CN116731525A - 一种豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种豌豆分离蛋白‑表没食子儿茶素没食子酸酯‑铁离子三元复合物及其制备方法和应用，所述方法包括通过pH碱性偏移结合加热处理得到豌豆分离蛋白分散液再与表没食子儿茶素没食子酸酯溶液混合，得到豌豆分离蛋白‑表没食子儿茶素没食子酸酯复合物，在所述复合物中加入六水合三氯化铁溶液混合后得到豌豆分离蛋白‑表没食子儿茶素没食子酸酯‑铁离子三元复合物。此外，将β‑胡萝卜素溶解于油相中再与上述水相三元复合物混合可制得负载β‑胡萝卜素的豌豆分离蛋白‑表没食子儿茶素没食子酸酯‑铁离子三元复合物高内相乳液。本申请原料广泛，廉价易得，产物安全且对人体有益，有较高的抗环境应力稳定性，制备方法简单可推广。

Description

一种豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元 复合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物及其制备方法和应用。
背景技术
豌豆中含有丰富的碳水化合物、蛋白质、维生素、矿物质等。豌豆蛋白作为一种植物来源的天然可持续性蛋白，不仅价格低廉、来源广泛、致敏性低、非转基因，还具有降低胆固醇、血压等生理活性。豌豆分离蛋白(PPI)是豌豆蛋白经过等电沉淀和膜分离(如超滤、透滤)等产生的，蛋白质浓度增加，蛋白质含量在90％以上。然而，豌豆蛋白中不溶性的球蛋白比例高，导致其溶解度差，并且通过常用的碱提酸沉法分离豌豆蛋白会进一步降低球蛋白的溶解度，因此分离得到的豌豆分离蛋白的功能特性，如乳化性、起泡性和凝胶性等会由于其水溶性差在食品工业应用上受到一定限制。目前，国内大多数生产厂家对豌豆的深加工侧重于豌豆淀粉的提取利用，而忽略了豌豆蛋白的开发，常将其作为废料或牲畜的饲料，导致大量的豌豆被浪费。基于此，如果提供一种能够改善豌豆蛋白溶解度、进一步改善豌豆蛋白功能特性的方法，将会扩大豌豆蛋白在食品工业中的应用。
多酚是广泛存在于水果、蔬菜等可食用植物中产生的次生代谢产物，普遍具有减轻活细胞和组织中蛋白质、脂类和碳水化合物的氧化损伤的作用，从而降低某些慢性疾病发生的风险。其中，茶多酚是典型的多酚类天然抗氧化剂，儿茶素类化合物是茶多酚的主要构成成分且生物活性最强。其次，表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是茶叶中最普遍的且抗氧化活性最强的儿茶素，可以保护食物和生物体免受自由基介导的氧化损伤，在多种细胞培养和动物模型系统中显示出良好的抗氧化、抗炎、抗癌作用。然而，由于其对光、热比较敏感，碱性条件下极不稳定，生物利用度低等诸多原因，阻碍了其应用。
多酚具有丰富的酚羟基，可通过静电相互作用、氢键、疏水相互作用等与食品中蛋白质结合形成可溶性蛋白质-多酚复合物，从而可以提高其稳定性，提供抗氧化活性，甚至增强其抗肿瘤活性。另一方面，酚类化合物的结合可以修饰蛋白质的结构，对蛋白质的物理化学和功能性质产生影响，如溶解度、稳定性和消化率等，进而影响食品的感官品质、营养特性及功能活性等。因此，蛋白质和多酚形成的复合物可以被认为是有效乳化剂和抗氧化剂，它们可以在油水界面中定位并发挥作用，并防止乳化食品中的氧化，构建兼具蛋白质、多酚的多功能载体能够解决活性成分生物局限性。中国发明专利CN103110107A公开了一种应用蛋白凝胶包裹茶多酚的方法，主要是将多酚加入到蛋白水溶液中再离心、酸化，加入食用油、乳化剂即可得到蛋白凝胶包裹的茶多酚。
铁是人体不可缺少的一种营养微量元素，能够协助酶来完成人体内各种生物活动，如合成血红蛋白、能量代谢等。膳食中铁的摄入不足和食物中铁的利用率低是人体内铁缺乏的主要原因。通过补铁或食物强化是增加铁摄入量的有效途径。由此可见，铁强化剂的设计和制造对食品工业中缺铁性贫血的预防和改善至关重要。
多酚具备与金属离子螯合的能力，利用这一现象可用于制备金属-多酚网络，进而形成不同形状和功能的薄膜或涂层，并应用于药物递送、生物医学和食品工业等领域，金属-多酚网络的形成是由多酚的吸附和pH值依赖的多价配位键引导的，结合了金属离子赋予的特定功能及多酚类物质对各种表面的高亲和力。茶多酚的分子结构中含有多个酚羟基，分子内有大的π键共轭体系和强配位的氧原子，这样的空间构型使其具有较强的络合金属离子的能力，是金属离子的良好配体。当多酚与金属离子相遇时，多酚作为多基配体在其邻位酚羟基上形成以金属离子为中心的稳定的茶多酚金属络合物。茶多酚形成金属络合物后其生物活性会受到影响，络合金属离子是茶多酚抑菌的重要机制之一。由此可见，茶多酚金属络合物有作为一类安全高效天然抗氧化抑菌剂应用的潜能。
水包油(O/W)乳液作为一种疏水性物质的有效递送载体已被广泛用于包封β-胡萝卜素来改善其应用特性。高内相乳液是分散相体积分数超过74％的特殊乳液，其具有极高的分散相比例和类似于泡沫状的结构。一方面高的分散相体积分数为负载更多的食品功能成分提供了可能，另一方面高内相乳液稳定的泡沫状网络结构，使得分散相中的液滴不易像传统乳液一样发生碰撞，同时提高了递送功能因子的有效性和稳定性。
综上，多酚具备同时与蛋白和金属离子结合的能力，因此如果构建一个含有豌豆分离蛋白、多酚、金属离子的全新复合体系，开发豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物作为一种优良的多功能食品添加剂，将会使得大量的豌豆资源得到充分利用，同时可以补充铁元素和表没食子儿茶素没食子酸酯。
发明内容
本发明提供一种豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物的制备方法其应用，目的在于构建一个含有豌豆分离蛋白、多酚、金属离子的全新复合体系，开发豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物作为一种优良的多功能食品添加剂，使得大量的豌豆资源得到充分利用，同时可以补充铁元素和表没食子儿茶素没食子酸酯。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
本发明提供一种豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物的制备方法：包括将豌豆分离蛋白分散液与表没食子儿茶素没食子酸酯溶液混合通过非共价结合作用得到豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物，在所述豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物中加入六水合三氯化铁，使得铁离子通过螯合作用与所述豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物形成豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物。
进一步地，上述制备方法包括通过pH碱性偏移结合加热处理得到豌豆分离蛋白分散液，将所述豌豆分离蛋白分散液与表没食子儿茶素没食子酸酯溶液等体积混合，在黑暗条件下搅拌，通过豌豆分离蛋白与表没食子儿茶素没食子酸酯非共价结合作用得到豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物，在所述豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物中加入六水合三氯化铁溶液混合，使得铁离子通过螯合作用与所述豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物形成豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物。
进一步地，上述豌豆分离蛋白分散液的制备方法包括将豌豆分离蛋白分散到水中，搅拌，加入碱性物质使得分散系的pH为11.5-12.5，再水浴加热至80-90℃保持30-35min后冷却，加入酸性物质调节pH为6.5-7.5得到所述豌豆分离蛋白分散液并且将其在0-4℃下保存。
进一步地，所诉豌豆蛋白分散液中豌豆分离蛋白的浓度为1-2w/v％。
进一步地，所述碱性物质包括氢氧化钠，所述酸性物质包括盐酸。
进一步地，所述表没食子儿茶素没食子酸酯与铁离子的质量比值在1∶0.5-4。
进一步地，所述豌豆分离蛋白分散液与所述表没食子儿茶素没食子酸酯溶液等体积混合后混合液中所述表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度为0.083-0.125w/v％。
进一步地，所述豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物中加入的六水合三氯化铁溶液中铁离子的浓度为0.05-0.4w/v％。
本发明还提供了一种豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物高内相乳液，包括：采用本发明提供的制备方法制得豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物作为水相，中链甘油三酯(MCT)油为油相，将上述油相加入到上述水相复合物中得到O/W型高内相乳液。
进一步地，所述豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物高内相乳液的pH在2-7的时候，乳液的粒径在41.20-34.73μm之间。
本发明还提供了一种负载β-胡萝卜素的豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物高内相乳液，包括：采用本发明提供的制备方法制得豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物作为水相，将β-胡萝卜素溶解于中链甘油三酯(MCT)油中，得到油相，将上述油相加入到上述水相复合物中得到负载β-胡萝卜素的O/W型高内相乳液。
进一步地，上述豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元水相复合物中所述豌豆分离蛋白浓度为1-2wt％；
进一步地，所述β-胡萝卜素用量为1-2mg/mL。
进一步地，所述油相的体积分数为75-80％。
本发明提供的豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物在食品添加剂或使用所述豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物制备负载β-胡萝卜素的O/W型高内相乳液在生物活性物质的包埋或营养物质的递送或药物的控释领域的应用。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果至少在于：
1.本发明以豌豆分离蛋白为原料，廉价易得，扩大了豌豆蛋白的应用范围和途径。
2.本发明使用的原料豌豆分离蛋白、多酚和铁元素均可食用且对人体有益，制备的三元复合物安全、无毒。
3.本发明使用pH偏移结合加热处理、将蛋白质与多酚和金属离子结合对豌豆蛋白进行改性，所得产品具有良好的乳化性、抗氧化性和抑菌活性。
4.本发明所得的豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物稳定的高内相乳液具有显著提高的抗环境应力(pH、温度、光照)稳定性，为新型食品功能因子递送载体的制备提供了新的方法，可以提高疏水性生物活性物质吸收效率。
5.本发明制备方法新颖，制备过程简单，易于实现工业化生产，在生物活性物质的包埋、营养物质的递送、药物的控释等领域具有广泛用途。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物的制备流程图。
图2A是本发明实施例1中豌豆分离蛋白、豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物和不同铁离子浓度下豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物的粒径、PDI值对比图。
图2B是本发明实施例1中豌豆分离蛋白、豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物和不同铁离子浓度下豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物的Zeta-电位变化图。
图3是本发明实施例1中豌豆分离蛋白、豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物和不同铁离子浓度下豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物的乳化活性指数(EAI)和乳化稳定性指数(ESI)检测结果示意图。
图4为本发明实施例1中豌豆分离蛋白、豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物和不同铁离子浓度下豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物的抗氧化性检测结果示意图。
图5为本发明实施例1中豌豆分离蛋白、豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物和不同铁离子浓度下豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物的抑菌活性检测结果示意图。
图6A为本发明实施例1中豌豆分离蛋白、豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物和豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物(豌豆分离蛋白∶表没食子儿茶素没食子酸酯∶铁离子＝10∶1∶2(w/w))在酸性和中性条件下稳定的高内相乳液(P-E，PE-E，PEFe-E)的平均液滴尺寸对比图。
图6B为本发明实施例1中豌豆分离蛋白、豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物和豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物(豌豆分离蛋白∶表没食子儿茶素没食子酸酯∶铁离子＝10∶1∶2(w/w))在酸性和中性条件下稳定的高内相乳液(P-E，PE-E，PEFe-E)的尺寸分布变化图。
图7为本发明实施例1中负载β-胡萝卜素的MCT油和豌豆分离蛋白、豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物和豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物(豌豆分离蛋白∶表没食子儿茶素没食子酸酯∶铁离子＝10∶1∶2(w/w))在酸性和中性条件下稳定的乳液(MCT-βc，P-E-βc，PE-E-βc，PEFe-E-βc)的热稳定性检测结果示意图。
图8为本发明实施例1中负载β-胡萝卜素的MCT油和豌豆分离蛋白、豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物和豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物(豌豆分离蛋白∶表没食子儿茶素没食子酸酯∶铁离子＝10∶1∶2(w/w))在酸性和中性条件下稳定的乳液(MCT-βc，P-E-βc，PE-E-βc，PEFe-E-βc)的光照稳定性检测结果示意图。
具体实施方式
通过应连同所附图式一起阅读的以下具体实施方式将更完整地理解本发明。本文中揭示本发明的详细实施例；然而，应理解，所揭示的实施例仅具本发明的示范性，本发明可以各种形式来体现。因此，本文中所揭示的特定功能细节不应解释为具有限制性，而是仅解释为权利要求书的基础且解释为用于教示所属领域的技术人员在事实上任何适当详细实施例中以不同方式采用本发明的代表性基础。
本发明提供一种豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物的制备方法：通过pH碱性偏移结合加热处理得到豌豆分离蛋白分散液，将豌豆分离蛋白分散液与表没食子儿茶素没食子酸酯溶液混合，得到豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物，在豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物中加入六水合三氯化铁溶液混合后得到豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物。
以下实施例中所使用的豌豆分离蛋白购买于西安泽隆生物技术有限公司，且蛋白含量≥90％；表没食子儿茶素没食子酸酯购买于北京北实纵横科技发展有限公司，且纯度≥98％；六水合氯化铁试剂购买于天津市科密欧化学试剂有限公司，等级为分析纯(AR)；中链甘油三酯(MCT)购买于北京E-show生物科技有限公司。
实施例1
参阅图1，为实施例1中豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物的制备流程图。制备方法包括将豌豆蛋白分散到水中搅拌30min，后调节pH为12.0，再静置30min，水浴加热至85℃保持30min，冷却至室温调节pH为7.0，将豌豆分离蛋白溶液与表没食子儿茶素没食子酸酯溶液等体积混合，其中PPI和EGCG质量比为10∶1，在黑暗中25℃搅拌2h，得到PPI-EGCG复合物，在其中加入一定量的六水合氯化铁，使表没食子儿茶素没食子酸酯和铁离子分别以2∶1、1∶1、1∶2、1∶4的质量比在室温下混合，剧烈涡旋10s，即得到豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物。
本实施例提供一种豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物的制备方法，具体地，制备步骤包括：
(1)豌豆分离蛋白分散液的制备
精确称量1.0g豌豆分离蛋白，分散到100mL去离子水中，室温下搅拌30min，然后使用0.5M氢氧化钠溶液将蛋白分散体系的pH提高到12.0，放置30min，进行碱性处理。将碱性处理后的豌豆分离蛋白分散体系水浴加热至85℃，保持30min，然后冷却至室温，并采用0.5M盐酸调节其pH至7.0，制得PPI分散液，其中，豌豆分离蛋白的浓度为1.0wt％，之后将PPI分散液于0-4℃保存备用。
(2)豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物的制备
将步骤(1)中制备好的豌豆分离蛋白溶液与等体积表没食子儿茶素没食子酸酯溶液(浓度为0.1w/v％)充分混合，在黑暗中25℃搅拌2h，制得豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物，豌豆分离蛋白和表没食子儿茶素没食子酸酯质量比为10∶1。
(3)豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物的制备
在步骤(2)中制备的豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物加入一定量的六水合氯化铁溶液，使表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和Fe3+以2∶1、1∶1、1∶2、1∶4的质量比混合，其中，六水合三氯化铁溶液浓度为0.05-0.4wt％，在室温下剧烈涡旋10s，得到系列浓度豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物。
表没食子儿茶素没食子酸酯中有丰富的酚羟基，通过静电相互作用、氢键、疏水相互作用等与豌豆分离蛋白结合形成可溶性的豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物，提高其稳定性，提供抗氧化活性。另一方面，表没食子儿茶素没食子酸酯的结合可以修饰豌豆分离蛋白的结构，对豌豆分离蛋白的物理化学和功能性质产生影响，如提高溶解度、稳定性和消化率等，减轻了豌豆蛋白低溶解性对起泡性、乳化性等功能的限制。
表没食子儿茶素没食子酸酯具备与金属离子螯合的能力，表没食子儿茶素没食子酸酯中含有多个酚羟基，分子内有大的π键共轭体系和强配位的氧原子，这样的空间构型使其具有较强的络合金属离子的能力，是金属离子的良好配体，表没食子儿茶素没食子酸酯与铁离子相遇时，表没食子儿茶素没食子酸酯作为多基配体在其邻位酚羟基上形成以铁离子为中心的稳定的表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子络合物。这种络合物大大增强了茶多酚的抗氧化及抑菌活性。
用上述制得的豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物来制备稳定的O/W型高内相乳液，具体步骤包括：
豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物分散液为水相，中链甘油三酯(MCT)油为油相。水相中豌豆分离蛋白的浓度为2wt％；油相的体积分数为75％。在高速乳化均质机的搅拌下缓慢将油相添加到水相中，10000转/分钟剪切3分钟，得到稳定的O/W型高内相乳液，之后于0-4℃下储存。
负载β-胡萝卜素的豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物稳定的O/W型高内相乳液，具体地，制备步骤包括：
上述步骤(3)中制得的豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物分散液为水相，水相中豌豆分离蛋白的浓度为2wt％；将β-胡萝卜素溶解于中链甘油三酯(MCT)油中，β-胡萝卜素用量为1mg/mL，得到油相，油相的体积分数为75％。在高速乳化均质机的搅拌下缓慢将油相添加到水相中，10000转/分钟剪切3分钟，得到负载β-胡萝卜素的豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物稳定的O/W型高内相乳液，之后于0-4℃下储存。
性质表征
粒径、PDI值和Zeta-电位
检测方法：采用马尔文粒度仪测量样品的平均粒径、多分散指数(PDI)和Zeta-电位。所有测量均在25℃下进行，相同条件下将每个样品重复测量三次。图2A和图2B分别是实施例1中步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中豌豆分离蛋白(PPI)、豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物(PPI-EGCG)和不同铁离子浓度下豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子(PPI-EGCG-Fe3+)三元复合物的粒径、PDI值对比图和Zeta-电位变化图。
从图2A可以看出，单纯的PPI蛋白颗粒直径在133nm左右，加入EGCG后，蛋白粒径微微增加，但无显著变化。加入少量Fe3+后，三元复合物的粒径明显增大，在EGCG∶Fe3+＝1∶1(w/w)时，三元复合物的粒径增大到440nm左右。再随着Fe3+的增加，复合物粒径逐渐减小，但体系分散更为均匀。
从图2B可以看出，单独的PPI蛋白颗粒电位绝对值为9.29mV，PPI-EGCG的电位绝对值为10.1mV，相对稳定性较差。而引入少量的Fe3+后，体系负电性增强。随着Fe3+浓度增加，体系的电位转变为正，在EGCG∶Fe3+＝1∶1(w/w)时电位绝对值稳定在19.1mV左右。同时，随着Fe3+进一步增加，体系电位达到了一个绝对值相对较高(30mV左右)且趋于稳定的正电位(EGCG∶Fe3+＝1∶2和1∶4(w/w))，结果表明在此条件下PPI-EGCG-Fe3+三元复合物的蛋白、多酚和铁离子相互作用接近饱和且体系趋于相对稳定的状态。
乳化性
通过测定样品的乳化活性指数(EAI)和乳化稳定性指数(ESI)评估乳化性，检测方法如下：
将5mL玉米油添加到15mL样品溶液中，并用高速均质机在20000rpm均质1min。分别在第0min和10min时从容器底部吸取100μL乳液，并用10mL 0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)溶液稀释，涡旋混合。使用分光光度计测定在500nm处吸光度(0.1％的SDS溶液作为空白)。按式(3)、(4)计算乳化活性指数(EAI)和乳化稳定性指数(ESI)：
EAI(g/mL)＝(2×2.303×A0)/C×104×(1-Φ) (3)
ESI(％)＝A10/A0×100％ (4)
式中：A0和A10分别是0min和10min的吸光度；C是蛋白质的浓度(g/mL)；Φ是油相的比例。
将实施例1步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中豌豆分离蛋白(PPI)、豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物(PPI-EGCG)和不同铁离子浓度下豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子(PPI-EGCG-Fe3+)三元复合物进行乳化活性指数(EAI)和乳化稳定性指数(ESI)检测，检测结果请参阅图3。从图3可以看出，较高Fe3+浓度下的豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物较之原豌豆分离蛋白和豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物，乳化稳定性有显著性的提高，在EGCG∶Fe3+＝1∶2(w/w)时其乳化性和乳化稳定性最优。
抗氧化性
检测方法：使用DPPH自由基清除法评估豌豆分离蛋白(PPI)、豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物(PPI-EGCG)和不同铁离子浓度下豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子(PPI-EGCG-Fe3+)的抗氧化能力。将1mL各样品和2mL 0.1mM的DPPH溶液(乙醇溶解)加入离心管，涡旋振荡，充分混合，室温避光孵育30min，在517nm处测吸光度值，分别做空白组、对照组、试验组，如表1所示。
表1 DPPH自由基清除率方法及各试剂加入量对照表
分组 样品溶液 乙醇 DPPH溶液 吸光度
试验组 1mL - 2mL A1
对照组 1mL 2mL - A2
空白组 - 1mL 2mL A0
根据式(5)计算DPPH自由基清除率(DPPHscav，％)：
DPPHscav＝1-(A1-A2)/A0×100％ (5)
将实施例1步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中豌豆分离蛋白(PPI)、豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物(PPI-EGCG)和不同铁离子浓度下豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子(PPI-EGCG-Fe3+)进行抗氧化性检测。
抗氧化性检测结果请参阅图4，单纯的豌豆分离蛋白DPPH自由基清除率为25.69％左右，豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物的DPPH自由基清除率为67.87％，而豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物的DPPH自由基均达到了90％以上，说明与原豌豆分离蛋白和豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物相比，豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物的抗氧化性得到显著增强。这是由于三元复合物稳定网络结构的形成大大提高了表没食子儿茶素没食子酸酯的利用率和稳定性。表没食子儿茶素没食子酸酯含有大量的酚羟基，其中一个与Fe3+络合，其余的酚羟基也可以有效且稳定地发挥其抗氧化能力。同时，多酚和Fe3+的添加诱导蛋白结构展开也使得其暴露出更多的羟基。以上结果说明，不同铁离子浓度条件下的豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物都展现出优异的抗氧化性。
抑菌活性
检测方法：从-80℃冰箱取出冻存的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，在营养琼脂平板上划线，放于37℃下培养24h。挑取单菌落于30mL营养肉汤中摇床培养过夜(100rpm，37℃)。收集过夜培养物于50mL离心管中，用无菌磷酸盐缓冲液清洗菌体两次(8000×g，5min，4℃)，并用营养肉汤重新悬浮菌体，调节菌悬液在600nm处的OD值至0.6左右，备用。分别对PPI分散液、PPI-EGCG复合物和PPI-EGCG-Fe3+复合物进行稀释，得到体系中PPI终浓度均为5mg/mL。然后在48孔板各孔中分别加入1μL菌悬液和99μL营养肉汤，随后加入100μL稀释好的PPI分散液、PPI-EGCG复合物和PPI-EGCG-Fe3+复合物分散液，测定各孔吸光度值。未加样品的菌悬液加入等体积蒸馏水作为初始组，添加PPI和PPI-EGCG复合物分散液的为对照组，添加PPI-EGCG-Fe3+复合物分散液的为试验组。然后将板放于37℃下培养24h，再次测定培养后各孔的吸光度值，计算培养前后吸光度的差值，根据吸光度的变化得出样品的抑菌活性。
将实施例1步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中豌豆分离蛋白(PPI)、豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物(PPI-EGCG)和不同铁离子浓度下豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子(PPI-EGCG-Fe3+)三元复合物进行抑菌活性检测。
抑菌活性检测结果参考图5所示，对比原蛋白，不同Fe3+浓度下豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子复合物培养的大肠杆菌和金葡球菌前后吸光度差值显著降低，且随着Fe3+浓度增加，吸光度差值也逐渐减小，复合物的抑菌能力增强。对于金黄色葡萄球菌，在EGCG∶Fe3+＝1∶2(w/w)和EGCG∶Fe3+＝1∶4(w/w)时，吸光度差值降到了0.549。对于大肠杆菌，在EGCG∶Fe3+＝1∶2(w/w)和EGCG∶Fe3+＝1∶4(w/w)时，吸光度差值分别降到了0.27和0.12。
上述结果说明，豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物可以有效抑制微生物的生长，对两种典型的食源性致病菌都展现出了优异的抗菌活性，在EGCG∶Fe3+＝1∶2(w/w)和EGCG∶Fe3+＝1∶4(w/w)条件时，豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物的抑菌活性达到最佳。
平均液滴尺寸和尺寸分布
检测方法：调整实施例1步骤(1)、(2)、(3)中豌豆分离蛋白、豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物和豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物到pH＝2.0和pH＝7.0。以实施例1中的方法制备豌豆分离蛋白、豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物和豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物稳定的高内相乳液(即图6A中P-E，PE-E，PEFe-E)。使用贝克曼激光衍射粒度分析仪在室温下测定上述各乳液在pH＝2.0和pH＝7.0下的平均液滴尺寸和尺寸分布变化。每个样品的测定至少重复三次。
不同pH下高内相乳液的平均液滴尺寸和尺寸分布变化分别如6A、B所示。从图6A中可以看出，豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物稳定的乳液的液滴最小。由于在pH 2条件下，豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物具有比原蛋白和二元复合物更大的粒径，且颗粒间较大的空间位阻使其不能很紧密的吸附在油滴表面，造成其稳定的乳液液滴增大，达到41.20μm左右。而在中性条件下，三元复合物稳定的乳液液滴尺寸减小至34.73μm左右。
从图6B中可以看出，各乳液液滴尺寸分布均为单峰，说明制备的乳液较均匀，体系中几乎无过大或过小的液滴出现。
热稳定性
检测方法：调整实施例1步骤(1)、(2)、(3)中豌豆分离蛋白、豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物和豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物到pH＝2.0和pH＝7.0。以实施例1中的方法制备负载β-胡萝卜素的豌豆分离蛋白、豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物和豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物稳定的高内相乳液(即图7中P-E-βc、PE-E-βc、PEFe-E-βc)。取一定量各负载β-胡萝卜素的乳液于血清瓶中，在85℃下加热30min，冷却至室温后测定β-胡萝卜素含量。β-胡萝卜素含量测定方法如下：在样品中加入混合提取剂(乙醇∶正己烷，2∶3，v/v)，涡旋振荡，过夜充分萃取β-胡萝卜素，12000rpm离心10min后收集有机相，适当稀释后在450nm用紫外可见分光光度计测定吸光度。根据吸光度随浓度变化的标准曲线确定光照后各样品中β-胡萝卜素的残留量(C/C0×100％，C为各光照时间后的β-胡萝卜素浓度，C0为初始浓度)。通过β-胡萝卜素含量变化来评估高内相乳液的热稳定性。
热处理后β-胡萝卜素在MCT油及各高内相乳液中的保留率检测结果请参考图7所示。从图7可以看出，MCT油中游离的β-胡萝卜素在85℃加热30min后保留率约为50％，在pH7.0条件下各乳化剂制备的乳液中的β-胡萝卜素的保留率都达到了85％以上，而pH 7.0的PEFe-E中的β-胡萝卜素保留率更是高达94％，说明了高内相乳液体系在加热条件下对β-胡萝卜素具有一定的保护作用。其中，豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物稳定的乳液保护效果最佳。这是因为蛋白质及其复合颗粒包裹在紧密靠近的液滴形成连续的界面层为其中的功能因子提供保护屏障，阻隔了热的直接传递，避免了β-胡萝卜素在加热中的过度降解。但pH为2.0的各乳化剂制备的高内相乳液对β-胡萝卜素的保护作用弱于pH 7.0条件下制备。结果表明，在加热条件下，pH＝7.0时豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物稳定的高内相乳液对β-胡萝卜素的保护作用最强。
光照稳定性
检测方法：调整实施例1步骤(1)、(2)、(3)中豌豆分离蛋白、豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物和豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物到pH＝2.0和pH＝7.0。以实施例1中方法制备负载β-胡萝卜素的豌豆分离蛋白、豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物和豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物稳定的高内相乳液(即图8中P-E-βc，PE-E-βc，PEFe-E-βc)。β-胡萝卜素在不同体系中的(MCT油，P-E，PE-E，PEFe-E)的光照稳定性采用氙灯老化试验箱测定。分装若干2mL的各样品置于老化箱中(光照强度0.35W/m2、温度为25℃)，分别在0、20、40、60、90、120、150min下收集样品进行β-胡萝卜素含量测定，具体测定方法同热稳定性检测。
MCT油中游离的β-胡萝卜素和各乳液中的β-胡萝卜素在光照下保留情况检测结果请参考图8所示。从图8可以看出，光照处理后，各体系中的β-胡萝卜素的保留率都发生降低，其中MCT油中的β-胡萝卜素在前20min迅速降解到了50％以下，在光照150min后仅剩余8.37％。而在酸性条件和中性条件下，相比于其他乳化剂，PEFe-E中的β-胡萝卜素的保留率在各个光照时间处理下均最高。在pH＝2.0和pH＝7.0时，光照处理150min后PEFe-E-βc中的β-胡萝卜素的保留率仍分别保持在55.38％和66.72％，显著优于P-E-βc，PE-E-βc。这是由于液滴周围的豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子纳米网络层穿插在油滴周围，形成更为紧密的连接结构，为β-胡萝卜素提供了有效屏障，延缓其光降解。但酸性条件下乳液对β-胡萝卜素的保护作用弱于中性条件。结果表明，在光照条件下，pH＝7.0时豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物稳定的高内相乳液对β-胡萝卜素的保护作用最强。
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于步骤(1)中使用0.5M氢氧化钠溶液将蛋白分散体系的pH提高到11.5，放置30min，进行碱性处理。将碱性处理后的豌豆分离蛋白分散体系水浴加热至80℃，保持30min，然后冷却至室温，并采用0.5M盐酸调节其pH至6.5，制得PPI分散液，之后将PPI分散液于0-4℃保存备用。
其余条件与实施例1保持一致，制得豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物。
实施例3
实施例3与实施例1的区别在于步骤(1)中使用0.5M氢氧化钠溶液将蛋白分散体系的pH提高到12.5，放置30min，进行碱性处理。将碱性处理后的豌豆分离蛋白分散体系水浴加热至90℃，保持35min，然后冷却至室温，并采用0.5M盐酸调节其pH至7.5，制得PPI分散液，之后将PPI分散液于0-4℃保存备用。
其余条件与实施例1保持一致，制得豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物。
实施例4
实施例4与实施例1的区别在于实施例4中，PPI分散液中，豌豆分离蛋白的浓度为2w/v％，等体积混合的表没食子儿茶素没食子酸酯溶液的浓度为0.083w/v％。
其余条件与实施例1保持一致，制得豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物。
实施例5
实施例5与实施例1的区别在于实施例5中，PPI分散液中，豌豆分离蛋白的浓度为1.5w/v％，等体积混合的表没食子儿茶素没食子酸酯溶液的浓度为0.125w/v％。
其余条件与实施例1保持一致，制得豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物。
实施例6
实施例与实施例1的区别在于将步骤(3)中制得的豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物分散液为水相，加水稀释至其中豌豆分离蛋白的浓度为1wt％，将β-胡萝卜素溶解于中链甘油三酯(MCT)油中，β-胡萝卜素用量为2mg/mL，得到油相，油相的体积分数为80％。在高速乳化均质机的搅拌下缓慢将油相添加到水相中，10000转/分钟剪切3分钟，也可以得到负载β-胡萝卜素的豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物稳定的O/W型高内相乳液，之后于0-4℃下储存。
对比例1
对比例1与实施例1的区别在于对比例1中不对豌豆蛋白进行pH碱性偏移处理，直接将豌豆蛋白分散到水中。
结果表明，豌豆蛋白分散性很差，不使用pH碱性偏移结合加热处理无法使其溶解。
对比例2
对比例2与实施例1的区别在于对比例2中将豌豆分离蛋白溶液与表没食子儿茶素没食子酸酯溶液等体积混合，在有光照的情况下搅拌，其余条件与实施例保持一致。
结果表明，表没食子儿茶素没食子酸酯在光照情况下会分解，三元复合物的性质不如实施例1-6。
综上所述，本发明提供了一种豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物的制备方法，包括通过pH碱性偏移结合加热处理得到豌豆分离蛋白分散液，将豌豆分离蛋白分散液与表没食子儿茶素没食子酸酯溶液混合，得到豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物，在豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物中加入六水合三氯化铁溶液混合，通过表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对铁离子的螯合作用以及豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯非共价结合作用，使得表没食子儿茶素没食子酸酯同时结合了豌豆分离蛋白和铁离子，得到豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物。
表没食子儿茶素没食子酸酯具有丰富的酚羟基，可通过氢键、范德华力、静电相互作用和疏水相互作用等非共价键与豌豆蛋白结合形成可溶性的豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物，且酚类化合物的结合可以修饰蛋白质的结构，从而可以减轻溶解性低对豌豆蛋白加工的影响，提高其稳定性，同时也可以增强蛋白的抗氧化活性。
茶多酚分子结构中含有多个酚羟基，分子内存在π键共轭体系和强配位氧原子，这种空间构型赋予了其较强的络合金属离子的能力，是金属离子的良好配体；且金属离子的吸电子作用可促进酚羟基上的H游离。当茶多酚与金属离子相遇时，茶多酚作为多基配体在其邻位酚羟基上形成以金属离子为中心的稳定的茶多酚金属络合物。茶多酚形成金属络合物后其生物活性(抗氧化性、抑菌活性)会大大增强。
因为三元复合物中纳米复合网络的空间位阻较大，增强了液滴间排斥力，复合物体系更加稳定。同时，蛋白结构有一定程度的展开，在界面处的分子柔韧性得到改善，这有利于其在油水界面的吸附和稳定，从而提高乳化活性。
通过pH偏移结合加热处理可以显著改善豌豆分离蛋白溶液的溶解度；通过蛋白质和表没食子儿茶素没食子酸酯的非共价结合作用可以提高蛋白质的功能特性，并赋予蛋白质强抗氧化活性；通过表没食子儿茶素没食子酸酯和铁离子的结合可以进一步提高蛋白质的抗氧化性及抑菌性能，使得产品具有良好的乳化性、抗氧化性和抑菌活性，显著改善豌豆分离蛋白溶液的溶解度，本发明以豌豆蛋白、表没食子儿茶素没食子酸酯、含有铁元素的六水合氯化铁溶液为原料，来源广泛，有利于提高豌豆资源的利用率，这些原料都是人体可食用而且对人体有益，因此制备的豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物可用作食品添加剂，本发明制备的豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物稳定的高内相乳液具有显著提高的抗环境应力(pH、温度、光照)稳定性，为新型食品功能因子递送载体的制备提供了新的方法，可以提高疏水性生物活性物质吸收效率。此外本发明制备方法新颖，制备过程简单，易于实现工业化生产，在生物活性物质的包埋、营养物质的递送、药物的控释等领域具有广泛用途。
本发明还提供了一种负载β-胡萝卜素的豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物稳定的O/W型高内相乳液，这种负载β-胡萝卜素的O/W型高内相乳液具有良好的稳定性。
本发明的各方面、实施例、特征及实例应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下，所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。

Claims (10)

1.一种豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物的制备方法，其特征在于，包括将豌豆分离蛋白分散液与表没食子儿茶素没食子酸酯溶液混合通过非共价结合作用得到豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物，在所述豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物中加入六水合三氯化铁，使得铁离子通过螯合作用与所述豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物形成豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物。
2.根据权利要求1所述的豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物的制备方法，其特征在于：通过pH碱性偏移结合加热处理得到豌豆分离蛋白分散液，将所述豌豆分离蛋白分散液与表没食子儿茶素没食子酸酯溶液等体积混合，在黑暗条件下搅拌，通过非共价结合作用得到豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物，在所述豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物中加入六水合三氯化铁溶液混合，使得铁离子通过螯合作用与所述豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物形成豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物。
3.根据权利要求2所述的豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物的制备方法，其特征在于：将豌豆分离蛋白分散到水中，搅拌，加入碱性物质使得分散系的pH为11.5～12.5，再水浴加热至80-90℃保持30-35min后冷却，加入酸性物质调节pH为6.5～7.5得到所述豌豆分离蛋白分散液并且将其在0～4℃下保存。
4.根据权利要求3所述的豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物的制备方法，其特征在于：所述豌豆蛋白分散液中豌豆分离蛋白的浓度为1w/v％-2w/v％；
和/或，所述碱性物质包括氢氧化钠；
和/或，所述酸性物质包括盐酸；
和/或，所述表没食子儿茶素没食子酸酯与铁离子的质量比值在1∶0.5-4。
5.根据权利要求4所述的豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物的制备方法，其特征在于：所述豌豆分离蛋白分散液与所述表没食子儿茶素没食子酸酯溶液等体积混合前所述表没食子儿茶素没食子酸酯溶液的浓度为0.083-0.125w/v％；
所述豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物中加入的六水合三氯化铁溶液中铁离子的浓度为0.05-0.4w/v％。
6.一种豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物，采用如权利要求1-5任一项所述的制备方法制备得到。
7.一种豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物高内相乳液，其特征在于：包括如权利要求6所述的豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物作为水相，中链甘油三酯(MCT)油作为油相，将所述油相加入到所述水相中得到高内相乳液；
和/或，所述豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物高内相乳液pH在2-7的时候，所述豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物高内相乳液的粒径在41.20-34.73μm之间。
8.一种负载β-胡萝卜素的豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物高内相乳液，其特征在于：包括如权利要求6所述的豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物作为水相，将β-胡萝卜素溶解于中链甘油三酯(MCT)油中作为油相，将所述油相加入到所述水相中得到负载β-胡萝卜素的豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物高内相乳液。
9.根据权利要求8所述的负载β-胡萝卜素的豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物高内相乳液，其特征在于：所述豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元水相复合物中所述豌豆分离蛋白浓度为1-2wt％；
和/或，所述β-胡萝卜素用量为1-2mg/mL；
和/或，所述油相的体积分数为75-80％。
10.权利要求6所述的豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物在食品添加剂中的应用或如权利要求8所述的负载β-胡萝卜素的豌豆分离蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子三元复合物高内相乳液在生物活性物质的包埋或营养物质的递送或药物的控释领域中的应用。
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