CN113498863B - 一种具有清除自由基能力的纳米载体的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有清除自由基能力的纳米载体制备方法，包括以下步骤：S1、将黑木耳粉与水按质量比1：60的比例混合，在30～35℃下发酵，离心得黑木耳发酵液；S2、在180～220℃下水热反应6～10h；S3、用2～5倍体积的无水乙醇浸泡，离心得粗提物溶液；S4、分离纯化后，收集荧光组分，冷冻干燥得纳米载体。本发明原料来源广泛且价格低廉，制作过程简单，获得的荧光纳米粒子‑金属复合物具有良好的生物相容性，还具有清除自由基能力，表面具有丰富的金属离子结合位点，可作为新型的金属元素补充剂；并且本发明中纳米粒子‑锌复合在同样浓度下对细胞几乎无影响，细胞活力接近100％。
Description
技术领域
本发明涉及纳米技术领域，具体来说，涉及一种具有清除自由基能力的纳米载体的制备及其金属离子载运的应用。
背景技术
自然界中包括铁、锌、铜、铬、钴、锰和钼在内的金属元素被认为是人体必需微量元素。这些金属元素在人体内含量极少，但具有强大的生物学作用，可参与酶、激素、维生素和核酸的代谢过程。这些元素不能在人体内合成，需要从食物中摄取来满足机体的需要。然而，食物中的含量较为有限，不能满足人体日常所需。另外，日常膳食中摄入的植酸、纤维素等物质会抑制这些金属元素在肠道内的正常吸收，使其生物利用度降低。为了满足人体对这些金属元素的需要，世界营养会议提出，根据各国实际情况可在食品中添加金属元素补充剂。
目前，用于制备金属元素补充剂的载体主要可分为四类：无机酸根离子、有机酸、氨基酸和生物活性肽。其中，以无机酸根离子为载体合成制剂的工艺简单，成本低，但是制得的金属元素补充剂吸收效率极低，不易保存，对胃肠道有刺激作用；以有机酸为载体合成的制剂虽然吸收效果好于无机盐，但其制备工艺复杂，得率低，服用后伴常有恶心呕吐等副作用；以氨基酸为载体合成的制剂化学性质较为稳定，但在螯合机制和转运方面存在缺陷；以生物活性肽为载体合成的制剂，除了具备上述制剂的优点外，还具有一定的清除自由基能力，但肽的制备和分离成本较高、结合能力有限。因此，迫切需要合成一种成本低，结合能力强、生物利用度好的金属离子载体用以制备新型金属元素补充剂。
在《Preparation,characterization,and anti-inflammatory effect of thechelate of Flammulina velutipes polysaccharide with Zn》中最优方案的金针菇多糖-锌螯合物在浓度为50μg/mL时细胞活力约为80％。
发明内容
本发明提供了一种具有自由基清除能力的纳米载体的制备方法，以解决现有技术中纳米载体制备工艺复杂、成本高、结合能力有限以及所构建的金属离子载运体系生物相容性不高等问题。
为了解决上述问题，本发明提供一种具有清除自由基能力的纳米载体制备方法，包括以下步骤：
S1、将黑木耳粉与水按质量比1：60的比例混合，在30～35℃下发酵10～15天，离心获得黑木耳发酵液；
S2、将所述黑木耳发酵液在180～220℃下水热反应6～10h；
S3、再用2～5倍体积的无水乙醇浸泡，经离心得粗提物溶液；
S4、分离纯化后，收集荧光组分，冷冻干燥得纳米载体。
优选的，步骤S1中所述发酵用枯草芽孢杆菌、乳酸菌和酿酒酵母菌悬液的一种或多种组合。
优选的，步骤S1中所述离心方法包括3000～6000rpm转速离心10～20min，除去沉淀得黑木耳发酵液。
优选的，步骤S3中所述离心方法包括6000～10000rpm转速离心10～20min，除去沉淀得粗提物溶液。
优选的，步骤S4中所述分离纯化的方法包括以水为洗脱液，用D101大孔树脂对粗提物进行吸附。
优选的，步骤S4中所述荧光组分为365nm紫外灯照射下显荧光的组分。
一种基于上述纳米载体制备纳米粒子-金属复合物的方法，包括以下步骤：
S1、取纳米粒子，溶于浓度为5～10mg/mL金属离子溶液中，获得反应溶液；
S2、调节所述反应溶液pH为5～9，50～70℃水浴加热1～4h；
S3、透析并冷冻干燥得纳米粒子-金属复合物。
优选的，步骤S1中所述金属离子来源包括金属盐：硫酸锌、氯化锌、硫酸亚铁、氯化亚铁和氯化钙。
优选的，所述纳米粒子与所述金属盐的质量比为1：1。
优选的，步骤S3中所述透析方法包括用100-500Da透析袋，透析8～12h，保留分子量大于300Da的溶液。
本发明的有益效果：
本发明所需原料来源广泛且价格低廉，制作过程简单，便于操作，获得的荧光纳米粒子-金属复合物具有良好的生物相容性，还具有清除自由基能力，表面具有丰富的金属离子结合位点，可作为新型的金属元素补充剂。
与现有技术相比本发明方法的原料为黑木耳，价格低廉，并且制备过程较为简单易于操作。并且本发明中纳米粒子-锌复合在同样浓度下对细胞几乎无影响，细胞活力接近100％，说明纳米粒子-锌复合物具有更好地的生物相容性，其载体纳米粒子可作为潜在的金属离子载体用于金属元素递送。
附图说明
图1是本发明制备的纳米载体的透射电子显微镜照片及粒径分布图；
图2是本发明制备的纳米载体的粒径分布图；
图3是本发明制备的纳米载体的傅里叶红外变换光谱图；
图4是本发明制备的纳米载体对DPPH自由基清除能力图；
图5是本发明制备的纳米载体对羟基自由基清除能力图；
图6是本发明制备的纳米粒子-锌复合物的傅里叶红外变换光谱图；
图7是本发明制备的纳米粒子-锌复合物的透射电子显微镜照片；
图8是本发明制备的纳米粒子-锌复合物的细胞毒性测定结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
一种具有清除自由基能力的纳米载体的制备方法，包括以下步骤：
A、将黑木耳粉与水按质量比1：60的比例进行混合，在一定温度下发酵10-15天，经离心获得黑木耳发酵液；
B、将黑木耳发酵液放置于高压反应釜中，水热反应一定时间；
C、用无水乙醇溶解步骤B中水热反应后的溶液，经离心得粗提物溶液；
D、使用D101大孔树脂对粗提物进行分离纯化，收集荧光组分，冷冻干燥得纳米粒子，即纳米载体。
E、称取一定质量的纳米载体，溶解于金属离子溶液中，获得反应溶液；
F、调节反应溶液至合适的pH，水浴加热一定时间；
G、透析8～12h去除游离锌，得纳米粒子-金属复合物。
所述步骤A中将2～3g黑木耳粉与150mL水混合，加入枯草芽孢杆菌、乳酸菌和酿酒酵母菌悬液中的一种或任意两种或三种的组合，在30～35℃温度下发酵10～15天，直至肉眼可见绝大部分黑木耳颗粒被微生物分解，活性物质释放到溶液中，经3000～6000rpm转速离心10～20min去除沉淀得黑木耳发酵液。
发酵方法还包括：加入枯草芽孢杆菌菌悬液4mL，30℃下发酵13天；分别加入乳酸菌和酿酒酵母菌悬液各4mL，30℃下各发酵7天。
所述步骤B中将黑木耳发酵液放置于高压反应釜中，180～220℃连续水热反应6～10h。
所述步骤C中用2～5倍体积无水乙醇浸泡水热反应后的溶液，6000～10000rpm转速离心10～20min去除沉淀得粗提物溶液。
所述步骤D中以水为洗脱液，用D101大孔树脂对粗提物进行吸附纯化，收集的荧光组分为在365nm紫外灯照射下激发显荧光的组分。
所述步骤D中冷冻干燥得纳米粒子。所述干燥条件为：温度-10～-50℃,真空度1.3～13Pa，干燥时间48～72h。
所述步骤E中称取5～15mg纳米载体，溶解于1～2mL浓度为5～10mg/mL的金属离子溶液中，获得反应溶液。
所述步骤E中金属离子溶液为硫酸锌、氯化锌、硫酸亚铁、氯化亚铁和氯化钙中的一种。
所述步骤E中纳米载体与金属盐颗粒的质量比为1：1。
所述步骤F中调节反应溶液的pH控制在5～9，50～70℃水浴加热1～4h。
所述步骤G中选用截留分子量为100-500Da透析袋，保留分子量大于300Da的溶液，冷冻干燥得纳米粒子-金属复合物。
以黑木耳发酵液为碳源水热合成纳米粒子，即金属离子载体的方法，所需原料来源广泛且价格低廉，制作过程简单可控，便于操作，获得的荧光纳米载体具有清除自由基的能力，且通过其制备的纳米粒子-金属复合物具有良好的生物相容性。
实施例1
一种具有清除自由基能力的纳米载体的制备方法，具体步骤为：A、将2.5g黑木耳粉与150g水混合，首先加入枯草芽孢杆菌和乳酸菌菌悬液各4mL，30℃发酵6天，在第7天加入酿酒酵母菌悬液4mL，30℃继续发酵至13天，经4000rpm离心10min获得黑木耳发酵液；B、将黑木耳发酵液放置于高压反应釜中，200℃连续水热反应8h；C、用4倍体积无水乙醇溶解反应溶液，6000rpm速度离心20min获得粗提物溶液；D、以水为洗脱液，用D101大孔树脂对粗提物进行分离纯化，收集365nm紫外灯照射下显荧光的组分，冷冻干燥得纳米粒子，即纳米载体。
实施例2
纳米载体的性质研究:
A、纳米载体的形态及粒径分布，图1是纳米载体的透射电子显微镜照片及粒径分布图，结果显示，以黑木耳发酵液为碳源制备的纳米载体为近球形颗粒，粒径分布均匀，颗粒尺寸集中在1.5～2.5nm范围内；
B、纳米载体的DPPH自由基清除能力，将100μL浓度为0.01mmol/mL的DPPH乙醇溶液与100μL不同浓度的纳米载体溶液充分混合，避光反应30min，用蒸馏水代替样品溶液作为空白对照，在紫外519nm下测定溶液的吸光度值，并用下列公式计算清除率：清除率＝[1-(A1-A2)/A0]×100％,其中A0是空白对照组的吸光度，A1是样品溶液和DPPH乙醇溶液的吸光度，A2是蒸馏水和样品溶液的吸光度，不同浓度纳米载体溶液对DPPH自由基的清除能力测定。
结果如图4所示，从图中可以看出，纳米载体的DPPH自由基清除率随溶液浓度的增加而增大，当样品浓度为0.2mg/mL时，DPPH自由基的清除率高达88.0％；
C、纳米载体的羟基自由基清除能力，将1mL的不同浓度的样品溶液、9mmol/L的FeSO4溶液1mL、9mmol/L的水杨酸溶液1mL和2.4mmol/L H2O2溶液混合，在37℃下孵育30min，于紫外510nm下测定混合物的吸光度，以蒸馏水代替样品溶液作为空白对照，并用下列公式计算清除率：清除率＝[1-(A1-A2)/A0]×100％,其中A0是空白对照组的吸光度，A1是实验组的吸光度，A2是以蒸馏水代替H2O2溶液的吸光度，不同浓度纳米载体溶液对羟基自由基的清除能力。
测定结果如图5所示，纳米载体对羟基自由基的清除能力具有浓度依赖性，EC50值为3.74mg/mL，当样品溶液为8mg/mL时，对羟基自由基的清除率高达82.3％。
D、纳米载体的傅里叶红外变换光谱表征，图6是纳米载体的红外光谱图，纳米载体在3500-3100cm-1范围内含有O-H和N-H的拉伸振动峰，1700-1500cm-1有C＝O的拉伸振动峰，1401cm-1有C-H的拉伸振动峰，1101cm-1有C-O的伸缩振动峰。
实施例3
纳米粒子-金属复合物的制备方法，这里以纳米粒子-锌复合物的制备方法为例，具体步骤为：A、称取10mg纳米粒子，溶解于2mL浓度为5mg/mL的硫酸锌溶液中，获得反应溶液；B、调节反应溶液pH至6，在60℃水浴加热2h；C、用300Da透析袋，保留分子量大于300Da的溶液，冷冻干燥的纳米粒子-锌复合物。
实施例4
纳米粒子-锌复合物的性质表征，A、纳米粒子-锌复合物的形态，图7是纳米粒子-锌复合物的透射电子显微镜照片，结果显示，纳米粒子-锌复合物未呈现单一分散性，表现出明显的聚集态；B、纳米粒子-锌复合物的傅里叶红外变换光谱表征，图6是纳米粒子-锌复合物的傅里叶红外光谱图，纳米载体在3242cm-1处的吸收峰的消失与O-H参与锌离子结合有关，纳米载体在1700～1600cm-1范围内两处吸收峰的消失也说明羧基中的C＝O参与了纳米载体与锌的结合，纳米粒子-锌复合物的形成，可使C-H键在1401cm-1处的吸收峰移动至1425cm-1处，纳米载体在1101cm-1处的吸收峰移动至1135cm-1处也意味着C-O和C-N在与锌的配位中起着重要作用，纳米粒子-锌复合物的红外光谱中还发现了621cm-1处Zn-O键的存在。
实施例5
纳米粒子-锌复合物的细胞毒性测定，具体步骤为：
A、将NRK细胞接种到96孔板中，在37℃和含有5％的CO2培养箱孵育24h；
B、用不同浓度的纳米粒子-锌复合物溶液再次孵育细胞24h；
C、向每孔中添加20μL浓度为5mg/mL的噻唑蓝溶液并孵育3h；
D、将孔内溶液吸出，分别向每孔内加入150μL二甲基亚砜，避光摇动20min后，用酶标仪在490nm处测量溶液的吸光度，细胞存活率的计算公式如下：Q＝A1/A0×100％，A0是对照组的吸光度，A1是实验组的吸光度。图8是纳米粒子-锌复合物的细胞毒性测定结果图，结果显示，纳米粒子-锌复合物对细胞的几乎没有明显的细胞毒性，当浓度为100μg/mL时，NRK细胞的存活率可达75％。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种具有清除自由基能力的纳米载体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将黑木耳粉与水按质量比1:60的比例混合，在30～35℃下发酵10～15天，离心获得黑木耳发酵液；所述发酵用枯草芽孢杆菌、乳酸菌和酿酒酵母菌悬液的一种或多种组合；所述离心方法包括3000～6000rpm转速离心10～20min，除去沉淀得黑木耳发酵液；
S2、将所述黑木耳发酵液在180～220℃下水热反应6～10h；
S3、再用2～5倍体积的无水乙醇浸泡，经离心得粗提物溶液；所述离心方法包括6000～10000rpm转速离心10～20min，除去沉淀得粗提物溶液；
S4、分离纯化后，收集荧光组分，冷冻干燥得纳米载体；所述分离纯化的方法包括以水为洗脱液，用D101大孔树脂对粗提物进行吸附；所述荧光组分为365nm紫外灯照射下激发，显荧光的组分。
2.一种基于权利要求1所述纳米载体制备纳米粒子-金属复合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、取所述纳米载体，溶于浓度为5～10mg/mL金属离子溶液中，获得反应溶液；
S2、调节所述反应溶液pH为5～9，50～70℃水浴加热1～4h；
S3、透析并冷冻干燥得纳米粒子-金属复合物。
3.根据权利要求2所述制备纳米粒子-金属复合物的方法，其特征在于，步骤S1中所述金属离子来源包括金属盐：硫酸锌、氯化锌、硫酸亚铁、氯化亚铁和氯化钙。
4.根据权利要求3所述制备纳米粒子-金属复合物的方法，其特征在于，所述纳米粒子与所述金属盐的质量比为1:1。
5.根据权利要求2所述制备纳米粒子-金属复合物的方法，其特征在于，步骤S3中所述透析包括用100～500Da的透析袋。
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