FI116625B - Menetelmä proteiinien kiteyttämiseksi hiilihydraattirunkoisilla polymeereillä - Google Patents

Description

116625 1 MENETELMÄ PROTEIINIEN KITEYTTÄMISEKSI HIILIHYDRAATTIRUNKOISILLA POLYMEEREILLÄ

Tiivistelmä 5

Keksinnön kohteena on makromolekyylien, erityisesti proteiinien ja polypeptidien kiteytysmenetelmä jossa käytetään reagensseina valittuja hiilihydraattirunkoisia biologista alkuperää olevia polymeerejä kuten alginaattia, pektiiniä, dekstriiniä tai kitosaania ja näiden hydrolysaatteja. Menetelmällä voidaan estää kiteiden 10 sedimentoituminen ja täten edistää tuotteen pysyvyyttä tasa-aineisena. Menetelmällä voidaan valmistaa polypeptideistä uusia kidemuotoja ja edistää kiteiden pysyvyyttä.

Polymeerejä koskevaa tunnettua tekniikkaa : 15 Kitosaania, alginaattia ja pektiiniä käytetään laajasti erilaisissa bioteknologian sovellutuksissa. Näiden polymeerien käytöstä löytyykin runsaasti muun muassa katsaus-tyyppistä kirjallisuutta. Osa julkaisuista käsittelee kyseisten polymeerien yleistä käyttöä (Hirano 1996) kun taas toiset keskittyvät tiettyyn ,, * * ’ käyttösovellusalueeseen kuten lääkkeiden tuotekehitykseen (Borchard ja Junginger ·...’ 20 2001; Singlaja Chawla 2001; Tonnesen ja Karisen 2002).

·;· Näiden polymeerien elektrolyytti luonne mahdollistaa fysikaalisten hydrogeelien valmistamisen vastakkaisen varauksen omaavien ionien kanssa (Hoffman 2002). Esimerkiksi alginaattia on perinteisesti käytetty lääkeformulaarioiden lisäaineena sen geeliä muodostavien ja stabiloivien ominaisuuksiensa vuoksi. Alginaatti ja pektiini 25 ovat polyanioneja ja kitosaani on polykationi. Näistä muodostettuja biohajoavia ·, ; geelejä voidaan käyttää esimerkiksi sellaisissa lääkeformulaatioissa, joilla säädellään 116625 2 lääkkeen vapautumista elimistössä tietyissä olosuhteissa kuten mahalaukun happamassa ympäristössä (Bodmeier, Chen ja Paeratakul 1989; el Fattah ym. 1998) tai paikallisesti tietyissä kudoksissa kuten vaikkapa nivelrustossa (Mierisch ym. 2001). Niistä voidaan valmistaa myös sellaisia liuoksia, jotka muodostavat geelin 5 vasta elimistöön annosteltuina esimerkiksi ruumiinlämmön vaikutuksesta (Chenite ym. 2000) tai mahalaukun happamissa olosuhteissa (Miyazaki, Kubo ja Attwood 2000).

Alginaatin ja pektiinin geeliyttämiseen on tavallisimmin käytetty kalsiumionia. Kitosaanin geeliyttämiseen on käytetty muun muassa tripolyfosfaattia (Bodmeier, 10 Chen ja Paeratakul 1989; Janes, Calvo ja Alonso 2001).

Kirjallisuudesta löytyy lukuisia näiden polymeeriliuosten fysikokemiallisia ominaisuuksia, viskositeettia ja geeli yty vyyttä käsitteleviä julkaisuja (Desbrieres 2002; Li ja Xu 2002; Singla ja Chawla 2001). Kiinnostus erityisesti kitosaanigeelien tutkimukseen on kasvanut voimakkaasti viime vuosina. Kitosaaniliuoksen 15 viskositeetti kasvaa kitosaanikonsentraation ja deasetylaatioasteen kasvaessa sekä lämpötilan laskiessa. Kitosaani on kuitenkin liukenematon alkalisessa ja neutraalissa pH:ssa, mikä saattaa toisinaan asettaa rajoituksia sen käytölle sellaisenaan.

Kitosaanista valmistettuja geelejä, niiden ominaisuuksia ja käyttösovelluksia on tutkittu paljon erilaisia lääkeformulaatioita ja hoitomuotoja kehiteltäessä. 20 Esimerkiksi injektoitavaa kitiinigeeliä on valmistettu kitosaania asetyloimalla (Gerentes ym. 2002). Yhä kasvavan mielenkiinnon vuoksi onkin jo käyty .···. keskustelua kitosaanin ja alginaatin turvalliseen lääketieteelliseen käyttöön liittyvästä standardoinnista ja ohjeistuksesta (Domish, Kaplan ja Skaugrud 2001).

• · « » 1 '! ‘ Vastaavanlaisissa tableteissa on käytetty myös kitosaanin ja alginaatin muodostamaa ' ·'.' 30 ionikompleksia (Takeuchi ym. 2000).

·

On yleisesti tunnettua kirjallisuudessa, että kitosaania, alginaattia ja pektiiniä on . 25 käytetty erilaisina partikkeleina lääkeaineiden ja proteiinien kantoaineena (engl.

”-t carrier). Esimerkiksi sellainen suun kautta annosteltava lääkeaineen vapautumista • _ säätelevä formulaatio, jossa kitosaanin ja lääkeaineen seos on granuloitu tai pelletöity, on patentoitu (Säkkinen ja Marvola 2001 patentti WO0176562).

» 116625 3 Lääkeaineiden partikkeleita tai kiteitä on myös kapseloitu (engl. encapsulated) pieniin pallomaisiin geelipartikkeleihin (engl. beads, microspheres tai microparticles), jotka on tavallisesti kovetettu tipauttamalla lääkeainetta sisältävää polymeeriliuosta pisaroina vastaionia sisältävään liuokseen (Bodmeier, Chen ja 5 Paeratakul 1989; Bodmeier ja Paeratakul 1989; Takka ja AcartUrk 1999). Kitosaania on kapseloitu myös ionikompleksina glysiiniliuoksessa (Kofuji ym. 2001).

Vastaavasti on suoritettu niin solujen (Serp ym. 2000) kuin myös proteiinien kapselointia. Esimerkiksi albumiinia on kapseloitu kitosaanilla päällystettyihin pektiinipartikkeleihin kalsiumkloridiliuoksessa (Kim ym. 2003). Proteiinien 10 kapselointia on suoritettu myös inkuboimalla proteiini liuosta puolivalmiissa polymeerikapselisuspensiossa, jolloin kapselien sisältämä geeli on saatu täyttymään proteiinilla. Tiourina ja Sukhorukov (2002) ovat osoittaneet a-kymotrypsiini-entsyymin säilyttäneen hyvin aktiivisuutensa tällaisessa alginaatti-protamiini-kapselien suspensiossa. Myös proteiinikiteiden kapselointi polymeerikantoaineeseen 15 on jo ennestään tunnettua tekniikkaa (Margolin ym. 2003 patentti US2003175239).

Geeliä tai partikkeleita muodostavan ominaisuuden lisäksi alginaatilla ja kitosaanilla tai niiden modifikaatioilla on mainittu myös useita muita edullisia ominaisuuksia kuten antioksidatiivisia (Schmidt 2003; Xue ym. 1998) ja antimikrobiaalisia (Huard ym. 2001 patentti US6197322; Jumaa, Furkert ja Muller 2002; Kim ym. 1999; ; 20 Sakurada 1995 patentti JP7258972) vaikutuksia. Näiden ominaisuuksiensa vuoksi *:··; erityisesti kitosaania on ehdotettu käytettävän muun muassa säilöntäaineena tai ·:1: terapeuttisena materiaalina ihon hoitoon ja haavojen parantamiseen. Kitosaanin on 1,,,: havaittu nopeuttavan haavojen paranemista uuden ihosolukon muodostumista edistäen (Singla ja Chavvla 2001) sekä elimistön omia puolustusmekanismeja kuten :... · 25 makrofageja aktivoiden (Ueno, Mori ja Fujinaga 2001).

·· Kationiluonne antaa kitosaanille bioadheesioon liittyvän erityisominaisuuden, jota on • · » · käytetty hyväksi limakalvojen kautta annosteltavien, esimerkiksi insuliinia tai muuta ,...; makromolekyyliä, peptidiä, proteiinia tai DNA:ta sisältävien lääkkeiden kehittelyssä .·**. (Femandez-Urrusuno ym. 1999; Janes, Calvo ja Alonso 2001; van der Lubben ym.

Λ 30 2001; Takeuchi, Yamamoto ja Kawashima 2001; Thanou, Verhoef ja Junginger 2001).

116625 4 Näiden polymeerien erilaisia käyttösovellutuksia löytyy lääketeollisuuden lisäksi paljon esimerkiksi elintarvike-, kosmetiikka-, tekstiili- ja paperiteollisuudesta. Kitosaanilla on lupaavia tulevaisuuden mahdollisuuksia, ei pelkästään geelinä tai lisäaineena, vaan myös biologisesti aktiivisena aineena.

5

Proteiinikiteytyksen tunnettua tekniikkaa

Joitakin tietoja proteiinien kiteytyksestä on julkaistu jo 1800-luvulla. Lääketieteellisessä oppikirjassa vuodelta 1853 kuvaillaan hemoglobiinin 10 kiteyttäminen. Proteiinien kiteytys kasvoi 1920-luvulla nopeasti laajenevaan käyttöön. 1900- luvun alkupuolella kiteytystä käytettiin erityisesti proteiinien puhdistamiseen preparatiivisessa mittakaavassa. Viime vuosikymmeninä proteiinien kiteytystä on kehitetty ensisijaisesti molekyylirakenteiden tutkimista varten. Hyviä yleiskatsauksia proteiinien kiteytysmenetelmiin ja käytettyihin reagensseihin on 15 julkaistu kirjoissa, joita ovat toimittaneet Alexander McPherson (1989), A. Ducruix and R. Giege (1992) ja. Bergfors, T. M. (1999).

Kiteytyksen käyttö tuotannollisiin ja lääketieteellisiin tarkoituksiin on suhteellisesti katsoen vähentynyt samalla kun proteiinien kromatografinen puhdistus on voimakkaasti kehittynyt. Viime aikoina on kuitenkin noussut uusi kiinnostus 20 proteiinien kiteytysmenetelmään lääketieteellistä formulointia varten.

Kuitenkaan useimmat kiteytysmenetelmät joita nykyisin käytetään • ♦ · rakennetutkimuksissa eivät ole laisinkaan sopivia lääketieteellisten tuotteiden valmistukseen. Näissä menetelmissä käytettävät kiteytysreagenssit ovat fysiologisesti sopimattomia ja usein suorastaan myrkyllisiä. Lääketieteellisiin kiteytyksiin täytyy 25 näin ollen valita sellaisia reagensseja jotka ovat sinällään elimistöön sopivia ja farmakopean mukaisesti hyväksyttyjä. Jotkin aineet ovat hyväksyttyjä ihonalaiseen * I » '·"/· tai suonensisäiseen injektioon, jotkin ainoastaan ruoansulatuskanavan kautta käytettäviksi.

’ I » • * 116625 5 Näin ollen farmakologinen hyväksyttävyys rajoittaa suuresti kiteytykseen käytettävissä olevien aineiden valikoimaa. Seuraavassa esitetään luettelomaisesti ryhmiteltynä joitakin proteiinien kiteytyksessä käytettyjen aineiden tai olosuhteiden perustyyppejä ja tarkastellaan niiden soveltuvuutta farmaseuttiseen käyttöön.

5 Epäorgaanisia suoloja, kuten ammoniumsulfaattia, natriumsulfaattia, fosfaatteja, litiumkloridia, natriumkloridia ja kaliumkloridia käytetään usein hyvin väkevinä 0.5 - 3 M liuoksina, jotka eivät ole farmakologisesti hyväksyttäviä. Alkoholit ja orgaaniset liuottimet, kuten metanoli, etanoli, isopropanoli ja asetoni ovat hyviä kiteyttäjiä, mutta myrkyllisiä. Synteettiset polymeerit, kuten lukuisat erilaiset 10 polyetyleeniglykolit ja niiden johdannaiset ovat rajoitetusti soveltuvia synteettisen kemian tuotteita. Proteiinien kiteytykseen on käytetty näiden esimerkkien lisäksi tuhansia erilaisia reagensseja ja niiden yhdistelmiä. Hyvin harvat näistä reagensseista ovat lääketieteelliseen käyttöön tai elintarvikeprosesseihin soveltuvia.

Kirjallisuudessa väitetään yleisesti, että proteiinien kiteytys on vaikeaa ja edellyttää 15 proteiinin hyvin suurta puhtautta. Proteiinin liuoksesta pitää poistaa kaikki vieraat aineet, erityisesti muut proteiinit ja polymeerit jotta kiteytys voisi lainkaan onnistua. Tämän yleisen periaatteen mukaisesti kiteytettävä proteiini puhdistetaan erittäin perusteellisesti esimerkiksi useilla peräkkäisillä kromatografiamenetelmillä. Puhdistamisen jälkeen liuokseen lisätään jotain edellä mainittua reagenssia, jolloin : 20 proteiini saattaa kiteytyä. Tämän kaltaisia menetelmiä on julkaistu tieteellisessä *: ·: kirjallisuudessa kymmeniä tuhansia.

• · .··. Tässä keksinnössä käytettyjen esimerkkiproteiinien kiteytyksiä on kuvattu • · kirjallisuudessa perusteellisesti. Abel julkaisi (1926) ensimmäisen insuliinin kiteytyksen. Myöhemmin Scott (1934) ja Schlichtkrull (1956 ja 1960) ovat 25 julkaisseet useita tutkimuksia insuliinin kiteytyksestä. Glukoosi-isomeraasin ·· kiteytyksen on kuvannut patenteissa Visuri (1987 ja 1992) sekä tieteellisessä » * « · julkaisussa Vuolanto ym (2003). Törrönen A. ym. (1994) ovat kuvanneet ksylanaasin kiteytyksen.

116625

Kiteytys geeleissä Röntgenkristallografiassa tarvittavien yksittäisten isojen proteiinikiteiden valmistusmenetelmiä geeleillä ovat kuvanneet julkaisuissaan Robert, M. C. ja 5 Lefauchcheux, F. (1988). sekä Robert, M. C. ym.(1992). Kuvatuilla menetelmillä proteiineja kiteytetään silikageelin tai agaroosigeelin kera. Näissä menetelmissä geelit eivät toimi kiteytysreagensseina vaan niiden tehtävänä on ensisijaisesti säädellä ja hidastaa kiteiden liian nopeata muodostumista. Proteiinien kiteyttäminen tehdään lisäämällä seokseen tunnetun tekniikan mukaisia kiteytysreagensseja.

10 Tämän keksinnön eroavaisuuksia tunnettuun tekniikkaan

Tunnetussa tekniikassa käytetään puheena olevia polymeerejä yleensä proteiinihiukkasten tai kiteiden kapselointiin tai stabilointiin mm. kuivauksen yhteydessä. Tässä keksinnössä on kuitenkin kyseessä ainoastaan polymeerien geeliin 15 tai liuokseen perustuva menetelmä ja tuotemuoto. Keksinnön mukaisella menetelmällä ei pyritä kapseloimaan proteiineja, vaan kiteet ovat sellaisenaan vapaana polymeerin liuoksessa tai jatkuvassa tasaisessa geelissä. Keksinnön ‘ ’ mukaisia kidesuspensioita ei kuivata.

• •III * · ·:·*: Tämän keksinnön mukaisilla polymeeriliuoksilla tai niiden geeleillä tehtyjä 20 proteiinien tai polypeptidien kiteytyksiä ei tunneta aikaisemmassa kirjallisuudessa.

Keksinnön mukainen ei-kapseloitu tuote on sellaisenaan käyttökelpoinen kiteisen ·,,,· makromolekyylin ja viskoosin liuoksen tai geelin tasalaatuinen seos, jota voidaan myös säilyttää tasalaatuisena sekoittamatta ja syöttää kohtuullisella paineella « · · kapillaarin läpi.

» · > » » * 25 Keksinnön mukaisena tavoitteena ovat seosolosuhteet, joissa proteiinien luonnolliset . ominaisuudet säilyvät ennallaan. Tätä tavoitetta edistää se, että kiteisen proteiinin fysikaalinen ympäristö on hyvin samankaltainen kuin liukoisen proteiinin.

116625 7 Tämä keksintö eroaa oleellisilta osiltaan aiemmin tunnetuista tekniikoista joissa käytetään geelejä kiteytyksen apuvälineenä. Kyseisillä tunnetuilla menetelmillä pyritään kiteyttämään proteiinit hyvin hitaasti siten että muodostuu mahdollisimman vähän kideytimiä. Tällöin saadaan syntymään yksittäisiä isoja kiteitä. Kuvatuissa 5 menetelmissä muodostetaan geelistä ja proteiiniliuoksesta kaksi eri faasia jotka ovat kosketuksessa toisiinsa. Näissä tekniikoissa kiteytyminen saadaan aikaan nimen omaan lisäämällä geelifaasiin proteiinin kiteytymisen aiheuttava ennalta tunnettu reagenssi. Kiteytyminen tapahtuu hitaasti kun reagenssi ja proteiini sekoittuvat diffuusion avulla. Tunnetun tekniikan geeliä muodostavat aineet ovat erilaisia kuin 10 tämän keksinnön mukaiset polymeerit.

Kirjallisuudessa kuvatussa tekniikassa geelin muodostukseen käytetyt aineet eivät itsenäisesti toimi kiteyttävinä reagensseina. Niiden halutaan nimen omaan olevan mahdollisimman inerttejä ja reagointi kiteytettävän proteiinin kanssa nähdään haittana.

15 Tämän keksinnön mukaisesti polymeerit ja kiteytettävä proteiini sekoitetaan nopeasti keskenään ja kiteytyminen tapahtuu tasaisesti koko seoksessa. Vaihtoehtoisesti ennalta muodostetut kiteet sekoitetaan näihin polymeereihin. Geelin muodostuminen ei ole välttämätön edellytys tämän tekniikan hyötykäytölle.

Tämän keksinnön mukaisesti polymeerit voivat olla oleellisia aineita kiteiden ] " 20 muodostumisessa. Monissa seuraavissa esimerkeissä polymeeri tai sen hydrolysaatti • · on suorastaan välttämätön reagenssi kiteiden tuottamisessa. Voidaan päätellä että • · nämä polymeerit osallistuvat monin tavoin kiteytymiseen. Tätä päätelmää tukee muun muassa yllättävä havainto, että proteiineista syntyy polymeereissä usein aivan erimuotoisia ja keskimäärin erikokoisia kiteitä kuin samoista proteiineista 25 kiteytettäessä aikaisemmin tunnetulla tekniikalla.

* » * * e * t » 116625 8

Keksinnön kuvaus Tämän keksinnön mukaisesti proteiinit tai polypeptidit kiteytetään liuoksessa joka sisältää valittuja hiilihydraattirunkoisia biologista alkuperää olevia polymeerejä. 5 Keksinnön mukaisia polymeerejä ovat alginaatti, dekstriini, pektiini ja kitosaani. Polymeerien molekyylikoko voi luonnostaan vaihdella niiden biologisesta alkuperästä ja puhdistusprosessista riippuen. Kaupallisesti on saatavissa saman tyyppisiä polymeerejä, joilla on hyvin vaihteleva molekyyli koko. Yleisen käsityksen ja kokemuksen mukaan hiilihydraatit ja polysakkaridit suojaavat proteiineja ja 10 edistävät niiden pysyvyyttä liukoisena.

Nyt on yllättäen havaittu ja osoitettu kokeellisesti, että nämä polymeeriset aineet voivat edistää proteiinien ja peptidien kiteytymistä tai soveltuvat käytettäväksi kiteytyksen yhteydessä. Lisäksi on havaittu, että nämä polymeerit voivat olla myös 15 osittain hydrolysoituja molekyylikoon pienentämiseksi. Keksinnön mukaisia polymeerejä ja niiden hydrolysaatteja käyttäen voidaan valita monenlaisia kiteytysolosuhteita jolloin voidaan saavuttaa erilaisia hyödyllisiä tavoitteita. Eri tyyppisiä polymeerejä voidaan myös tarkoituksenmukaisesti yhdistellä.

t * > · 20 Keksinnön mukaisilla polymeeriliuoksilla on kiteytettyjä seostettu useita erilaisia *:'· proteiineja, mm. glukoosi-isomeraasi, insuliini, ksylanaasi ja endoglukanaasi. Näin : : voidaan päätellä, että kyseisiä polymeerejä voidaan edullisesti käyttää lukuisien eri proteiinien ja polypeptidien kiteytyksen yhteydessä.

♦ * · * 25 Erityisen kiinnostavaa ja edullista on se, että voidaan valmistaa pieniä ja tasakokoisia kiteitä. Tällainen kidesuspensio on edullinen esimerkiksi tarkan annostelun kannalta.

116625 9

Viskoosissa liuoksessa tai tiksotrooppisessa geelissä tällainen kidesuspensio on hyvin pysyvä.

Näistä polymeereistä on myös valmistettu entsymaattisen hydrolyysin avulla 5 pienimolekyylisempiä tuotteita, jotka ovat hyvin soveltuvia proteiinien kiteytykseen. Hydrolyysin avulla voidaan alentaa polymeeriliuoksen viskositeettia, mikä on eduksi esimerkiksi silloin kun päätavoitteena on proteiinin kiteyttäminen. Hydrolysoidusta polymeeristä voidaan tarvittaessa valmistaa väkevämpiä liuoksia kuin alkuperäisestä.

10 Alkuperäisiä suurimolekyylisiä polymeerejä on edullista käyttää silloin kun tavoitteena on geelimäinen tuote ja kiteiden laskeutumisen estäminen. Polyelektrolyyttisiä polymeerejä, kuten alginaattia ja pektiiniä voidaan geeliyttää lisäämällä sopivia vastaioneja, esimerkiksi kalsiumia. Polymeerien avulla voidaan säädellä kidesuspensioiden viskositeettia laajalla alueella. Näistä polymeerien 15 ominaisuuksista on paljon kirjallisuutta kuten edellä tunnetussa tekniikassa on mainittu.

« I · ....: Menetelmän etuja.

t · , · · ·, Seuraavaksi kuvaillaan joitakin keksinnön mukaisen menetelmän etuja.

• · • * · 20 t ·

Polymeerit kiteytysreagensseina lit ”*: Nämä polymeerit toimivat usein pääasiallisina proteiineja kiteyttävinä reagensseina,

* t I

kuten esimerkit 12 - 65 osoittavat. Vastaavissa olosuhteissa pelkässä * · puskuriliuoksessa kiteytymistä ei tapahdu.

t » * » 25 1 1 6625 10 Lääketieteellinen hyväksyttävyys

Polymeerit ovat lääketieteellisesti hyväksyttäviä aineita. Näin voidaan valmistaa kiteisiä lääkeainetuotteita esimerkiksi ihonalaista injektiota varten. Kiteytys voidaan tehdä hyvin alhaisessa suolapitoisuudessa. Kiteytyksessä ainoana suolana voi olla pH 5 säädössä käytetty laimea puskuriliuos, esimerkiksi fosfaatti. Polysakkarideilla on tunnetun tekniikan perusteella proteiineja stabiloiva vaikutus. Keksinnön mukaisessa lopullisessa koostumuksessa polymeerin kuiva-ainepitoisuus on alhainen, tavallisesti alle 5 painoprosenttia.

10 Edut lääkkeiden annostelussa

Kiteisten suspensioiden käyttöä vaikeuttaa tai rajoittaa yleensä kiteiden laskeutuminen ja sen seurauksena epähomogeenisten suspensioiden muodostuminen. Tästä ovat esimerkkinä kaupalliset hidasvaikutteiset kiteiset insuliinivalmisteet, joita täytyy aina ravistella voimakkaasti ennen käyttöä. Polymeerit nostavat liuoksen 15 viskositeettia ja niillä voi siten estää kiteiden laskeutumisen astian pohjalle. Näin voidaan lääkeainesuspensio pitää kauan homogeenisena.

* * · • * · , _ _ _; Edut teollisuusentsyymien tuotannossa ja annostelussa

Useita teollisuusentsyymejä voitaisiin edullisesti valmistaa ja varastoida kiteisinä jos • · ·*;* 20 kiteet eivät sedimentoituisi. Kidesuspensioina voidaan teollisuusentsyymejä * » · varastoida ja käyttää hyvin väkevinä. Näin saavutetaan merkittäviä säästöjä. Nyt » * • · voidaan kiteisen valmisteen edut saada käyttöön tämän keksinnön mukaisella . menetelmällä « « · » ♦ · * t 4 4 * 4 I 0 I > < ♦ · t ·

> I

116625 n

Geeliytys

Polymeeri voidaan tarvittaessa geeliyttää ennen proteiinin kiteytymistä, jolloin kiteytyminen tapahtuu tasaisesti vaikka panos pidetään sekoittamatta. Kiteytysolosuhteet voidaan säätää sellaisiksi, että kahden liuoksen yhdistäminen 5 tuottaa tasaisen seoksen, jossa yhdistämisen jälkeen tapahtuu sekä geelin muodostuminen että proteiinin kiteytyminen ilman uusia reagenssilisäyksiä. Geelin viskositeetti voidaan säätää halutunlaiseksi tunnetulla tekniikalla. Keksinnön mukaisen geelin viskositeetti on riittävä estämään kiteiden laskeutumisen, mutta samalla sellainen, että geeliä voidaan syöttää kohtuullisella paineella ohuen 10 kapillaarin läpi.

Hidas liukoisuus

Yksi kiteisen proteiinin etu liukoiseen proteiiniin verrattuna on sen hitaampi ja pitkäkestoisempi vaikutus sen vaatiman liukenemisajan vuoksi. Kiteisen proteiinin 15 liukenemisnopeuteen vaikuttaa fysikaalinen ja kemiallinen ympäristö sekä kidekoko. Jos kidekoko on tasainen, Iiukenemisnopeus on ennustettavissa ja hallittavissa.

* , ,; Homogeeninen kidekoko * « ' 1 ·

Kun proteiinin tai polypeptidin kiteytys suoritetaan liukoisen tai geeliytetyn • · ”) 20 polymeerin, polymeeriseoksen tai polymeeri hydrolysaatin läsnäollessa, '!!! kiteytymisnopeudessa tai kiteiden koossa ja muodossa voidaan havaita • · • · eroavaisuuksia, jotka ovat edullisia tavanomaiseen liuokseen verrattuna. Keksinnön mukaisella liuos- tai geelikoostumuksella voidaan saada aikaan homogeeninen

* 1 1 I

, -", nukleaatio mikä johtaa tasaisen kidekoon muodostumiseen.

i a 25 » * t * · » · 1 1 6625 i2

Keksinnön edullinen suoritustapa

Kiteytettävä proteiini tai peptidi, liuotetaan puskurisuolaliuokseen. Edullinen puskuri on esimerkiksi laimea fosfaatti, jonka konsentraatio voi olla 20 - 50 mM. Tässä liuoksessa proteiinin ei tarvitse kiteytyä. Toisaalta proteiini voi tässä vaiheessa olla 5 kiteisenä jos se on lopputuotteen kannalta hyväksyttävää tai edullista.

Valmistetaan keksinnön mukaisesta polymeeristä, esimerkiksi pektiinistä, dekstriinistä, alginaatista, kitosaanista, polymeerin hydrolysaatista tai jostakin näiden seoksesta liuos veteen. Polymeerin edullinen pitoisuusalue on alempi kuinlO %. Polymeerien hydrolysaateista voi valmistaa väkevämpiä liuoksia niiden 10 alhaisemman viskositeetin johdosta. Liuos voi sisältää polymeerin ohella ainetta joka helpottaa polymeerin liuottamista, esimerkiksi happamuuden säätöön tarvittavaa ainetta kuten asetaattia.

Valmistetaan proteiinin ja polymeerin liuoksista tasa-aineinen seos. Tämän jälkeen tapahtuu proteiinin kiteytyminen. Panosta sekoitetaan jatkuvasti jos seoksen 15 viskositeetti on suhteellisen alhainen. Jos viskositeetti on riittävän korkea, panosta ei tarvitse sekoittaa liuosten yhdistämisen jälkeen.

Haluttaessa voidaan tähän seokseen lisätä ainetta, joka geeliyttää käytetyn polymeerin tai säätää sen viskositeetin halutulle tasolle. Tällainen aine voi olla esimerkiksi jokin kahdenarvoinen kationi kuten kalsium-ioni. Vaihtoehtoinen i · . 20 geeliyttäjä voi olla esimerkiksi sähkövaraukseltaan toisenlainen polymeeri. Sopivan ,,. polymeeriparin voi muodostaa esimerkiksi kitosaani ja alginaatti.

« I

··>·’ Proteiinin tai polypeptidin kiteytymisen edellytyksenä on se, että panoksen ’*·’ sekoittamisen jälkeen olosuhteet ovat hallitut. Seoksen happamuuden (pH) tulee olla sellainen, että kyseinen proteiini voi kiteytyä. Edullisin pH on erilainen eri ·;;; 25 proteiineilla. Edullinen pH arvo saavutetaan käyttämällä proteiinin ja polymeerin liuoksissa tarkalleen annosteltuja puskuri aineita. Proteiinin kiteytyminen voi myös *»» * * ‘ ’ edellyttää jonkin erityisen reagenssin käyttöä. Tämän keksinnön mukaisesti itse » · '··* polymeeri tai sen hydrolysaatti voi hyvin monissa tapauksissa yksinään toimia pääasiallisena kiteyttävänä reagenssina.

1 1 6625 is

Seuraavat esimerkit valaisevat tarkemmin keksinnön toimivuutta ja etuja erilaisista lähtökohdista ja näkökulmista tarkasteltuna.

5 Esimerkit Esimerkki 1.

Ihmisen insuliinin kiteyttäminen 1,5 % natriumalginaattiliuoksessa

Kiteytettävänä materiaalina käytettiin ihmisen insuliinia. Tämä proteiini on tuotettu ilmentämällä ihmisen insuliinin geeni E. Colissa. Insuliinin toimittaja oli Sigma, 10 jonka luettelossa se on tuotenumerolla I 0259. Kuivaa insuliinijauhetta liuotettiin 21,1 mg/ml happameen liuotusreagenssiin joka sisälsi 10 mM suolahappoa ja 3 mM sinkkikloridia.

Valmistettiin 3 % (w/w) natriumalginaatti (Fluka 71238) polymeeriliuos veteen. 450 mikrolitraan tätä polymeeri liuosta lisättiin puskuriksi 50 mikrolitraa 4 M kalium 15 natrium fosfaattia, jonka pH on 5,6. Sekoitettiin koeputki sekoittajalla puskuroitua alginaattiseosta ja samalla lisättiin 500 mikrolitraa insuliiniliuosta, jonka '*. proteiinipitoisuus oli 10,6 mg/ml. Loppuolosuhteet kiteytyspanoksessa olivat: 1,5 % • * , natriumalginaattia; 0,2 M kalium natrium fosfaattia ja 5,3 mg/ml ihmisen insuliinia, joka vastaa 145 kansainvälistä yksikköä (lyhennetään ky) per millilitra. Suolahapon • · 20 loppupitoisuus on tällöin 2,5 mM ja sinkkikloridin 0,75 mM. Kiteytys tehtiin tili , · · ·. huoneenlämmössä (25 °C).

• · Tällöin syntyi aluksi tasainen amorfinen valkoinen saostuma. Koeputki siirrettiin I” keinutukseen. Noin kahden ja puolen tunnin kuluessa amorfinen sakka liukeni ja Ί* muodostui täysin kiteytynyt melko tasakokoinen kuutiomainen insuliinikidejoukko 25 (Valokuva 1). Kuutiomaisten kiteiden särmän pituus oli tyypillisesti 10-15 •; · * mikrometriä valokuvasta 1 mitaten.

* ♦

Esimerkki 2.

1 1 6625 14

Ihmisen insuliinin kiteyttäminen 1,5 % kalsiumalginaattigeelissä

Kiteytettävänä materiaalina oli ihmisen insuliini kuten esimerkissä 1. Kiteytys tehtiin siten että kalsiumalginaattigeeli muodostui lopullisessa seoksessa ennen insuliinin 5 kiteytymistä.

Kuivaa insuliinijauhetta liuotettiin 20 % (v/v) etikkahappoon niin, että insuliinipitoisuudeksi tuli 16,7 mg/ml. 200 mikrolitraa tätä liuosta laimennettiin lisäämällä 85 mikrolitraa vettä. Tähän insuliiniliuokseen lisättiin 70 mikrolitraa 0,1 M kalsiumkloridia.

10 Natriumalginaattiliuos valmistettiin erikseen sekoittamalla 1,5 millilitraa 2 % (w/w) natrium-alginaattia, 140 mikrolitraa 1 M natriumhydroksidia ja 5 mikrolitraa 0,25 M sinkkikloridia. Kalsiumkloridipitoinen insuliiniliuos lisättiin alginaattiliuokseen huoneenlämmössä magneettisekoittimella samalla hyvin sekoittaen, jolloin muodostui nopeasti kalsiumalginaattigeeli.

15 Lopulliset kiteytysolosuhteet olivat: 1,67 mg/ml insuliini, 2 % etikkahappo, 70 mM natriumhydroksidi, 0,625 mM sinkkikloridi, 1,5 % natrium-alginaatti, 3,5 mM kalsiumkloridi. Näin valmistettiin kirkas, melko homogeeninen ja jähmeä geeli, joka samentui nopeasti. Geelin annettiin olla sekoittamatta huoneenlämmössä 3 päivää. ·: Insuliini kiteytyi geelissä (pH 4,1) pieninä, tasakokoisina neuloina ja neulakimppuina . 20 (Valokuva 2). Yksittäisten kideneulasten tyypillinen paksuus oli 1,5 Mm ja pituus 25 :>( ,· Mm. Kiteet eivät laskeutuneet tässä geelissä. Jos olosuhteet ovat muuten samat, mutta t natriumalginaattia ei ole lisätty, insuliini ei kiteydy ja liuos pysyy kirkkaana. Tästä • * » *.. .· voidaan päätellä, että yllättävästi alginaatti aiheuttaa insuliinin kiteytymisen.

··· Esimerkki 3.

* · < I

• · * t 25 Ihmisen insuliinin kiteyttäminen 0,9 % kalsiumalginaattigeelissä •.., * Kiteytettävänä materiaalina oli ihmisen insuliini kuten esimerkissä 2. Kiteytys tehtiin : V: kalsiumalginaattigeelissä.

4 * · * » * » · 1 1 6625 15

Insuliinijauhetta liuotettiin 20 % (v/v) etikkahappoon niin, että insuliinipitoisuudeksi tuli 16,7 mg/ml. 200 mikrolitraan tätä liuosta lisättiin 85 mikrolitraa vettä ja 70 mikrolitraa 0,1 M kalsiumkloridia. Tämä liuos sekoitettiin 1,645 millilitraan 85,1 mM natriumhydroksidia ja 0,76 mM sinkkikloridia sisältävää liuosta, jolloin seoksen 5 pH:ksi saatiin 4,0.

Seoksesta tehtiin geeli lisäämällä siihen magneettisekoittimella sekoittaen 900 mikrolitraa 3 % (w/w) natriumalginaattiliuosta. Lopulliset kiteytysolosuhteet olivat: 1,15 mg/ml insuliini, 1,4 % etikkahappo, 48 mM natriumhydroksidi, 0,431 mM sinkkikloridi, 0,9 % natrium-alginaatti, 2,4 mM kalsiumkloridi.

10 Syntynyt geeli oli sameaa, ja vähemmän viskoosia kuin esimerkissä 2. Geelin annettiin olla sekoittamatta huoneenlämmössä 3 päivää. Insuliini kiteytyi geelissä pieninä, tasakokoisina neuloina ja neulakimppuina (Valokuva 3). Yksittäisten kideneulasten tyypillinen paksuus oli 1,5 /im ja pituus 25 μτη. Kiteet eivät laskeutuneet tässä geelissä.

15

Esimerkki 4.

Sian insuliinin kiteytys 0,45 %(w/w) kitosaanissa pH 5,0

i · I

Kiteytettävänä materiaalina käytettiin sian insuliinia (Calbiochem). Esimerkin 1 kaltaisesti 49 mg kuivaa insuliinijauhetta liuotettiin 4 millilitraan hapanta ,···. 20 liuotusreagenssia joka sisälsi 10 mM suolahappoa ja 3 mM sinkkikloridia.

• · · .Valmistettiin 0,9 % (w/w) kitosaaniliuos 0,28 M asetaattipuskuriin pH 5. Kitosaanin toimittaja oli Sigma, jonka luettelossa se on tuotenumerolla C-3646.

1 millilitraan kitosaaniliuosta lisättiin 1 millilitraa liuotettua sian insuliinia samalla * * I » ,···, koko ajan koeputkisekoittajalla sekoittaen. Lisäyksen jälkeen koeputki siirrettiin • _ 25 jatkuvaan keinutukseen huoneenlämmössä. Loppuolosuhteet kiteytyspanoksessa ,,. olivat: 0,45 %(w/w) kitosaania, 0,14 M natrium asetaattia pH 5 ja 6,1 mg/ml porsaan insuliinia. Suolahapon loppupitoisuus oli 5 mM ja sinkkikloridin 1,5 mM. Tuloksena saatiin vuorokauden kuluttua paljon pieniä sauvamaisia kiteitä. Panoksen kidesaanto » · 1 1 6625 16 oli 92,7 % insuliinin kokonaismäärästä. Valokuvasta 4 mitaten kiteiden tyypillinen pituus oli välillä 5-10 mikrometriä ja paksuus 0,5 - 1 mikrometriä.

Esimerkki 5

Sian insuliinin kiteytys 0,35 % (w/w) kitosaanissa pH 5,6 5 Tässä esimerkissä käytettiin samanlaista sian insuliinin liuosta kuin esimerkissä 4. Valmistettiin 0,9 % (w/w) kitosaaniliuos 0,66 M asetaattipuskuriin pH 5,6.

100 mikrolitraan näin valmistettua kitosaaniliuosta lisättiin 100 mikrolitraa liuotettua sian insuliinia koeputkisekoittajalla sekoittaen. Loppuolosuhteet kiteytyspanoksessa olivat: 0,35 %(w/w) kitosaani; 0,33 M natrium asetaatti pH 5,6 ja 6,1 mg/ml sian 10 insuliini. Suolahapon loppupitoisuus 5 mM ja sinkkikloridin 1,5 mM. Tässä kokeessa muodostui runsaasti kuutiomaisia kiteitä (samanlaisia kuin kuvassa 1) vuorokaudessa. Kidesaanto määritettynä liukoisuusmittauksella oli 98,8 %.

Esimerkki 6

Ihmisen insuliinin kiteytys 0,45 % kitosaanissa pH 5,0 15 Kokeessa käytettiin samaa ihmisen insuliinia kuin esimerkissä 1. Jauhe liuotettiin samalla tavalla siten että insuliinin pitoisuudeksi tuli 21,1 mg/ml. Valmistettiin 0,63 * * · ' ·: ·' % (w/w) kitosaaniliuos jonka asetaattipitoisuus oli 0,1M ja pH 5,0.

• ·

Kiteytyspanos valmistettiin sekoittamalla 355 mikrolitraa kitosaaniliuosta ja 145 mikrolitraa insuliiniliuosta. Loppuolosuhteiksi saatiin: 0,45 % kitosaania, 0,07 M 20 natrium asetaattia pH 5,0 ja 6,1 mg/ml insuliinia. Suolahapon loppupitoisuus oli 2,9 mM ja sinkkikloridin 0,9 mM. Tulokseksi saatiin runsaasti tiimalasin ja kartion muotoisia kiteitä jotka muodostuivat vuorokauden kuluessa (Valokuva 5). Tiimalasin muotoisten kiteiden tyypillinen pituus oli 50 μηπ ja pienempien kidekartioiden koko välillä 10 - 25 μηι. Tästä voidaan havaita, että kitosaani 25 vaikuttaa yllättävästi kiteiden kasvun mekaniikkaan tuottaen tulokseksi muodoltaan ..aivan toisenlaisia kiteitä kuin on nähty tunnetun tekniikan menetelmillä.

Sian insuliinin kiteytys kitosaanin ja natriumalginaatin seoksissa: 116625 π

Esimerkit 7 ja 8

Esimerkki 7

Kiteytettävänä materiaalina oli sian insuliini. Kiteytys tehtiin kitosaanin ja alginaatin 5 seoksen muodostamassa geelissä.

Kuivaa insuliinijauhetta liuotettiin 0,1 M etikkahappo, 3 mM sinkkikloridi -liuokseen niin, että insuliinipitoisuudeksi tuli 12,4 mg/ml. 300 mikrolitraan tätä liuosta lisättiin 500 mikrolitraa 1 % (w/w) kitosaaniliuosta 0,1 M etikkahapossa. Tähän insuliinin ja kitosaanin seokseen lisättiin välittömästi 700 mikrolitraa 1,3 % (w/w) 10 natriumalginaattiliuosta samalla magneettisekoittimella hyvin sekoittaen. Näin valmistettiin helposti juokseva, kirkas geeli (pH 4,3). Geelin annettiin olla sekoittamatta huoneenlämmössä 3 päivää jolloin insuliini kiteytyi ohuina neuloina joiden paksuus oli 2-3 μτη ja pituus 30-50 μηι. Lopulliset kiteytysolosuhteet olivat: 2,5 mg/ml insuliini, 0,3 % kitosaani, 0,6 % natrium-alginaatti, 53 mM etikkahappo, 15 0,6 mM sinkkikloridi, pH 4,3.

Esimerkki 8

Kiteytettävänä materiaalina oli sian insuliini kuten esimerkissä 7. Tässä esimerkissä kitosaanin pitoisuus oli huomattavasti korkeampi ja alginaatin pitoisuus alhaisempi 20 kuin esimerkissä 7.

‘... * Kiteytys tehtiin sekoittamalla kaksi liuosta (1) ja (2):

*:* Liuos (1): 1,4 mg/ml insuliini, 0,89 % (w/w) kitosaani, 0,1 M etikkahappo, 0,34 mM

: : sinkkikloridi. Liuos (2): 3,6 %(w/w) natriumalginaatti, 0,48 M natriumhydroksidi.

4500 mikrolitraa liuosta (1) lisättiin huoneenlämmössä 457 mikrolitraan liuosta (2) 25 jota samalla sekoitettiin huolellisesti. Näin valmistettiin samea geeli, jonka annettiin olla sekoittamatta huoneenlämmössä yön yli. Insuliini kiteytyi geelissä pieninä 18 116625 kuutio- ja prismakiteinä joiden läpimitta oli 10- 15 pm (Valokuva 6). Lopulliset kiteytysolosuhteet olivat: 1,3 mg/ml insuliini, 0,8 % kitosaani, 0,2 % natrium-alginaatti, 91 mM etikkahappo, 44 mM natriumhydroksidi, 0,3 mM sinkkikloridi, pH 5,3.

5

Esimerkit 9 ja 10

Sian insuliinin kiteytys glysiinin ja kitosaanin muodostamassa geelissä Esimerkki 9

Kiteytettävänä materiaalina oli sian insuliini. Kiteytys tehtiin glysiinin ja kitosaanin 10 muodostamassa geelissä. Insuliinia liuotettiin 0,1 M etikkahappo, 3 mM sinkkikloridi- liuokseen niin, että insuliinipitoisuudeksi tuli 12,4 mg/ml. 300 mikrolitraan tätä insuliiniliuosta lisättiin 1,5 millilitraa 1 % (w/w) kitosaaniliuosta 0,1 M etikkahapossa.

Tähän insuliinin ja kitosaanin liuokseen lisättiin hyvin sekoittaen 500 mikrolitraa 15 1,05 M glysiini, 0,2 M natriumhydroksidipuskuria (pH 9,0), jolloin seoksen pH oli 5,5. Muodostunutta viskoosia geeliliuosta sekoitettiin kunnes se oli kirkas ja < * · tasainen. S en j älkeen se n a imettiin o 11a s ekoittamatta h uoneenlämmössä, j olioin s e » * » « * · , pysyi kirkkaana useita tunteja. Seuraavana päivänä insuliini oli kiteytynyt • · ... keskimäärin 20 pm läpimittaisina prismakiteinä. Lopulliset kiteytysolosuhteet olivat: ♦ i ’ 20 1,61 mg/ml insuliini, 0,65 % kitosaani, 78 mM etikkahappo, 0,391 mM sinkkikloridi, . · ·, 228 mM glysiini, 43 mM natriumhydroksidi.

• t

* I

Esimerkki 10 , * , Esimerkki 9 toistettiin kemialliselta koostumukseltaan täsmälleen samalla tavoin.

·. 25 Tässä esimerkissä insuliinin kiteytyspanosta sekoitettiin voimakkaasti, jolloin se muuttui nopeasti sameaksi. Tuloksena saatiin suhteellisen pieniä, 4-5 pm 1 1 6625 19 läpimittaisia insuliinin prismakiteitä (Valokuva 7). Esimerkit 9 ja 10 osoittavat että kiteiden kokoon geelissä voidaan vaikuttaa merkittävästi sekoituksella.

Esimerkit muiden proteiinien kiteyttämisestä polymeereillä 5 Esimerkki 11

Glukoosi-isomeraasin kiteytys pektiinissä

Kiteytettävänä materiaalina oli erittäin puhdas veteen diafiltroitu glukoosi-isomeraasi jonka systemaattinen nimi on D-xylose ketol-isomerase EC 5.3.1.5. Kiteytys tehtiin kalsiumpektiinigeelissä seuraavasti: Koeputkeen pipetoitiin 1 millilitra glukoosi-10 isomeraasin vesiliuosta (57 mg/ml). Liuokseen sekoitettiin 200 mikrolitraa 0,5 M Tris-HCl-puskuria pH 7,0 ja 800 mikrolitraa 4 % (w/w) pektiiniliuosta (pectin from citrus peel, Fluka). Pektiinin ja glukoosi-isomeraasin liuoksesta valmistettiin kirkas, homogeeninen ja melko jähmeä geeli sekoittamalla siihen 500 mikrolitraa 1 M kalsiumkloridia. Geeli siirrettiin kylmään (5 °C), missä sen annettiin seistä 15 sekoittamatta.

Geeli samentui 30 minuutin aikana. Mikroskoopilla tarkasteltaessa nähtiin glukoosi-: ; isomeraasin kiteytyneen tasakokoisina sauvamaisina kiteinä. Kiteytymisen annettiin edetä yön yli. Valokuva 8 on otettu 20 tunnin kuluttua aloituksesta ja siinä kiteet ovat ‘ 20 keskimäärin 25 μτη pituisia. Lopulliset kiteytysolosuhteet olivat: 23 mg/ml glukoosi- isomeraasi, 40 mM Tris-HCl pH 7, 1,3 % pektiini, 200 mM kalsiumkloridi. Kiteet i .M’ eivät laskeudu tässä geelissä.

* · · • · * * #

Glukoosi-isomeraasin kiteytyminen on huomattavasti hitaampaa ja syntyneet kiteet ·;· ovat suurempia monikulmioita (Valokuva 9), jos pektiiniä ei ole lisätty. Ilman _ _ _: 25 kalsiumkloridia glukoosi-isomeraasi ei kiteydy vastaavissa olosuhteissa.

* · * ·

Esimerkit 12 — 38

Glukoosi-isomeraasin kiteyttäminen alginaatissa ja alginaattihydrolysaatissa 116625 20

Kiteytysreagenssiksi soveltuvat alginaattihydrolysaatit valmistettiin entsymaattisella menetelmällä. Esimerkissä käytetyn entsyymin tuotetiedot: entsyymin nimi on 5 alginaattilyaasi, aktiivisuus 2630 U/g, tuottajaorganismi Flavobacterium multivolum, toimittaja Sigma, tuotenumero A 6973. Natriumalginaatin 8 %(w/w) vesiliuosta hydrolysoitiin alginaattilyaasilla 20 tuntia 40 asteen lämpötilassa. Hydrolysointi tehtiin eriasteisesti käyttämällä eri määriä entsyymiä suhteessa alginaattiin. Entsyymimäärät olivat 0,9 mg - 9,5 mg per gramma alginaattia. Hydrolyysi 10 keskeytettiin keittämällä seoksia 20 minuutin ajan vesihauteella. Tämän jälkeen hydrolysaatit suodatettiin paperilla kiintoaineksen poistamiseksi. Näin valmistettuja alginaatin hydrolysaatteja käytettiin väkevyydeltään erilaisina liuoksina kiteyttämään proteiineja mikrodiffuusiomenetelmällä.

Kiteytettävänä materiaalina oli erittäin puhdas veteen diafiltroitu glukoosi-15 isomeraasi. Kiteytys suoritettiin +5 °C lämpötilassa mikrodiffuusiomenetelmällä sekoittaen reagenssit aluksi siten, että niiden pitoisuus oli puolet siitä mitä seuraavissa taulukoissa on ilmoitettu loppupitoisuudeksi. Kunkin kokeen aikana sekä proteiini että polymeeri väkevöityvät veden haihtumisen johdosta siten, että . saavutetaan taulukossa ilmoitettu loppupitoisuus. Kunkin esimerkin alkutilavuus oli

• I

20 10 mikrolitraa ja lopputilavuus 5 mikrolitraa. Tämän väkevöi tyrni sen seurauksena t, t; olosuhteet muuttuvat otollisiksi proteiinien kiteytymiselle.

*·;’ Nämä esimerkit tuottivat isomeraasille tyypillisiä monisärmäisiä (esimerkiksi « i < ;;; valokuva 9) tai kaksoispyramidin muotoisia kiteitä. Samanlainen prosessi voidaan i · • · toistaa haluttaessa suuremmassa mittakaavassa haihduttamalla tai muulla , 25 tavanomaisella vedenpoistomenetelmällä.

* · · * « > i ' ! >

Taulukko 1. Esimerkit 12 - 38 116625 21

Esimerkki Glukoosi- Alginaatin Hydrolyysiaste 50 mM

isomeraasin pitoisuus mg entsyymiä/g fosfaatti

No loppupitoisuus alginaattia pH Tulos __mg/ml__%____ 12__57__1__(k9__6^2__kiteytyi _13__”__2__”__6,2 kiteytyi JA__”__4__”__6,2 kiteytyi _L5__”__1__”__8/2__kiteytyi 16__”__2__”__8/2__kiteytyi J7__”__4__”__8,2 kiteytyi J_8__”__1__2j4__6,2 kiteytyi J9__”__2__”__6,2 kiteytyi 20 __”__4__”__6,2 kiteytyi 21 __”__1__”__8^2__kiteytyi 22 __”__2___”__8,2 kiteytyi 23 __”__4__”__8,2 kiteytyi 24 __”__1__4/7__6^2__kiteytyi _25__”__2__”__6,2 kiteytyi 26__”__4__”__6J2__kiteytyi _27__”__1__”__8^2__kiteytyi _28__”__2__”__8,2 kiteytyi 29 __”__4__”__%2__kiteytyi 30 __”__1__9^5__6J__kiteytyi _31__”__2J__”__6,2 kiteytyi 32__”__5__”__6,2 kiteytyi _33__”__1__”__8,2 kiteytyi _34__”__23__”__8,2 kiteytyi , *. ^5__”__5__”__8,2 kiteytyi 36__54__1__ei hydrolysoitu 7__kiteytyi ' ’ JJ__”__3__ei hydrolysoitu 7__kiteytyi ’: ’: ^8__”__5__ei hydrolysoitu 7__kiteytyi • · i * *

Glukoosi-isomeraasin kiteytys pektiinillä 22 116625

Esimerkit 39 - 41

Kiteytettävänä proteiinina käytettiin samaa glukoosi-isomeraasia kuin esimerkeissä 12-38. Kiteytys suoritettiin mikrodiffuusiomenetelmällä samoin kuin esimerkeissä 5 12-38.

Kiteet 4 %:lla pektiinillä (pectin from citrus peel, Fluka) muodostuivat huoneen lämmössä. Kiteet alemmilla pektiinitasoilla 1 % ja 2 % muodostuivat 7 asteen lämpötilassa. Nämä esimerkit osoittavat, että glukoosi-isomeraasin voi kiteyttää käyttäen ainoastaan pektiiniä kiteytysreagenssina. Samoissa olosuhteissa 20 mM 10 fosfaattipuskurissa pH 7 ilman pektiiniä glukoosi-isomeraasi ei kiteydy.

Taulukko 2. Esimerkit 39 - 41

Esimerkki Glukoosi-isomeraasin Pektiinin 20 mM Tulos

No loppupitoisuus fosfaatti pitoisuus pjj mg/ml % 39 54 1 % 7 kiteytyi ' ‘": 40 ” 2 % 7 kiteytyi : 41 ” 4% 7 kiteytyi i s »

Esimerkit 42 - 47

Ksylanaasin kiteytys alginaatin hydrolysaateissa 1 1 6625 23

Kiteytettävänä proteiinina käytettiin ksylanaasia. Tämä ksylanaasi on tuotettu Trichoderma sp organismilla ja tunnetaan kirjallisuudessa systemaattisella nimellä 5 endo-1,4-B-xylanase EC 3.2.1.8. . Kiteytys suoritettiin mikrodiffuusiomenetelmällä 5 asteen lämpötilassa alginaatin hydrolysaateissa samoin kuin esimerkeissä 12-38. Ksylanaasi ei kiteydy vastaavissa olosuhteissa ilman alginaatin hydrolysaattia. Valokuva 11 esittää tyypillisiä näissä esimerkissä valmistettuja ksylanaasin kiteitä. Tyypilliset kiteet ovat suhteellisen ohuita levyjä, joiden paksuus on 5-10 μτη ja 10 särmien pituus 200 - 300 jam.

Taulukko 3. Esimerkit 42 - 47

Esimerkki Ksylanaasin Alginaatin Hydrolyysiaste 50 mM Tulos

No loppupitoisuus pitoisuus mg entsyymiä/ fosfaatti mg/ml %

g alginaattia pH

_ __ . __ _ kjteytyi _ _ 2 ” ” ' kiteytyi "44 ” ~~ "~5 ” ” kiteytyi • # · » · · » | » f

Valokuva • » * ♦ » 10 • · "! 45 ” 2 2,4 ” kiteytyi 46 ” 5 ” ” kiteytyi • · ~47 ” 5 4/7 ” kiteytyi > • * · • ·

I I

‘ * » I · • ·

♦ I

» · * » » » 24

Esimerkit 48 - 65 1 1 6625

Glukoosi-isomeraasin kiteytys pektiinin hydrolysaateilla

Valmistettiin 2 % (w/w) liuos pektiinistä veteen. Tätä liuosta hydrolysoitiin 40 asteen lämpötilassa pektinaasientsyymillä (Genencor International, Multifect PL) 5 eriasteisesti suhteuttamalla entsyymimäärä pektiinin kuiva-aineeseen. Valmistettiin kaksi eriasteisesti hydrolysoitua erää, joista toinen hydrolysoitiin vain osittain ja toinen lähes loppuun asti. Entsyymi määrät olivat 0,01 mg ja 0,1 mg per gramma pektiiniä. Hydrolyysi pysäytettiin keittämällä vesihauteessa 20 minuutin ajan. Pektiiniliuos suodatettiin kirkkaaksi, jäädytettiin ja kylmäkuivatuin.

10 Näin hydrolysoituja pektiinejä käytettiin eri pitoisuuksissa kiteyttämään glukoosi-isomeraasia. Vastaavissa olosuhteissa ilman pektiinin hydrolysaatteja glukoosi-isomeraasi ei kiteydy. Kiteytysesimerkit tehtiin mikrodiffuusiokokeina 6 asteen lämpötilassa. Kokeissa valmistetut kiteet olivat hyvälaatuisia prismoja, joiden särmien tyypillinen pituus oli 100 - 200 mikrometriä. Kiteiden muoto ilmenee 15 havainnollisesti valokuvasta 11.

• · • · t * » * » t • » • · ( I · • · « t · » »

Taulukko 4. Esimerkit 48 - 65 25 116625

Esimerkki Glukoosi- Pektiinin Hydrolyysiaste 50 mM Tulos

No isomeraasin , . . pitoisuus mg entsyymiä/ fosfaatti loppupitoisuus r o jj

% g pektiiniä pH

48 49 mg/ml 1 0,01 6,4 kiteytyi 49 ” 3 0,01 6,4 kiteytyi 50 ” 3 0,01 6,8 kiteytyi ~51 ” 3 (kÖI V2 kiteytyi 52 ” 3 0,1 6,4 kiteytyi 53 ” 3 0,1 6,8 kiteytyi "54 ” 3 0Ö V2 kiteytyi 55 ” 5 0,01 6,4 kiteytyi 56 ” 5 0,01 6,8 kiteytyi valokuva 11 ~57 ” 5 ÖÖ1 VI kiteytyi 58 ” 5 0,1 6,8 kiteytyi __ _ _ — — kiteytyi , 60 ” 9 0,01 6,4 kiteytyi \ ~61 ;; 9 ÖÖI 6^8 kiteytyi • * _____________ , 62 ” 9 0,01 7,2 kiteytyi ? * , ‘ ·. 63 ” 9 0,1 6,4 kiteytyi ·;. 64 ” 9 0,1 6,8 kiteytyi * * t » 65 ” 9 0,1 7,2 kiteytyi ( t · t » t • » i

• I

< ‘ *

« I

Esimerkit 66 - 79 Ihmisen insuliinin kiteytys pektiinin hydrolysaateissa 1 1 6625 26

Kiteytysesimerkit tehtiin mikrodiffuusiokokeina huoneenlämmössä samalla suoritustekniikalla kuin esimerkit 12 — 38. Monissa kokeissa kiteet syntyivät jo noin tunnin kuluttua pipetoinnista eli ennen tasapainotilaa, joten olosuhteet 5 muistuttivat kiteytyshetkellä enemmän panoskoetta kuin mikrodiffuusiokoetta. Kiteet olivat joko pieniä neuloja ja neulakimppuja tai prismoja. Valokuvan 12 esittämien kideneulojen tyypilliset mitat ovat: paksuus 1-2 μτη ja pituus 20 - 30 μτη.

Taulukko 5. Esimerkit 66 - 79

Esimerkki Insuliinin Pektiinin Hydrolyysiaste 50 mM Tulos loppupitoisuus pitoisuus mg entsyymiä/ fosfaatti mg/ml

No % g pektiiniä pH

66 4 3 0,01 5,0 kiteytyi 67 ” 3 ÖÖ1 7/7 ” ~68 ” 3 (U 5/3 ” ”69 ” ” 3 ÖJ 7/7 ” ~7Ö 5 ÖÖI 5/3 ” Ύΐ ” 5 öiöl 6/5 ” ~72 ” 5 ÖJ 5,0 ” ’ · ’ · valokuva 12 "73 ” 5 ÖJ 6^6 ” ..:r "74 2 ~~9 ÖÖI ” ' *75 ~ 9 ÖÖI 6^6 ” ”76 ” 9 OÖl 7/7 ” • » · ~r\ “ 9 öä 5^0 ” ... _ - _ — 6^ ” ;. .* "79 ” 9 öj 7/7 ” 10

Esimerkit 80 - 84 1 1 6625 27

Insuliinin kiteyttäminen dekstriinillä, pektiinillä sekä natriumalginaatin ja pektiinin seoksella

Seuraavissa esimerkeissä käytettiin kiteytettävänä proteiinina ihmisen insuliinia. 5 Liuos sisälsi 4 mg/ml insuliinia, 2,5 mM HC1 ja 0,75 mM ZnCb- Kiteytysesimerkit tehtiin mikrodiffuusiokokeina huoneenlämmössä. Maissitärkkelyksestä valmistettu dekstriini oli Flukan tuote no 31412. Natriumalginaatti ja pektiini olivat samoja kuin esimerkeissä 1 ja 39 - 41. Insuliini kiteytyi dekstriinillä levymäisinä kiteinä kun taas pektiinipitoiset liuokset kiteyttivät insuliinin neulamaisessa kidemuodossa.

10

Taulukko 6. Esimerkit 80 - 84

Esimerkki Insuliinin Kiteyttävä 40 mM Tulos

No loppupitoisuus polymeeri ja fosfaatti

pitoisuus % PH

mg/ml 80 4,0 10 % Dekstriini 15 5,0 kiteytyi levyinä 81 ” 20 % Dekstriini 15 5,0 kiteytyi levyinä t 82 ” 30 % Dekstriini 15 5,0 kiteytyi levyinä • · · 83 ” 2 % Pektiini 5,0 kiteytyi neuloina > » 84 ” 0,5 % Natrium 5,0 kiteytyi neuloina alginaatti ja 1 % Pektiini • 1 · • » • · # 1 1 · » > • ♦ Λ 15 * » · 116625

Esimerkit 85 - 88.

28

Kidepitoisten geelien viskositeetti

Hyvin hyödyllinen ominaisuus on se, että muodostunut polymeerin ja kiteiden seos on viskositeettityypiltään tiksotrooppinen. Tämä tarkoittaa sitä, että liuoksen 5 viskositeetti alenee kun leikkausnopeus kasvaa. Tästä seuraa, että kun seosta varastoidaan liikkumattomassa astiassa, se muuttuu hyvin nopeasti kiinteäksi geeliksi, jossa kiteet eivät laskeudu. Kun seosta annostellaan ja pumpataan, niin jo suhteellisen vähäisellä voimalla se muuttuu nestemäiseksi ja helposti käsiteltäväksi. Nämä ominaisuudet ilmenevät kuviosta 1, jossa esimerkkien 85 ja 86 mukaisia 10 seoksia on pumpattu erilaisilla paineilla kapillaariputken läpi. Kuviosta ilmenee, että painetta nostettaessa näytteen virtausnopeus kapillaarin läpi kasvaa jyrkkenevästi. Vertailuaineena käytetyn glyserolin virtausnopeus kasvaa lineaarisesti paineen kasvaessa, mikä merkitsee sitä että glyserolin viskositeetti pysyy vakiona tässä esimerkissä käytetyissä olosuhteissa.

15 Glyserolin viskositeetti käsikirjan (CRC Handbook of Chemistry and Physics, 1994 CRC Press. Inc.) mukaan on huoneenlämmössä 934 mPa s. Vertailuaineen viskositeetin perusteella laskettiin kidesuspensioiden viskositeetti eri virtausnopeuksilla ja tulosten perusteella piirrettiin kuvio 2. Tästä kuviosta ilmenee havainnollisesti se, että esimerkkisuspensioiden viskositeetti alenee hyvin jyrkästi ': 20 silloin kun virtausnopeus kasvaa.

Esimerkit 87 ja 88 valmistettiin siten, että savutettiin mahdollisimman korkea ··;’ proteiini kiteiden pitoisuus ja samalla kuitenkin seos joka on pumpattavissa ohuen kapillaariputken, esimerkiksi injektioneulan läpi. Proteiinikiteiden pitoisuuden • t ylärajan määrää oleellisesti kiteiden nestepitoisuus. Kirjallisuuden perusteella . 25 tiedetään että eri proteiinien ja peptidien kiteet sisältävät merkittävästi erilaisia määriä emäliuosta, tavallisesti vettä ja veteen liuotettuja puskurisuoloja. Yksi » · * _ gramma endoglukanaasin kiinteää kidemassaa voi sisältää proteiinia korkeintaan 358 * · ... mg. Näin ollen tämän proteiinin väkevimmät pumpattavissa tai injektoitavissa olevat » » ’! ‘ liuokset ovat pakostakin tätä laimeampia. Esimerkeissä 87 ja 88 valmistettiin näytteet **·* 30 joissa oli 255 mg ja 272 mg endoglukanaasia millilitrassa kideseosta. Yllättävästi 1 1 6625 29 voitiin havaita, että näiden suspensioiden virtausnopeudet pienillä paineilla olivat samaa suuruusluokkaa kuin esimerkeissä 85 ja 86, joissa endoglukanaasia oli vain 17,5 mg millilitrassa. Nämä suspensiot olivat siten hyvin helposti injektoitavia. Suspensiot muuttuivat kuitenkin kiinteiksi geeleiksi tunnin kuluessa siitä kun niiden 5 sekoittaminen lopetettiin. Geelit voi muuttaa jälleen juokseviksi sekoittamalla hyvin vähäisellä voimalla.

Esimerkit 87 ja 88 osoittavat, että silloin kun proteiinikiteiden pitoisuutta nostetaan, niin geeliaineen tarve koko seokselle laskettuna vähenee. Tämä on ymmärrettävissä siten, että polymeeriä voi olla ainoastaan kiteiden välisessä nestetilassa, joka vähenee 10 silloin kun kiteiden osuus kasvaa.

Esimerkki 85 Tässä esimerkissä kuvaillaan kiteisestä endoglukanaasista (endo-1,4-p-glukanaasi, eli 1,4-(1,3; l,4)-8-D-Glucan 4-glucanohydrolase, EC 3.2.1.4, tuotettu Melanocarpus 15 albomyces fermentaatiolla) ja alginaatista valmistettu geeli joka voidaan ajaa vähäisellä paineella hyvin ohuesta kapillaariputkesta läpi (Kuvio 1).

Geeli valmistettiin sekoittamalla keskenään kolme liuosta seuraavasti: 1) 1 ml 3 % natriumalginaattia, samoin kuin esimerkissä 1 2) 2 ml endoglukanaasin (35 mg/ml) kidesuspensiota 5 mM Na-asetaattipuskurissa 20 pH 4,1 • » ’...' Liuokset 1) ja 2) sekoitettiin keskenään tasaiseksi kidesuspensioksi ;:· 3) 1 ml 14 mM CaCh lisättiin vähitellen ja samalla voimakkaasti sekoittaen edelliseen seokseen.

* * * * · • · Näin valmistettu kidesuspensio on geelimäinen ja hyvin pysyvä. Kiteet eivät 25 laskeutuneet säilytysastian pohjalle 2 viikon tarkasteluajan kuluessa. Geelimäisyydestä huolimatta suspensiota voidaan helposti sekoittaa ja pumpata * * · » · 1 1 6625 30 kapillaariputken läpi. Geeli muuttuu hyvin juoksevaksi vähäisellä sekoitusvoimalla. Suspensiota pumpattiin sisähalkaisijaltaan 0.48 mm ja pituudeltaan 42 mm pitkän teräsputken läpi. Käytettäessä 200 millibaarin painetta saavutettiin virtausnopeus 734 μΐ/min, mikä lineaariseksi virtaukseksi muutettuna on 400 cm/min.

5 Esimerkin mukainen kiteistä entsyymiä sisältävä seos pysyy tasaisena suspensiona geelimäisyydestä johtuen, mutta on kuitenkin hyvin tehokkaasti ja helposti pumpattavissa ohuenkin putken läpi.

Esimerkki 86 10 Tämä esimerkki on suoritustavaltaan samanlainen kuin edellinen esimerkki 85. Tässä muutettiin vain CaCL pitoisuutta korkeammaksi:

Geeli valmistettiin sekoittamalla keskenään kolme liuosta seuraavasti: 1) 1 ml 3 % natriumalginaattia 2) 2 ml endoglukanaasin (35 mg/ml) kidesuspensiota 5 mM Na-asetaattipuskurissa 15 pH 4,1 : , Liuokset 1) ja 2) sekoitettiin keskenään tasaiseksi kidesuspensioksi t>ii; 3) 1 ml 16 mM CaCL lisättiin vähitellen ja samalla voimakkaasti sekoittaen ,··, edelliseen seokseen.

·;;; Näin valmistettu kidesuspensio on geelimäinen ja hyvin pysyvä samoin kuin 20 edellisen esimerkin suspensio. Tällä seoksella oli kuitenkin korkeampi viskositeetti . kuin esimerkissä 85, mikä ilmenee kapillaariputkikokeesta. Suspensiota pumpattiin sisähalkaisijaltaan 0.48 mm ja pituudeltaan 42 mm pitkän teräsputken läpi.

» I

'*’t Käytettäessä 200 millibaarin painetta saavutettiin virtausnopeus 531/il/min, mikä ’fj* lineaariseksi virtaukseksi muutettuna on 290 cm/min (kuvioi).

• I

* » : Y: 25 » ψ *

Esimerkki 87 1 1 6625 31 Väkevä kidesuspensio alginaattigeelissä.

Alginaattigeeli valmistettiin sekoittamalla 10 ml 1,5 % natriumalginaattia ja 10 ml 7 mM CaCb- Endoglukanaasin kiteitä 5 mM Na-asetaattipuskurissa pH 4,1 5 suodatettiin vakuumisuotimella siten että kaikki vapaa puskuriliuos poistui ja muodostui kiinteä kidemassa. Kidemassan proteiinipitoisuus oli kuiva-ainemäärityksen perusteella 358,2 mg /1000 mg.

Sekoitettiin huolellisesti keskenään 2,042 g endoglukanaasin kidemassaa ja 0,418 g alginaattigeeliä. Näin valmistettiin tasainen maitomainen kidesuspensio joka on 10 geelimäinen ja hyvin pysyvä. Seoksen endoglukanaasin pitoisuudeksi määritettiin 272 mg/ml. Alginaatin pitoisuus seoksessa oli 0,14 %. Suspensiota pumpattiin sisähalkaisijaltaan 0.48 mm ja pituudeltaan 42 mm pitkän teräsputken läpi. Käytettäessä 198 millibaarin painetta saavutettiin virtausnopeus 312 μΐ/min.

15 Esimerkki 88 Väkevä kidesuspensio alginaattigeelissä.

Sekoitettiin huolellisesti keskenään 2,067 g endoglukanaasin kidemassaa ja 0,592 g alginaattigeeliä. kuten esimerkissä 87. Näin valmistettiin tasainen maitomainen [ ’ kidesuspensio joka on geelimäinen ja hyvin pysyvä. Seoksen endoglukanaasin 20 pitoisuudeksi määritettiin 255 mg/ml. Alginaatin pitoisuus seoksessa oli 0,18 %.

• « · ·;;; Suspensiota pumpattiin sisähalkaisijaltaan 0.48 mm ja pituudeltaan 42 mm pitkän • · "' teräsputken läpi. Käytettäessä 208 millibaarin painetta saavutettiin virtausnopeus 471 μΐ/min.

25

< > I

1 1 6625 32

Kirjallisuusluettelo 1. Abel J (1926). Crystalline insulin. Proc. Natl. Acad. Sei. (Wash) 12, 132.

5 2. Bergfors, Terese M. (1999). In Protein Crystallization, (ed. Terese M. Bergfors), pp. 41-61. International university Line, La Jolla California.

3. Bodmeier R, Chen H, Paeratakul O. A novel approach to the oral delivery of micro- or nanoparticles. Pharmaceutical Research 1989; 6(5); 413-417. Abstract.

10 4. Bodmeier R, Paeratakul O. Spherical agglomerates of water-insoluble drugs. J Pharm Sci. 1989 Nov;78(l 1):964-7. Abstract.

5. Borchard G, Junginger HE. Modem drug delivery applications of chitosan.

15 Advanced Drug Delivery Reviews 2001; 52: 103.

• · .:. 6. Chenite A, Chaput C, Wang D, Combes C, Buschmann MD, Hoemann CD,

Leroux JC, Atkinson BL, Binette F, Selmani A. Novel injectable neutral solutions of chitosan form biodegradable gels in situ. Biomaterials 2000 Nov; > ··· 20 21(21):2155-2161.

• I

7. Desbrieres J. Viscosity of semiflexible chitosan solutions: influence of concentration, temperature, and role of intermolecular interactions.

: ’ ·. i Biomacromolecules. 2002 Mar-Apr;3(2):342-9.

1 1 6625 33 8. Domish M, Kaplan D, Skaugrud O. Standards and guidelines for biopolymers in tissue-engineered medical products: ASTM alginate and chitosan standard guides. American Society for Testing and Materials. Ann N Y Acad Sci. 2001 5 Nov;944:388-97.

9. Ducruix, A. and Giege, R. pp. 127 - 143. (1992). Crystallization of Nucleic Acids and Proteins Oxford University Press 10 10. el Fattah EA, Grant DJ, Gabr KE, Meshali MM. Physical characteristics and release behavior of salbutamol sulfate beads prepared with different ionic polysaccharides. Drug Dev Ind Pharm. 1998 Jun;24(6):541-7. Abstract.

11. Femandez-Urrusuno R, Calvo P, Remunan-Lopez C, Vila-Jato JL, Alonso MJ.

15 Enhancement of nasal absorption of insulin using chitosan nanoparticles. Pharm Res. 1999 Oct; 16( 10): 1576-81. Abstract.

*; ' i 12. Gerentes P, Vachoud L, Doury J, Domard A. Study of a chitin-based gel as :,,: injectable material in periodontal surgery. Biomaterials 2002; 23: 1295-1302.

Ä". 20 . 13. Hirano S. Chitin biotechnology applications. Biotechnol Annu Rev 1996; 2:237- ,··', 58. Abstract.

I % Λ 14. Hoffman AS. Hydrogels for biomedical applications. Advanced Drug Delivery ·. ; 25 Reviews 2002; 43:3-12.

15. Huard LS, Qin J, Sun T, Bevemitz KJ, Dutkiewicz J, Wallajapet PRR.

Antimicrobial structures. 2001. Patent US6197322.

1 1 6625 34 5 16. Janes KA, Calvo P, Alonso MJ. Polysaccharide colloidal particles as delivery systems for macromolecules. Advanced Drug Delivery Reviews 2001; 47: 83-97.

17. Jumaa M, Furkert FH, Muller BW. A new lipid emulsion formulation with high antimicrobial efficacy using chitosan. Eur J Pharm Biopharm 2002 Jan; 10 53(1):115-23. Abstract.

18. Kim HJ, Lee HC, Oh JS, Shin BA, Oh CS, Park RD, Yang KS, Cho CS. Polyelectroylte complex composed of chitosan and sodium alginate for wound dressing application. J Biomater Sci Polym Ed. 1999; 10(5):543-56. Abstract.

15 ; 19. Kim TH, Park YH, Kim KJ, Cho CS. Release of albumin from chitosan-coated ,...: pectin beads in vitro. International Journal of Pharmaceutics 2003; 250: 371-383.

* · 20. Kofuji K, Ito T, Murata Y, Kawashima S. Biodegradation and drug release of 20 chitosan gel beads in subcutaneous air pouches of mice. Biol Pharm Bull 2001 24(2):205-208.

" 21. Li J, Xu Z. Physical characterization of a chitosan-based hydrogel delivery ;'system. J Pharm Sci. 2002 Jul; 91(7):1669-77. Abstract.

22. van der Lubben IM, Verhoef JC, Borchard G, Junginger HE. Chitosan for mucosal vaccination. Advanced Drug Delivery Reviews 2001; 52: 139-144.

1 1 6625 35 5 23. Margolin AL, Rakestraw SL, Khalaf NK, Shenoy BC, St Clair NL. Stabilized protein crystals, formulations comprising them and methods of making them. 2003. Patent US2003175239.

24. McPherson A.(1989). Preparation and Analysis of Protein Crystals. Robert E. 10 Kriegler Publishing Company, Malabar, Florida.

25. Mierisch CM, Jordan LC, Balian G, Diduch DR. The use of calcium alginate in the treatment of articular cartilage defects. 47th Annual Meeting, Orthopaedic Research Society, February 25 - 28, 2001, San Francisco California. Poster.

15 26. Miyazaki S, Kubo W, Attwood D. Oral sustained delivery of theophylline using . in-situ gelation of sodium alginate. Journal of Controlled Release 2000; 67: 275- 280.

« · 20 27. Robert, M. C. ja Lefauchcheux, F. (1988). J. Cryst. Growth, 90, 358 - 367.

* · * ,,, 28. Robert, M. C., Provost, K. ja Lefauchcheux, F. (1992). Crystallization in Gels and Related Methods. Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, edited by A.

‘ ·' · * Ducruix and R. Giege, pp. 127 - 143. Oxford University Press.

29. Sakurada T. Composite raw material comprising chitosan and protein material.

1995. Patent JP7258972. Abstract.

36 116625 5 30. Schlichtkrull J (1956). Insulin crystals. II. Shape of rhombohedral zinc-insulin crystals in relation to species and crystallization media. Acta Chem. Scand.10, 1459.

31. Schlichtkrull J (1960). Insulin crystal suspensions having a protracted effect. Patent no. GB835638.

10 32. Schmidt RJ. Therapeutic compositions comprising modified polysaccharides. 2003. Patent W003080135 (GB2386900), abstract.

33. Scott DA (1934). CCXI. Crystalline insulin. Biochem. J. 28, 1592.

15 • t * , 34. Serp D, Cantana E, Heinzen C, von Stockar U, Marison IW. Characterization of ,,, an encapsulation device for the production of monodisperse alginate beads for • · "! cell immobilization. Biotechnology and bioengineering 2000 Oct 5; 70(1): 41-53.

( i J' 20 35. Singla AK, Chawla M. Chitosan: some pharmaceutical and biological aspects -

• I I

an update. Journal of Pharmacy and Pharmacology 2001; 53: 1047-1067.

> > x » · » I * » * 1 1 6625 37 36. Säkkinen M, Marvola M. A peroral pharmaceutical formulation for controlled release of a drug. 2001. Patent WO0176562.

37. Takeuchi H, Yamamoto H, Kawashima Y. Mucoadhesive nanoparticulate 5 systems for peptide drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews 2001; 47: 39-54.

38. Takeuchi H, Yasuji T, Yamamoto H, Kawashima Y. Spray-dried lactose composite particles containing an ion complex of alginate-chitosan for designing 10 a dry-coated tablet having a time-controlled releasing function. Pharmaceutical Research 2000; 17(1): 94-99. Abstract.

39. Takka S and Acarturk F. Calcium alginate microparticles for oral administration: I: effect of sodium alginate type on drug release and drug entrapment efficiency.

15 J Microencapsulation 1999; 16(3):275-90.

* « • 40. Thanou M, Verhoef J., Junginger H. Oral drug absorption enhancement by ' : chitosan and its derivatives. Advanced Drug Delivery Reviews 2001; 52: 117- 126.

o - 41.Tiourina O. and Sukhorukov G. Multilayer alginate/protamine microsized capsules: encapsulation of a-chymotrypsin and controlled release study.

• 1

International Journal of Pharmaceutics 2002; 242: 155-161.

1 1 6625 38 42. Tonnesen H., Karisen J. Alginate in drug delivery systems. Drug Dev Ind Pharm 2002 Jul; 28(6): 621-30. Abstract.

43. Ueno H, Mori T, Fujinaga T. Topical formulations and wound healing 5 applications of chitosan. Advanced Drug Delivery Reviews 2001; 52: 105-115.

44. Visuri, K.(1987) United States Patent No. 4,699,882 Stable glucose isomerase concentrate and a process for the preparation of thereof 10 45. Visuri, K. (1992) United States Patent No. 5,120,650 Method for producing crystalline glucose isomerase 46. Vuolanto, A.; Uotila, S.; Leisola, M.; Visuri, K. (2003) Solubility and crystallization of xylose isomerase from Streptomyces rubiginosus, J.

15 Cryst. Growth 257:403-411.

» 1 47. Xue C, Yu G, Hirata T, Terao J, Lin H. Antioxidative activities of several marine polysaccharides evaluated in a phosphatidylcholine-liposomal suspension and

< I I

•; ” organic solvents. Biosci Biotechnol Biochem. 1998 Feb;62(2):206-9. Abstract.

20 : ” ’; 48. Törrönen, A., Harkki, A. and Rouvinen, J. (1994) Three-dimensional structure of ,,,,: endo-l,4-B-xylanase II from Trichoderma reesei : two conformational states in the active site. The EMBO Journal Vol. 13, no. 11, pp.2493-2501

Claims (12)

116625

1. Menetelmä proteiinien ja peptidien kiteyttämiseksi tai laskeutumattoman kidesuspension valmistamiseksi tunnettu siitä, että valmistetaan (a) 5 proteiiniliuos tai peptidiliuos tai kidesuspensio, jossa liuotin on vesi ja (b) polymeeriliuos, jossa on veteen liuotettuna alginaattia tai dekstriiniä tai kitosaania tai pektiiniä tai jonkin edellä mainitun polymeerin hydrolysaattia tai joidenkin edellä mainittujen polymeerien seosta ja että valmistetut liuokset (a) ja (b) sekoitetaan keskenään ja että yhdistämisen jälkeen polymeerien tai niiden 10 hydrolysaattien vaikutuksesta liukoinen proteiini tai peptidi kiteytyy pysyvästi ja valmiit kiteet suspendoituvat muodostaen laskeutumattoman tai hyvin hitaasti laskeutuvan suspension, joka voidaan syöttää kohtuullisella paineella ohuen kapillaarin läpi. 15

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiteyttävän polymeerin vesiliuos sisältää alginaattia tai sen geeliä 5 % tai vähemmän.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiteyttävän ·. · 20 polymeerin vesiliuos sisältää dekstriiniä 30 % tai vähemmän. * « ·

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiteyttävän polymeerin vesiliuos sisältää kitosaania tai sen geeliä 1 % tai vähemmän.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiteyttävän , , polymeerin vesiliuos sisältää pektiiniä tai sen geeliä 9 % tai vähemmän.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiteyttävä liuos ’; ’ ’ on kahden tai useamman polymeerin seos, jossa on veteen liuotettuna jonkin * ·; · ’ 30 edellä olevan patenttivaatimuksen 2-5 mukainen määrä kutakin polymeeriä. 1 ’ 7. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiteyttävä polymeeri on hydrolysoitu. 116625

8. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liuosten (a) ja (b) sekoittamisen jälkeen polymeerin loppupitoisuus on edullisesti alle 10%.

9. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 40 että kiteytyminen tapahtuu joko sekoituksen alaisena tai sekoittamatta 1-3 vuorokauden kuluessa.

10. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sillä voidaan valmistaa kiteitä, joiden koko on 1- 300 mikrometriä. 45

11. Patenttivaatimuksien 1-10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiteytymisen aikana jatkuvasti sekoittamalla voidaan valmistaa hyvin pieniä kiteitä, joiden koko on välillä 1-10 mikrometriä.

12. Patenttivaatimuksien 1-11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että näin kiteytetty proteiini tai peptidi saa leijua vapaasti tasa-aineisena suspensiona, joka on syötettävissä kohtuullisella paineella ohuen kapillaarin läpi. » · • » » 1 · > · * I » r » · 116625 LI1