CN109429894B - 一种高腺苷含量的富硒蛹虫草及其栽培方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高腺苷含量的富硒蛹虫草及其栽培方法与应用。本发明利用多糖复合纳米硒进行蛹虫草的富硒栽培，获得高腺苷含量的富硒蛹虫草。本发明提供的栽培方法获得的高腺苷含量的富硒蛹虫草产量高、有机硒含量高、营养品质高、具有抗氧化能力，有利于推广种植，具有很高的推广价值。

Description

一种高腺苷含量的富硒蛹虫草及其栽培方法与应用

技术领域

本发明属于蛹虫草栽培技术领域，具体涉及一种高腺苷含量的富硒蛹虫草及其栽培方法与应用。

背景技术

硒对人体健康有重要作用，是人类必需的微量元素，被国内外医药界和营养学界誉为“生命的火种”，享有“长寿元素”、“抗癌之王”、“心脏守护神”等美誉。其生物学功能只要有：提高人体免疫力，抗氧化、延缓衰老，保护修复细胞，防癌抗癌，对重金属有解毒作用，保护眼睛等。因此合理地摄入硒元素对人体健康、预防疾病有着重要的作用。然而我国有超过三分之二的缺硒地区，缺硒省份达22个。缺硒已严重威胁我国国民的身体健康，与克山病、大骨节病等有密切关系。中国营养学会及FA0/WHO/IAEA联合专家委员会确定人体摄入量适宜范围为60～250μg/d，安全剂量为400μg/d，中毒剂量为800μg/d。硒过量也会造成人体危害，因此亟待为缺硒人群开发安全高效硒源。自然界中硒主要以有机硒和无机硒两种形式存在，通常无机硒(硒酸盐、亚硒酸盐等)毒性较大，安全窗较窄，直接作为补硒源具有潜在危险；而有机硒(硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸、硒酵母等)毒性较低，并具有多种生物活性。在急性毒性(LD₅₀)方面，无机硒为15mg/kg，有机硒为35mg/kg，纳米硒为113mg/kg。因此利用生物转化，将无机硒转化为具有高活性的有机硒是目前硒产品的最安全有效的手段之一。随着纳米技术的进展出现的纳米硒，相比无机硒和有机硒，元素态的纳米硒(SeNPs)具有毒性低、生物利用度高、反应产率高和易于表面修饰等特点而被广泛关注。由于纳米硒的毒性低，生物体对其吸收和耐受浓度也显著高于无机硒，因此纳米硒在生物转化过程中更安全高效。

蛹虫草(Cordyceps militaris)又名蛹草菌、北虫草，分类学上属于真菌门、子囊菌亚门，核菌纲，球壳目，麦角菌科，虫草属。虫草素是在1950年从北虫草的培养液中分离出来的一种3’-脱氧腺嘌呤核苷，它具有显著的药理作用，如抑菌作用、抗肿瘤作用、抑制病毒作用，以及增强免疫功能、防治心脑血管疾病等。现代科学研究表明，虫草素是蛹虫草重要的活性成分，蛹虫草中虫草素含量为冬虫夏草的数十倍，是获得虫草素的主要来源。蛹虫草具有抗疲劳、抗肿瘤、耐缺氧、增强免疫力以及抑制血小板的凝结等作用。蛹虫草作为野生虫草的替代品，市场空间大。蛹虫草人工栽培投资少、效益高，生产周期短，一年四季均可培养。但是普通蛹虫草子实体中硒含量很低，而在培养基中加入纳米硒，通过蛹虫草的生物转化，蛹虫草中的硒含量将大大提高，并且基本以有机硒的形态存在于子实体中，从而极易被人体吸收利用。

腺苷是一种内源性嘌呤核苷酸，具有广泛的生理活性，可降低心律，影响心肌收缩力，松弛血管平滑肌，抑制脂肪分解，减少肾血流量和肾素释放，减少儿茶酚胺释放，抑制中枢神经系统，增加cAMP等多种药理作用。蛹虫草中腺苷的含量与冬虫夏草相似，甚至更高，多在0.01％以上。腺苷是我国蛹虫草子实体的质量标准之一，要求腺苷含量不少于0.055％，但目前富硒蛹虫草中的腺苷含量较低，无法满足人们对蛹虫草营养价值的需求，因此，如何栽培出高含量腺苷的富硒蛹虫草，是有待解决的问题。

发明内容

为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种高腺苷含量的富硒蛹虫草的栽培方法，用该方法栽培蛹虫草能大幅度地提高蛹虫草子实体中腺苷的含量，同时可以保持蛹虫草中硒的含量及必需氨基酸的含量，从而提高蛹虫草的营养和药用价值。

本发明的另一目的在于提供一种上述高腺苷含量的富硒蛹虫草，该蛹虫草是由上述蛹虫草培养方法获得。

本发明的再一目的在于提供一种上述高腺苷含量的富硒蛹虫草的应用。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种高腺苷含量的富硒蛹虫草的栽培方法，包括以下步骤：

(1)将培养好的蛹虫草菌丝体接种至发酵培养基中培养，得到蛹虫草种子液；

(2)将多糖复合纳米硒和步骤(1)制备的蛹虫草种子液加入到蛹虫草子实体培养基中继续培养，得到蛹虫草子实体。

步骤(1)中所述的培养好的蛹虫草菌丝体是指将蛹虫草组织分离获得的优良菌种或复壮菌种接种到PDA斜面培养基上培养获得。

所述的菌种接种于PDA斜面培养基上培养中的培养条件优选为：于18～22℃培养15～35天。

步骤(1)中所述的发酵培养基的组成如下：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、MgSO₄1.5g/L、KH₂PO₄ 3g/L和蛋白胨1g/L，余量为水。

所述的发酵培养基通过如下步骤制备得到：将如下各成分混合，加水定容，灭菌，得到发酵培养基；各成分如下：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、MgSO₄ 1.5g/L、KH₂PO₄ 3g/L和蛋白胨1g/L。

步骤(1)中所述的培养的条件优选为：在18～26℃、100～150rpm条件下震荡培养5～9天；更优选为：在18～26℃、130rpm条件下震荡培养5～7天。

步骤(2)中所述的多糖复合纳米硒是指多糖修饰的纳米硒，优选为壳聚糖-纳米硒和香菇多糖纳米硒中的一种或两种。

所述的壳聚糖-纳米硒的粒径优选为10-200nm；更优选为100nm。

所述的香菇多糖纳米硒的粒径优选为10-200nm；更优选为120nm。

所述的多糖复合纳米硒优选通过如下步骤制备得到：将多糖溶液与无机硒溶液混合，再加入还原剂进行反应，透析，得到多糖复合纳米硒；其中，各原料的用量按多糖：还原剂：无机硒＝(0.05～1)g：(1～10)mmol：1mmol计算。

所述的各原料的用量优选按多糖：还原剂：无机硒＝(0.1～0.2)g：4mmol：1mmol计算。

所述的多糖优选为壳聚糖和香菇多糖中的一种或两种。

所述的无机硒优选为亚硒酸钠。

所述的还原剂优选为维生素C。

所述的反应是在室温条件下进行。

所述的室温为0～35℃；优选为10～30℃；更优选为24～26℃。

步骤(2)中所述的纳米硒的除菌方式优选为通过1-20KGy照射量的Co60射线照射灭菌；更优选为通过10KGy照射量的Co60射线照射灭菌。

步骤(2)中所述的纳米硒的用量优选按纳米硒在蛹虫草子实体培养基中的浓度为0～120μg/g大米计算，不含端点值0；更优选按30～60μg/g大米计算；最优选按40～60μg/g大米计算。

步骤(2)中所述的蛹虫草种子液的加入量优选按蛹虫草种子液：蛹虫草子实体培养基＝体积比0.01～0.20：1计算，更优选为按蛹虫草种子液：蛹虫草子实体培养基＝体积比0.02：1计算。

步骤(2)中所述的加入的方式为：先将纳米硒加入到蛹虫草子实体培养基中，待纳米硒被完全吸收后，再加入蛹虫草种子液；或者先将纳米硒和蛹虫草种子液混合均匀，然后再将混合液加入到蛹虫草子实体培养基中。

步骤(2)中所述的蛹虫草子实体培养基的组成如下：大米和营养液按0.1～10g：1mL配比得到；优选按1g：1mL配比得到。

所述的营养液为蛹虫草培养用营养液，由黄豆、蔗糖、蚕蛹粉、奶粉和缓冲盐配制而成；其组成优选如下：黄豆8.0g/L、蔗糖8.0g/L、蚕蛹粉1.0g/L、奶粉1.0g/L，KH₂PO₄ 1.0g/L和MgSO₄ 1.0g/L。

所述的蛹虫草子实体培养基优选通过如下步骤制备得到：将大米和营养液混合，于120～128℃灭菌15～30min，再经过紫外灭菌得到。

步骤(2)中所述的继续培养的过程包括发菌管理、转色期管理、子实体生长阶段管理和采收。

所述的发菌管理的条件优选为：菌丝培养温度控制在20～24℃，空气湿度60％～70％，完全黑暗条件培养4～7天。

所述的转色期管理的条件优选为：培养温度控制在18～22℃，每天光照10小时以上，优选12h；光照强度保持在100～200Lx，优选为150Lx。

所述的子实体生长阶段管理的条件优选为：待料面上长出菌蕾后，温度适当降低，控制在16～20℃，空气湿度80～90％；光照强度保持在100～200Lx，优选为150Lx；促进子实体形成，且生长强壮、色泽鲜艳。

所述的采收的条件优选为：当子实体高度达到7～9cm，约80％子实体顶端膨大即可采收烘干。

一种高腺苷含量的富硒蛹虫草，由上述栽培方法获得。

所述的蛹虫草中腺苷的含量为0.17％～0.30％，总硒的含量为13.26～217.41μg/g，其中，硒代胱氨酸占总硒的比例为13.73％～54.52％，虫草素的含量为0.120％～0.264％，虫草酸的含量为1.46％～1.69％，必须氨基酸的含量为6.0％～7.0％。

上述高腺苷含量的富硒蛹虫草在食品领域中的应用，适合用于制备功能性食品、保健品。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

(1)采用Co60射线辐照纳米硒灭菌，灭菌方法简单，能够完整保持纳米硒的形态；现有技术大都采用高压灭菌法得到无菌纳米硒，但是高温会导致纳米硒聚沉，甚至导致其变性，从而失去效果。

(2)采用的纳米硒为多糖修饰的纳米硒，所得的纳米硒稳定性好，粒径在100-200nm，有利于蛹虫草对纳米硒的吸收。

(3)所得到的富硒蛹虫草中腺苷含量高，为0.17％～0.30％，同时其硒含量达到现有技术的水平，且又不影响蛹虫草中其他有效成分在蛹虫草中的富集。

(4)采用的纳米硒为纳米硒的冻干粉，易于储存和定量使用。

附图说明

图1为实施例2中栽培的不同分组的蛹虫草采摘时的生长情况照片图。

图2为实施例2中栽培的蛹虫草中的硒形态图谱图。

图3为实施例3不同纳米硒浓度和加入方式栽培的蛹虫草在采摘时的生长状况照片图。

图4为实施例4栽培的蛹虫草采摘时的生长情况照片图。

图5为实施例5中蛹虫草水提物清除自由基的检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

总硒的测定方法：按照GB/T 5009.93食品中硒的测定(第一法氢化物原子荧光光谱法)进行。具体方法为：将蛹虫草粉碎后或蛹虫草水提物称取约0.5g样品置于消化管中(每个样品三个平行)，加入5mL混酸(硝酸：高氯酸＝体积比3：1)，冷消化过夜，次日加热消化，待溶液变为清亮无色并伴有白烟时，再继续加热至剩余体积2mL左右，切不可蒸干。冷却，再加5.0mL浓度为6M的盐酸溶液，继续加热至溶液变为清亮无色并伴有白烟出现，将六价硒还原成四价硒。冷却，转移至15mL离心管中定容，混匀备用。同时做空白试验。

形态硒的测定方法：分别称取蛹虫草粉末约0.4g试样于10mL EP管中，分别加入7mL蛋白酶K(含有蛋白酶K 4mg)或1M盐酸，置于摇床中37℃下100rpm震荡提取24h。6000rpm下离心30min，离心取上清，过0.45μm滤膜，滤液采用HPLC-AFS分析。

蛹虫草水提物的提取：蛹虫草子实体粉末过200目筛，加入一定量的水，采用超声或者微波提取的方法提取，提取完成后，采用喷雾干燥的方法将水溶液喷干，干燥条件下保存。

依据行业标准《虫草制品中虫草素和腺苷的测定高效液相法》(NY/T 2116-2012)，虫草素和腺苷的测定方法为：称取粉碎的蛹虫草子实体0.5g于100mL容量瓶中，加水约80mL，置于超声波仪中超声提取3h，取出后用水定容，摇匀。取1mL试样离心后，将上清液过0.45μm的微孔滤膜，滤液采用高效液相测谱法分析。

虫草酸的测定方法为：称取粉碎的蛹虫草子实体0.5g，置于25mL容量瓶中，加入20mL提取液(水：乙醇＝40:60)，混匀，超声波震荡30min，冷却后用提取液定容，摇匀，经0.45μm微孔滤膜过滤，滤液采用高效液相测谱法测定。

蛹虫草子实体中氨基酸的测定根据GB5009.124-2016的方法检测。

壳聚糖-纳米硒和香菇多糖的纳米硒的制备方法为：将壳聚糖或香菇多糖溶液与Na₂SeO₃溶液混合，再加入Vc于室温进行反应，反应时间12h，用6000-8000Da的透析袋透析，得到纳米硒。壳聚糖和香菇多糖按终浓度0.5～10mg/mL计算，Vc和Na₂SeO₃的按摩尔比3～10:1进行配比。制备得到的纳米硒通过马尔文粒径仪检测。

实施例1

(1)配制蛹虫草子实体培养基

向灭菌袋中加入58g大米和60mL营养液，封口后于高压灭菌锅121℃灭菌30min；灭菌后冷却至室温，将灭菌后的培养袋置于超净台，开紫外灭菌30min，得到灭菌的蛹虫草子实体培养基。

其中营养液是由8g/L黄豆、8g/L蔗糖、1g/L蚕蛹粉、1g/L奶粉、KH₂PO₄1.0g/L和MgSO₄ 1.0g/L配制而成。其配制过程如下：将前述成分按配方量混合得到，溶剂为水。

(2)纳米硒的灭菌处理

将壳聚糖(分子量2×10⁵)溶于1％醋酸溶液中，与Na₂SeO₃溶液混合，再加入Vc溶液，得到反应液，其中，反应液中，壳聚糖的浓度为2mg/mL，维生素C的浓度为40mM，亚硒酸钠的浓度为10mM；于室温进行反应，反应时间12h，用6000-8000Da的透析袋透析，将透析液直接喷雾干燥后得到纳米硒粉末。制备得到的纳米硒在喷雾干燥后，取10mg粉末溶于1mL去离子水溶解，通过马尔文粒径仪检测，平均粒径为100nm。

将100nm的壳聚糖-纳米硒粉末密封后，用Co60射线照射，照射剂量为10KGy，得到无菌壳聚糖-纳米硒粉末，然后将其置于阴凉干燥处保存备用。

(3)蛹虫草种子液培育

将蛹虫草菌种(购于广东省微生物研究所菌种保藏中心)接种于PDA斜面培养基上，于18-22℃恒温培养箱中培养10天后，将培养好的蛹虫草菌丝体转接至装有发酵培养基的锥形瓶中，其装液量与锥形瓶的容积比约为200mL/500mL，然后在18-22℃、130rpm条件下震荡培养6天，得到蛹虫草种子液。将种子液稀释到一定的浓度后(10mL/500mL水)备用。

(4)蛹虫草子实体富硒培养

壳聚糖-纳米硒的加入方式是先将步骤(2)无菌壳聚糖-纳米硒加入到步骤(1)的灭菌蛹虫草子实体培养基中，其中壳聚糖-纳米硒的浓度为10μg/g大米，待壳聚糖-纳米硒被完全吸收后，再加入50mL步骤(3)的稀释后的蛹虫草种子液，得到总体积为65mL的菌种富硒培养基进行培养；培养时间为40～60天；同时设置不添加纳米硒的实验组作为空白对照组；培养过程中发菌管理为：菌丝培养温度控制在20～24℃，空气湿度60％～70％，完全黑暗条件培养4天；转色期管理为：培养温度控制在18～22℃，每天光照时间12h，光照强度保持在150Lx；子实体生长阶段管理为：待料面上长出菌蕾后，温度适当降低，控制在16～20℃，空气湿度80～90％，光照强度保持在150Lx，促进子实体形成，且生长强壮、色泽鲜艳；采收：当子实体高度达到7～9cm，约80％子实体顶端膨大即可采收烘干。

蛹虫草中总硒含量和平均干重的结果如表1所示：

表1蛹虫草中总硒含量和平均干重

如表1所示，添加壳聚糖-纳米硒组的总硒含量约为对照组的42.6倍，表明培养基中添加纳米硒可以显著增加硒在蛹虫草中的富集。

实施例2

(1)配制蛹虫草子实体培养基

同实施例1中的步骤(1)。

(2)纳米硒或亚硒酸钠的灭菌处理

将香菇多糖(分子量1153)用水溶解，得到香菇多糖溶液；接着将其与Na₂SeO₃溶液混合，再加入Vc溶液，得到反应液，其中，香菇多糖的浓度为1mg/mL，维生素C的浓度为40mM，亚硒酸钠的浓度为10mM；于室温进行反应，反应时间12h，用6000-8000Da的透析袋透析，将透析液直接喷雾干燥后得到纳米硒粉末。制备得到的纳米硒在喷雾干燥后，取10mg粉末溶于1mL去离子水溶解，通过马尔文粒径仪检测，平均粒径为120nm。

将粒径为120nm的纳米硒粉末或亚硒酸钠(M_W＝172.94)密封后，用Co60射线照射，照射剂量为10KGy，得到无菌纳米硒粉末或亚硒酸钠，然后将其置于阴凉干燥处保存备用。

(3)蛹虫草种子液培育

同实施例1中的步骤(3)。

(4)蛹虫草子实体富硒培养

香菇多糖-纳米硒加入方式是先将步骤(2)制备得到的无菌纳米硒粉末或亚硒酸钠加入到步骤(1)的灭菌蛹虫草子实体培养基中，设置对照组亚硒酸钠，亚硒酸钠的加入方式同香菇多糖-纳米硒；其中硒的种类和浓度见表2，表中浓度的分母为大米的质量含量，待纳米硒粉末或亚硒酸钠被完全吸收后，再加入50mL步骤(3)的稀释后的蛹虫草种子液，得到总体积为65mL的菌种富硒培养基进行培养；培养时间为40～60天，在培养的不同时间采样进行检测；同时设置不添加纳米硒的实验组作为空白对照组；培养过程中同实施例1。

表2纳米硒的种类及浓度

在培养到第8周时进行采收，不同分组的蛹虫草的采收时照片如图1所示，图1的9幅小图先从左到右，再从上到下的顺序分别对应A～I组。从图1可以看出，亚硒酸钠组的子实体比空白对照组和香菇多糖-纳米硒组的都要细，其平均鲜重、平均干重以及干湿比的结果如表3所示。结果显示，亚硒酸钠的加入会导致蛹虫草的产量降低，而纳米硒的加入对蛹虫草的产量影响较小。

表3蛹虫草生长情况。

蛹虫草(培养8周)中总硒含量和形态硒含量的结果如表4所示。结果表明，无论是纳米硒的加入还是亚硒酸钠的加入，都会使蛹虫草子实体中的硒含量显著增加。随着加入的纳米硒的浓度的增加，蛹虫草子实体中的硒含量也逐渐增加。采用高效液相-原子荧光测定的不同硒源和不同提取方式硒形态的图谱如图2所示，检测样品来自C组和G组，其中的标准曲线是由如下物质上样后制备得到：硒代胱氨酸(SeCys)，出峰时间(t_R)＝3.30min，为1号；甲基硒代半胱氨酸(Met-SeCys)，t_R＝3.96min，为2号；四价硒(Se(IV))，t_R＝4.77min，为3号；硒代蛋氨酸(SeMet)，t_R＝4.33min，为4号；六价硒(Se(VI))，t_R＝14.20min，为5号。可见，相同浓度的亚硒酸钠组和纳米硒组相比，纳米硒组的有机硒的转化率远远高于亚硒酸钠组。结合培养6周采集的蛹虫草检测结果(I组总硒含量＞C组总硒含量)，如表4所示，可见，相对于亚硒酸钠，纳米硒在虫草中的代谢更快，在培养到第8周时，硒的转化量更高，这也说明使用纳米硒培养蛹虫草可能缩短蛹虫草的生长周期。

表4蛹虫草中总硒含量和形态硒含量

表5为蛹虫草子实体水提物的含量总量的测定。结果显示，加入纳米硒组的水提物中总硒含量显著高于亚硒酸钠组。

表5蛹虫草子实体水提物中总硒含量

表6为蛹虫草中虫草素、腺苷以及虫草酸的含量。结果显示，纳米硒和亚硒酸钠的加入基本不会影响虫草素的含量，但是纳米硒的在相对较小量的加入就可以显著地提高虫草中腺苷的含量，可见，纳米硒相对于亚硒酸钠对虫草腺苷含量的促进作用相对比较好。

表6蛹虫草中虫草素、腺苷以及虫草酸的含量

实施例3

(1)配制蛹虫草子实体培养基

同实施例1中的步骤(1)。

(2)纳米硒的灭菌处理

将香菇多糖(分子量1153)用水溶解，得到香菇多糖溶液；接着将其与Na₂SeO₃溶液混合，再加入Vc溶液，得到反应液，其中，香菇多糖的浓度为1mg/mL，维生素C的浓度为40mM，亚硒酸钠的浓度为10mM；于室温进行反应，反应时间12h，用6000-8000Da的透析袋透析，将透析液直接喷雾干燥后得到纳米硒粉末。制备得到的纳米硒在喷雾干燥后，取10mg粉末溶于1mL去离子水溶解，通过马尔文粒径仪检测，平均粒径为120nm。

将粒径为120nm的香菇多糖-纳米硒粉末密封后，用Co60射线照射，照射剂量为10KGy，得到无菌香菇多糖-纳米硒粉末，然后将其置于阴凉干燥处保存备用。

(3)蛹虫草种子液培育

同实施例1中的步骤(3)。

(4)蛹虫草子实体富硒培养

香菇多糖-纳米硒采用两种加入方式：第一种是先将步骤(2)无菌香菇多糖-纳米硒粉末加入到步骤(1)的灭菌蛹虫草子实体培养基中，待香菇多糖-纳米硒粉末被完全吸收后，再加入步骤(3)的蛹虫草种子液；第二种是先将步骤(2)无菌香菇多糖-纳米硒和步骤(3)的蛹虫草种子液混合均匀，然后将混合液接入步骤(1)灭菌蛹虫草子实体培养基中；其中香菇多糖-纳米硒的加入方式和浓度、蛹虫草种子液的加入量见表7，表中浓度表示为大米的质量含量；得到总体积为65mL的菌种富硒培养基进行培养；培养时间为60天；同时设置不添加纳米硒的实验组作为空白对照组；培养过程中同实施例1。

表7纳米硒浓度及加入方式

图3为不同纳米硒浓度和加入方式栽培的蛹虫草在采摘时的生长状况图。结果发现高浓度(120μg/g大米)的纳米硒对蛹虫草的生长具有一定的抑制作用。30μg/g大米与60μg/g大米的纳米硒对蛹虫草的生长没有明显的抑制作用。表8为蛹虫草采收时的平均鲜重、平均干重和干湿比的情况。

表8蛹虫草采收时的平均鲜重、平均干重和干湿比

蛹虫草中的总硒含量测定结果如表9所示，结果显示，随着加入的纳米硒的含量的增加，蛹虫草子实体中的硒含量显著增加。

表9蛹虫草中总硒含量

实施例4

(1)～(3)同实施例3。

(4)蛹虫草子实体富硒培养

香菇多糖-纳米硒的加入方式是先将步骤(2)无菌香菇多糖-纳米硒和步骤(3)的蛹虫草种子液混合均匀，然后将混合液接入步骤(1)灭菌蛹虫草子实体培养基中；其中香菇多糖-纳米硒的浓度60μg/g大米，蛹虫草种子液含量为10mL/500mL含纳米硒的水溶液；得到总体积为65mL的菌种富硒培养基进行培养，一次性种植278袋；培养时间为60天；同时设置不添加纳米硒的实验组作为空白对照组；培养过程中同实施例1。

图4为蛹虫草采收时的生长情况图，从图4可以看出，蛹虫草生长良好。采收时富硒蛹虫草共278袋，总鲜重为14.416kg，平均鲜重为51.85g/袋；总干重2kg，平均干重为7.19g；干湿比为0.1395。

蛹虫草子实体中的总硒含量如表10所示，结果显示纳米硒的加入可以显著提高蛹虫草子实体的硒含量。

表10蛹虫草子实体总硒含量

实施例5

将实施例4中的蛹虫草子实体粉末，过60目筛，加入一定量的水，采用超声提取的方法提取(具体提取方法参考江苏省地方标准DB32/T 1275-2008《蛹虫草中虫草素含量的测定高效液相色谱法》)，提取完成后，采用喷雾干燥的方法将水溶液喷干，干燥条件下保存。

(1)用甲醇配制浓度为6mM的DPPH溶液，-20℃避光保存备用。

(2)取适量上述DPPH溶液，加入甲醇稀释，使溶液中的OD₅₁₅值为0.30±0.01。

(3)称取一定量的水提物用去离子水配制成12.5μg/mL的水提物溶液，备用。

(4)测定时先在96孔板中加入20μL被测水提物溶液，对照组加入20μL DMSO溶剂，然后每孔加入180μL步骤(2)制备的DPPH溶液。震荡均匀后，用VERSAmax酶标仪测定515nm处的吸光值(代表DPPH自由基的含量)。以上操作在室温下避光进行。

图5为蛹虫草水提物清除自由基的情况，结果如图5所示，加入12.5μg/mL的富硒或不富硒蛹虫草水提物，富硒蛹虫草水提物清除自由基的能力强于非富硒蛹虫草水提物的能力。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种高腺苷含量的富硒蛹虫草的栽培方法，其特征在于步骤如下：

（1）将培养好的蛹虫草菌丝体接种至发酵培养基中培养，得到蛹虫草种子液；

（2）将多糖复合纳米硒和步骤（1）制备的蛹虫草种子液加入到蛹虫草子实体培养基中继续培养，得到蛹虫草子实体；

步骤（1）中所述的蛹虫草菌丝体是指将蛹虫草组织分离获得优良菌种或复壮菌种接种到PDA斜面培养基上，于18～22℃培养15～35天获得；

步骤（1）中所述的发酵培养基的组成如下：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、MgSO41.5g/L、KH2PO43g/L和蛋白胨1g/L，余量为水；

步骤（2）中所述的多糖复合纳米硒的除菌方式是通过1-20KGy照射量的Co60射线照射灭菌；

步骤（2）中所述的蛹虫草子实体培养基的组成如下：大米和营养液按0.1～10g：1mL配比得到；

步骤（2）中所述的纳米硒的用量按纳米硒在蛹虫草子实体培养基中的浓度为30~40μg/g大米计算；

所述的营养液的组成如下：黄豆8.0g/L、蔗糖8.0g/L、蚕蛹粉1.0g/L、奶粉1.0g/L，KH2PO4 1.0g/L和MgSO4 1.0g/L；

步骤（2）中所述的多糖复合纳米硒为壳聚糖-纳米硒和香菇多糖纳米硒中的一种或两种。

2.根据权利要求1所述的高腺苷含量的富硒蛹虫草的栽培方法，其特征在于：

所述的壳聚糖-纳米硒的粒径为10-200 nm；

所述的香菇多糖纳米硒的粒径为10-200 nm。

3.根据权利要求1所述的高腺苷含量的富硒蛹虫草的栽培方法，其特征在于：

所述的多糖复合纳米硒通过如下步骤制备得到：将多糖溶液与无机硒溶液混合，再加入还原剂进行反应，透析，得到多糖复合纳米硒；其中，各原料的用量按多糖：还原剂：无机硒=（0.05～1）g：（1～10）mmol：1mmol计算。

4.根据权利要求1所述的高腺苷含量的富硒蛹虫草的栽培方法，其特征在于：

步骤（2）中所述的蛹虫草种子液的加入量按蛹虫草种子液：蛹虫草子实体培养基=体积比0.01～0.20：1计算。

5.根据权利要求1所述的高腺苷含量的富硒蛹虫草的栽培方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的培养的条件为：在18～26℃、100～150 rpm条件下震荡培养5～9天；

步骤（2）中所述的加入的方式为：先将纳米硒加入到蛹虫草子实体培养基中，待纳米硒被完全吸收后，再加入蛹虫草种子液；或者先将纳米硒和蛹虫草种子液混合均匀，然后再将混合液加入到蛹虫草子实体培养基中；

步骤（2）中所述的继续培养的过程包括发菌管理、转色期管理、子实体生长阶段管理和采收。

6.根据权利要求5所述的高腺苷含量的富硒蛹虫草的栽培方法，其特征在于：

所述的发菌管理的条件为：菌丝培养温度控制在20～24℃，空气湿度60%～70%，完全黑暗条件培养4～7天；

所述的转色期管理的条件为：培养温度控制在18～22℃，每天光照10小时以上；光照强度保持在100～200Lx；

所述的子实体生长阶段管理的条件为：待料面上长出菌蕾后，温度适当降低，控制在16～20℃，空气湿度80～90%；光照强度保持在100～200Lx；

所述的采收的条件为：当子实体高度达到7～9 cm，80%子实体顶端膨大即可采收烘干。

7.一种高腺苷含量的富硒蛹虫草，其特征在于：由权利要求1～6任一项所述的栽培方法获得。

8.权利要求7所述的高腺苷含量的富硒蛹虫草在食品领域中的应用。

9.根据权利要求8所述的高腺苷含量的富硒蛹虫草在食品领域中的应用，其特征在于：所述的食品包括功能性食品和保健品。

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