CN116202846B - 一种鉴别动脉及静脉的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴别动脉及静脉的方法，提供了一种鉴别动脉及静脉的试剂盒。本发明提供的鉴别动脉及静脉的染色方法能清晰显示并成功区分组织中的微动脉、微静脉，具有操作简单、成本低的优势，为血管微循环的研究提供形态学研究基础，具有广阔的应用前景。

Description

一种鉴别动脉及静脉的方法
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种鉴别动脉及静脉的方法。
背景技术
目前具有多种显示组织血管的染色方法，主要包括免疫组织化学、组织化学显色和转基因动物模型等，这些方法均能显示组织的心脏、脑和骨骼肌等组织的毛细血管，但是并不能有效区分组织的动脉及静脉血管。因此，本领域亟需一种能够有效区分组织样本动脉及静脉血管的方法，为血管循环的研究提供形态学基础。
发明内容
为弥补现有技术的不足，本发明提供了一种鉴别动脉及静脉的染色方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种鉴别动脉及静脉的染色方法，所述方法包括对墨汁灌注的组织进行碱性磷酸酶染色和脂溶性染料染色。
进一步，碱性磷酸酶染色的方法包括金属盐沉淀法和偶氮偶联法。
进一步，碱性磷酸酶染色的方法选自偶氮偶联法。
进一步，所述脂溶性染料包括苏丹红、对位红、油红O。
进一步，所述脂溶性染料选自油红O。
进一步，墨汁灌注的组织使用墨汁工作液进行灌注。
进一步，所述墨汁工作液包括油墨。
进一步，所述墨汁工作液还包括用于固定墨汁的试剂。
进一步，所述用于固定墨汁的试剂包括明胶。
进一步，所述明胶的浓度为2％-6％。
进一步，所述明胶的浓度为4％。
进一步，所述墨汁工作液的灌注温度为37℃-40℃。
进一步，所述方法还包括使用固定液对组织进行固定。
进一步，所述固定液包括单纯固定液、混合固定液。
进一步，所述固定液选自混合固定液。
进一步，所述混合固定液包括Gendre液、Bouin液、Zenker液、Helly液、Carnoy液、中性甲醛固定液、4％多聚甲醛固定液、Orth液、Regaud液、Susa液、酒精-甲醛液、乙醚-酒精液。
进一步，所述混合固定液选自4％多聚甲醛固定液。
进一步，所述方法还包括使用脱水剂使组织脱水。
进一步，所述脱水剂包括蔗糖溶液、乙醇溶液、异丙醇溶液、丙酮溶液。
进一步，所述脱水剂选自蔗糖溶液。
进一步，所述蔗糖溶液为20％-30％蔗糖溶液。
进一步，所述蔗糖溶液为30％蔗糖溶液。
进一步，所述组织包括脑组织、心脏组织、肌肉组织、肝脏组织、胰腺组织、肾脏组织、肠道组织。
进一步，所述组织选自脑组织。
进一步，组织切片具有2μm-100μm的厚度。
进一步，组织切片具有2μm-50μm的厚度。
进一步，组织切片具有8μm-18μm的厚度。
进一步，组织切片的厚度为15μm。
进一步，所述动脉为微动脉，所述静脉为微静脉。
本发明的第二方面提供了一种鉴别动脉及静脉的染色组合物，所述组合物包括碱性磷酸酶染色液和脂溶性染料。
进一步，所述脂溶性染料包括苏丹红、对位红、油红O。
进一步，所述脂溶性染料选自油红O。
进一步，所述组合物对墨汁灌注的组织进行染色。
进一步，所述组合物还包括进行墨汁灌注的墨汁工作液。
进一步，所述墨汁工作液包括油墨。
进一步，所述墨汁工作液还包括用于固定墨汁的试剂。
进一步，所述用于固定墨汁的试剂包括明胶。
进一步，所述明胶的浓度为2％-6％。
进一步，所述明胶的浓度为4％。
进一步，所述组合物还包括组织固定液。
进一步，所述组织固定液包括单纯固定液、混合固定液。
进一步，所述组织固定液选自混合固定液。
进一步，所述混合固定液包括Gendre液、Bouin液、Zenker液、Helly液、Carnoy液、中性甲醛固定液、4％多聚甲醛固定液、Orth液、Regaud液、Susa液、酒精-甲醛液、乙醚-酒精液。
进一步，所述混合固定液选自4％多聚甲醛固定液。
进一步，所述组合物还包括组织脱水剂。
进一步，所述组织脱水剂包括蔗糖溶液、乙醇溶液、异丙醇溶液、丙酮溶液。
进一步，所述组织脱水剂选自蔗糖溶液。
进一步，所述蔗糖溶液为20％-30％蔗糖溶液。
进一步，所述蔗糖溶液为30％蔗糖溶液。
进一步，所述动脉为微动脉，所述静脉为微静脉。
本发明的第三方面提供了一种鉴别动脉及静脉的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第二方面所述的组合物。
进一步，所述试剂盒还包括适当的缓冲液和用于改善试剂盒货架期的防腐剂。
进一步，所述试剂盒还包括包装组合物的包装材料。
进一步，所述试剂盒还包括说明书。
本发明的第四方面提供了一种系统，所述系统包括：
存储器，其存储处理器可读指令；和
一个或多个处理器，被布置用于读取和执行存储在所述存储器中的指令；
其中，所述处理器可读指令包括被布置为控制计算机执行本发明第一方面所述的方法的指令。
本发明的第五方面提供了碱性磷酸酶染色液和脂溶性染料在制备鉴别动脉及静脉的产品中的应用。
进一步，所述脂溶性染料包括苏丹红、对位红、油红O。
进一步，所述脂溶性染料选自油红O。
进一步，所述产品对墨汁灌注的组织进行染色。
进一步，所述产品还包括进行墨汁灌注的墨汁工作液。
进一步，所述墨汁工作液包括油墨。
进一步，所述墨汁工作液还包括用于固定墨汁的试剂。
进一步，所述用于固定墨汁的试剂包括明胶。
进一步，所述明胶的浓度为2％-6％。
进一步，所述明胶的浓度为4％。
进一步，所述产品还包括组织固定液。
进一步，所述组织固定液包括单纯固定液、混合固定液。
进一步，所述组织固定液选自混合固定液。
进一步，所述混合固定液包括Gendre液、Bouin液、Zenker液、Helly液、Carnoy液、中性甲醛固定液、4％多聚甲醛固定液、Orth液、Regaud液、Susa液、酒精-甲醛液、乙醚-酒精液。
进一步，所述混合固定液选自4％多聚甲醛固定液。
进一步，所述产品还包括组织脱水剂。
进一步，所述组织脱水剂包括蔗糖溶液、乙醇溶液、异丙醇溶液、丙酮溶液。
进一步，所述组织脱水剂选自蔗糖溶液。
进一步，所述蔗糖溶液为20％-30％蔗糖溶液。
进一步，所述蔗糖溶液为30％蔗糖溶液。
进一步，所述动脉为微动脉，所述静脉为微静脉。
本发明的优点和有益效果：
本发明提供的鉴别动脉及静脉的染色方法能清晰显示并成功区分组织中的微动脉、微静脉，并且具有操作简单、成本低的优势，为血管微循环的研究提供形态学基础，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是墨汁/明胶染色结果图，其中，1A是黑墨汁/明胶染色结果图，1B是红墨汁/明胶染色结果图；
图2是红墨汁/明胶及碱性磷酸酶染色结果图，其中，2A是红墨汁/明胶及碱性磷酸酶固红染色结果图，2B是红墨汁/明胶及碱性磷酸酶甲基绿染色结果图；
图3是红墨汁/明胶、碱性磷酸酶染色及油红O染色结果图，其中，3A是脑组织基底节红墨汁/明胶、碱性磷酸酶固红染色及油红O染色结果图，3B是脑组织基底节红墨汁/明胶、碱性磷酸酶甲基绿染色及油红O染色结果图，3C是脑皮层组织红墨汁/明胶、碱性磷酸酶甲基绿染色及油红O染色结果图；
图4是红墨汁/明胶及油红染色结果图，其中，4A是脑组织基底节红墨汁/明胶及油红染色结果图，4B是脑皮层组织红墨汁/明胶及油红染色结果图，4C是红墨汁/明胶、油红及HE染色结果图；
图5是明胶、碱性磷酸酶及油红染色结果图；
图6是红墨汁/明胶、油红及碱性磷酸酶染色结果图；
图7是碱性磷酸酶染色结果图，其中，7A是脑组织基底节碱性磷酸酶甲基绿染色结果图，7B是脑皮层组织碱性磷酸酶甲基绿染色结果图。
具体实施方式
下文提供了本说明书中使用的一些术语的定义。除非另有说明，本文中使用的所有技术和科学用语通常具有和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意思。
本发明提供了一种鉴别动脉及静脉的染色方法，所述方法包括对墨汁灌注的组织进行碱性磷酸酶染色和脂溶性染料染色。
在本发明中，染色总体上涉及检测和/或区别生物标本中的具体分子(诸如组织、脂质、蛋白质或核酸)或具体结构(诸如正常或恶性细胞、细胞溶质、细胞核、高尔基体或细胞骨架)的存在、位置、和/或量(诸如浓度)的生物标本的任意处理。例如，染色能够提供生物标本的具体分子或具体细胞结构和环绕部分之间的对比，且染色的强度能够提供标本中具体分子的量的测量。染色能够用于辅助不仅用明场显微镜，而且还用其它观察工具(诸如相差显微镜、电子显微镜和荧光显微镜)观察分子、细胞结构和组织。
在本发明的实施方案中，染色用于提供组织中动脉血管及静脉血管的对比，进一步，用于提供组织微循环中动脉血管及静脉血管的对比。
在本发明的实施方案中，鉴别动脉及静脉的染色方法是对墨汁灌注的组织首先进行碱性磷酸酶染色，然后进行脂溶性染料染色。
在本发明中，碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，简称ALP或AKP)为一类磷酸酯酶，广泛分布于哺乳动物组织内，碱性磷酸酶主要存在于物质交换活跃之处(细胞膜)，如肠上皮和肾近曲小管的刷状缘、附睾上皮之静纤毛、肝的毛细胆管膜以及微动脉和毛细血管动脉内皮(体循环)，还见于内质网、高尔基复合体、吞饮小泡、肠上皮之溶酶体、中性粒细胞之中性颗粒以及平滑肌之细胞膜。
本发明的碱性磷酸酶染色的方法包括金属盐沉淀法和偶氮偶联法。
其中，金属盐沉淀法中最经典的是Gomori的钙钴法，其原理是以β-甘油磷酸为底物，在pH9.3的碱性条件下水解为磷酸钠和甘油，磷酸钠与钙离子作用生成磷酸钙，再与钴离子作用生成磷酸钴，后者与硫化铵作用生成不溶性硫化钴沉淀。
偶氮偶联法又称同时偶联法，其原理是在pH9.2～9.8的碱性条件下细胞内碱性磷酸酶可使AS-BI磷酸盐水解，释放出磷酸与萘酚，后者与偶联重氮盐(FBB盐)生成有色产物，定位于细胞质中。
在本发明的实施方案中，采用偶氮偶联法对碱性磷酸酶进行染色。
在本发明中，脂溶性染料是指任何天然的或合成的、通常是有机的化合物，其可溶于油相或可与脂肪物质混溶的溶剂中，并且能够赋予颜色。脂溶性染料包括但不限于苏丹红、对位红、油红O。
其中，苏丹红染料主要基团是苯基偶氨萘酚，包括但不限于苏丹Ⅰ、苏丹Ⅱ、苏丹Ⅲ，苏丹Ⅳ、苏丹Ⅴ、苏丹橙G、苏丹红7B、苏丹红G。其中苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ和苏丹红Ⅳ是苏丹红Ⅰ的化学衍生物，苏丹红Ⅰ和苏丹红Ⅱ是单偶氮染料，苏丹红Ⅲ和苏丹红Ⅳ是双偶氮染料。苏丹红化合物憎水性强，具有相似的显色基团，苏丹红I、Ⅱ颜色相近，苏丹红Ⅲ和苏丹红Ⅳ颜色相近。
对位红(1-((对硝基苯基)偶氮)-2-萘酚，C16H11N3O3)，也叫作红颜料PR-1(Pigmentred 1)、对硝苯胺红，是一种偶氮染料，常温下呈固态。
油红O(Oil Red O)又可以称为油红、透明红5B，分子量为408.495，分子式为C26H24N4O。
在本发明的实施方案中，脂溶性染料选自油红O。
油红O染色在避光的条件下孵育组织，孵育的时间例如是5-30min，例如是5-20min，例如是8-15min，例如是8min，例如是9min，例如是10min，例如是11min，例如是12min，例如是13min，例如是14min，例如是15min。
在本发明的实施方案中，油红O工作液孵育时间是10min。
在本发明中，使用墨汁工作液进行墨汁灌注，所述墨汁工作液包括墨汁。
在本发明中，墨汁包括水墨和油墨。
在本发明的实施方案中，墨汁选自油墨。
墨汁的颜色可以任意选择，例如可以是常见的红色墨汁、蓝色墨汁、黑色墨汁，只要能够达到区分不同血管的目的即可，在本发明的实施方案中，墨汁的颜色是红色墨汁。
在本发明中，所述墨汁工作液还包括用于固定墨汁的试剂。
所述用于固定墨汁的试剂包括明胶，在本发明中，将明胶与油墨混合，制成墨汁工作液，可以根据不同的实验目的，调整明胶的浓度，例如，在本发明中，组织微循环血管染色(如脑)建议使用的明胶浓度例如是1％-10％，例如是1％-8％，例如是2％-7％，例如是2％-6％。
在本发明的实施方案中，明胶的浓度为2％-6％。
在本发明的具体实施方案中，明胶的浓度为4％。
明胶的溶解温度为>40℃，可以选用在此区间的任意温度溶解明胶，例如温度可以是45℃、50℃、55℃、60℃、65℃。
在本发明的实施方案中，于60℃的条件下溶解明胶。
在本发明中，可以使用任意方法进行墨汁灌注，墨汁灌注的对象包括哺乳动物，哺乳动物包括但不限于大鼠、小鼠、牛、狗、驴、豚鼠或兔。
在本发明的实施方案中，对小鼠进行墨汁灌注。
灌注后的小鼠于低温下保存，保存温度可以是4℃、6℃、8℃，在本发明的实施方案中，保存温度选择4℃。保存的时间可以是6小时、7小时、8小时、9小时、10小时，只要能够确保血管内的明胶墨汁凝固即可。
在本发明中，使用组织固定液固定组织。
组织固定液的主要目的是固定组织，阻止组织、细胞的自溶和腐败，防止细胞过分收缩或膨胀保持其原有的形态结构。
所述组织固定液包括单纯固定液、混合固定液。
其中，单纯固定液由单一试剂组成。单纯固定液包括但不限于甲醇、酒精、氯化汞、冰醋酸、苦味酸、重铬酸钾、锇酸、丙酮、铬酸、三氯醋酸。
其中，酒精既是配制混合固定液的基本成分，又可作为单纯固定液使用，酒精的优选浓度为80％-95％。
常用的甲醛即市售的福尔马林，优选的浓度为10％，以10ml的商品甲醛(37％-40％甲醛水溶液)加入90ml水配制而成。
重铬酸钾，其穿透速度快，对组织收缩小并稍有膨胀，重铬酸钾优选的浓度为3-5％。
锇酸配制时要用洗涤干净的玻塞棕色瓶，优选使用双蒸水配制，锇酸穿透力弱，且易使组织硬脆，因此它固定的组织必须小而薄，优选的体积在3x3x2mm以内。
混合固定液是采用两种或两种以上化学试剂混合配成，混合的各种试剂要考虑对组织的互补作用。混合固定液包括但不限于Gendre液、Bouin液、Zenker液、Helly液、Carnoy液、中性甲醛固定液、4％多聚甲醛固定液、Orth液、Regaud液、Susa液、酒精-甲醛液、乙醚-酒精液。
其中，Gendre液其内有乙醇和冰醋酸，其中的乙醇可沉淀糖原，但会使组织收缩，而配以冰醋酸后因醋酸可使组织膨胀，从而抵消乙醇对组织的收缩。
Bouin固定液由饱和苦味酸水溶液、饱和甲醛水溶液和冰醋酸按15:5:1的比例配置而成，固定液中的苦味酸可使蛋白质沉淀并使组织适当硬化，冰醋酸能固定染色质，甲醛水溶液可以调节苦味酸和冰醋酸对组织的膨胀作用。
Zenker固定液是按升汞(氧化汞)5.0g，重铬酸钾2.5g，硫酸钠1.0g，蒸馏水100ml和冰醋酸5ml的比例配置而成，配制时将重铬酸钾、升汞和硫酸钠溶于加温的蒸馏水制成储存液，冰醋酸临用前加入。
Carnoy液按无水乙醇60ml、三氯甲烷30ml和冰醋酸10ml的比例配置而成，其中无水乙醇用于固定细胞质，冰醋酸固定染色质。
中性甲醛是由磷酸二氢钠4.0g，磷酸氢二钠6.5g，37％甲醛100.0ml，蒸馏水900.0ml按比例充分混合而成。
Orth液主要由重铬酸钾、硫酸盐、甲醛等组成。
4％多聚甲醛是由多聚甲醛及0.01M的PBS按比例配制而成，配制过程中需加热搅拌，并过夜溶解，过滤备用。
在本发明的实施方案中，组织固定液选自混合固定液。
在本发明的具体实施方案中，混合固定液选自4％多聚甲醛固定液。
在本发明中，使用脱水剂使组织脱水。
脱水剂的目的是使组织细胞充分脱水。所述脱水剂包括但不限于蔗糖溶液、乙醇溶液、异丙醇溶液、丙酮溶液。
在本发明的实施方案中，所述脱水剂选自蔗糖溶液。
在本发明中，可以根据组织的性质确定蔗糖溶液的浓度，例如，蔗糖溶液的浓度可以是20％-30％，具体的，蔗糖浓度可以是20％、22％、24％、26％、28％、30％或以上任意区间的浓度。
在本发明的具体实施方案中，所述蔗糖溶液为30％蔗糖溶液。
在本发明中，可以根据不同的实验目的，选择感兴趣的组织，所述组织可以包括但不限于脑组织、心脏组织、肌肉组织、肝脏组织、胰腺组织、肾脏组织、肠道组织。
在本发明的具体实施方案中，组织选自脑组织。
组织经-80℃冰箱储存后切片，组织切片具有约2μm-200μm的厚度，例如约2μm-100μm，例如约2μm-50μm的厚度，例如约2μm-25μm的厚度，例如约5μm-20μm的厚度，例如约8μm-18μm的厚度，具体的，可以是8μm、10μm、12μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm的厚度。
在本发明的实施方案，组织切片的厚度为15μm。
组织切片于0.01M PBS中浸泡，浸泡的时间例如是2-10分钟，例如是2-8分钟，例如是2-5分钟。
在本发明中，碱性磷酸酶的染色液可以是市售获得，也可以是实验室自行制备。碱性磷酸酶的孵育液由AS-BI染色液与FBB染色液以1：1的比例配置而成，孵育液的用量根据组织切片确定，如本发明使用的脑组织切片的孵育液的用量例如是30μl-100μl，例如是40μl-90μl，例如是50μl-80μl，例如是60μl-80μl。
在本发明的实施方案中，碱性磷酸酶孵育液的用量为60μl-80μl。
组织切片在避光的条件下孵育，孵育的时间例如是10-30min，例如是15-25min，例如是15-20min。
在本发明的实施方案中，组织切片避光孵育的时间是15-20min。
组织孵育后进行复染，复染的染色液包括固红染色液或甲基绿染色液。
在本发明中，采用显微镜使染色后的组织可视化，显微镜包括但不限于荧光显微镜、宽视野显微镜、超分辨率显微镜、共焦显微镜、具有单光子或多光子激发荧光的共焦显微镜、二次谐波或高谐波生成荧光显微镜、光片显微镜、FLIM显微镜、明视野显微镜、暗视野显微镜、结构光照明显微镜、全内反射显微镜、计算显微镜、偏光显微镜、基于合成孔径的显微镜或相衬显微镜。
在本发明建立的方法的基础上，可以进一步进行HE染色或免疫组织化学染色，同步观察组织细胞形态、间质组织、微循环、坏死组织以及检测特定蛋白的表达定位。
HE染色((H&E染色)全称为苏木精(Hematoxylin)和伊红(Eosin)染色方法，苏木精(苏木素)染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。可以区分出一般细胞的形态，在实际应用中可以鉴定组织细胞坏死、水肿、变性和炎性细胞浸润等异常病理学改变。
免疫组织化学染色应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。
本发明提供了一种鉴别动脉及静脉的试剂盒，所述试剂盒包括上述组合物。
在本发明中，所述试剂盒还包括适当的缓冲液和用于改善试剂盒货架期的防腐剂。
所述试剂盒还包括包装组合物的包装材料。
所述试剂盒还包括用于染色组合物的使用说明书，记载了各个染色剂的使用方法、用量及注意事项。
本发明提供了一种系统，所述系统包括：
存储器，其存储处理器可读指令；和
一个或多个处理器，被布置用于读取和执行存储在所述存储器中的指令；其中，所述处理器可读指令包括被布置为控制计算机执行上述的方法的指令。
在本发明中，所述系统的实施可包括手动地、自动地、或它们组合地来执行或完成所选任务。而且，根据本发明的系统的实施方式的实际仪器和设备，可通过硬件、通过软件、或通过固件或通过它们的组合使用操作系统来实施多个所选任务。
例如，根据本发明实施方式用于执行所选任务的硬件可实施为染色器，所述染色器分别保持多个容器中的液体组，所述液体组包括墨汁、碱性磷酸酶染色液、脂溶性染料染色液、组织固定剂、组织脱水剂等。作为软件，根据本发明实施方式的所选任务可实施为通过计算机使用任何合适的操作系统执行的多个软件指令。在本发明的示例性实施方式中，根据如本发明所述方法的示例性实施方式的一个或多个任务可通过数据处理器，如用于执行多个指令的计算平台来执行。可选地，该数据处理器包括用于存储指令和/或数据的易失性存储器，和/或用于存储指令和/或数据的非易失性存储器，例如，磁性硬盘和/或可移动介质。可选地，还提供网络连接。还可选地提供显示器和/或用户输入装置诸如键盘或鼠标。
如果没有明确地另外指出，在本发明中使用术语“包含/包括”是为了表明，除了在“包含/包括”之下所列示的组分之外，其他组分也可能可选地存在。然而，被认为是特别的实施方案的是，术语“包含/包括”包括没有其他组分存在的可能性，即在该特别的实施方案的范围内，术语“包含/包括”被理解为术语“由......组成”。
下面结合具体实施例进一步阐述此发明。应理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，并不作为对本发明的限制。在不偏离本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。
实施例
1.1实验方法
1、准备试剂
1)试剂及材料：明胶(Solarbio,Cat#G8061)、书宗红墨汁(油墨)、ALP试剂盒(Solarbio,Cat#G1480)、油红O(Solarbio,Cat#G1260)；
2)自备试剂与材料：多聚甲醛、异丙醇、蔗糖、0.01％PBS、过滤器(70～100μm)、灌注泵、水浴箱(60度)。
3)试剂准备：
墨汁储存液：书宗红墨汁与双蒸水以1：1比例稀释；
明胶-墨汁工作液：根据不同实验目的，设置不同的明胶浓度，组织微循环血管染色(如：脑)建议适宜明胶浓度为2～6％；以下以4％明胶为例配置工作液，灌注小鼠5只；①0.01M PBS 400ml+明胶20g，50～60℃水浴箱溶解，玻璃棒搅拌加速溶解；②将完全溶解的明胶溶液经过滤器过滤，加入100ml红墨汁储存液，水浴箱孵育5分钟，配置成明胶-墨汁工作液；③将工作液再次过滤，并置于60℃水浴箱中孵育备用；
60％异丙醇：异丙醇与双蒸水3:2稀释；
4％多聚甲醛：20g多聚甲醛+0.01M PBS 500ml，加热搅拌，过夜溶解，过滤备用。
2、小鼠灌注
1)试剂预热：小鼠灌注前，将0.01M PBS、4％多聚甲醛、明胶-墨汁工作液放入60水浴箱预热，明胶-墨汁工作液使用前进行过滤。水浴箱温度的设置根据灌注泵管路的长短来设定，以确保最终进入小鼠体内的明胶-墨汁的实际温度为37～40℃左右；
2)小鼠灌注：①小鼠称重后，用三溴乙醇(0.4g/kg)腹腔注射进行麻醉；麻醉成功后的小鼠取仰卧位固定于灌注台，从剑突下打开胸腔，暴露心脏、主动脉，使用4号半输液器针头，沿心轴方向进针，刺入心尖3-4mm，止血钳固定针头与心脏组织，剪开右心耳，开始灌注；②首先使用0.01M PBS 50ml进行快速灌注(15ml/min)，使组织的血液充分排出，直到经右心耳流出的灌注液变清亮，肝脏组织变成灰白色；③然后，换用4％多聚甲醛45rpm/min快速灌注进行2min；调整针头位置，使其刺入主动脉腔内，以提高后续灌注成功率；后调整泵速(25rpm/min)慢灌固定8min；④后改用明胶墨汁工作液，以10ml/min速度灌注10分钟，小鼠口唇、耳、四肢逐渐变成均匀一致的红色，灌注结束前用缝合线结扎主动脉，防止灌注液经心脏流出，灌注结束。将灌注后的小鼠存放于4℃保存过夜(或6～8小时)，确保血管内的明胶墨汁成功凝固。
3、组织取材及保存
1)组织取材固定：根据实验目的，提取感兴趣组织，如：脑、心脏、肌肉等组织；4％多聚甲醛浸润数天，充分固定组织；后30％蔗糖浸润2～3天直到组织沉到器皿底部；蔗糖脱水成功后，镊子取出组织，滤纸吸干组织表面的液体，铝箔纸包裹，-80℃冰箱存储；
2)冷冻切片：①取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上OTC包埋剂，速放于冷冻台上冰冻，至包埋剂与组织冻结成白色冰体即可切片(1～3分种)；②将载有组织块的支撑器，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平；③调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，本实验中脑组织选择15μm；④准确地将防卷板调校至适当的位置，以切出完整、平滑的切片为准；⑤切好的组织在干净的玻片上黏附时顺着一个方向稍微用力轻轻一带，可避免组织摊片过程中皱折，保证组织结构的完整及切片的美观；⑥组织切片可直接应用于随后的染色，也可以保存至-20℃备用。
4、碱性磷酸酶染色
1)组织切片于0.01M PBS浸润2～5分钟；
2)AS-BI染色液与FBB染色液1：1配置成ALP孵育液，将组织切片放入湿盒中，滴加ALP孵育液(每个脑片60～80μl)，避光孵育15～20分钟，水洗3～5分钟；
3)滴加固红染色液或甲基绿染色液3～5分钟；水洗3次，每次2min。
5、饱和油红染色
1)油红工作液配置：饱和油红原液与蒸馏水3：2稀释，混匀，室温放置5～10min，过滤备用；
2)60％异丙醇浸润3～5s；
3)油红O工作液染色避光孵育10min，60％异丙醇浸润5s，镜下控制分化程度；
4)蒸馏水洗3次，每次2分钟；
5)显微光镜拍照。
1.2实验结果
结果显示，使用墨汁/明胶灌注后的组织血管呈红色(图1)，碱性磷酸酶染色之后，已经能够成功显示微动脉、微静脉，其中，红色血管为静脉，红色+蓝色血管为动脉(图2)，再加入另一种染料油红O之后，显微镜下红色静脉与红色+蓝色动脉之间对比更加清晰，还能清晰的显示脑组织的富含脂类物质的神经髓鞘，神经髓鞘呈红色或棕黄色(图3)。
对比例
使用上述相同的试剂与方法对组织进行染色，发现对使用红墨汁/明胶灌注的组织进行油红染色(图4)，对使用明胶灌注的组织进行ALP和油红染色(图5)，仅对组织进行ALP染色(图7)均不能达到区分动脉及静脉血管的效果。
对使用红墨汁/明胶灌注的组织先进行油红染色再进行ALP染色(图6)，可部分区分动脉及静脉，但染色对比度远不及本专利所述方法。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (71)

1.一种鉴别动脉及静脉的染色方法，其特征在于，所述方法包括对墨汁灌注的组织先进行碱性磷酸酶染色，再进行脂溶性染料染色。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，碱性磷酸酶染色的方法包括金属盐沉淀法和偶氮偶联法。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，碱性磷酸酶染色的方法选自偶氮偶联法。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脂溶性染料包括苏丹红、对位红、油红O中的任一种。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述脂溶性染料选自油红O。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，墨汁灌注的组织使用墨汁工作液进行灌注。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述墨汁工作液包括油墨。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述墨汁工作液还包括用于固定墨汁的试剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述用于固定墨汁的试剂包括明胶。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述明胶的浓度为2％-6％。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述明胶的浓度为4％。
12.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述墨汁工作液的灌注温度为37℃-40℃。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使用固定液对组织进行固定。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述固定液包括单纯固定液、混合固定液中的任一种。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述固定液选自混合固定液。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述混合固定液包括Gendre液、Bouin液、Zenker液、Helly液、Carnoy液、中性甲醛固定液、4％多聚甲醛固定液、Orth液、Regaud液、Susa液、酒精-甲醛液、乙醚-酒精液中的任一种。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述混合固定液选自4％多聚甲醛固定液。
18.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使用脱水剂使组织脱水。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述脱水剂包括蔗糖溶液、乙醇溶液、异丙醇溶液、丙酮溶液中的任一种。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述脱水剂选自蔗糖溶液。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述蔗糖溶液为20％-30％蔗糖溶液。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述蔗糖溶液为30％蔗糖溶液。
23.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述组织包括脑组织、心脏组织、肌肉组织、肝脏组织、胰腺组织、肾脏组织、肠道组织中的任一种。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述组织选自脑组织。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，组织切片具有2μm-100μm的厚度。
26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，组织切片具有2μm-50μm的厚度。
27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，组织切片具有8μm-18μm的厚度。
28.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，组织切片的厚度为15μm。
29.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述动脉为微动脉，所述静脉为微静脉。
30.一种鉴别动脉及静脉的染色组合物，其特征在于，所述组合物包括碱性磷酸酶染色液和脂溶性染料，所述组合物还包括对组织进行墨汁灌注的墨汁工作液，所述组合物还包括组织固定液，所述组合物还包括组织脱水剂，所述组织为脑组织，所述组合物对墨汁灌注的组织先进行碱性磷酸酶染色，再进行脂溶性染料染色。
31.根据权利要求30所述的组合物，其特征在于，所述脂溶性染料包括苏丹红、对位红、油红O中的任一种。
32.根据权利要求31所述的组合物，其特征在于，所述脂溶性染料选自油红O。
33.根据权利要求30所述的组合物，其特征在于，所述墨汁工作液包括油墨。
34.根据权利要求33所述的组合物，其特征在于，所述墨汁工作液还包括用于固定墨汁的试剂。
35.根据权利要求34所述的组合物，其特征在于，所述用于固定墨汁的试剂包括明胶。
36.根据权利要求35所述的组合物，其特征在于，所述明胶的浓度为2％-6％。
37.根据权利要求36所述的组合物，其特征在于，所述明胶的浓度为4％。
38.根据权利要求30所述的组合物，其特征在于，所述组织固定液包括单纯固定液、混合固定液中的任一种。
39.根据权利要求38所述的组合物，其特征在于，所述组织固定液选自混合固定液。
40.根据权利要求39所述的组合物，其特征在于，所述混合固定液包括Gendre液、Bouin液、Zenker液、Helly液、Carnoy液、中性甲醛固定液、4％多聚甲醛固定液、Orth液、Regaud液、Susa液、酒精-甲醛液、乙醚-酒精液中的任一种。
41.根据权利要求40所述的组合物，其特征在于，所述混合固定液选自4％多聚甲醛固定液。
42.根据权利要求30所述的组合物，其特征在于，所述组织脱水剂包括蔗糖溶液、乙醇溶液、异丙醇溶液、丙酮溶液中的任一种。
43.根据权利要求42所述的组合物，其特征在于，所述组织脱水剂选自蔗糖溶液。
44.根据权利要求43所述的组合物，其特征在于，所述蔗糖溶液为20％-30％蔗糖溶液。
45.根据权利要求44所述的组合物，其特征在于，所述蔗糖溶液为30％蔗糖溶液。
46.根据权利要求30所述的组合物，其特征在于，所述动脉为微动脉，所述静脉为微静脉。
47.一种鉴别动脉及静脉的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求30-46任一项所述的组合物。
48.根据权利要求47所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括适当的缓冲液和用于改善试剂盒货架期的防腐剂。
49.根据权利要求47所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括包装组合物的包装材料。
50.根据权利要求47所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括说明书。
51.一种系统，其特征在于，所述系统包括：
存储器，其存储处理器可读指令；和
一个或多个处理器，被布置用于读取和执行存储在所述存储器中的指令；
其中，所述处理器可读指令包括被布置为控制计算机执行权利要求1-29任一项所述的方法的指令。
52.碱性磷酸酶染色液和脂溶性染料在制备鉴别组织中动脉及静脉的产品中的应用，所述产品对墨汁灌注的组织先进行碱性磷酸酶染色，再进行脂溶性染料染色，所述组织为脑组织。
53.根据权利要求52所述的应用，其特征在于，所述脂溶性染料包括苏丹红、对位红、油红O中的任一种。
54.根据权利要求53所述的应用，其特征在于，所述脂溶性染料选自油红O。
55.根据权利要求52所述的应用，其特征在于，所述产品还包括进行墨汁灌注的墨汁工作液。
56.根据权利要求55所述的应用，其特征在于，所述墨汁工作液包括油墨。
57.根据权利要求55所述的应用，其特征在于，所述墨汁工作液还包括用于固定墨汁的试剂。
58.根据权利要求57所述的应用，其特征在于，所述用于固定墨汁的试剂包括明胶。
59.根据权利要求58所述的应用，其特征在于，所述明胶的浓度为2％-6％。
60.根据权利要求59所述的应用，其特征在于，所述明胶的浓度为4％。
61.根据权利要求52所述的应用，其特征在于，所述产品还包括组织固定液。
62.根据权利要求61所述的应用，其特征在于，所述组织固定液包括单纯固定液、混合固定液中的任一种。
63.根据权利要求62所述的应用，其特征在于，所述组织固定液选自混合固定液。
64.根据权利要求63所述的应用，其特征在于，所述混合固定液包括Gendre液、Bouin液、Zenker液、Helly液、Carnoy液、中性甲醛固定液、4％多聚甲醛固定液、Orth液、Regaud液、Susa液、酒精-甲醛液、乙醚-酒精液中的任一种。
65.根据权利要求64所述的应用，其特征在于，所述混合固定液选自4％多聚甲醛固定液。
66.根据权利要求61所述的应用，其特征在于，所述产品还包括组织脱水剂。
67.根据权利要求66所述的应用，其特征在于，所述组织脱水剂包括蔗糖溶液、乙醇溶液、异丙醇溶液、丙酮溶液中的任一种。
68.根据权利要求67所述的应用，其特征在于，所述组织脱水剂选自蔗糖溶液。
69.根据权利要求68所述的应用，其特征在于，所述蔗糖溶液为20％-30％蔗糖溶液。
70.根据权利要求69所述的应用，其特征在于，所述蔗糖溶液为30％蔗糖溶液。
71.根据权利要求52所述的应用，其特征在于，所述动脉为微动脉，所述静脉为微静脉。
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