CN110393683B - 一种基于蛋白载体的茶多酚微纳米复合体的制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于蛋白载体的茶多酚微纳米复合体的制备方法及用途，采用经多重物理诱导改性的食品蛋白为载体在特定条件下封装载运茶叶多酚，并结合壳聚糖构建三元复合稳态体系，进一步提高茶叶多酚的应用稳定性及抗氧化、抑菌等活性功效，与现有相关技术相比，多酚负载量及抑菌活性大幅提高。本发明能够作为多酚类成分包封、保护和递送系统实现茶叶酚类乃至植物多酚成分功效的高效发挥和稳态化应用，跨界应用于食品工业、日化产品、医药保健、防腐保鲜等多个领域。

Description

一种基于蛋白载体的茶多酚微纳米复合体的制备方法及用途

技术领域

本发明属于微纳米载体技术控缓释应用于多酚类成分及其衍生物技术领域，具体涉及一种基于蛋白载体的茶多酚微纳米复合体的制备方法及用途。

背景技术

茶叶酚类（Tea polyphenol，TP）是一类含有多个酚羟基并具有多种生物学活性的植物次生代谢产物，因其突出的抗氧化、抗肿瘤、抗炎抑菌、降血糖等诸多活性功效而受到广泛研究和关注。近年来，随着化学添加剂健康安全风险及残留隐患逐步显现，为满足人们对高品质产品及美好生活的需求，越来越多的研究者将目光转向了来源天然、绿色安全的植物源添加剂。茶多酚作为植物源天然食品添加剂，以其优异的抗氧化能力、广谱杀菌性能和其高度安全性，并兼具一定营养价值和保健功效等特点，且来源充足，含量丰富，应用潜力巨大。

然而，TP稳定性差，体系相容性不佳、脂溶性差等问题严重制约了茶叶多酚的广泛应用。首先，在光照、温度、pH、金属离子等因素影响下TP易被氧化成邻醌类及联苯酚醌物质，使其在贮存、加工过程中极易发生降解。其次，茶叶多酚与产品基质的相容性不佳，通常难以将茶多酚直接应用于产品体系中。例如，TP可以非特异性地与产品基质中的脂质结合导致有效性和生物利用度的降低。基于此，有必要寻求这一问题的解决方案，以促进茶叶多酚的利用和产品价值的更好发挥。

微纳米载体技术（Micro-Nano Carrier Technology）被认为是提高活性成分应用稳定性的有效途径，能够克服传统改性产品特征无法精准控制，靶向性不足等问题，且避免了化学改性存在的安全风险及溶剂残留等弊端，具有绿色天然、安全性高、应用范围广等特点。

然而，传统基于微纳米载体封装多酚的技术存在有效成分负载率低的缺陷，导致其难以产业化应用。酪蛋白被认为是绿色安全的食品添加剂。本发明通过对富脯氨酸蛋白如酪蛋白等进行多重物理诱导改性，提高其包封载运活性成分的能力。通过涡旋孵育建立自组装模型，结合大分子拥挤环境下的两步自组装法，在疏水聚集及静电引力驱动下诱导改性酪蛋白结构开合以荷载TP，构建CS-TP-CTS微纳米运载体系，获得了高荷载TP的纳米粒子，克服产品易氧化劣变缺陷，丰富和扩大茶资源活性成分产品形式和应用领域，并具有原料绿色天然、技术简便、健康安全、成本可控的特点。与常规微纳米载体技术相比，多酚负载量进一步提高，能够作为多酚成分及其衍生物包封、保护和递送系统更好发挥作用，进一步广泛应用于食品加工、医药保健、日用化工等领域。

发明内容

针对现有研究中存在的问题，本发明设计的目的在于提供一种基于蛋白载体的茶多酚微纳米复合体制备方法及用途。

本发明通过以下技术方案加以实现：

所述的一种基于蛋白载体的茶多酚微纳米复合体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）茶叶酚类（TP）溶液体系制备：将茶叶多酚溶于超纯水或磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline ，PBS）中超声处理至澄清透明，搅拌，制得浓度为2-10 mg/mL的茶叶酚类溶液，4℃储存待用；

2）蛋白溶液体系制备：以蛋白为基本运载模型，通过超声空化同步热诱导，pH多极性震荡变换处理对蛋白进行改性和结构重组，制得改性后蛋白，将改性后蛋白溶于PBS缓冲液中，于超声条件下进行分散处理制得浓度为2～20mg/mL的蛋白溶液体系，调节pH至8.0，储存待用；

3）壳聚糖（CTS）溶液体系制备：按料液比0.01～1.5 g/50～100mL的比例，取壳聚糖溶于1%（v/v）乙酸水溶液，超声空化处理20min至澄清透明，搅拌，使其充分溶解至溶液透明，制得浓度1～30mg/mL壳聚糖溶液，调节pH至6.0，储存待用；

4）CS-TP-CTS微纳米聚集体制备：将步骤1）、步骤2）、步骤3）所得储备液在RCF4000×g下离心10～20min，以进一步除去杂质和不溶物；

将步骤1）制得的浓度为2～10 mg/mL的茶叶多酚储备溶液使用注射器按1滴/秒的速度逐滴加入或使用微量恒流泵以10ml/min的速度滴加于150～800r/min搅拌状态下的蛋白储备溶液中，并于1h内滴加完毕，滴加完毕后的混合溶液在30℃，600 r/min密封条件下涡旋孵育10h，以形成CS-TP溶液体系。涡旋过程中保证茶叶多酚储备液与CS蛋白储备液体积比为1:0.5～1:10之间，对应的TP与蛋白的质量比为1:100～10:1g/g；

涡旋完毕后，将步骤3）制得的壳聚糖储备溶液使用微量恒流泵滴加处于150～1000r/min搅拌状态下的CS-TP溶液体系，以120～1200rpm 连续搅拌2～24h，以确保形成微纳米复合物，其中，壳聚糖储备液与CS-TP溶液体系的体积比为1:1，制得CS-TP-CTS微纳米体系 ；

或者将步骤2）制得的浓度为2～10 mg/mL的蛋白储备溶液使用微量恒流泵以3滴每秒的速度滴加处于150～1000rpm搅拌状态下的CTS-TP涡旋体系，在30℃下以120～1200r/min连续搅拌4～24 h，以形成CS-TP-CTS微纳米聚集体；保证蛋白储备液与CS-TP溶液体系的体积比为1:2；

其中，CTS-TP体系制备方法如下，取0.01～1.5g壳聚糖（CTS）溶于50～100ml1%（v/v）乙酸水溶液中，800r/min搅拌1h使其充分溶解至溶液透明，超声空化处理(450W,10min)使溶液充分溶解，制得浓度1～30 mg/ml CTS溶液，再加入2～10mg/ml EGCG，800r/min搅拌1h使其充分溶解至溶液透明，超声空化处理即得；

5）反应底物及非目标物的脱除：采用透析法、离心法、膜过滤法中的一种或一种以上对反应底物及非目标物进行脱除，得混合反应体系；

6）溶剂的脱除：

将混合反应体系过膜通过0.22μm滤膜，以除去杂质和大分子非目标产物，所得溶液于25℃的条件下通过减压旋转蒸发脱除体系中相应溶剂，得到不透明单相溶液，通过离心分离出CS-TP-CTS微纳米体；

7）干燥及贮存：在步骤6）制得的CS-TP-CTS中添加冷冻干燥保护剂吐温80后，于0.01Mpa，-50℃的条件下冷冻干燥48 h至水分含量低于7%，得固态茶多酚微纳米复合体。

上述体系的制备过程，也可以添加在涡旋孵育过程中，适当添加乳化剂以改善产品份分散特征的理化性能；

所述的一种基于蛋白载体的茶多酚微纳米复合体的制备方法，其特征在于步骤1）中茶多酚与超纯水或磷酸盐缓冲液的料液比为0.2g/20～100ml，所述磷酸盐溶液的pH=7.4，浓度为0.2M，超声功率200w，超声时间15min。

所述的一种基于蛋白载体的茶多酚微纳米复合体的制备方法，其特征在于步骤2）中超声空化同步热诱导的条件为：将超声波探头置于70mL蛋白悬浮液液面下方3cm处，超声过程中恒温水浴控制温度，超声占空比50%，超声频率30Hz，工作7s，间歇3s，超声功率600w，总时间40min，温度35℃，不同组合处理CS体系，得到超声处理后的系列样品。

所述的一种基于蛋白载体的茶多酚微纳米复合体的制备方法，其特征在于步骤2）中pH多极性震荡变换处理为：将物理诱导处理后的蛋白分散体系于去离子水中搅拌1h，得浓度为20mg/mL的溶液，用0.1M NaOH将溶液pH调至12，并持续600 r/min涡旋1h以使折叠蛋白质分子充分展开，然后用0.1M HCl中和溶液至pH =7，并以800r/min涡旋孵育2h使分子内部结构重新折叠，通过冷冻干燥获得变换处理后的蛋白样品，并用超纯水通过过滤清洗3次，再次干燥即得蛋白样品。

所述的一种基于蛋白载体的茶多酚微纳米复合体的制备方法，其特征在于步骤2）中改性蛋白与PBS缓冲液的料液比为2～20mg/ml，超声分散处理的条件为：超声功率800w，超声频率30Hz，工作7s，间歇3s条件下进行超声分散处理10～15min，600 r/min涡旋1 h，所述PBS缓冲液的pH值为7.0，浓度为0.1M。

所述的一种基于蛋白载体的茶多酚微纳米复合体的制备方法，其特征在于步骤5）透析法为在室温下连续搅拌24小时后，自由暴露于空气中，将样品用10次超纯水，每次1L透析48小时以除去游离多酚及非目标产物；离心法为将所得CS-TP-CTS微纳米体系在冷冻离心机RCF 4000×g下离心15分钟，或13000 rpm 25 min；或5次离心，12000×g每8min循环进行以分离制备的微纳米复合体；膜过滤为将混合反应体系通过0.22μm -0.45μm滤膜过滤器，以除去任何杂质和非目标产物。

所述的基于蛋白载体的茶多酚微纳米复合体在涂膜保鲜剂上的用途。

所述的基于蛋白载体的茶多酚微纳米复合体在食品加工、医药保健、日用化工领域的用途。

应用于涂膜保鲜剂开发具体为：

取羧甲基纤维素钠（CMC）分步溶解于70℃超纯水中水化1 h，并保持70℃水浴下1000 r/min搅拌1 h至分散均匀，制得20 %（w/v）的基础胶液，加入甘油（8% w/w CMC溶液），在功率800 w、频率30 Hz下超声处理5 min以脱气，保温静置30～50min，再用刮板除去胶液表层气泡，形成初步成膜液。将CTS溶于1%醋酸水溶液制得浓度1%（v/v）的CTS溶液，室温下保持800 r/min搅拌2 h至完全溶解。CTS水溶液在使用前用1 M NaOH调节其pH至6.20-6.50。

配制浓度50 %的CS-TP-CTS微纳米体水溶液体系，800 r/min搅拌分散1 h。将CS-TP-CTS水溶液按CMC溶液体积的1/5逐滴（3滴每秒）加入保温于40℃水浴条件下300 r/min搅拌状态的CMC溶液，完毕后搅拌混合使其分散均匀。然后按混合液体积的1/10（v/v）将上述壳聚糖溶液，逐滴加入处于50℃水浴条件下300 r/min搅拌状态的混合涂膜液中，搅拌溶解，即得涂膜浸液。

进一步地，也可将涂膜浸液在热风条件（45℃，50% RH）下干燥，待干燥至水分含量小于12%时，将薄膜剥离得保鲜膜或保鲜包装材料。

其中，CMC，在25℃利用 Brookfield 粘度计所测1wt％ CMC水溶液黏度为 50-200mpa.s。进一步地，所述CMC也可以被羟丙基甲基纤维素（HPMC）、明胶、阿拉伯胶、卡拉胶、海藻酸钠、黄原胶、刺槐豆胶等中的一种或多种及其组合所替代。

本发明所述一种稳态化CS-TP-CTS微纳米复合体，其内含成分由40～70wt％的茶叶多酚化合物及其衍生物体系、5～20 wt％的蛋白溶液体系、5～15wt％的壳聚糖溶液及1～2 wt％的乳化剂及少量磷酸盐缓冲液等制备而成。该稳态化CS-TP-CTS微纳米体成品包括以下具体组分：茶叶酚类及其衍生物、食品蛋白类、壳聚糖、适量乳化剂及余量的水等。

采用本发明方法制备的茶多酚微纳米复合体，在扫描电镜下观察呈球形，表面光滑，无黏连，无凹陷。将其置于30℃，RH70%环境下贮存，在贮存30天后，多酚保留率仍达60%以上，粒径未发生显著性变化，Zeta电位在贮存15天后，增幅18.7%，具有较好环境体系稳定性。DPPH自由基清除实验表明，CS-TP-CTS微纳米体抗氧化性能得到增强。抑菌实验结果表明，CS-TP-CTS微纳米体具有较好抑菌活性，对常见腐败菌包括但不限于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae) 、弯曲杆菌 (Campylobacterjejuni)、单增李斯特菌( Listeria monocytogenes )、假单胞菌( Pseudomonas spp.)等都具有较好抑制效果。体外释放动力学实验结果表明，本发明所述产物具有较好体外释放特性，3 h累积释放量为38.43%，随着时间的延长，持续缓慢释放，72 h的累积释放量为63.7% 。

此外，本发明制备的茶多酚微纳米复合体具有一定的脂溶性（油溶度26.8%），应用体系稳定性良好。

本发明茶叶酚类化合物及衍生物包括但不限于不同规格及纯度的茶叶酚类及其单体成分如EC、EGC、ECG、EGCG等中的一种或几种及组合物。更广泛地，本发明所述多酚包括但不限于茶叶多酚，也包括其它植物类多酚类如花青素、白藜芦醇、苹果多酚、葡萄多酚及其衍生物如植物黄酮、茶黄素等。

本发明蛋白为食品级富脯氨酸蛋白，包括但不限于酪蛋白、乳清分离蛋白（又名白蛋白）、酪蛋白磷酸肽、明胶蛋白、牛奶蛋白、鸡蛋蛋白等富含脯氨酸蛋白中的一种或多种及其组合。

本发明制备方法包括但不限于反溶剂沉淀法、离子相互作用、离子凝胶、层层自组装、微纳米载体、蛋白藕联、物理包埋等技术中的一种或多种及其组合。

本发明制得的CS-TP-CTS微纳米体，关键功效成分即茶叶酚类化合物及其衍生物含量≧40%。对包括蜡样芽孢杆菌 (Bacillus cereus) 、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae) 、弯曲杆菌 (Campylobacter jejuni)、单增李斯特菌( Listeria monocytogenes )、沙门氏菌(Salmonella)、假单胞菌( Pseudomonas spp.)等常见食品腐败菌均具有较好抑制效果。DPPH自由基清除实验结果表明，样品溶液体积110μL时，DPPH自由基清除率达94.2%；

本发明CS-TP-CTS微纳米体中的蛋白载体除可经过多重物理诱导改性外，还可通过对酪蛋白酶解制得的富脯氨酸蛋白为基本载体，也可以牛初乳为基本原料经过离心脱脂，乙醇抽提，硫酸铵盐析，透析液干燥后制得的蛋白成分为基本蛋白载体。

本发明制得的CS-TP-CTS微纳米体具有较好的贮藏稳定性，在40℃，相对湿度60%条件下贮存15天，其多酚保留率仍可达59%。

本发明制备方法中乳化剂可以是司盘、吐温、硬脂酰乳酸钠、三聚甘油酯、丙二醇脂肪酸酯、大豆磷脂或月桂酸单甘油酯、十二烷基硫酸钠、椰油单酸甘油酯磺酸钠、月桂基磺基乙酸钠、月桂酰胺乙基磺酸钠、聚山梨醇酯中的一种或多种及其组合。

本发明制备的CS-TP-CTS微纳米复合体，其物理状态可为固态粉末或层叠堆积半透明薄膜状固体或均相乳液形态，可作为一种基本原料或基础性功效成分，广泛应用于食品保鲜、食品制造、日用化工、口腔护理、医药保健等多个领域。

本发明能够显著提高茶叶酚类化合物及其衍生物的应用稳定性和体系相容性，提高其抗氧化、抑菌性、防腐保鲜等活性功效的发挥，兼具缓释效果，为多酚类活性成分及衍生物的更好应用提供了绿色解决方案。

本发明制备的CS-TP-CTS微纳米复合体产品粒径处于微纳米级别，平均粒径分布在80～800nm 之间，包封率达90～95%，装载率均高于305μg/mg，水分含量3～12%，具有良好的体系稳定性和抗氧化、抑菌、缓释特性。CS-TP-CTS微纳米体在贮藏10天内多酚保留率及粒径变化率均优于未改性处理组别。

本发明方法制备的CS-TP-CTS微纳米体，相较于未处理茶叶酚类及衍生物组别，其体系稳定性和实际应用效果有显著提高，且高浓度EGCG 不会造成体系聚集和沉淀。

本发明方法制备的CS-TP-CTS微纳米体，进一步地，也可以富脯氨酸蛋白为基本原料通过超声酶解等工艺先制备相应食品蛋白，并以富脯氨酸蛋白作为微纳米载体，经热诱导处理后与茶叶酚类及衍生物等通过自组装机制形成微纳米复合体，也可达到同样之目的和功效。

本发明具有以下有益效果：

1）本发明具有制备简便、成本可控、绿色安全、应用范围广的特点，制得成品具有粒径均一，分散性好，包封率高以及良好的体系相容性和缓释效果。本发明除用于包封载运茶叶酚类化合物及其衍生物外，还可广泛应用于食品保鲜、食品加工、日化工业、口腔护理，医药保健等多个领域。

2）本发明通过低成本、绿色安全的物理转化手段，采用超声空化结合热诱导、pH多极性变换处理等手段对酪蛋白进行多重改性，以诱发蛋白结构改变而增强其柔性，进一步提高了茶叶酚类化合物及衍生物的装载率。

附图说明

图 1为本发明的制备流程示意图；

图 2为酪蛋白变换改性前后制得的CS-TP-CTS微纳米复合体粒径分布对比示意图（上图为改性前状态及粒径分布；下图为改性后状态及粒径分布）；

图 3为实施例1制备的CS-TP-CTS微纳米体制备过程中因素优化分析图（A：不同载体浓度对产品粒径及电位的影响；B：不同载体浓度对茶叶多酚结合效果的比较；

图 4为实施例1制备的CS-TP-CTS微纳米体的抗氧化及抑菌性比较分析图；

图5为实施例1制备的CS-TP-CTS微纳米体在贮存期间的平均粒径变化及多酚保留率随时间的变化；

图6为实施例1中制备的CS-TP-CTS微纳米体的贮藏稳定性及光照稳定性分析图；

图7为实施例1中的CS-TP-CTS微纳米体照片及扫描电镜（SEM）图。

具体实施方式

以下结合说明书附图及具体实施例对本发明做进一步详细描述。

本发明的目的是提供一种高生物活性的稳态化茶叶酚类及其衍生物的微纳米复合体，尤其涉及一种CS-TP-CTS微纳米复合体及其制备方法和用途。

本发明所述CS-TP-CTS微纳米复合体制备方法并不代表可以制备或利用本发明的唯一形式。除非另作陈述，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属技术领域普通技术人员通常理解的含义相同。

实施例1：

基本工序参见图1，CS-TP-CTS微纳米复合体制备依次包括如下步骤：

（1）CS溶液制备

配制15mg/ml的CS溶液于室温磁力搅拌1h，转速800r/min，将超声波处理仪探头置于CS悬浮液（70mL）液面下方3cm 处，设置超声波占空比50 %，超声频率30Hz，工作时间7s，间歇时间3s，超声功率600 w，超声过程恒温水浴控制温度35℃，时间40min得到超声处理后样品。在85℃水浴加热并搅拌2h4℃冷藏水化过夜。用0.1M的NaOH溶液调至pH=12，600 r/min下涡旋搅拌1h，用0.1MHCl溶液调至pH=7，800 r/min搅拌2h，水化过夜后得CS溶液体系。

（2）茶叶多酚溶液制备

用pH=7.4 PBS缓冲液做溶剂，配制8.0 mg/ml的EGCG溶液，超声空化处理20min至澄清透明，室温下1000 r/min磁力搅拌2h。

（3）壳聚糖溶液的配制

取壳聚糖（CTS）800mg溶于50ml 1%（v/v）乙酸溶液，超声空化处理20min至澄清透明，室温搅拌1h后，65℃水浴加热持续搅拌2h，配制浓度16mg/ml的壳聚糖溶液体系，用0.1M的NaOH溶液调至pH=6，储存待用。

（4）孵育制备

样品溶液经过滤（0.45μm滤膜）除杂后，将CTS与CS溶液等体积（1:1 V/V）混合，持续搅拌1h，80℃水浴下800 r/min搅拌1h。待溶液温度降低至室温后，将8mg/ml制备好的EGCG溶液按照体积比2:1（V/V）以每秒2滴速度滴加于混合反应液中，并于30min内滴加完毕。滴加过程中保持混合体系800r/min涡旋状态。避光条件下200 r/min搅拌2h，在50℃下热反应0.5h，然后以功率600w超声10min后用0.45μm微孔滤膜过滤。酪蛋白变换改性前后制得的CS-TP-CTS微纳米复合体粒径分布见图2。

（5）反应底物及非目标物脱除

将所得混合反应体系在RCF 4000×g下离心10min，取上清液通过旋转蒸发器（25℃）在真空下脱除溶剂后得不透明单相溶液。将分散体系于4000rpm下离心10分钟以分离出粒径及比重较大的CS-TP-CTS微纳米复合体。

（6）干燥及贮存

将分散体系储存于4℃，在添加冷冻干燥保护剂吐温80后使用真空冷冻干燥48小时至水分含量低于7%，将所得样品于4℃下贮存并进一步应用。

（7）性质测定

粒径、PDI和Zeta电位测定：取CS-TP-CTS微纳米粒冻干品，用双蒸水复溶，采用激光粒径测定仪在 25 ℃下测定。

多酚保留率的计算：多酚保留率（%）=（贮藏至特定时间样品中被包封的多酚含量/贮藏前样品中被包封的多酚含量）×100。

包埋率和装载率测定：所得CS-TP-CTS微纳米粒，用双蒸水复溶10倍后，12000r/min离心30分钟，取上清液在276nm下测定吸光度值，根据EGCG标准曲线（GB/T 8313-2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》）计算游离EGCG含量，根据以下公式计算EGCG的包封率（ER）和装载率（LR）。

包封率

装载率

本实施例制备的CS-TP-CTS微纳米体制备过程中因素优化分析图见图3，其中，A为不同载体浓度对粒径及电位的影响；B为不同载体浓度对茶叶多酚结合效果的比较；从图中可以看出：随着载体浓度的变化，目标产物的粒径、电位和多酚结合效果发生明显变化，在本发明选择的参数范围内，CS-TP-CTS微纳米体具有较优的粒径和电位且多酚结合程度较高。

抗氧化及抑菌性比较分析图见图4，从图中可知：本发明制备的CS-TP-CTS微纳米体相较于TBHQ及BHT具有较优的抗氧化活性，也具有一定抑菌特性。

本实施例制备的CS-TP-CTS微纳米体在贮存期间的平均粒径变化及多酚保留

率随时间的变化见图5，从图中可知：本发明制备的CS-TP-CTS微纳米体贮存30天后粒径变化较小，贮存30天后多酚保留率仍≥50%，表明本发明产物稳定性较好。

本实施例制备的CS-TP-CTS微纳米体的贮藏稳定性及光照稳定性分析图见图6，

从图中可知：相较于未包封的TP,CS-TP-CTS微纳米体稳定性显著提高，且在避光和低温贮存条件下更趋于稳定。

本实施例制备的CS-TP-CTS微纳米体照片及扫描电镜（SEM）图见图7。

进一步地，将所得产品采用上述方法进行物化性质测定，结果如表1所示。

表1

（8）应用于护肤产品开发

取甘油（0.5份）、丁二醇（3份）、结冷胶（0.1份）、EDTA二钠（1份）、茶黄素（0.2份）、透明质酸钠（2份）、丙二醇（2份）、油酸酯（0.1份）、牛油果树果脂（3份）、黄原胶（4份）及余量的水混合作为水相，搅拌加热至80～85 ℃，恒温20 min。将乳木果油与橄榄油按质量比1:1混合作为油相，搅拌加热至70～80 ℃，恒温30 min。将水相与油相充分混合，搅拌并降温至45 ℃，加入CS-TP-CTS微纳米体（3份）、香精（适量）等后加入真空均质器中均质乳化，搅拌均匀即得富含茶叶酚类活性成分的护肤面霜产品。

实施例2：

取0.5g酪蛋白溶解于50mL蒸馏水并搅拌过夜以使其完全分散或溶解，用0.1MNaOH将蛋白质溶液pH调至9.0。通过搅拌将壳聚糖溶解于1%乙酸溶液中，得浓度3.0mg/mL的壳聚糖溶液。将0.25g茶叶多酚（TP或EGCG）溶解在30mL蒸馏水。

保持蛋白溶液处于300r/min搅拌状态下，将茶叶多酚溶液以每秒2滴速度滴加于蛋白溶液中，并于30min内滴加完毕。加入壳聚糖溶液体系，保持500r/min持续搅拌状态至充分分散均匀，加入吐温-80，在搅拌状态下，用0.1M的NaOH溶液调至pH 6～8之间。

室温下连续搅拌24h，将反应溶液体系用蒸馏水（共约10L，补充水分8次）透析（MWCO=12000～14000）48小时以除去游离多酚和蛋白成分。将所得溶液按照实施例1所述方法干燥得目标产物。

进一步地，将对比实施例1得到的产品进行基本物化性质的测定，测试方法同实施例1，结果如表2所示。

表2

应用于护肤产品开发：

将油相成分辛酸C16-18烷酯（3份）、霍霍巴籽油（0.5份）、向日葵籽油（1份）混合均匀，加热到75℃左右制成油相。将水相成分包括CS-TP-CTS微纳米体（4份）、甘油（5份）、交联丙烯酸（0.2）、茶氨酸（0.2份）、三乙醇胺（0.2份）、海藻糖（0.5份）、木薯淀粉（0.3份）混合均匀，加热到75℃左右制成水相。油相、水相都加入真空均质器中均质乳化，冷却到45℃，加香精、防腐剂，搅拌均匀，即可罐装成品。

未详述步骤基本同实施例1，不再赘述。

实施例3：

富脯氨酸蛋白制备：以鲜牛乳为原料，经过8000×g 离心30 min 脱脂，在10℃下加入60% （v/v）乙醇抽提，保持边加边搅拌的状态，12000×g 离心，取上层有机相旋转蒸发去除有机溶剂，旋蒸温度25℃，待体积恢复至原脱脂乳体积之后，离心（5000r/min，10min）去除不溶性沉淀。取混合体系，以 50% 饱和硫酸铵进行盐析，沉淀蛋白并以少量超纯水溶解，用共约10L（补充水分8次）隔夜透析（MWCO=12 000-14 000），干燥后即得所述蛋白成分。

壳聚糖溶液制备：取壳聚糖溶于pH 3.0的PBS缓冲液中，在功率600W，频率50Hz下超声20min，配制5mg/mL溶液。 40℃下500r/min搅拌2h使其均一水化，得壳聚糖储备液。

其余步骤基本同实施例1，不再赘述。

进一步地，将对比实施例1得到的产品进行基本物化性质的测定，测试方法同实施例1，结果如表3所示。

表3

表注：所得产品为按照本实施例所述方法制备的产品，对照产品为以改性酪蛋白为原料，通过本实施例其余方法制备的产品。

洗面奶产品开发：

吐温80（1.5份）及防腐剂（适量）、香精（适量）及余量的水在80℃条件下分别溶解分散均匀，制得水相和油相。将水相及油相加入真空均质器中均质乳化（85℃，5 min），冷却到45℃，搅拌均匀，即得成品。该产品外观凝胶状、呈晶莹剔透感，清洁及抗氧化效果较佳，实际使用效果良好。 将油相包括白油（16份）、葵酸三甘油酯（8份）、橄榄油（2份），水相包括单硬脂酸甘油酯（2份）、丁二醇（5份）、CS-TP-CTS微纳米体（3份）、卡波树脂（0.6份）、三乙醇胺（1份）

实施例4：

以PBS作溶剂，按实施例1所述配制10mg/mlEGCG溶液体系，在室温下将其逐滴加入处于75-85℃水浴搅拌状态（800 r/min）下的改性酪蛋白溶液体系中并涡旋孵育20min。改性酪蛋白溶液浓度15mg/ml，溶剂为30mM PBS，调节pH至6.9。涡旋孵育结束后冷却至室温（21～25℃）。在降温过程中应使溶液在4.5min内降低至40℃，8min内降低至30℃。

其余步骤基本同实施例1，不再赘述。

进一步地，将对比实施例1得到的产品进行基本物化性质的测定，测试方法同实施例1，结果如表4所示。

表4

表注：对照产品为将本实施例中PBS替换为蒸馏水作溶剂制备EGCG溶液所得产品。

CS-TP-CTS微纳米粒缓释特性测定：取制得CS-TP-CTS微纳米体2.0g，分散于相应的溶出介质50mL中，置于透析袋(MWCO=12 000～14000)，然后将透析袋置于盛有溶出介质（PBS缓冲溶液(pH 7.4)）1L的烧杯中，在水浴恒温振荡器中进行释放实验，旋转频率为120r/min，温度 37±0.5°C。在特定时间点取样分析，并补充挥发的溶出介质。以0h样品作空白对照，以累积释放百分率分析其释放特性。

结果表明，在溶出介质体系中，CS-TP-CTS微纳米体呈现出良好缓释性能，前6h释放度达40.58％，随后呈现缓慢释放过程，72h内累积释放71.4％。

应用于保鲜剂开发：取CS-TP-CTS微纳米体（2.0 wt%），0.5 wt%的壳聚糖醋酸水溶液、乙酸（0.5wt%）、蔗糖月桂酸酯（1.0 wt%）、乙二醇（0.3wt %）、吐温-80 （0.3wt%）及余量的水室温搅拌过夜，使其充分水化后制成水相。将肉桂油0.25%（v/v）、中链甘油三酯（1.0wt%）加入水相，40℃恒温水浴搅拌（800r/min）10 min，10000r/min高速剪切10min，30Mpa均质2次即得富含茶叶活性成分的保鲜剂产品。

实施例5：

微纳米复合体的制备也可采用不添加壳聚糖体系方式进行，在涡旋孵育过程中，并可适当添加乳化剂以改善产品分散特征及理化性能。按实施例1所述，将改性酪蛋白溶于pH=7 PBS缓冲液中并在21～25℃下搅拌12h，充分溶解得蛋白溶液体系。用精密蠕动泵，以2ml/min 流速将等体积的EGCG溶液滴加到不同蛋白溶液中，滴加过程中保持蛋白溶液处于600 r/min涡旋状态。将0.5g吐温80溶解于用1.0mol/L HCl 调节至pH= 4.0的100ml水溶液中，以500 rpm磁力搅拌10min。在涡旋孵育过程中，将10ml吐温80溶液逐步滴加于混合溶液体系，在30min内滴加完成。在功率600W，频率50Hz下超声后并以300 r/min搅拌1h。

其余步骤和方法基本同实施例1，不再赘述。

进一步地，将对比实施例1得到的产品进行基本物化性质的测定，测试方法同实施例1，结果如表5所示。

表5

应用于保鲜剂开发：取CS-TP-CTS微纳米体1.0wt%，壳聚糖1.0 wt%、乙酸0.5wt %、丙三醇0.60wt %、山梨糖醇酐脂肪酸1.0wt%、吐温-80 0.2wt %，肉桂油0.25%（v/v）、中链甘油三酯（1.0wt%）以及余量的水，在10000 r/min条件下高速剪切乳化20min，每剪切5min间歇1min进行，混合均匀后即得富含茶叶活性成分的保鲜剂产品。

实施例6

取30mg 茶叶多酚加入于12ml浓度5.0mg/ml 的酪蛋白水溶液，涡旋孵育反应；在快速搅拌（800r/min）状态下，向上述溶液逐滴加入30ml 的10mg/ml 壳聚糖溶液，在30s内滴加完毕，用0.1M的NaOH溶液调至7。将混合溶液体系持续搅拌12h使其充分反应。在室温（25℃）下连续搅拌24h将反应溶液体系用蒸馏水（共约10L，补充水分8次）透析（MWCO=14000）48h以除去游离多酚和蛋白成分。

通过离心冷冻干燥脱除体系中的水分，冷冻离心转速为15, 000rpm，下层沉淀用去离子水洗涤4次，收集下层沉淀，-40～50°C冷冻干燥20～30小时得CS-TP-CTS微纳米复合体，储存待用。

进一步地，将得到的产品进行基本物化性质的测定，测试方法同实施例1，结果如表6所示。

表6

其余步骤和方法同实施例1，不再赘述。

应用于保鲜薄膜产品开发：

取HPMC溶解于50℃超纯水中水化1 h，并保持60℃水浴下800 r/min搅拌1 h至分散均匀，制得20 %（w/v）的胶液，加入甘油（5% w/wHPMC溶液），在功率800 w下超声处理10min脱气，保温静置30min，再用刮板除去胶液表层气泡，形成初步成膜液。

按照体积比2:1将HPMC溶液加入处于500 r/min搅拌条件下的 CS-TP-CTS微纳米体溶液中（浓度50%），600 r/min搅拌1 h至充分混合。取一定量成膜液缓慢倒入光滑干净的平皿上，除去表层气泡后于45℃、50% RH环境中避光干燥至水分含量≤15%，将薄膜剥离即得含有稳态化茶多酚成分的保鲜膜或保鲜包装材料。

实施例7：

（1）CS溶液制备

配制15mg/ml的CS溶液于室温磁力搅拌1h，转速800r/min，将超声波处理仪探头置于70mL CS悬浮液液面下方3cm 处，设置超声波占空比50%，超声频率30 Hz，工作时间7 s，间歇时间3 s，超声功率600 w，超声过程恒温水浴控制温度35℃，时间40min得到超声处理后样品。在85℃水浴加热并搅拌2h4℃冷藏水化过夜。用0.1M的NaOH溶液调至pH=12，1000r/min下搅拌1h，用0.1MHCl溶液调至pH=7，1000 r/min搅拌1h，水化过夜后得CS溶液体系。

（2）茶叶多酚溶液制备方法基本同实施例1，不再赘述。

（3）β-环糊精溶液配制

取一定量β-环糊精溶于蒸馏水，50℃水浴条件下保持600 r/min磁力搅拌1h，制得浓度10%的分散体系。

（4）孵育制备

样品溶液经过滤（0.45μm滤膜）除杂后，将β-环糊精与CS溶液等体积（1:1 v/v）混合，持续搅拌1h，80℃水浴800 r/min搅拌反应1h。待溶液温度降低至室温后，将5mg/ml制备好的EGCG溶液按照体积比3:1（v/v），以每秒2滴速度滴加并于30min内滴加完毕，在涡旋孵育过程中，边滴边保持800 r/min搅拌。避光条件下300 r/min搅拌2h，在50℃下热反应1h，然后在4℃以功率200w超声10min后10000 r/min条件下离心即得。

其余步骤和方法基本同实施例1，不再赘述。

进一步地，将所得产品采用上述方法进行物化性质测定，结果如表7所示。

表7

表注：所得产品为按本实施例所述方法制备的产品，对照产品为以未改性酪蛋白为原料，通过本实施例其余方法制备的产品。

实施例8

本实施例与实施例1的区别在于，改性酪蛋白溶液也可用明胶蛋白替代，达到同样使用效果：将1.0g明胶溶于50℃的30ml去离子水中，800 r/min搅拌溶解1h，即得所用明胶蛋白溶液。

本实施例所述溶剂体系包括但不限于超纯水或不同浓度乙醇水溶液，以及磷酸盐缓冲液（pH 6.0，0.01M）、柠檬酸盐缓冲液（pH 3.0，0.01M）；乙酸盐缓冲液（pH 4.5，0.01M）；PBS磷酸盐缓冲液（pH 6.0，0.01M）等其中的一种或多种及其组合。

其余步骤和方法基本同实施例1，不再赘述。

实施例9：

本实施例与实施例1的区别在于，反应底物及非目标物的脱除，除采用上述方法外也可采用膜过滤、离心、透析等方法。透析：25℃下连续搅拌24小时，自由暴露于空气中，将样品用10次水（共约10L）透析48小时以除去游离多酚及非目标产物。离心：将所得混合体系在冷冻离心机RCF 4000×g下离心10分钟（或采用12000×g离心，每次8min循环进行5次）分离制备目标产物。

其余步骤和方法基本同实施例1，不再赘述。

CS-TP-CTS微纳米粒贮藏稳定性测定：取相同质量的茶多酚粉末及CS-TP-CTS微纳米粒冻干产品，分别于30℃，相对湿度60%条件下保存，在预定的时间点取样(0、1、2、3、4和5d)，按照GB 8313/T所示方法测定多酚含量，计算多酚保留率（以0d茶多酚含量作100%）。多酚保留率结果如表8。

表8

天数（d）

0

1

2

3

4

5

CS-TP-CTS多酚保留率（%）

100±0.0

97.5±1.4

92.2±2.0

91.4±2.1

89.7±1.8

88.6±1.7

TP多酚保留率（%）

100±0.0

90.8±2.1

84.0±1.9

77.3±1.2

75.5±2.0

70.2±1.9

结果表明，贮藏期内随着时间延长，CS-TP-CTS微纳米复合体的多酚保留率下降缓慢，使茶叶多酚的功效发挥保持相对稳定。本发明所述CS-TP-CTS微纳米体在不同环境中均具有较好的稳定性和多酚保留率。

实施例10：

本实施例与实施例1的区别在于，在微纳米制备过程中，也可添加适量的抗坏血酸，能够显著增强CS-TP-CTS微纳米复合体系的抑菌活性，达到协同增效的作用，同时能够稳定EGCG体系。

其余步骤和方法基本同实施例1，不再赘述。

对所得CS-TP-CTS微纳米体进行抑菌特性分析，结果如表9所示。

表9

应当指出，上述仅是本发明的优选实施方式，本领域的普通技术人员应理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，在不脱离本发明原理和内涵外延的前提下，对本发明简单变换后的方案均属于本专利的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于蛋白载体的茶多酚微纳米复合体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）茶多酚溶液体系制备：将茶多酚溶于超纯水或磷酸盐缓冲液中超声处理至澄清透明，搅拌，制得浓度为2～10mg/mL的茶多酚溶液，4℃储存待用；

2）蛋白溶液体系制备：以蛋白为基本运载模型，通过超声空化同步热诱导，pH多极性震荡变换处理对蛋白进行改性和结构重组，制得改性后蛋白，将改性后蛋白溶于PBS缓冲液中，于超声条件下进行分散处理制得浓度为2～20mg/mL的蛋白溶液体系，调节pH至8.0，储存待用；

3）壳聚糖溶液体系制备：按料液比0.01～1.5g/50～100mL的比例，取壳聚糖溶于体积浓度为1%的乙酸水溶液，超声空化处理20min至澄清透明，搅拌，使其充分溶解至溶液透明，制得浓度1～30mg/mL壳聚糖溶液，调节pH至6.0，储存待用；

4）CS-TP-CTS微纳米复合体制备：将步骤1）、步骤2）、步骤3）所得储备液在RCF 4000×g下离心10～20min，以进一步除去杂质和不溶物；

将步骤1）制得的浓度为2～10mg/mL的茶多酚储备溶液使用注射器按1滴/秒的速度逐滴加入或使用微量恒流泵以10ml/min的速度滴加于150～800r/min搅拌状态下的蛋白储备溶液中，并于1h内滴加完毕，滴加完毕后的混合溶液在30℃，600 r/min密封条件下涡旋孵育10h，以形成CS-TP溶液体系；涡旋过程中保证茶多酚储备液与CS蛋白储备液体积比为1:0.5～1:10之间，对应的TP与蛋白的质量比为1:0.1～1:10；

涡旋完毕后，将步骤3）制得的壳聚糖储备溶液使用微量恒流泵滴加处于150～1000r/min搅拌状态下的CS-TP溶液体系，以120～1200rpm 连续搅拌2～24h，以确保形成微纳米复合物，其中，壳聚糖储备液与CS-TP溶液体系的体积比为1:1，制得CS-TP-CTS微纳米体系；

5）反应底物及非目标物的脱除：采用透析法、离心法、膜过滤法中的一种或一种以上对反应底物及非目标物进行脱除，得混合反应体系；

6）溶剂的脱除：

将混合反应体系过膜通过0.22μm滤膜，以除去杂质和大分子非目标产物，所得溶液于25℃的条件下通过减压旋转蒸发脱除体系中相应溶剂，得到不透明单相溶液，通过离心分离出CS-TP-CTS微纳米体；

7）干燥及贮存：在步骤6）制得的CS-TP-CTS中添加冷冻干燥保护剂吐温80后，于0.01Mpa，-50℃的条件下冷冻干燥48 h至水分含量低于7%，得茶多酚微纳米复合体。

2.一种基于蛋白载体的茶多酚微纳米复合体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）茶多酚溶液体系制备：将茶多酚溶于超纯水或磷酸盐缓冲液中超声处理至澄清透明，搅拌，制得浓度为2～10mg/mL的茶多酚溶液，4℃储存待用；所述茶多酚溶液选用EGCG；

2）蛋白溶液体系制备：以蛋白为基本运载模型，通过超声空化同步热诱导，pH多极性震荡变换处理对蛋白进行改性和结构重组，制得改性后蛋白，将改性后蛋白溶于PBS缓冲液中，于超声条件下进行分散处理制得浓度为2～20mg/mL的蛋白溶液体系，调节pH至8.0，储存待用；

3）壳聚糖溶液体系制备：按料液比0.01～1.5g/50～100mL的比例，取壳聚糖溶于体积浓度为1%的乙酸水溶液，超声空化处理20min至澄清透明，搅拌，使其充分溶解至溶液透明，制得浓度1～30mg/mL壳聚糖溶液，调节pH至6.0，储存待用；

4）CS-TP-CTS微纳米复合体制备：将步骤1）、步骤2）、步骤3）所得储备液在RCF 4000×g下离心10～20min，以进一步除去杂质和不溶物；

将步骤2）制得的浓度为2～10mg/mL的蛋白储备溶液使用微量恒流泵以3滴每秒的速度滴加处于150～1000rpm搅拌状态下的CTS-TP涡旋体系，在30℃下以120～1200r/min连续搅拌4～24 h，以形成CS-TP-CTS微纳米聚集体；保证蛋白储备液与CTS-TP溶液体系的体积比为1:2；其中，CTS-TP体系制备方法如下，取0.01～1.5g壳聚糖溶于50～100ml体积浓度为1%乙酸水溶液中，800r/min搅拌1h使其充分溶解至溶液透明，于450W超声空化条件下处理10min，使溶液充分溶解，制得浓度1～30 mg/ml CTS溶液，再加入2～10mg/ml EGCG，800r/min搅拌1h使其充分溶解至溶液透明，450W超声空化条件下处理10min即得；

5）反应底物及非目标物的脱除：采用透析法、离心法、膜过滤法中的一种或一种以上对反应底物及非目标物进行脱除，得混合反应体系；

6）溶剂的脱除：

将混合反应体系过膜通过0.22μm滤膜，以除去杂质和大分子非目标产物，所得溶液于25℃的条件下通过减压旋转蒸发脱除体系中相应溶剂，得到不透明单相溶液，通过离心分离出CS-TP-CTS微纳米体；

7）干燥及贮存：在步骤6）制得的CS-TP-CTS中添加冷冻干燥保护剂吐温80后，于0.01Mpa，-50℃的条件下冷冻干燥48 h至水分含量低于7%，得茶多酚微纳米复合体。

3.一种基于蛋白载体的茶多酚微纳米复合体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）茶多酚溶液体系制备：将茶多酚溶于超纯水或磷酸盐缓冲液中超声处理至澄清透明，搅拌，制得浓度为8mg/mL的茶多酚溶液，4℃储存待用；所述茶多酚溶液选用EGCG；

2）蛋白溶液体系制备：以蛋白为基本运载模型，通过超声空化同步热诱导，pH多极性震荡变换处理对蛋白进行改性和结构重组，制得改性后蛋白，将改性后蛋白溶于PBS缓冲液中，于超声条件下进行分散处理制得浓度为2～20mg/mL的蛋白溶液体系，调节pH至8.0，储存待用；

3）壳聚糖溶液体系制备：按料液比0.01～1.5g/50～100mL的比例，取壳聚糖溶于体积浓度为1%的乙酸水溶液，超声空化处理20min至澄清透明，搅拌，使其充分溶解至溶液透明，制得浓度1～30mg/mL壳聚糖溶液，调节pH至6.0，储存待用；

4）CS-TP-CTS微纳米复合体制备：将步骤1）、步骤2）、步骤3）所得储备液在RCF 4000×g下离心10～20min，以进一步除去杂质和不溶物；

将步骤3）制得CTS溶液与步骤2）制得CS溶液等体积混合，持续搅拌1h，80℃水浴下800r/min搅拌1h；待溶液温度降低至室温后，取8mg/mlEGCG溶液按照体积比2:1以每秒2滴速度滴加于混合反应液中，并于30min内滴加完毕；滴加过程中保持混合体系800r/min涡旋状态；避光条件下200 r/min搅拌2h，在50℃下热反应0.5h，然后以功率600w超声10min后即得；

5）反应底物及非目标物的脱除：采用透析法、离心法、膜过滤法中的一种或一种以上对反应底物及非目标物进行脱除，得混合反应体系；

6）溶剂的脱除：

将混合反应体系过膜通过0.22μm滤膜，以除去杂质和大分子非目标产物，所得溶液于25℃的条件下通过减压旋转蒸发脱除体系中相应溶剂，得到不透明单相溶液，通过离心分离出CS-TP-CTS微纳米体；

7）干燥及贮存：在步骤6）制得的CS-TP-CTS中添加冷冻干燥保护剂吐温80后，于0.01Mpa，-50℃的条件下冷冻干燥48 h至水分含量低于7%，得茶多酚微纳米复合体。

4.如权利要求1所述的一种基于蛋白载体的茶多酚微纳米复合体的制备方法，其特征在于所述磷酸盐缓冲液的pH=7.4，浓度为0.2M，超声功率200w，超声时间15min。

5.如权利要求1所述的一种基于蛋白载体的茶多酚微纳米复合体的制备方法，其特征在于步骤2）中超声空化同步热诱导的条件为：将超声波探头置于70mL蛋白悬浮液液面下方3cm处，超声过程中恒温水浴控制温度，超声占空比50%，超声频率30Hz，工作7s，间歇3s，超声功率600w，总时间40min，温度35℃。

6.如权利要求1所述的一种基于蛋白载体的茶多酚微纳米复合体的制备方法，其特征在于步骤2）中pH多极性震荡变换处理为：将物理诱导处理后的蛋白分散体系于去离子水中搅拌1h，得浓度为20mg/mL的溶液，用0.1M NaOH将溶液pH调至12，并持续600 r/min涡旋1h以使折叠蛋白质分子充分展开，然后用0.1M HCl中和溶液至pH =7，并以800r/min涡旋孵育2h使分子内部结构重新折叠，通过冷冻干燥获得变换处理后的蛋白样品，并用超纯水通过过滤清洗3次，再次干燥，即得蛋白样品。

7.如权利要求1所述的一种基于蛋白载体的茶多酚微纳米复合体的制备方法，其特征在于步骤2）中改性蛋白与PBS缓冲液的料液比为2-20mg/ml，超声分散处理的条件为：超声功率800w，超声频率30Hz，工作7s，间歇3s条件下进行超声分散处理10～15min，600 r/min涡旋1 h，所述PBS缓冲液的pH值为7.0，浓度为0.1M。

8.如权利要求1所述的一种基于蛋白载体的茶多酚微纳米复合体的制备方法，其特征在于步骤5）透析法为：在室温下连续搅拌24小时后，自由暴露于空气中，将样品用10次超纯水，每次1L透析48小时以除去游离多酚及非目标产物；离心法为：将所得CS-TP-CTS微纳米体系在冷冻离心机RCF 4000×g下离心15分钟，或13000 rpm 25 min；或5次离心，12000×g每8min循环进行以分离制备的微纳米复合体；膜过滤法为将混合反应体系通过0.22μm～0.45μm滤膜过滤器，以除去任何杂质和非目标产物。

9.权利要求1所述的基于蛋白载体的茶多酚微纳米复合体在涂膜保鲜剂上的用途。

10.权利要求1所述的基于蛋白载体的茶多酚微纳米复合体在食品加工、医药保健、日用化工领域的用途。

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