CN111138682A - 一种荧光标记的生物材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种荧光标记的生物材料及其制备方法,该方法包括以下步骤:(1)活化荧光分子;(2)将聚合物与活化荧光分子进行反应;(3)将步骤(2)反应后的溶液用去离子水透析后冻干得到荧光标记的生物材料;其中,所述的聚合物为聚氨基酸基聚合物或壳聚糖基聚合物。本发明将荧光分子上羧基活化为活性酯后使其与生物高分子上氨基进行酰胺化反应,将荧光分子化学偶联到生物高分子上。荧光标记材料因所标记荧光分子不同而具有不同的荧光颜色。此种化学标记方法避免了物理混合或静电吸附等方法中荧光分子或其微粒容易扩散出体系的缺点。该荧光标记生物材料在体内外成像、示踪、材料降解、生物传感及3D打印等研究领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物材料技术领域,具体涉及一种荧光标记的生物材料及其制备方法。
背景技术
组织工程概念提出以来人们已开发出许多类型的生物材料,其中一些聚氨基酸材料如胶原、明胶和聚赖氨酸等,多糖类材料如壳聚糖等均在分子结构上富含氨基,这不仅为细胞的粘附增殖提供正电荷粘附位点,同时也为化学改性提供活性基团。
荧光探针在体内外成像、材料示踪、生物传感等领域有重要的应用。目前市售荧光探针多为量子点、聚合物微球,将其与生物材料复合虽有良好的荧光效果,但这些微粒的加入使材料在结构上有许多不可控的变化。荧光微粒与材料在在化学结构上是完全独立的,小尺寸微粒会从材料中扩散出,无法长时间标记,同时也不能跟踪材料的降解。大尺寸微粒的引入会在较大程度上改变材料的力学性能。荧光微粒多为乳浊液保存,使用较多有机溶剂,加入材料后具有较高生物毒性。因此,需要对生物材料进行分子层面的化学荧光标记。
发明内容
为了解决以上现有技术存在的问题,本发明的目的在于提供一种荧光标记的生物材料及其制备方法。
为了实现上述目的,本发明提供以下技术方案:
一种荧光标记的生物材料的制备方法,包括以下步骤:
(1)将荧光分子溶解于溶剂A中,随后依次加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCl),室温反应4-24 h对荧光分子进行活化,得到活化荧光分子溶液;
(2)将聚合物溶于去离子水中,然后加入步骤(1)制备的活化荧光分子溶液,37 ℃避光搅拌反应12-24 h;
(3)将步骤(2)反应后的溶液用去离子水透析后冻干得到荧光标记的生物材料;
其中,所述的聚合物为聚氨基酸基聚合物或壳聚糖基聚合物。
进一步的,所述溶剂A为去离子水、二甲基亚砜(DMSO)或N,N’-二甲基甲酰胺中(DMF)的一种;为去离子水时,溶解荧光分子后的pH调节为4~6;所述荧光分子在溶剂A中的浓度为10~200 mg/mL。
进一步的,所述荧光分子为含有羧基官能团的荧光分子。
进一步的,所述荧光分子为5(6)-羧基荧光素、罗丹明B、钙黄绿素或香豆素中的一种。
进一步的,所述聚合物溶液浓度为0.5~10 %w/v;所述的荧光分子、N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔比为1/1/1~1/2/2。
进一步的,所述聚合物为聚氨基酸基聚合物时,其为含氨基官能团的聚氨基酸及其衍生物。
进一步的,所述聚合物为胶原、明胶、聚赖氨酸、甲基丙烯酸酐改性胶原、甲基丙烯酸缩水甘油酯改性胶原、甲基丙烯酸酐改性明胶、甲基丙烯酸缩水甘油酯改性明胶、甲基丙烯酸酐改性聚赖氨酸或甲基丙烯酸缩水甘油酯改性聚赖氨酸。
进一步的,所述聚合物为壳聚糖基聚合物时,其为壳聚糖及其衍生物。
进一步的,所述聚合物为壳聚糖、羧甲基壳聚糖、羟丙基壳聚糖、丙烯酸酐改性壳聚糖、甲基丙烯酸酐改性壳聚糖或甲基丙烯酸缩水甘油酯改性壳聚糖。
以上所述的制备方法制得的荧光标记的生物材料。
有益效果:本发明提供了一种荧光标记的聚氨基酸及壳聚糖基生物材料及其制备方法,本发明将荧光分子上羧基活化为活性酯后使其与生物高分子上氨基进行酰胺化反应,将荧光分子化学偶联到生物高分子上。荧光标记材料因所标记荧光分子不同而具有不同的荧光颜色。此种化学标记方法避免了物理混合或静电吸附等方法中荧光分子或其微粒容易扩散出体系的缺点。该荧光标记生物材料在体内外成像、示踪、材料降解、生物传感及3D打印等研究领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明所述荧光标记的生物材料的制备原理图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,但实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 荧光标记的甲基丙烯酸酐改性明胶(GelMA)的制备
(1)GelMA的制备:将10 g明胶溶于50 ℃0.01M PBS(pH=7.4)溶液中,向溶液中缓慢滴加0.4 g甲基丙烯酸酐,同时用氢氧化钠溶液调节维持溶液pH在8~9之间。甲基丙烯酸酐滴加完成后继续反应2h,随后用盐酸溶液调节反应液pH=7.4。将反应液移入截留分子量为10kDa的透析袋,在去离子水中透析3天后冻干得到GelMA。产物氨基取代度为60 %。
(2)将1 g罗丹明B以10 mg/mL溶解于DMF中,随后依次加入1.2 g NHS和2gEDC.HCl,室温反应4h得到活化荧光分子溶液。罗丹明B/NHS/EDC.HCl摩尔比为1/1/1。
(3)将1g GelMA以5%w/v浓度溶于去离子水,加入1mL步骤(1)所制备的活化荧光分子溶液,使荧光分子与GelMA质量百分比为1%。37 ℃避光搅拌反应24 h。
(4)以去离子水透析5天后冻干得到荧光标记的GelMA。
实施例2~6总体步骤与实施例1相同,不同实施例所使用的参数见表1所示:
表1
实施例7 荧光标记的甲基丙烯酸酐改性壳聚糖(CSMA)的制备
(1)CSMA的制备:将10 g壳聚糖溶于500 mL 2% v/v乙酸溶液中溶液中。加热至50℃,向溶液中缓慢滴加0.4 g甲基丙烯酸酐。甲基丙烯酸酐滴加完成后继续反应2h,随后用盐酸溶液调节反应液pH=7.4。将反应液移入截留分子量为10 kDa的透析袋,在去离子水中透析3天后冻干得到CSMA。产物氨基取代度为50 %。
(2)将1 g罗丹明B以10 mg/mL溶解于DMF中,随后依次加入1.2 g NHS和2 gEDC.HCl,室温反应4h得到活化荧光分子溶液。罗丹明B/NHS/EDC.HCl摩尔比为1/1/1。
(3)将1g CSMA以1%w/v浓度溶于去离子水,加入1mL步骤(1)所制备的活化荧光分子溶液,使荧光分子与GelMA质量百分比为1%。37 ℃避光搅拌反应24 h。
(4)以去离子水透析5天后冻干得到荧光标记的CSMA。
实施例8~9总体步骤与实施例1相同,不同实施例所使用的参数见表2所示:
表2
实施例1~9所制备的荧光标记材料其荧光光谱最大激发波长及发射波长见表3所示:
表3
Claims (10)
1.一种荧光标记的生物材料的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将荧光分子溶解于溶剂A中,随后依次加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐,室温反应4-24 h对荧光分子进行活化,得到活化荧光分子溶液;
(2)将聚合物溶于去离子水中,然后加入步骤(1)制备的活化荧光分子溶液,37 ℃避光搅拌反应12-24 h;
(3)将步骤(2)反应后的溶液用去离子水透析后冻干得到荧光标记的生物材料;
其中,所述的聚合物为聚氨基酸基聚合物或壳聚糖基聚合物。
2. 根据权利要求1所述的一种荧光标记的生物材料的制备方法,其特征在于,所述溶剂A为去离子水、二甲基亚砜或N,N’-二甲基甲酰胺中的一种;为去离子水时,溶解荧光分子后的pH调节为4~6;所述荧光分子在溶剂A中的浓度为10~200 mg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种荧光标记的生物材料的制备方法,其特征在于,所述荧光分子为含有羧基官能团的荧光分子。
4.根据权利要求3所述的一种荧光标记的生物材料的制备方法,其特征在于,所述荧光分子为5(6)-羧基荧光素、罗丹明B、钙黄绿素或香豆素中的一种。
5. 根据权利要求1所述的一种荧光标记的生物材料的制备方法,其特征在于,所述聚合物溶液浓度为0.5~10 %w/v;所述的荧光分子、N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔比为1/1/1~1/2/2。
6.根据权利要求1所述的一种荧光标记的生物材料的制备方法,其特征在于,所述聚合物为聚氨基酸基聚合物时,其为含氨基官能团的聚氨基酸及其衍生物。
7.根据权利要求6所述的一种荧光标记的生物材料的制备方法,其特征在于,所述聚合物为胶原、明胶、聚赖氨酸、甲基丙烯酸酐改性胶原、甲基丙烯酸缩水甘油酯改性胶原、甲基丙烯酸酐改性明胶、甲基丙烯酸缩水甘油酯改性明胶、甲基丙烯酸酐改性聚赖氨酸或甲基丙烯酸缩水甘油酯改性聚赖氨酸。
8.根据权利要求1所述的一种荧光标记的生物材料的制备方法,其特征在于,所述聚合物为壳聚糖基聚合物时,其为壳聚糖及其衍生物。
9.根据权利要求8所述的一种荧光标记的生物材料的制备方法,其特征在于,所述聚合物为壳聚糖、羧甲基壳聚糖、羟丙基壳聚糖、丙烯酸酐改性壳聚糖、甲基丙烯酸酐改性壳聚糖或甲基丙烯酸缩水甘油酯改性壳聚糖。
10.权利要求1-9任一项所述的制备方法制得的荧光标记的生物材料。
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