CN112121178B - 一种水溶性玉米醇溶蛋白-egcg共价复合物及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种水溶性玉米醇溶蛋白‑EGCG共价复合物及其制备和应用，属于食品科学和食品添加剂技术领域。本发明利用EGCG作为共价交联物，与玉米醇溶蛋白在水环境下构建玉米醇溶蛋白‑EGCG共价复合物，无需引入有机试剂，复合方式绿色环保安全。所得玉米醇溶蛋白‑EGCG共价复合物与单纯的玉米醇溶蛋白相比，具有更好的耐热稳定性和更强的抗氧化性。同时，还可以进一步与酪蛋白酸钠复合形成更稳定、抗氧化效果优异的复合物纳米颗粒，具有非常好的应用前景。

Description

一种水溶性玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物及其制备和应用
技术领域
本发明属于食品科学和食品添加剂技术领域，具体涉及一种水溶性玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物及其制备和应用。
背景技术
玉米醇溶蛋白是植物蛋白质中的代表蛋白质，是一种天然的蛋白质，由不同分子量和不同溶解度的肽混合组成，玉米醇溶蛋白中含有高比例的非极性氨基酸，因此玉米醇溶蛋白具有很强的疏水性，它可溶于60-95％的醇水溶液、高浓度的尿素溶液、高浓度的碱性水溶液(pH＞11)。
溶剂的pH从碱性向中性变化的过程中，玉米醇溶蛋白的溶解度会随着pH值的降低而逐渐降低，在这个过程中蛋白质构象会发生改变，使分子出现聚集的现象，此过程称为玉米醇溶蛋白的自组装。玉米醇溶蛋白分子的结构会发生改变，由以α-螺旋结构为主变为主要为β-折叠的结构，在疏水作用下，β-折叠结构会向相反的方向变化，形成首尾相连的卷曲的条带，最终形成Zein纳米颗粒。正是由于这一特性，玉米醇溶蛋白颗粒成为了一种适用于包埋和递送活性物质及药物的优良载体。
植物多酚是广泛存在于植物体内的天然化合物，也是目前研究最受关注的天然抗氧化剂，在食品、材料、医药、农业和化工等领域得到了很好的应用。由于植物多酚广泛存在于水果、蔬菜、饮料等食品中，且适量的多酚对于人体健康是有益且甚至是必需的，因而植物多酚常被称为第七营养素。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是绿茶茶多酚的主要成分，占茶多酚制品的40％～50％。它是2-连苯酚基苯并吡喃与没食子酸形成的酯，具有酚类抗氧化剂的通用性，同时因其结构中有6个邻位酚羟基，因而EGCG的抗氧化性等其他性质优于其他儿茶素。
对于玉米醇溶蛋白和多酚的非共价作用已经研究的比较透彻，但是关于两者的共价相互作用还研究较少，而且大多数的研究都是探究玉米醇溶蛋白在乙醇溶液中与多酚的反应，现在还没有关于碱性水溶液中玉米醇溶蛋白与多酚的共价相互作用研究。
玉米醇溶蛋白纳米颗粒的制备方法有很多，通常使用反溶剂沉淀法制备，但由于其制备过程中要添加乙醇，乙醇具有易燃性，虽然在纳米粒加工后会将乙醇除去，但仍然具有食品不安全，并且增加了成本。
现有研究表明，和单纯的蛋白质相比，蛋白质和多酚复合物具有更好的热稳定性和抗氧化性，且蛋白质和多酚结合后形成的颗粒具有更强的稳定性。因此，在水溶液中制备玉米醇溶蛋白-EGCG的共价化合物是改善玉米醇溶蛋白的性质，提升zein颗粒稳定性和扩大zein颗粒的应用领域的一种选择。
发明内容
本发明的目的是提供一种在水溶液中制备玉米醇溶蛋白-EGCG共价化合物的方法，采用碱性诱导处理法共价交联和pH调节法制备纳米颗粒。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了在水溶液中玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物的制备方法，分为以下步骤：
(1)将玉米醇溶蛋白、EGCG分散在水中形成混合体系，然后调节pH至11.0-13.0进行缩合反应；
(2)反应结束后，利用透析袋分离，将透析后的溶液进行干燥，即得玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)混合体系中的玉米醇溶蛋白的浓度为5mg/ml～25mg/ml。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)混合体系中的EGCG的浓度为0.13mg/ml～2mg/ml。优选1-1.5mg/ml。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)混合体系中玉米醇溶蛋白与EGCG的质量比为15:1～25:1。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中pH优选11.0-12.0；进一步优选12.0。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)的缩合反应是在120rmp转速下进行的。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)所用的透析袋的规格为3500道尔顿，透析时间为48小时。
在本发明的一种实施方式中，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将玉米醇溶蛋白分散在水中，然后调节pH至11.0-12.0，混匀后形成玉米醇溶蛋白溶液；将EGCG溶解在水中，形成EGCG溶液；
(2)将玉米醇溶蛋白溶液与EGCG溶液混合形成混合体系，并调节pH维持在11.3-12.7下进行缩合反应；
(3)反应结束后，利用透析袋分离，将透析后的溶液进行干燥，即得玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物。
在本发明的一种实施方式中，所述制备方法具体包括如下步骤：
步骤1：称量取4.0g玉米醇溶蛋白粉末于100ml超纯水中，在磁力搅拌下，用5M的氢氧化钠调节溶液的pH到12.0，搅拌过夜，充分溶解待用；称取量0.2g EGCG于100ml的超纯水中，磁力搅拌，充分溶解待用；
步骤2：将得到的玉米醇溶蛋白溶液和EGCG溶液等体积混合，用5M的氢氧化钠将溶液的pH值调节至12.0，搅拌均匀待用；
步骤3：将步骤3得到的溶液在常温下敞口搅拌反应24h，使溶液和空气充分接触，同时在制备过程中维持反应体系的pH值为12.0，让EGCG和玉米醇溶蛋白充分反应，生成玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物；
步骤4：将步骤4得到的反应液置于透析袋内，放在磁力搅拌器上透析，以去除游离EGCG；
步骤5：将透析后的溶液进行真空冷冻干燥，得到玉米醇溶蛋白-EGCG共价化合物固体样品。
本发明利用上述方法制备得到了一种玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物。
本发明利用上述玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物提供了一种制备高性能复合物纳米颗粒的方法。
在本发明的一种实施方式中，所述制备高性能复合物纳米颗粒的方法包括如下步骤：
(1)：称取适量冻干的玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物溶于置于100ml去离子水中，用5M的氢氧化钠调溶液的pH值至12.0，磁力搅拌至完全溶解，获得玉米醇溶蛋白-EGCG共价化合物溶液；
(2)：称取适量酪蛋白酸钠于步骤(1)所得的玉米醇溶蛋白-EGCG共价化合物溶液中，用0.1M的氢氧化钠微调pH值至12.0，磁力搅拌至充分溶解，获得混合体系；
(3)：用葡萄糖酸内酯溶液将步骤(2)所得的混合体系的pH调节至7.0，混匀、干燥，即得玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物纳米颗粒。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中的玉米醇溶蛋白-EGCG共价化合物与酪蛋白酸钠的质量比为5:1，最终蛋白总浓度为8mg/ml。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)所用的葡萄糖酸内酯溶液的浓度为20％(w/v)。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中，混合体系的pH调节至7.0后，持续磁力搅拌30分钟，后置于4℃冰箱中静置过夜。
本发明涉及的玉米醇溶蛋白的纯度为99.8％。
本发明涉及的EGCG的纯度为90％。
本发明利用上述玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物提供了一种制备高性能复合物纳米颗粒在药物载体方面或者在构建药物输送系统中的应用。
本发明的优点为：
本发明玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物的制备方法简单，不需要使用有机试剂，所有的技术都在水溶液中进行，符合绿色环保安全的要求。
本发明采用EGCG作为共价交联物，具有大量酚羟基，交联效果好。本发明采用玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物制备纳米颗粒，提高了纳米颗粒的稳定性。与单纯的玉米醇溶蛋白相比，本发明所述的玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物具有更好的耐热性和更强的抗氧化性。
同时，玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物还可以进一步与酪蛋白酸钠复合形成更稳定、抗氧化效果优异的复合物纳米颗粒，具有非常好的应用前景。
附图说明
图1为玉米醇溶蛋白和玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物的DPPH·自由基清除能力。
图2为玉米醇溶蛋白和玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物TGA曲线。
图3为pH对玉米醇溶蛋白纳米颗粒和玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物纳米颗粒的粒径(A)和PDI(B)的影响。
图4为短时热处理(30min)对玉米醇溶蛋白纳米颗粒和玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物纳米颗粒的粒径(A)和PDI(B)的影响。
图5为NaCl浓度对玉米醇溶蛋白纳米颗粒和玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物纳米颗粒的粒径(A)和PDI(B)的影响。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变更或改进，均属于本发明的保护范围。
实施例1
称量取4.0g玉米醇溶蛋白粉末于100ml超纯水中，在磁力搅拌下，用5M的氢氧化钠调节溶液的pH到12.0，搅拌过夜，充分溶解待用。
称取量0.2g EGCG于100ml的超纯水中，磁力搅拌，充分溶解待用。
将步骤1和步骤2得到的澄清溶液等体积混合，用5M的氢氧化钠将溶液的pH值调节至12.0，搅拌均匀待用。
将步骤3得到的溶液在常温下敞口搅拌反应24h，使溶液和空气充分接触，同时在制备过程中维持反应体系的pH值为12.0，让EGCG和玉米醇溶蛋白充分反应，生成玉米醇溶蛋白-EGCG共价化合物。
步将步骤4得到的反应液置于透析袋内，放在磁力搅拌器上透析，以去除游离EGCG。
将透析后的溶液进行真空冷冻干燥，得到玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物固体样品。
量取2ml待测样品(含等量的EGCG 16μg/ml)于10ml的塑料离心管中，加入2ml浓度为2mmol/l的DPPH自由基溶液，旋涡振荡均匀，室温避光反应15分钟后，在517nm波长处测量其吸光值，用含有2ml去离子水作空白调零，每个样品重复3次，取其平均值。
DPPH自由基清除率(％)＝[1-(A1-A2)/A0]*100％
式中：A0是DPPH空白对照的吸光度，A1是样品反应液的吸光度，A2是不含DPPH自由基溶液的样品的吸光度。
从图1可知，玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物的DPPH·自由基清除能力显著高于玉米醇溶蛋白。
称取3mg～5mg的样品于坩埚中进行热重分析(TGA)，测定结果如图2所示。
从图2可知，玉米醇溶蛋白-EGCG共价化合物在高温时的质量损失显著小于玉米醇溶蛋白，表明玉米醇溶蛋白与EGCG共价反应生成复合物后有更好的热稳定性。
对实施例1所得的玉米醇溶蛋白与EGCG共价复合物进行性能测定，结果如下表所示：
表1实施例1所得玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物的结果
样品 DPPH·自由基清除能力 热稳定性(剩余质量)
玉米醇溶蛋白 16.6％±0.2％ 13.1％
玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物 36.8％±0.4％ 24.9％
实施例2
分别取实施例1中的玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物和玉米醇溶蛋白各665mg于100ml的超纯水中，用5M的氢氧化钠溶液将其pH调至12.0，磁力搅拌至完全溶解。
分别称量取135mg的酪蛋白酸钠于上述充分溶解的玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物溶液和玉米醇溶蛋白溶液中，用0.1M的氢氧化钠微调pH值至12.0，磁力搅拌至充分溶解。
用20％(w/v)葡萄糖酸内酯溶液将上述所得溶液的pH调节至7.0，在转速300rmp下，持续磁力搅拌30分钟，后置于4℃冰箱中静置过夜，冷冻干燥，得到玉米醇溶蛋白纳米颗粒和玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物纳米颗粒。
取所制备的玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物纳米颗粒和玉米醇溶蛋白纳米颗粒，分别用超纯水稀释样品溶液，配成浓度为1mg/ml的玉米醇溶蛋白纳米颗粒溶液和玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物纳米颗粒溶液。
pH稳定性测定：用0.1M的氢氧化钠溶液和0.1M的盐酸溶液将纳米颗粒溶液的pH调节至5-9，并测量纳米颗粒溶液的粒径大小和粒径分布(PDI)，测定结果如图3所示。
从图3可知，zein-EGCG纳米颗粒的粒径小于zein纳米颗粒，且zein-EGCG纳米颗粒的PDI较小，表明zein-EGCG纳米颗粒的粒径具有更好的pH稳定性。
热稳定性测定：用0.1M的盐酸溶液将纳米颗粒溶液的pH调节至7，将溶液加热至60℃-100℃，持续加热30min。冷却至室温后测量纳米颗粒溶液的粒径大小和粒径分布(PDI)，测定结果如图4所示。
从图4可知，除了在80℃时，zein-EGCG纳米颗粒的粒径略大于zein纳米颗粒，另外3个温度下，zein-EGCG纳米颗粒的粒径都小于zein纳米颗粒，且zein-EGCG纳米颗粒的PDI较小，表明zein-EGCG纳米颗粒具有更好的热稳定性。
盐稳定性测定：称取一定量的NaCl溶解于超纯水中，配制成浓度为0mM-100mM的NaCl溶液，用不同浓度的NaCl溶液稀释样品溶液，配制成浓度为1mg/ml的玉米醇溶蛋白纳米颗粒溶液和玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物纳米颗粒溶液，测量纳米颗粒溶液的粒径大小和粒径分布(PDI)，测定结果如图5所示。
从图5可知，随着NaCl浓度的增长，zein-EGCG纳米颗粒的粒径大小变化幅度较大，粒径小于zein纳米颗粒，且zein-EGCG纳米颗粒的PDI较小，表明EGCG会提高zein纳米颗粒的NaCl稳定性。
对实施例2所得复合物纳米颗粒的性能进行测定，结果如表2-表4所示：
表2实施例2所得复合物纳米颗粒的pH稳定性测定结果
Figure BDA0002749564870000061
表3实施例2所得复合物纳米颗粒的热稳定性测定结果
Figure BDA0002749564870000062
表4实施例2所得复合物纳米颗粒的盐稳定性测定结果
Figure BDA0002749564870000063
Figure BDA0002749564870000071
实施例3
探究EGCG溶液浓度对所得共价复合物性能的影响。
参照实施例1，将EGCG的浓度分别替换为表5中所示的不同浓度，其他条件不变，制得相应的共价复合物。具体的性能结果见下表。
表5不同浓度EGCG溶液所得共价复合物的性能结果
EGCG的浓度 DPPH·自由基清除能力 热稳定性(剩余质量)
0.1mg/ml 16.9％±0.2％ 13.4％
0.2mg/ml 17.6％±0.1％ 14.7％
0.3mg/ml 18.8％±0.3％ 18.1％
1.3mg/ml 37.2％±0.2％ 23.5％
1.5mg/ml 38.4％±0.1％ 22.9％
2mg/ml 39.4％±0.1％ 18.4％
2.5mg/ml 41.1％±0.3％ 15.3％
2.8mg/ml 41.8％±0.2％ 14.9％
由表5可知，EGCG溶液的浓度为0.1mg/ml、0.2mg/ml时，其DPPH·自由基清除能力较低，热稳定性较差。当EGCG溶液的浓度大于1.3mg/ml时，随着EGCG浓度的增大，DPPH·自由基清除能力变化不显著，且随着EGCG溶液的浓度的增加，热稳定性的减弱显著。
实施例4
称量取4.0g玉米醇溶蛋白粉末、0.2g EGCG于200ml超纯水中，在磁力搅拌下，用5M的氢氧化钠调节溶液的pH到12.0，搅拌过夜，充分溶解待用。
将得到的混合溶液在常温下敞口搅拌反应24h，使溶液和空气充分接触，同时在制备过程中维持反应体系的pH值为12.0，让EGCG和玉米醇溶蛋白充分反应，生成玉米醇溶蛋白-EGCG共价化合物。
将步骤4得到的反应液置于透析袋内，放在磁力搅拌器上透析，以去除游离EGCG。
将透析后的溶液进行真空冷冻干燥，得到玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物固体样品。
所得玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物固体样品的性能结果为：DPPH·自由基清除能力为37.2％±0.1％，热稳定性(剩余质量)为24.1％。

Claims (4)

1.一种制备复合物纳米颗粒的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将4.0g玉米醇溶蛋白、0.2g EGCG分散在200ml水中形成混合体系，然后调节pH至12.0在常温下敞口搅拌反应24h，使溶液和空气充分接触，同时在制备过程中维持反应体系的pH值为12.0；
(2)反应结束后，利用透析袋分离去除游离EGCG，将透析后的溶液进行干燥，即得玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物；
(3)将步骤(2)所得的玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物溶于水中，调节pH值至12.0，完全溶解后，获得玉米醇溶蛋白-EGCG共价化合物溶液；
(4)将酪蛋白酸钠加入到步骤(3)所得的玉米醇溶蛋白-EGCG共价化合物溶液中；调节pH值维持在12.0，充分溶解后，获得混合体系；
(5)将步骤(4)所得的混合体系的pH调节至7.0，在转速300rmp下，持续磁力搅拌30分钟，后置于4℃冰箱中静置过夜，冷冻干燥，即得玉米醇溶蛋白-EGCG共价复合物纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中用葡萄糖酸内酯溶液将步骤(4)所得的混合体系的pH调节至7.0。
3.权利要求1或者权利要求2所述的方法制备得到的复合物纳米颗粒。
4.权利要求3所述的复合物纳米颗粒在制备药物载体或者构建药物输送系统中的应用。
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