花活性多糖的提取方法及提取的活性多糖和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于膜过滤技术提取灰树花活性多糖的方法及该方法提取得到的灰树花活性多糖和用途，包括：(1)向灰树花子实体原料中加入水；合并，真空浓缩得到灰树花提取浓缩液；(2)将灰树花提取浓缩液微滤预处理；(3)将微滤透过液超滤处理；(4)将超滤截留液干燥，得到灰树花多糖。本发明具有有益效果：(1)最大限度防止破坏灰树花提取液中活性成分，同时分离过程相当于一次预浓缩；本发明的超滤技术非常适合分离提取液中的有效成分，而去除与功效性较差、甚至无效的成分，所制备的灰树花多糖纯度高于传统工艺制备多糖；提高超滤效果，减轻膜污染，有利于提高生产效率，延长超滤膜使用寿命，节省成本；适用于工业化，经济前景好。

Description

一种灰树花活性多糖的提取方法及提取的活性多糖和用途
技术领域
本发明涉及一种多糖的提取方法，具体涉及一种基于膜过滤技术提取灰树花活性多糖的方法及该方法提取得到的灰树花活性多糖和用途。
背景技术
灰树花是我国传统食药用菌，具有良好的保健作用和较高的药用价值。国内外的研究结果显示，灰树花具有减少胰岛素抵抗，控制血糖，抑制脂肪细胞堆积，降低血压，增强免疫和抗癌功效。
灰树花多糖是灰树花中的一种提取物，由葡聚糖和小分子单糖及少量蛋白质的异聚糖复合物组成，动物实验和临床实验显示，其可以通过活化吞噬细胞、诱导癌细胞凋亡等发挥防癌抗癌功效。
目前，提取制备灰树花多糖一般采用水提取醇沉法，热水提取后加入乙醇除去水溶性蛋白、单糖等水溶性小分子杂质，沉淀得到粗多糖。然而，因为醇沉的纯化效率低，造成沉淀物中成分复杂，多糖含量降低，影响功效活性，且乙醇使用量大，导致多糖制备生产成本较高，且造成一定程度的环境污染。
发明内容
针对以上不足，本发明提供一种基于膜过滤技术提取灰树花活性多糖的方法，可以极大简化灰树花多糖的制备过程，提取的多糖纯度高，并且根据活性多糖的效果反向进行提取方法参数例如超滤参数等的筛选，使提取到的活性多糖效果显著，还实现提取方法的产业化应用。
本发明通过以下方案达到上述目的：
第一方面，一种灰树花活性多糖的提取方法，包括：
(1)向灰树花子实体原料中加入原料重量10-40倍的水，采用80-105℃提取1-4次，每次提取1-4小时，80-200目过滤提取液；合并提取液，真空浓缩至固形物含量5-20％得到灰树花提取浓缩液；
(2)将灰树花提取浓缩液进行微滤预处理，微滤膜孔径100-400nm，温度控制25-60℃，操作压力在1MPa以内，收集微滤透过液，弃去微滤未透过液；
(3)将微滤透过液进行超滤处理，超滤膜孔径对应截留1-18KDa分子量，操作压力0.3-1MPa，温度控制25-40℃，当透过液的体积在总体积的40％-75％时停止超滤，保留未透过膜的超滤截留液，丢弃超滤透过液；
(4)将超滤截留液进行干燥，控制粉体水分含量＜15％，所得干粉即为灰树花多糖。
优选的，发明对上述提取方法参数进一步优化，得到一种提取效率更高，纯度更好的方法：一种灰树花活性多糖的提取方法，包括：
(1)向灰树花子实体原料中加入原料重量10-25倍的水，采用95-105℃提取2-3次，每次提取1-2小时，100-200目过滤提取液；合并提取液，真空浓缩至固形物含量10-18％得到灰树花提取浓缩液；
(2)将灰树花提取浓缩液进行微滤预处理，微滤膜孔径100-200nm，温度控制25-55℃，操作压力在0.8MPa以内，收集微滤透过液，弃去微滤未透过液；
(3)将微滤透过液进行超滤处理，超滤膜孔径对应截留2-15KDa分子量，操作压力0.3-0.6MPa，温度控制25-35℃，当透过液的体积在总体积的55％-75％时停止超滤，保留未透过膜的超滤截留液，丢弃超滤透过液；
(4)将超滤截留液进行干燥，控制粉体水分含量＜12％，所得干粉即为灰树花多糖。
发明人发现，在灰树花提取液中，灰树花水溶性氨基酸和单糖等成分的相对分子质量一般都低于1KDa，而淀粉、纤维素等相对分子量很大，因此采用超滤技术非常适合分离提取液中的有效成分而去除与功效性较差、甚至无效的成分。
在本发明提供的制备方法中，分离过程相当于一次预浓缩，然后采用微滤和超滤技术联用，具有操作简单，能耗低，生产周期短，滤膜可多次使用，过滤全程低温操作且不存在溶剂残留，最大限度防止破坏灰树花提取液中活性成分，结果表明：所制备的灰树花多糖纯度远高于传统工艺制备的灰树花多糖。
进一步地，发明人将实验室规模的提取方法不断方法，调整，得到可以工业化的一种灰树花活性多糖的提取方法，包括：
(1)将灰树花子实体原料投入提取罐中，加入原料重量10-40倍的水，采用80-105℃提取1-4次，每次提取1-4小时，将提取液通过过滤网，过滤网的孔径为80-200目；合并提取液，真空浓缩至固形物含量5-20％得到灰树花提取浓缩液；
(2)将灰树花提取浓缩液引入微滤设备进行预处理，微滤膜孔径100-400nm，温度控制25-60℃，操作压力在1MPa以内，收集微滤透过液，弃去微滤未透过液；
(3)将微滤透过液引入超滤设备，用超滤膜对不同分子量的多糖进行截留纯化，超滤膜孔径对应截留1-18KDa的分子量，操作压力0.3-1MPa，温度控制25-40℃，控制透过液的体积在总体积的40％-75％时，停止超滤，保留未透过膜的超滤截留液，弃超滤透过液；
(4)将超滤截留液进行干燥，控制成品粉体水分含量＜15％，所得干粉即为灰树花多糖成品。
进一步地，发明人结合上述对提取效率和纯度所做的研究，在实验室规模的提取方法中成功优化可以工业化的灰树花活性多糖的提取方法，包括：
(1)将灰树花子实体原料投入提取罐中，加入原料重量10-25倍的水，采用95-105℃提取2-3次，每次提取1-2小时，将提取液通过过滤网，过滤网的孔径为100-200目；合并提取液，真空浓缩至固形物含量10-18％得到灰树花提取浓缩液；
(2)将灰树花提取浓缩液引入微滤设备进行预处理，微滤膜孔径100-200nm，温度控制25-55℃，操作压力在0.8MPa以内，收集微滤透过液，弃去微滤未透过液；
(3)将微滤透过液引入超滤设备，用超滤膜对不同分子量的多糖进行截留纯化，超滤膜孔径对应截留2-15KDa分子量，操作压力0.3-0.6MPa，温度控制25-35℃，控制透过液的体积在总体积的55％-75％时，停止超滤，保留未透过膜的超滤截留液，弃超滤透过液；
(4)将超滤截留液进行干燥，控制成品粉体水分含量＜12％，所得干粉即为灰树花多糖成品。
优选的，所述的超滤截留液的干燥包括：喷雾干燥、冷冻干燥、真空干燥或常压干燥方法中的一种或几种。
优选的，所述的微滤膜材料为陶瓷膜、有机高分子膜、金属膜中的一种或几种。
优选的，所述的超滤膜孔径小于100nm，截留分子量范围1-18KDa，超滤膜材料为陶瓷膜、有机高分子膜、金属膜中的一种或几种。
在上述灰树花活性多糖的提取方法中，所述的微滤操作属于一种物理的提取液预处理方法，类似的还可以采用减压抽滤、活性炭脱色、低速离心、高速离心等预处理方法；但是，发明人发现，采用微滤和超滤联用更利于灰树花活性多糖的提取以及超滤膜寿命，节省提取成本。
第二方法，本发明提供一种上述提取方法提取得到的灰树花多糖。
该灰树花多糖的成分分析如图2和表2所示。
与传统方法制备的灰树花多糖相比，灰树花活性多糖分子量分布更为集中，纯度更高。
第三方面，本发明提供上述提取得到的灰树花活性多糖在降血糖方面的用途。
第四方面，本发明提供上述提取得到的灰树花活性多糖在制备降血糖药物方面的用途。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)采用微滤和超滤技术具有操作简单，能耗低，生产周期短，滤膜可多次使用，过滤全程属于低温操作且不存在溶剂残留，最大限度防止破坏灰树花提取液中活性成分，同时分离过程相当于一次预浓缩；
(2)灰树花水溶性氨基酸和单糖等成分的相对分子质量一般都低于1KDa，而淀粉、纤维素等相对分子量很大，因此本发明的超滤技术非常适合分离提取液中的有效成分，而去除与功效性较差、甚至无效的成分，所制备的灰树花多糖纯度高于传统工艺制备多糖；
(3)本发明中超滤前采用微滤处理提取液除去提取液中较大的悬浮颗粒或胶状物质，提高超滤效果，减轻膜污染，有利于提高生产效率，延长超滤膜使用寿命，节省成本；
(4)操作过程不涉及乙醇，节约了生产成本，同时提高了生产操作便捷性和安全性。
(5)本发明的方法适用于工业化，经济前景好。
(6)本发明提取的灰树花多糖的纯度更高，分子量分布更集中，其降血糖效果更显著。
附图说明
图1为试验例1中的普通灰树花多糖(GFE)的分子量分布图。
图2为试验例1中的本发明的灰树花活性多糖(GFH5)的分子量分布图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1：
(1)将100kg水分含量约为12％的灰树花子实体投入提取罐，加入25倍水，100℃提取4h，提取液过100目滤网，引入双效浓缩装置，浓缩至固形物含量10％的浓缩液，得到470L浓缩液；
(2)将浓缩液引入微滤设备，滤膜孔径200nm，温度55℃，操作压力低于0.5MPa，透过液收率90％；
(3)将微滤透过液引入超滤设备，超滤膜孔径对应截留5KDa以上的分子量，操作压力0.5MPa，温度控制在35℃，当透过液达到总体积的60％时停止超滤，保留未透过膜的超滤截留液，得到截留液170L；
(4)将超滤截留液引入喷雾干燥装置，控制进风温度170℃，喷雾干燥至粉体水分含量约10％，所得干粉即为灰树花多糖成品。
最终得到成品9.57kg，成品中多糖含量为4.38g/100g。
试验例1
采用实施例1中的灰树花多糖样品(命名为GFH5)，同时制备普通灰树花多糖(命名为GFE)，测定两种样品的多糖分子量分布。
其中，普通灰树花多糖的制备方法：
(1)将100kg水分含量约为12％的灰树花子实体投入提取罐，加入25倍水，100℃提取4h，提取液过100目滤网，引入双效浓缩装置，浓缩至固形物含量10％的浓缩液，得到470L浓缩液；
(2)将浓缩液引入喷雾干燥装置，控制进风温度170℃，喷雾干燥至粉体水分含量约10％，所得干粉即为普通灰树花多糖成品。
测定结果如表1-表2和图1及图2所示：
表1：普通灰树花多糖(GFE)
序号 保留时间 峰面积％ 数均分子量 重均分子量
1 44.967 2.66 13452 13945
2 50.025 16.69 1415 1501
3 51.800 80.65 515 536
表2：灰树花活性多糖(GFH5)
序号 保留时间 峰面积％ 数均分子量 重均分子量
1 17.417 7.21 14032 16892
2 19.217 36.00 1960 2755
3 20.052 56.79 302 397
从图1和图2及表1和表2的结果可以看出，与传统工艺制备的普通灰树花多糖相比，本发明提取的的灰树花活性多糖分子量分布更为集中，纯度高于传统工艺制备的多糖。
试验例2
采用实施例1中的灰树花多糖为样品(命名为GFH5)进行动物实验评价降血糖活性。同时制备普通灰树花多糖(GFE)作为对照。
普通灰树花多糖(GFE)的制备参照试验例1的方法。
1、方法
健康雄性SD大鼠，体重160-180g，数量111只，购自广东省医学实验动物中心。大鼠饲养于广东省实验动物监测所SPF级动物房，温度22-23℃，相对湿度为50-60％。
造模方法：用含有高糖高脂的饲料喂养动物可形成糖代谢紊乱动物模型，再给予剂量四氧嘧啶腹腔注射，可形成胰岛素抵抗，诱发实验性糖尿病，形成2型糖尿病大鼠模型。
给药方法：以人体推荐量(1.8g/d)设低、中、高剂量组为112.5、225、675mg/kg·BW，相当于人体推荐量的5倍，10倍和30倍。GFE组以675mg/kg·BW灌胃，相当于人体推荐剂量的30倍。同时设置正常对照组和阴性对照组，灌胃等量溶媒，以及阳性对照组，灌胃盐酸二甲双胍片200mg/kg。每3d称量一次体重，据此调整灌胃量。受试样品连续灌胃48天。试验方法：适应期结束后，将大鼠按体重随机分组，正常组、模型组、阳性组每组15只，GFE、GFH5三个剂量组每组16只，各组给予维持饲料，样品组灌胃给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，正常组不做处理，连续1周后，除正常组给予维持饲料外，其他组均给予高热能饲料并灌胃。连续3周后，模型对照组和样品组禁食24小时(不禁水)，给予四氧嘧啶103mg/kg.BW腹腔注射，注射量1mL/100g体重。注射后继续给予高热能饲料喂饲20天。在注射后的第20天将各组大鼠禁食4小时，检测空腹血糖、糖耐量。
动物分组如表3所示：
表3实验动物分组及给药剂量
组别(n＝7) 动物数/只 给药剂量/mg/kg
正常对照组 15
高糖模型对照组 15 溶剂
阳性对照组(二甲双胍) 15 200
GFH5-低剂量 16 112.5
GFH5-中剂量 16 225
GFH5-高剂量 16 675
GFE 16 675
2、结果
造模第20天大鼠空腹血糖及糖耐量结果如表4所示。
表4不同样品对糖尿病大鼠血糖及糖耐量的影响
Figure BDA0002725496540000061
注：与正常组组相比，*P<0.05；**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05；##P≤0.01。
由表4可知，在造模的第20天，GFH5低剂量和中剂量给药组与模型对照组比较，空腹血糖、在给葡萄糖后0.5、2小时各个时间点血糖及0、0.5、2小时血糖曲线下面积降低均具有统计学意义，故判定GFH5低剂量和中剂量给药组空腹血糖和糖耐量指标结果阳性。GFH5高剂量空腹血糖下降与模型组比较无显著性差异，而在给葡萄糖后0.5、2小时各个时间点血糖及0、0.5、2小时血糖曲线下面积降低具有统计学意义。
结果表明：GFE给药组无降血糖效果，GFH5各剂量组降血糖作用显著，尤其是GFH5低剂量组和中剂量组。说明本发明方法制备的灰树花多糖具有良好的降血糖活性。
以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种灰树花活性多糖的提取方法，其特征在于，包括：
(1)向灰树花子实体原料中加入原料重量10-40倍的水，采用80-105℃提取1-4次，每次提取1-4小时，80-200目过滤提取液；合并提取液，真空浓缩至固形物含量5-20％得到灰树花提取浓缩液；
(2)将灰树花提取浓缩液进行微滤预处理，微滤膜孔径100-400nm，温度控制25-60℃，操作压力在1MPa以内，收集微滤透过液，弃去微滤未透过液；
(3)将微滤透过液进行超滤处理，超滤膜孔径对应截留1-18KDa分子量，操作压力0.3-1MPa，温度控制25-40℃，当透过液的体积在总体积的40％-75％时停止超滤，保留未透过膜的超滤截留液，丢弃超滤透过液；
(4)将超滤截留液进行干燥，控制粉体水分含量＜15％，所得干粉即为灰树花多糖。
2.根据权利要求1所述的一种灰树花活性多糖的提取方法，其特征在于，包括：
(1)向灰树花子实体原料中加入原料重量10-25倍的水，采用95-105℃提取2-3次，每次提取1-2小时，100-200目过滤提取液；合并提取液，真空浓缩至固形物含量10-18％得到灰树花提取浓缩液；
(2)将灰树花提取浓缩液进行微滤预处理，微滤膜孔径100-200nm，温度控制25-55℃，操作压力在0.8MPa以内，收集微滤透过液，弃去微滤未透过液；
(3)将微滤透过液进行超滤处理，超滤膜孔径对应截留2-15KDa分子量，操作压力0.3-0.6MPa，温度控制25-35℃，当透过液的体积在总体积的55％-75％时停止超滤，保留未透过膜的超滤截留液，丢弃超滤透过液；
(4)将超滤截留液进行干燥，控制粉体水分含量＜12％，所得干粉即为灰树花多糖。
3.工业化的一种灰树花活性多糖的提取方法，其特征在于，包括：
(1)将灰树花子实体原料投入提取罐中，加入原料重量10-40倍的水，采用80-105℃提取1-4次，每次提取1-4小时，将提取液通过过滤网，过滤网的孔径为80-200目；合并提取液，真空浓缩至固形物含量5-20％得到灰树花提取浓缩液；
(2)将灰树花提取浓缩液引入微滤设备进行预处理，微滤膜孔径100-400nm，温度控制25-60℃，操作压力在1MPa以内，收集微滤透过液，弃去微滤未透过液；
(3)将微滤透过液引入超滤设备，用超滤膜对不同分子量的多糖进行截留纯化，超滤膜孔径对应截留1-18KDa的分子量，操作压力0.3-1MPa，温度控制25-40℃，控制透过液的体积在总体积的40％-75％时，停止超滤，保留未透过膜的超滤截留液，弃超滤透过液；
(4)将超滤截留液进行干燥，控制成品粉体水分含量＜15％，所得干粉即为灰树花多糖成品。
4.根据权利要求3所述的工业化的灰树花活性多糖的提取方法，其特征在于，包括：
(1)将灰树花子实体原料投入提取罐中，加入原料重量10-25倍的水，采用95-105℃提取2-3次，每次提取1-2小时，将提取液通过过滤网，过滤网的孔径为100-200目；合并提取液，真空浓缩至固形物含量10-18％得到灰树花提取浓缩液；
(2)将灰树花提取浓缩液引入微滤设备进行预处理，微滤膜孔径100-200nm，温度控制25-55℃，操作压力在0.8MPa以内，收集微滤透过液，弃去微滤未透过液；
(3)将微滤透过液引入超滤设备，用超滤膜对不同分子量的多糖进行截留纯化，超滤膜孔径对应截留2-15KDa分子量，操作压力0.3-0.6MPa，温度控制25-35℃，控制透过液的体积在总体积的55％-75％时，停止超滤，保留未透过膜的超滤截留液，弃超滤透过液；
(4)将超滤截留液进行干燥，控制成品粉体水分含量＜12％，所得干粉即为灰树花多糖成品。
5.根据权利要求1-4中任一所述的提取方法，其特征在于，所述的超滤截留液的干燥包括：喷雾干燥、冷冻干燥、真空干燥或常压干燥方法中的一种或几种。
6.根据权利要求1-4中任一所述的提取方法，其特征在于，所述的微滤膜材料为陶瓷膜、有机高分子膜、金属膜中的一种或几种。
7.根据权利要求1-4中任一所述的提取方法，其特征在于，所述的超滤膜孔径小于100nm，截留分子量范围1-18KDa，超滤膜材料为陶瓷膜、有机高分子膜、金属膜中的一种或几种。
8.一种权利要求1-7中任一所述的提取方法提取得到的灰树花多糖。
9.权利要求8所述的灰树花活性多糖在制备降血糖药物方面的用途。
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