CN114149693B - 一种用于血管网络标记成像的染料工作液、其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物样本处理和生物医学光学成像技术领域，更具体地，涉及一种用于血管网络标记成像的染料工作液、其制备和应用。该染料工作液中引入明胶，明胶的引入一方面能有效抑制脂溶性染料从工作液中的快速析出，避免其堵塞血管引起血管破裂，保证了标记血管结构的完整性；另一方面，明胶可使染料有效聚合在血管中，使其不易被后续的组织固定、透明等操作洗脱，保证了成像时的信号强度。本发明提出的用于血管网络标记的染料工作液可以与多种透明方法荧光显微成像技术有效结合，为获取多种组织内部血管网结构的三维高分辨信息获取提供了新的技术手段。
Description
技术领域
本发明属于生物样本处理和生物医学光学成像技术领域，更具体地，涉及一种用于血管网络标记成像的染料工作液、其制备和应用。
背景技术
血管是生物体进行各种基础代谢及活动的生命通道。血管为机体提供营养，清除代谢废物并支持损伤后修复，是各器官工作的最根本保障系统，因此，很多研究致力于了解血管在发育和损伤后的重塑过程中是如何形成的，以及它们如何受到遗传缺陷和疾病的影响。血管贯穿全身并浸润组织，形成广泛的网络结构，构成这些网络的血管大小不一，从大动脉到极小的毛细血管。对血管网络的三维整体可视化，可以为了解由于遗传缺陷、损伤或疾病而发生的多器官结构、功能病变提供重要指导。
传统医学影像技术如CT、MRI等可以对较大血管进行成像，但是其有限分辨率难以有效识别毛细血管。基于传统组织切片技术获取三维结构，费时费力，且易导致结构信息的丢失，图像重建难度大。随着光学显微成像技术的不断发展，如共聚焦、多光子和光片显微镜，以及组织光透明技术的出现，为血管网的三维高分辨成像提供全新思路。这些光学显微成像技术都需要对血管结构进行整体荧光标记为前提。现有的荧光血管标记技术主要包括转基因标记，靶向性探针标记以及染料填充式标记。转基因标记主要通过转基因技术使得实验动物的血管内皮细胞表达特定荧光蛋白，该种方法所需时间周期较长，且容易出现非特异性标记；靶向性探针标记主要通过静脉注射特异性标记物结合血管内皮细胞，价格昂贵，标记不完整且信号较弱；染料填充式标记通过心脏灌注填充式染料来标记血管，但灌注过程中极易发生染料渗漏，使得血管结构破损甚至缺失。总的来说，现有的血管网络标记方法在应用于整体血管网结构标记时，均存在一定的问题，亟待解决。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明提供了一种用于血管网络标记成像的染料工作液、其制备和应用，该染料工作液中引入明胶，解决了现有技术填充式染料来标记血管在灌注过程中极易发生染料渗漏，使得血管结构破损甚至缺失等的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种用于血管网络标记成像的染料工作液，该染料工作液中含有染料分子和明胶，其中染料分子与明胶的质量比为0.1～50∶2000，其中明胶的质量百分数小于或等于10％。
优选地，所述染料分子与明胶的质量比为1～30∶2000。
优选地，所述明胶的质量百分数为0.5％～8％。
优选地，所述染料分子为脂溶性染料分子或水溶性染料分子。
进一步优选地，所述脂溶性染料分子为3，3`-双十八烷基氧碳花菁高氯酸盐、1，1`-双十八烷基-3，3，3`，3`-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐和1，1`-双十八烷基-3，3，3`，3`-四甲基吲哚二碳花菁高氯酸盐中的一种或多种；所述水溶性染料分子为荧光耦合的蛋白分子或荧光耦合的聚合物，更进一步优选为白蛋白或右旋糖酐。
优选地，该染料工作液中溶剂为醇类溶剂和水的混合物，所述醇类溶剂进一步优选为乙醇，所述醇类溶剂与水的体积比为1∶40-60。
优选地，该染料工作液中还含有磷酸盐缓冲液，其浓度为0.01M～0.05M。
按照本发明的另一个方面，提供了一种用于血管三维标记成像的染料工作液的制备方法，包括如下步骤：
(1)将染料粉末溶解到醇类溶剂中，得到染料分子浓度为0.1～10mg/ml的染料储存液；室温条件下避光保存备用；
(2)将明胶粉末与蒸馏水或磷酸盐缓冲液混合，加热至明胶融化，混合液变得澄清，得到质量百分数小于或等于10％的明胶稀释液；
(3)将步骤(1)所述染料储存液与步骤(2)所述明胶稀释液按照体积比1∶40-60混合，即得到所述染料工作液。
优选地，步骤(1)得到染料分子浓度为1～6mg/ml的染料储存液，步骤(2)得到质量百分数为0.5％～8％的明胶稀释液。
按照本发明的另一个方面，提供了一种所述染料工作液的应用，用于血管网络标记成像。
优选地，该应用包括如下步骤：
S1：首先用磷酸盐缓冲液将动物尸体内的血液冲洗干净，然后将染料工作液经心脏灌注进动物尸体内，使其循环实验动物全身血管；将充分灌注工作液的动物尸体放入低温环境冷藏，使明胶充分凝固；
S2：取出待成像动物组织放入多聚甲醛溶液中，在低温条件下固定，得到标记过的动物组织；
S3：将标记过的动物组织进行切片或整体透明，并用于共聚焦成像、双光子成像或光片荧光显微成像中获取血管结构信息。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明提供了一种用于血管网络标记成像的染料工作液，其中含有染料分子和明胶，实验发现明胶的引入一方面能有效抑制脂溶性染料从工作液中的快速析出，避免其堵塞血管引起血管破裂，保证了标记血管结构的完整性；另一方面，明胶可使染料有效聚合在血管中，使其不易被后续的组织固定、透明等操作洗脱，保证了成像时的信号强度。
(2)本发明提供的用于血管网络标记成像的染料工作液制备方法简单，仅需将染料工作液和明胶稀释液复配混合得到，且本发明所使用的试剂容易获得且价格低廉，易于大规模推广使用。
(3)本发明通过对实验动物心脏灌注本发明提供的含有明胶的染料工作液来实现血管网络结构的有效标记。该标记方法操作简单，可以实现从大血管到毛细血管的完整、高亮标记，有效克服了现有血管标记方法标记亮度低、标记不完全的问题。并且操作简单、价格低廉，可以与多种光学显微成像技术及组织光透明技术兼容和相结合，实现对多种组织器官血管网结构的三维高分辨荧光成像。
(4)本发明提供的用于血管网络标记成像的染料工作液可以有效地结合荧光显微成像技术及组织光透明技术，实现在大体积组织甚至完整器官水平下的整体血管网络结构信息的获取，为研究多种疾病发展过程中血管结构功能变化提供了新的方法。
附图说明
图1为本发明实施实验动物组织器官血管网络标记的流程示意图。
图2a为脂溶性染料DiO的分子结构式。
图2b为脂溶性染料DiI的分子结构式。
图2c为脂溶性染料DiD的分子结构式。
图3a为未加明胶和加入1％、5％和8％明胶的染料工作液放置特定时间后的白光图。
图3b为未加明胶和加入1％、5％和8％明胶的DiI染料工作液所标记的脑血管结构荧光成像图。
图4为采用不同种脂溶性染料标记的小鼠脑组织血管网结构的荧光图像。其中图4左(内容DiO+6％gel)为DiO标记的小鼠脑组织血管网结构的荧光图，图4中(内容DiI+6％gel)为DiI标记的小鼠脑组织血管网结构的荧光图，图4右(内容DiD+6％gel)为DiD标记的小鼠脑组织血管网结构的荧光图，染料工作液中的明胶浓度固定为4％。
图5a为DiI标记的小鼠心脏组织血管网结构的荧光图。
图5b为DiI标记的小鼠肝脏组织血管网结构的荧光图。
图5c为DiI标记的小鼠脾脏组织血管网结构的荧光图。
图5d为DiI标记的小鼠肾脏组织血管网结构的荧光图。
图6给出了共聚焦显微镜拍摄的采用不同标记方法的小鼠肾脏切片血管网结构的荧光图像。其中图6左(内容CD31)为CD31抗体标记的小鼠肾脏组织血管网结构的荧光图，图6中(内容Lectin)为Lectin标记的小鼠肾脏组织血管网结构的荧光图，图6右(内容DiI+4％)为DiI+4％明胶的小鼠肾脏组织血管网结构的荧光图。
图7给出了使用未加明胶和加入6％明胶的DiI染料工作液所标记、且经uDISCO透明方法透明的小鼠脑切片血管网结构的荧光图像。
图8给出了共聚焦显微镜拍摄的经Dex-FITC染料工作液标记的小鼠多种器官切片的血管网荧光图像，包括肝脏切片，肾脏切片及脑切片。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供的一种用于血管三维网络成像的染料工作液，该染料工作液中含有染料分子和明胶，染料工作液中染料分子和明胶的浓度控制对该染料工作液进行血管标注应用时填充效果有重要的影响，其中染料分子与明胶的质量比为0.1～50∶2000，较佳为1～30∶2000；其中明胶的质量百分数不大于10％，较佳为0.5％～8％，更佳为1％～6％。
本发明染料工作液中的染料分子用于与血管内壁结合并填充在血管中，使血管发出明亮荧光。染料分子可以采用脂溶性染料分子，也可以采用水溶性染料分子，一些实施例中，所使用的脂溶性染料粉末为3，3`-双十八烷基氧碳花菁高氯酸盐(DiO)，分子量881.7，结构式如图2a所示；1，1`-双十八烷基-3，3，3`，3`-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(DiI)，分子量933.87，结构式如图2b所示；或1，1`-双十八烷基-3，3，3`，3`-四甲基吲哚二碳花菁高氯酸盐(DiD)，分子量959.9，结构式如图2c所示。这三种染料均为常用的细胞膜荧光探针，可以快速和血管内皮细胞结合，发出明亮的荧光。水溶性染料分子比如荧光耦合的蛋白分子及聚合物，优选为白蛋白或右旋糖酐，右旋糖酐进一步优选为中分子右旋糖酐(平均分子量为6万～8万)或低分子右旋糖酐(平均分子量为2万～4万)，采用分子量较大的中分子右旋糖酐制备染料工作液，实验发现相对于低分子右旋糖酐获得染料工作液，标注的毛细血管有细微的不连续现象，分子量增加时可能在血管标注过程中导致染料分子的析出，因此更佳为低分子右旋糖酐。
本发明一些实施例中，该染料工作液中溶剂为醇类溶剂和水的混合物，醇类溶剂优选为乙醇。醇类溶剂与水的体积比为1∶40-60。
一些实施例中，该染料工作液中还含有磷酸盐缓冲液，其浓度为0.01M～0.05M。
传统的填充式染料工作液标记血管，染料粉末会从溶液中析出来，极易发生染料渗漏，使得血管结构破损甚至缺失。而将本发明所述染料工作液进行动物组织血管灌注标记实验时，发现明胶的加入一方面能有效减抑制脂溶性染料从工作液中的快速析出，避免其堵塞血管引起血管破裂，保证了标记血管结构的完整性；另一方面，明胶的引入使得灌注后的工作液凝固之后为胶体状，使染料有效聚合在血管中，使其不易被后续的组织固定、透明等操作洗脱，保证了成像时的信号强度。明胶是由动物的皮料熬制而成的动物蛋白质，本发明所用明胶可以为各种动物皮料熬制而成的明胶材料，不限制明胶种类，优选采用纯度相对较高的食用明胶和医用明胶，本发明一些实施例采用的为猪皮明胶。
本发明还提供了一种用于血管三维网络成像的染料工作液的制备方法，包括如下步骤：
(1)将染料粉末溶解到醇类溶剂中，得到染料分子浓度为0.1～10mg/ml，较佳为1～6mg/ml的染料储存液；室温条件下避光保存备用；
(2)将明胶粉末与蒸馏水或磷酸盐缓冲液混合，加热至明胶融化，混合液变得澄清，得到质量百分数不大于10％，较佳为0.5％～8％，更佳为1％～6％的明胶稀释液；
(3)将步骤(1)所述染料储存液与步骤(2)所述明胶稀释液按照体积比1∶40-60混合，即得到所述染料工作液。
一些实施例中，步骤(2)用用45-50℃水浴加热至明胶融化。
本发明将上述染料工作液用于血管三维网标记成像，包括如下步骤：
S1：首先用磷酸盐缓冲液将动物尸体内的血液冲洗干净，然后将染料工作液经心脏灌注进动物尸体内，使其循环实验动物全身血管；将充分灌注工作液的动物尸体放入4℃低温环境冷藏，使明胶充分凝固；
S2：取出待成像动物组织放入多聚甲醛溶液中，在4℃低温条件下固定，得到标记过的动物组织；
S3：将标记过的动物组织进行切片或整体透明，并用于共聚焦成像、双光子成像或光片荧光显微成像中获取血管结构信息。
步骤S2中将充分灌注工作液的动物尸体放入4℃低温环境冷藏，使明胶充分凝固，冷藏时间不少于6h。
本发明步骤S1中对实验动物进行心脏灌注，依次采用磷酸盐缓冲液以及染料工作液进行灌注，磷酸盐缓冲液灌注时间为5-10min，灌注量为50-100ml；染料工作液灌注时间为5-10min，灌注量为10-20ml，灌注时染料工作液温度控制在37-45℃，防止明胶提前凝固。
本发明步骤S3中，所述动物组织包括小鼠及大鼠的全脑、小脏、肝脏、肾脏、肺脏、脾脏、胃、肠等。
一些实施例中，步骤S3中，所述多聚甲醛溶液浓度为4％，固定时间不少于24h。
为了让本发明之上述和其它目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特举数实施例，来说明本发明所述染料工作液的血管网络标记方法及其应用。以下实施例中所用明胶粉末为市购猪皮明胶粉末。
实施例1
本实施例1生物组织取自C57实验小鼠，通过本发明实施例1血管标记方法对实验小鼠进行处理，如图1所示，具体包括如下步骤：
(1)配制染料储存液：将脂溶性染料粉末DiI溶解到无水乙醇中，使得溶液浓度3mg/ml，得到染料储存液，室温条件下避光保存。
(2)配制磷酸盐缓冲液和多聚甲醛固定液：磷酸盐粉末加蒸馏水配制磷酸盐缓冲液，浓度为0.01M。用配好的0.01M磷酸盐缓冲液配制4％多聚甲醛溶液。
(3)配制染料工作液：称取明胶粉末加入离心管中，加入适量蒸馏水或磷酸盐缓冲液，用50℃水浴加热至明胶融化，混合液变得澄清，得到质量百分数为1％、5％和8％的明胶稀释液。将染料储存液按体积比1∶50的比例加入明胶稀释液中，得到染料工作液。
(4)对实验动物进行心脏灌注：首先用磷酸盐缓冲液对实验动物进行心脏灌注，将动物体内的血液冲洗干净，磷酸盐缓冲液灌注时间为5min，灌注量为50ml；然后将染料工作液经心脏灌注进动物体内，使其循环实验动物全身血管，染料工作液灌注时间为5min，灌注量为10ml，灌注时染料工作液温度控制在37℃，防止明胶提前凝固；将充分灌注工作液的动物尸体放入4℃低温环境冷藏，时间为12h。
(5)取出小鼠的脑组织，放入4％的多聚甲醛溶液中，在4℃低温条件下固定24h。
(6)将通过所述血管标记方法获得的小鼠组织进行切片，并用于共聚焦荧光显微成像中。
图3a给出了不添加和添加明胶的染料工作液在室温下放置一段时间后，脂溶性染料DiI的析出情况。可以看出，未加入明胶的染料工作液在很短时间内就有明显的染料析出，而加入1％、5％及8％明胶的染料工作液则未见明显析出，但加入8％明胶的染料工作液在灌注过程中明胶有少量的凝固析出，为避免该问题，可以在40℃下进行血管灌注。图3b给出了添加不同浓度明胶的染料工作液对小鼠脑血管结构的标记情况。可以看出，由于染料会快速析出堵塞毛细血管，未加入明胶的染料工作液在小鼠脑血管中会堵塞血管导致破裂，发生明显渗漏。而加入1％、5％及8％明胶的染料工作液则可以很好的标记小鼠脑中的血管结构。
实施例2
本实施例2生物组织取自C57实验小鼠，通过本发明实施例2血管标记方法对实验小鼠进行处理，具体包括如下步骤：
(1)配制染料储存液：将脂溶性染料粉末DiO、DiI和DiD溶解到无水乙醇中，使得溶液浓度分别为1mg/ml、6mg/ml和3mg/ml，得到染料储存液，室温条件下避光保存。
(2)配制磷酸盐缓冲液和多聚甲醛固定液：磷酸盐粉末加蒸馏水配制磷酸盐缓冲液，浓度为0.01M。用配好的0.01M磷酸盐缓冲液配制4％多聚甲醛溶液。
(3)配制染料工作液：称取明胶粉末加入离心管中，加入适量蒸馏水或磷酸盐缓冲液，用45℃水浴加热至明胶融化，混合液变得澄清，得到质量百分数为6％的明胶稀释液。将染料储存液按1∶50的比例加入明胶稀释液中，得到染料工作液。
(4)对实验动物进行心脏灌注：首先用磷酸盐缓冲液对实验动物进行心脏灌注，将动物体内的血液冲洗干净，磷酸盐缓冲液灌注时间为5min，灌注量为50ml；然后将染料工作液经心脏灌注进动物体内，使其循环实验动物全身血管，染料工作液灌注时间为10min，灌注量为15ml，灌注时染料工作液温度控制在37℃，防止明胶提前凝固；将充分灌注工作液的动物尸体放入4℃低温环境冷藏，时间为12h。
(5)取出小鼠的脑组织，放入4％的多聚甲醛溶液中，在4℃低温条件下固定24h。
(6)将通过所述血管标记方法获得的小鼠组织进行切片，并用于共聚焦荧光显微成像中。
图4给出了共聚焦显微镜拍摄的采用不同脂溶性染料标记的小鼠脑组织血管网结构的荧光图像。其中图4左(内容DiO+6％gel)为DiO标记的小鼠脑组织血管网结构的荧光图，图4中(内容DiI+6％gel)为DiI标记的小鼠脑组织血管网结构的荧光图，图4右(内容DiD+6％gel)为DiD标记的小鼠脑组织血管网结构的荧光图，染料工作液中的明胶浓度固定为4％。结果表明，基于本发明提供的血管标记方法，三种脂溶性染料都可以较好的标记鼠脑组织内的血管网结构。
实施例3
本实施例3生物组织取自C57实验小鼠，通过本发明实施例3血管标记方法对实验小鼠进行处理，具体包括如下步骤：
(1)配制染料储存液：将脂溶性染料粉末DiI溶解到无水乙醇中，使得溶液浓度为4mg/ml，得到染料储存液，室温条件下避光保存。
(2)配制磷酸盐缓冲液和多聚甲醛固定液：磷酸盐粉末加蒸馏水配制磷酸盐缓冲液，浓度为0.01M。用配好的0.01M磷酸盐缓冲液配制4％多聚甲醛溶液。
(3)配制染料工作液：称取明胶粉末加入离心管中，加入适量蒸馏水或磷酸盐缓冲液，用50℃水浴加热至明胶融化，混合液变得澄清，得到质量百分数为1％的明胶稀释液。将染料储存液按1∶40的比例加入明胶稀释液中，得到染料工作液。
(4)对实验动物进行心脏灌注：首先用磷酸盐缓冲液对实验动物进行心脏灌注，将动物体内的血液冲洗干净，磷酸盐缓冲液灌注时间为5min，灌注量为50ml；然后将染料工作液经心脏灌注进动物体内，使其循环实验动物全身血管，染料工作液灌注时间为5min，灌注量为15ml，灌注时染料工作液温度控制在37℃，防止明胶提前凝固；将充分灌注工作液的动物尸体放入4℃低温环境冷藏，时间为12h。
(5)取出小鼠的肝、肾、脾等组织，放入4％的多聚甲醛溶液中，在4℃低温条件下固定24h。
(6)将通过所述血管标记方法获得的小鼠组织进行切片，并用于共聚焦荧光显微成像中。
图5a-5d给出了共聚焦显微镜拍摄的采用脂溶性染料DiI标记的小鼠不同器官血管网结构的荧光图像，染料工作液中的明胶浓度固定为1％。其中图5a为DiI标记的小鼠心脏组织血管网结构的荧光图，图5b为DiI标记的小鼠肝脏组织血管网结构的荧光图，图5c为DiI标记的小鼠脾脏组织血管网结构的荧光图，图5d为DiI标记的小鼠肾脏组织血管网结构的荧光图。结果表明，本发明提供的血管标记方法可以很好地标记小鼠多种器官内的血管网结构。
实施例4
本实施例4生物组织取自C57实验小鼠，通过本发明实施例4血管标记方法对实验小鼠进行处理，具体包括如下步骤：
(1)配制染料储存液：将脂溶性染料粉末DiI溶解到无水乙醇中，使得溶液浓度为8mg/ml，得到染料储存液，室温条件下避光保存。
(2)配制磷酸盐缓冲液和多聚甲醛固定液：磷酸盐粉末加蒸馏水配制磷酸盐缓冲液，浓度为0.01M。用配好的0.01M磷酸盐缓冲液配制4％多聚甲醛溶液。
(3)配制染料工作液：称取明胶粉末加入离心管中，加入适量蒸馏水或磷酸盐缓冲液，用50℃水浴加热至明胶融化，混合液变得澄清，得到质量百分数为4％的明胶稀释液。将染料储存液按1∶60的比例加入明胶稀释液中，得到染料工作液。
(4)对实验动物进行心脏灌注：首先用磷酸盐缓冲液对实验动物进行心脏灌注，将动物体内的血液冲洗干净，磷酸盐缓冲液灌注时间为5min，灌注量为50ml；然后将染料工作液经心脏灌注进动物体内，使其循环实验动物全身血管，染料工作液灌注时间为5min，灌注量为10ml，灌注时染料工作液温度控制在37℃，防止明胶提前凝固；将充分灌注工作液的动物尸体放入4℃低温环境冷藏，时间为12h。
(5)取出小鼠的肾脏组织，放入4％的多聚甲醛溶液中，在4℃低温条件下固定24h。
(6)将通过所述血管标记方法获得的小鼠组织进行切片，并用于共聚焦荧光显微成像中。
此外，CD31抗体以及植物凝集素lectin通过尾静脉注射对相应C57实验小鼠进行血管标记，对实验小鼠进行常规灌流后取出肾脏组织进行固定、切片及观察，用以与本发明提供的血管标记方法在标记效果上进行比较。图5给出了共聚焦显微镜拍摄的采用不同标记方法的小鼠肾脏切片血管网结构的荧光图像。其中图6左(内容CD31)为CD31抗体标记的小鼠肾脏组织血管网结构的荧光图，图6中(内容Lectin)为Lectin标记的小鼠肾脏组织血管网结构的荧光图，图6右(内容DiI+4％)为DiI+4％明胶的小鼠肾脏组织血管网结构的荧光图。结果表明，CD31和lectin可以有效标记肾小球结构，但无法标记肾小球周围的血管结构，而基于脂溶性染料的标记方法则可以很好的标记肾脏中的肾小球和周围血管网。因此，相比现有血管标记方法，本发明提供的血管标记方法可以更好地标记小鼠组织器官内的血管网结构，包括大血管及毛细血管。
实施例5
本实施例5生物组织取自C57实验小鼠，通过本发明实施例5血管标记方法对实验小鼠进行处理，具体包括如下步骤：
(1)配制染料储存液：将脂溶性染料粉末DiI溶解到无水乙醇中，使得溶液浓度为6mg/ml，得到染料储存液，室温条件下避光保存。
(2)配制磷酸盐缓冲液和多聚甲醛固定液：磷酸盐粉末加蒸馏水配制磷酸盐缓冲液，浓度为0.01M。用配好的0.01M磷酸盐缓冲液配制4％多聚甲醛溶液。
(3)配制染料工作液：称取明胶粉末加入离心管中，加入适量蒸馏水或磷酸盐缓冲液，用50℃水浴加热至明胶融化，混合液变得澄清，得到质量百分数为6％的明胶稀释液。将染料储存液按1∶50的比例加入明胶稀释液中，得到染料工作液。
(4)对实验动物进行心脏灌注：首先用磷酸盐缓冲液对实验动物进行心脏灌注，将动物体内的血液冲洗干净，磷酸盐缓冲液灌注时间为10min，灌注量为60ml；然后将染料工作液经心脏灌注进动物体内，使其循环实验动物全身血管，染料工作液灌注时间为10min，灌注量为20ml，灌注时染料工作液温度控制在40℃，防止明胶提前凝固；将充分灌注工作液的动物尸体放入4℃低温环境冷藏，时间为12h。
(5)取出小鼠的脑组织，放入4％的多聚甲醛溶液中，在4℃低温条件下固定24h。
(6)将通过所述血管标记方法获得的小鼠脑组织进行1mm切片，用uDISCO组织光透明方法对切片进行透明，并用于共聚焦荧光显微成像中，获取血管网的三维高分辨结构信息。
图7给出了共聚焦显微镜拍摄的经uDISCO透明方法透明的小鼠脑切片血管网结构的荧光图像，图中BeforeuDISCOclearing表示uDISCO透明试剂洗脱之前，AfteruDISCOclearing表示uDISCO透明试剂洗脱之后。可以看出，工作液中未加明胶时荧光信号大部分被透明试剂洗脱，而加入6％明胶的血管信息则在透明后很好地被保存。结果说明，本发明提供的血管标记方法可以有效地克服脂溶性染料容易被有机试剂洗脱的缺点，可以更好地与现有光透明方法兼容，有效获取多种组织器官血管网的三维高分辨结构信息。
实施例6
本实施例生物组织取自C57实验小鼠，通过本发明血管标记方法对实验小鼠进行处理，具体包括如下步骤：
(1)配制染料：得到染料储存液，室温条件下避光保存。
(2)配制磷酸盐缓冲液和多聚甲醛固定液：磷酸盐粉末加蒸馏水配制磷酸盐缓冲液，浓度为0.01M。用配好的0.01M磷酸盐缓冲液配制4％多聚甲醛溶液。
(3)配制染料工作液：称取明胶粉末加入离心管中，加入适量蒸馏水或磷酸盐缓冲液，用45℃水浴加热至明胶融化，混合液变得澄清，得到质量百分数为2％的明胶稀释液。将偶联FITC荧光素的右旋糖酐Dextran-FITC粉末DiI溶解到稀释液中，使得溶液浓度为3mg/ml，得到染料工作液。
(4)对实验动物进行心脏灌注：首先用磷酸盐缓冲液对实验动物进行心脏灌注，将动物体内的血液冲洗干净，磷酸盐缓冲液灌注时间为10min，灌注量为60ml；然后将染料工作液经心脏灌注进动物体内，使其循环实验动物全身血管，染料工作液灌注时间为10min，灌注量为20ml，灌注时染料工作液温度控制在40℃，防止明胶提前凝固；将充分灌注工作液的动物尸体放入4℃低温环境冷藏，时间为12h。
(5)取出小鼠的脑组织，放入4％的多聚甲醛溶液中，在4℃低温条件下固定24h。
(6)将通过所述血管标记方法获得的小鼠脑组织进行1mm切片，用uDISCO组织光透明方法对切片进行透明，并用于共聚焦荧光显微成像中，获取血管网的三维高分辨结构信息。
图8给出了共聚焦显微镜拍摄的经Dex-FITC染料工作液标记的小鼠多种器官切片的血管网荧光图像，包括肝脏切片，肾脏切片及脑切片。可以看出，除了脂溶性染料，本发明提供的血管标记方法也适用于右旋糖酐这种大分子聚合物，可以很好地标记小鼠多种器官内的血管网结构。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (8)
1.一种用于血管网络标记成像的染料工作液，其特征在于，该染料工作液中含有染料分子和明胶，其中染料分子与明胶的质量比为1～30:2000，其中明胶的质量百分数小于或等于10%；
所述染料分子为脂溶性染料分子或水溶性染料分子，其中脂溶性染料分子为3,3`-双十八烷基氧碳花菁高氯酸盐、1,1`-双十八烷基-3,3,3`,3`-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐和1,1`-双十八烷基-3,3,3`,3`-四甲基吲哚二碳花菁高氯酸盐中的一种或多种；所述水溶性染料分子为荧光耦合的蛋白分子或荧光耦合的聚合物。
2.如权利要求1所述的染料工作液，其特征在于，所述明胶的质量百分数为0.5%～8%。
3.如权利要求1所述的染料工作液，其特征在于，该染料工作液中溶剂为醇类溶剂和水的混合物，所述醇类溶剂与水的体积比为1:40-60。
4.如权利要求3所述的染料工作液，其特征在于，所述醇类溶剂为乙醇。
5.如权利要求1所述的染料工作液，其特征在于，该染料工作液中还含有磷酸盐缓冲液，其浓度为0.01 M～0.05 M。
6.一种如权利要求1所述的染料工作液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将染料粉末溶解到醇类溶剂中，得到染料分子浓度为0.1～10 mg/ml的染料储存液；室温条件下避光保存备用；
（2）将明胶粉末与蒸馏水或磷酸盐缓冲液混合，加热至明胶融化，混合液变得澄清，得到质量百分数小于或等于10%的明胶稀释液；
（3）将步骤（1）所述染料储存液与步骤（2）所述明胶稀释液按照体积比1:40-60混合，即得到所述染料工作液。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）得到染料分子浓度为1～6 mg/ml的染料储存液，步骤（2）得到质量百分数为0.5%～8%的明胶稀释液。
8.如权利要求1至5任一项所述染料工作液的非疾病诊断和治疗目的的应用，其特征在于，用于血管网络标记成像；该应用包括如下步骤：
S1：首先用磷酸盐缓冲液将动物尸体内的血液冲洗干净，然后将染料工作液经心脏灌注进动物尸体内，使其循环实验动物全身血管；将充分灌注工作液的动物尸体放入低温环境冷藏，使明胶充分凝固；
S2：取出待成像动物组织放入多聚甲醛溶液中，在低温条件下固定，得到标记过的动物组织；
S3：将标记过的动物组织进行切片或整体透明，并用于共聚焦成像、双光子成像或光片荧光显微成像中获取血管结构信息。
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