CN114456251B - 一种小分子-铁蛋白包埋物及铁蛋白一步脱铁包埋小分子的方法 - Google Patents

一种小分子-铁蛋白包埋物及铁蛋白一步脱铁包埋小分子的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114456251B
CN114456251B CN202111413990.8A CN202111413990A CN114456251B CN 114456251 B CN114456251 B CN 114456251B CN 202111413990 A CN202111413990 A CN 202111413990A CN 114456251 B CN114456251 B CN 114456251B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ferritin
solution
embedding
small molecule
supernatant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111413990.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114456251A (zh
Inventor
李景明
姚启蒙
臧佳辰
赵广华
范卓妍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Agricultural University
Original Assignee
China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Agricultural University filed Critical China Agricultural University
Priority to CN202111413990.8A priority Critical patent/CN114456251B/zh
Publication of CN114456251A publication Critical patent/CN114456251A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114456251B publication Critical patent/CN114456251B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/16—Inorganic salts, minerals or trace elements
    • A23L33/165—Complexes or chelates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23P—SHAPING OR WORKING OF FOODSTUFFS, NOT FULLY COVERED BY A SINGLE OTHER SUBCLASS
    • A23P10/00—Shaping or working of foodstuffs characterised by the products
    • A23P10/30—Encapsulation of particles, e.g. foodstuff additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明属于铁蛋白包埋小分子技术领域，具体涉及一种小分子‑铁蛋白包埋物及铁蛋白一步脱铁包埋小分子的方法。本发明提供了一种铁蛋白一步脱铁包埋小分子的方法，将小分子溶液滴加到pH为2.0～3.0的铁蛋白溶液中，得到小分子铁蛋白混合溶液；离心所述小分子铁蛋白混合溶液，得上清液；所述上清液经静置和脱盐，得到小分子‑铁蛋白包埋物溶液；所述静置的pH为6.0～8.0。本发明通过调节pH以及离心来脱铁，同时加入小分子，使包埋可以在一步操作内完成，与通过连二亚硫酸钠还原、联吡啶螯合以及长时间的透析而将天然铁蛋白中的铁核去除的传统方法相比，极大地缩短了时间，减少能耗，提高效率，适于产业化开发。

Description

一种小分子-铁蛋白包埋物及铁蛋白一步脱铁包埋小分子的 方法
技术领域
本发明属于铁蛋白包埋小分子技术领域，具体涉及一种小分子-铁蛋白包埋物及铁蛋白一步脱铁包埋小分子的方法。
背景技术
铁储藏蛋白，也称为铁蛋白，是一种天然的笼形蛋白，广泛存在于自然界的动物、植物及微生物中。其结构高度保守，由24个亚基排列组成，外径12nm，内径8nm。铁蛋白的每个亚基由4个较长的α螺旋(A螺旋、B螺旋、C螺旋、D螺旋)和一个较短的α螺旋(E螺旋)组成，B和C螺旋之间由一段loop结构连接。每个铁蛋白都由八个三重轴和六个四重轴连通铁蛋白的内、外部。铁蛋白在生物体内主要具有三种功能。一是储藏铁：每个铁储藏蛋白分子的内部空腔可以容纳4500个铁，远高于其它铁结合蛋白。二是具有调节铁代谢平衡的功能：当机体二价铁离子浓度过高时，铁储藏蛋白可以将其氧化成三价铁储存于内部空腔中；当机体缺铁时，铁储藏蛋白在还原剂的帮助下，将三价铁还原为二价铁释放出来，以供其它代谢利用。第三，二价铁可以诱导羟基自由基的产生，对细胞产生氧化性损伤，因而具有毒性。而铁蛋白通过铁氧化沉淀过程能够抑制Fenton反应的发生，从而减少自由基的产生，进而保护细胞。因此，铁蛋白是一种天然、安全，且极具开发潜力的新型补铁功能因子。其中，马脾铁蛋白是典型的动物来源铁蛋白，产量大、产率高，且具有比植物铁蛋白更好的稳定性和水溶性。
同时，铁储藏蛋白可以作为纳米载体运用到营养领域。铁储藏蛋白内部空腔含铁时称为全铁蛋白holoferritin，当去除铁核后称为脱铁铁蛋白apoferritin。天然提取制备的铁蛋白都是holoferritin，需要通过去除铁核处理才能用于活性小分子的包埋。目前常被报道的方法是通过连二亚硫酸钠还原、联吡啶螯合、以及长时间的透析将天然铁蛋白中的铁核去除，耗时较长。因此，建立一种更为高效的脱铁及包埋方法是有待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种小分子-铁蛋白包埋物及铁蛋白一步脱铁包埋小分子的方法，本发明提供的方法可以极大地缩短包埋时间，减少能耗和提高包埋效率。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种铁蛋白一步脱铁包埋小分子的方法，包括：将小分子溶液滴加到pH为2.0～3.0的铁蛋白溶液中，得到小分子铁蛋白混合溶液；离心所述小分子铁蛋白混合溶液，得上清液；所述上清液经静置和脱盐，得到小分子-铁蛋白包埋物溶液；所述静置的pH为6.0～8.0。
优选的，在将所述小分子溶液滴加到pH为2.0～3.0的铁蛋白溶液中后，还包括搅拌；所述搅拌的时间为20～30min。
优选的，所述静置的时间为0.5～2h。
优选的，所述铁蛋白包括动物铁蛋白或植物铁蛋白。
优选的，所述动物铁蛋白包括马脾铁蛋白；所述植物铁蛋白包括大豆铁蛋白、豌豆铁蛋白或红小豆铁蛋白。
优选的，所述铁蛋白与所述小分子的摩尔比为1:10～2000。
优选的，所述小分子溶液的浓度为0.25～3.0mmol/L，所述铁蛋白的浓度为0.5～20μmol/L。
优选的，所述小分子溶液滴加的速率为每1～10s滴加10μL。
优选的，所述小分子包括水溶性小分子或脂溶性小分子。
本发明还提供了上述方法制备得到的小分子-铁蛋白包埋物，所述铁蛋白和小分子的包埋摩尔比为1:10～50。
有益效果：
本发明提供了一种铁蛋白一步脱铁包埋小分子的方法，将小分子溶液滴加到pH为2.0～3.0的铁蛋白溶液中，得到小分子铁蛋白混合溶液；离心所述小分子铁蛋白混合溶液，得上清液；所述上清液经静置和脱盐，得到小分子-铁蛋白包埋物溶液；所述静置的pH为6.0～8.0。
本发明通过调节pH以及离心来脱铁，同时加入小分子，并通过静置反应即可使包埋可以在一步操作内完成，与通过连二亚硫酸钠还原、联吡啶螯合以及长时间的透析而将天然铁蛋白中的铁核去除的传统方法相比，极大地缩短了时间，减少能耗，提高效率，适于产业化开发。
同时，本发明中的铁蛋白主要来源于动物蛋白和植物蛋白，更加的绿色安全；尤其是马脾铁蛋白产量大、产率高，且具有比植物铁蛋白更好的稳定性和水溶性。
其次，与上述传统方法相比，本发明可以避免因还原剂和螯合剂的残留而给后续包埋物应用于食品领域所带来的安全隐患。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1中铁蛋白一步脱铁及包埋小分子的技术路线图；
图2为实施例1～4和对比例1中采用高效液相色谱法测定小分子浓度的标准曲线图；
图3为实施例1～4及对比例1中制备得到的小分子-铁蛋白包埋物的紫外吸收光谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种铁蛋白一步脱铁包埋小分子的方法，包括：将小分子溶液滴加到pH为2.0～3.0的铁蛋白溶液中，得到小分子铁蛋白混合溶液；离心所述小分子铁蛋白混合溶液，得上清液；所述上清液经静置和脱盐，得到小分子-铁蛋白包埋物溶液；所述静置的pH为6.0～8.0。
本发明将小分子溶液滴加到pH为2.0～3.0的铁蛋白溶液中，得到小分子铁蛋白混合溶液。
在本发明中，所述铁蛋白溶液的pH为2.0～3.0，优选为2.0～2.5，更优选为2.0。在本发明中，调节所述铁蛋白溶液pH的酸优选包括盐酸或乙酸。本发明将所述铁蛋白置于pH为2.0～3.0的环境中的作用是解离所述铁蛋白，将所述铁蛋白从笼形闭合结构解离为亚基。本发明在调节所述铁蛋白溶液pH过程中，还优选包括搅拌。本发明对所述搅拌的操作没有特殊限定，采用本领域常规搅拌蛋白溶液的方式即可，如缓慢搅拌。在本发明中，所述缓慢搅拌可以避免因极速搅拌所发生的起泡现象导致的蛋白质变性，进而保证了小分子包埋效果。
在本发明中，所述铁蛋白的浓度优选为0.5～20μmol/L，更优选为1～15μmol/L，进一步优选为1～10μmol/L，更进一步优选为2～5μmol/L，最优选为2μmol/L。在本发明中，所述铁蛋白优选包括动物铁蛋白或植物铁蛋白，更优选包括动物铁蛋白；所述动物铁蛋白优选包括马脾铁蛋白；所述植物铁蛋白优选包括豆科植物铁蛋白，更优选包括大豆铁蛋白、豌豆铁蛋白或红小豆铁蛋白，进一步优选为大豆铁蛋白。在本发明中，所述蛋白溶液的溶剂优选为磷酸缓冲液(PBS)。本发明可以选择所述动物铁蛋白或植物铁蛋白的市售商品，也可以自行制备。
当采用自行制备的方式提供相应铁蛋白时，方法如下：
在本发明中，当所述铁蛋白为马脾铁蛋白时，所述马脾铁蛋白的制备方法优选包括将清除杂质的马脾经榨汁、均质后沉淀蛋白，再通过离心、溶解、透析和纯化后得到所述马脾铁蛋白。
本发明优选将清除杂质的马脾榨汁，得到马脾溶液。在本发明中，所述清除杂质的方式优选包括将马脾表面肉眼可见的白色脂肪组织和结缔组织清除。所述榨汁前，本发明优选还包括将所述清除杂质的马脾进行剪碎，得到细化的除杂马脾，所得碎块的体积优选为2～3cm3。本发明优选将所述除杂马脾与水混合后加入到榨汁机中榨汁，直至没有明显的肉块。在本发明中，所述水优选为去离子水；所述清除杂质的马脾的水用量优选没过所述除杂马脾。本发明还优选包括采用纱布对榨汁所得液体进行过滤，得到所述马脾溶液；本发明对所述纱布的材质和规格没有特殊限定，采用本领域常规过滤用纱布即可。在本发明中，所述过滤可以过滤掉所述马脾溶液中的白色结缔组织。
得到所述马脾溶液后，本发明优选将所述马脾溶液均质后沉淀蛋白，得到马脾沉淀蛋白溶液。在本发明中，所述均质的压力优选为20～50MP，更优选为50MP；所述均质的温度优选为20～25℃，更优选为20℃；所述均质的时间优选为每200mL均质3～5min，更优选为4min。本发明对所述均质使用的均质机的来源和型号没有特殊限定，采用本领域常规均质机即可。本发明在所述均质后优选还包括离心，所述离心的转速优选为8000～10000r，更优选为10000r；所述离心的时间优选为5～10min，更优选为5min。本发明优选对所述离心得到的上清液沉淀蛋白，得到所述马脾沉淀蛋白溶液。在本发明中，所述沉淀蛋白的方式优选包括在所述离心得到的上清液中加入硫酸铵粉末，并同时进行搅拌；所述硫酸铵粉末与所述离心得到的上清液的质量体积比优选为36.1g:100mL。本发明对将所述硫酸铵粉末加入到所述离心得到的上清液中的操作过程和所述搅拌的操作均没有特殊限定，采用本领域常规操作即可。
得到所述马脾沉淀蛋白溶液后，本发明优选对所述马脾沉淀蛋白溶液进行离心，得到红褐色马脾沉淀蛋白。在本发明中，所述离心的转速优选为8000～10000r/min，更优选为10000r/min；所述离心的时间优选为5～10min，更优选为5min。
得到所述红褐色马脾蛋白后，本发明优选对所述红褐色马脾沉淀蛋白进行溶解，得到溶解后马脾蛋白溶液。在本发明中，所述溶解用溶液优选为PBS缓冲液；本发明对所述PBS缓冲液的体积没有特殊限定，采用本领域常规PBS缓冲液用量即可。
得到所述溶解后马脾蛋白溶液后，本发明优选将所述溶解后马脾蛋白溶液经PBS缓冲液透析后，得到红褐色铁蛋白溶液。在本发明中，所述透析用透析袋的截留分子量优选为50～100kD。所述透析的次数优选为2～3次，更优选为3次。本发明通过所述透析去除溶解后马脾蛋白溶液中的盐类。本发明对所述透析的具体操作没有特殊限定，采用本领域常规透析操作即可。
得到所述红褐色铁蛋白溶液后，本发明优选采用DEAE阴离子柱(DEAE Sepharosefast flow)和凝胶柱纯化，得到马脾铁蛋白。在本明中，所述纯化步骤如无特殊限定，均在4℃以下操作。
本发明采用DEAE阴离子柱纯化的方式优选包括：采用Tris-HCl平衡DEAESepharose fast flow后，将所述红褐色铁蛋白溶液上柱，Tris-HCl冲洗后，梯度洗脱，收集，超滤浓缩至5mL，溶解得到第一纯化马脾铁蛋白溶液。在本发明中，所述Tris-HCl的浓度优选为50mM；所述Tris-HCl的pH优选为7.5。在本发明中，所述冲洗用Tris-HCl与所述红褐色铁蛋白溶液的体积比优选为4:1。本发明所述冲洗的作用为去除部分杂蛋白。在本发明中，所述洗脱液优选为PBS与NaCl的混合液，所述NaCl的摩尔质量优选为1M；所述洗脱液的流速为0.4mL/min。在本发明中，所述收集优选分管收集，更优选为3mL/管分管收集。本发明优选将具有铁蛋白的收集液进行超滤浓缩。本发明对所述收集液是否含有铁蛋白的验证方式没有特殊限定，采用本领域常规验证方式即可，如通过电泳或紫外收集器验证。在本发明中，所述溶解用溶剂优选为含有NaCl的Tris-HCl；所述NaCl的摩尔质量优选为0.15M；所述Tris-HCl的浓度优选为50mM；所述Tris-HCl的pH优选为7.5。
本发明采用凝胶柱纯化的方式优选包括：采用含有NaCl的Tris-HCl平衡凝胶柱后，将所述第一纯化马脾铁蛋白溶液上柱后洗脱，收集得到所述马脾铁蛋白。在本发明中，所述凝胶柱优选为聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶，更优选为Sephacryl S-300。在本发明中，所述含有NaCl的Tris-HCl的浓度与上述所述溶解用溶剂相同，在此不再赘述。在本发明中，所述洗脱液优选为氯化钠，所述氯化钠的浓度优选为0.1M。在本发明中，所述洗脱流速优选为0.2mL/min。在本发明中，所述收集优选分管收集，更优选为3mL/管分管收集。
在本发明中，当所述铁蛋白为大豆铁蛋白时，所述大豆蛋白的制备方法优选包括将浸泡过夜的大豆经匀浆、加热后沉淀蛋白，再通过离心、溶解、盐析和纯化后，得到所述大豆铁蛋白。
本发明优选将浸泡过夜的大豆匀浆，得到大豆浆液。在本发明中，所述浸泡温度优选为4℃；所述浸泡用水优选为蒸馏水。本发明优选将所述浸泡过夜的大豆与含有1％PVP的Tris-HCl溶液混合后匀浆。在本发明中，所述大豆与所述Tris-HCl溶液的体积比优选为1:2。在本发明中，所述Tris-HCl溶液的浓度优选为50mM；所述Tris-HCl溶液的pH优选为7.5。在本发明中，所述匀浆机优选为内切式匀浆机；所述匀浆时间优选为2min。本发明还优选采用滤网对匀浆所得的液体进行过滤，得到大豆浆液。在本发明中，所述滤网的孔径优选为200目。
得到所述大豆浆液后，本发明优选加热后沉淀蛋白，得到大豆铁蛋白沉淀。在本发明中，所述加热的温度优选为55℃；所述加热时间优选为10min。本发明还优选包括对加热后的大豆浆液进行离心，得大豆上清液。在本发明中，所述离心的转速优选为5000g，所述离心的时间优选为5min。本发明优选将所述大豆上清液与MgCl2晶体混合后静置后，再与柠檬酸三钠晶体混合静置过夜后离心得到大豆铁蛋白沉淀。在本发明中，所述MgCl2晶体的浓度优选为50mM；所述大豆上清液与MgCl2晶体混合后的静置时间优选为30min。在本发明中，所述柠檬酸三钠晶体的浓度优选为70mM。在本发明中，所述离心的转速优选为12000g；所述离心的时间优选为5min。本发明还优选将所述离心得到的上清液保留待用。
得到所述大豆蛋白沉淀后，本发明优选将所述离心得到的上清液与所述大豆铁蛋白沉淀混合后离心后，弃上清，重复2次，得到大豆铁蛋白褐色沉淀。在本发明中，将所述离心得到的上清液与所述大豆铁蛋白沉淀混合可达到冲洗沉淀中沉淀和核糖体的作用。在本发明中，所述离心得到的上清液与所述大豆蛋白沉淀的体积比优选为1.5:1。在本发明中，所述离心的转速为10000g，所述离心的时间为5min。
本发明优选将得到所述大豆铁蛋白褐色沉淀溶解于蒸馏水中，离心后弃上清，重复2次后，得到第一大豆铁蛋白沉淀。在本发明中，所述蒸馏水与所述大豆铁蛋白褐色沉淀的体积比优选为1.5:1。在本发明中，所述离心的转速优选为10000g，所述离心的时间优选为5min。
本发明优选采用蒸馏水溶解所述第一大豆铁蛋白沉淀，离心后，得到大豆铁蛋白溶液。在本发明中，所述蒸馏水优选为所述第一大豆铁蛋白沉淀的5倍。在本发明中，所述离心的转速优选为12000g，所述离心的时间优选为5min。
得到所述大豆铁蛋白溶液后，本发明优选采用DEAE阴离子柱和凝胶柱纯化，得到大豆铁蛋白。
在本发明中，所述大豆铁蛋白溶液的纯化步骤与马脾铁蛋白的纯化步骤相同，在此不再赘述。
本发明采用特定的方式制备相应蛋白，能够节约制备成本。
本发明在将所述小分子溶液滴加到pH为2.0～3.0的铁蛋白溶液中后，优选还包括搅拌。在本发明中，所述搅拌的时间优选为20～30min，更优选为30min；本发明对所述搅拌速率没有特殊限定，采用本领域常规搅拌速率即可。在本发明中，所述搅拌可以使小分子物质与铁蛋白充分接触，提高后续的包埋效果。
在本发明中，所述小分子溶液的浓度优选为0.25～3.0mmol/L，更优选为1～2.5mmol/L，再优选为1.5～2.2mmol/L，进一步优选为2.0mmol/L。本发明可以实现对多种水溶性或脂溶性小分子的快速包埋。在本发明中，所述小分子优选包括水溶性小分子或脂溶性小分子，更优选包括花色苷或虾青素。在本发明中，所述小分子溶液的溶剂优选包括乙酸、二甲基亚砜、乙醇、丙酮或水，更优选的，根据小分子的溶解性选择对应的溶剂。
在本发明中，所述铁蛋白与所述小分子的摩尔比优选为1:10～2000，更优选为1:100～1800，再优选为1:300～1500，还可以优选为1:500～1200，进一步优选为1:1000。在本发明中，所述铁蛋白的浓度主要取决于和小分子间的比例，包埋不同的小分子物质，铁蛋白和小分子之间的比例会不同，所以铁蛋白溶液的浓度会随小分子分子量的增大或小分子正电荷的增加而增大。
在本发明中，所述小分子溶液滴加的速率优选为每1～10s滴加10μL(约1滴)，进一步优选为每5～10s滴加10μL，更优选为每5s滴加10μL。在本发明中，将所述两种溶液直接混合会造成的小分子物质局部浓度过高，进而导致的蛋白聚集或变性，而本发明中将所述小分子溶液滴加到所述铁蛋白溶液中的方式恰好可以避免上述蛋白的聚集或变性。
得到所述小分子铁蛋白混合溶液后，本发明将所述小分子铁蛋白混合溶液离心，得到小分子铁蛋白上清液。在本发明中，所述离心的转速优选为8000～10000r/min，更优选为10000r/min；所述离心的时间优选为5～10min，更优选为5min。在本发明中，所述离心的作用是将所述铁蛋白中的铁核去除。本发明对所述离心用的离心装置没有特殊限定，采用本领域常规离心装置即可。
得到所述小分子铁蛋白上清液后，本发明将所述小分子铁蛋白上清液静置，得到反应后的小分子铁蛋白上清液。在本发明中，所述静置的pH为6.0～8.0，优选为6.5～7.5，进一步优选为7.0。本发明优选在静置前将所述pH调至6.0～8.0，在调节pH的过程中还伴随搅拌，本发明对所述搅拌的具体操作没有特殊限定，采用本领域常规调节蛋白溶液pH的操作即可，如缓慢搅拌。在本发明中，所述静置的时间优选为30～120min，更优选为30～110min，再优选为30～80min，还可以优选为30～50min，进一步优选为30min。在本发明中，所述静置过程中发生铁蛋白的聚合反应，将铁蛋白亚基聚合成笼形结构，恢复其天然的四级结构，进而将小分子物质截留在内部空腔中。
得到所述反应后的小分子铁蛋白上清液，本发明将所述反应后的小分子铁蛋白上清液脱盐得到小分子-铁蛋白包埋物溶液。本发明优选采用脱盐柱进行脱盐；所述脱盐柱优选为G25脱盐柱。
本发明还提供了上述制备方法制备得到的的小分子-铁蛋白包埋物。在本发明中，所述铁蛋白和小分子的包埋摩尔比为1:10～50，优选为1:10～35。在本发明中，所述铁蛋白本身为红褐色，脱铁后颜色变浅，包埋小分子物质后的所述小分子-铁蛋白包埋物呈现小分子物质本身的颜色。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
花色苷-马脾铁蛋白包埋物的制备：
制备浓度为3.0mmol/L的花色苷溶液，将其溶于水溶液中；
分离纯化马脾铁蛋白，制备浓度为20μmol/L的马脾铁蛋白溶液；
将制备的马脾铁蛋白溶液缓慢搅拌，调节pH至2.0，之后将制备的花色苷溶液缓慢滴加到马脾铁蛋白溶液中，滴加的速率为每5s滴加1滴(10μL)，使马脾铁蛋白与花色苷的摩尔比为1:1000；
搅拌20min，离心去除铁核。将上清液pH调至7.0，反应30min，过脱盐柱纯化，获得花色苷-马脾铁蛋白包埋物溶液，制备过程如图1所示。
马脾铁蛋白分离纯化的方法：
先用剪刀简单剃除马脾表面肉眼可见的白色脂肪组织和结缔组织，然后用剪刀将脾脏剪成2-3cm3的碎块。
将碎块放入榨汁机，加入适量去离子水进行榨汁，直到没有明显的肉块。
榨汁后的液体用烧杯收集，用纱布过滤掉白色结缔组织等杂质。
将得到的滤液用均质机进行均质、离心。
用烧杯收集上清液，以每100mL上清液添加36.1g硫酸铵粉末的比例缓慢地向上清液中加入硫酸铵粉末，同时缓慢搅拌，沉淀蛋白质。
离心后弃上清，用PBS缓冲液溶解红褐色沉淀。
将经过溶解沉淀后的溶液移至透析袋中，在PBS缓冲液中透析。并多次更换缓冲液以除去盐类，得到红褐色的铁蛋白溶液。
透析后的粗蛋白溶液进行DEAE阴离子柱和凝胶柱纯化，具体为用50mM Tris-HCl(pH7.5)平衡DEAE Sepharose fast flow(DFF)后，将所得粗蛋白溶液上柱，先用4倍体积的Tris-HCl(pH7.5)冲洗去除部分杂蛋白，再在PBS中加入1MNaCl进梯度洗脱，流速为0.4mL/min，3mL管分管收集，把具有铁蛋白活性的收集液超滤浓缩到5mL并用含0.15M NaCl的Tris-HCl(pH7.5)作为溶剂，以特进一步纯化。
用含0.15M NaCl 50 mM Tris-HCl(pH7.5)先平衡Sephacryl S-300(聚丙烯酰胺葡聚凝胶)，待样品上柱后再洗脱，流速为0.2mL/min，3mL/管分管收集，得到马脾铁蛋白，储于冰箱待用。纯化过程中除特殊指出，其他步骤均在4℃以下低温操作。
在分光光度计上扫描花色苷-马脾铁蛋白包埋物在200～700nm波长下的紫外可见光谱，可以发现在280nm和600nm处有特征吸收峰，说明包埋物中铁蛋白与花色苷同时存在。通过透射电镜对包埋物进行表征，发现铁蛋白空腔已被占据，说明花色苷成功被包埋在铁蛋白内部空腔，结果如图3中A图。
对花色苷-马脾铁蛋白包埋物进行肉眼观察，可见其为深蓝色；
通过BCA蛋白浓度测定方法(博奥森BCA蛋白浓度测定试剂盒)和高效液相色谱法分别测定花色苷-马脾铁蛋白包埋物中马脾铁蛋白质和花色苷的摩尔浓度，其摩尔比例为1:(21.2±0.7)，说明平均每个铁蛋白分子可以包埋21个花色苷。同时，说明本实施例中的方法可以有效用于马脾铁蛋白对水溶性小分子的包埋。
高效液相色谱法测定花色苷的具体步骤如下：花色苷-马脾铁蛋白包埋物样300μL用1MHCl调节pH值至2.0附近，离心(10000g，5min)，过膜(0.22μm有机滤膜)。进样量20μL，样品在519nm下检测，柱温25℃。流动相B为甲酸，水和色谱甲醇的混合物，比例为1:49:50(v:v:v)；流动相A为含1％甲酸的超纯水。采用梯度洗脱，流速0.8mL/min程序时间49min。首先40％B和60％A保持2min，随后采用线性梯度洗脱，在40min内流动相B由40％增大到100％，然后保持5min，最后在2min内将流动相B从100％降到40％。
以已知花色苷-马脾铁蛋白浓度在519nm检测波长下，对17.5min处保留时间的峰面积积分做标曲，如图2所示，其中横坐标为花色苷-马脾铁蛋白浓度，纵坐标为积分面积，标准曲线为y＝19042x-1751.8，R2＝0.995。在519nm检测波长下同样保留时间处峰面积计算样品中花色苷含量，每个样品做3次重复取平均值。
以下实施例和对比例中检测小分子的高效液相色谱法均如上述方法和标准曲线，以下不再赘述。
实施例2
花色苷-马脾铁蛋白包埋物的制备：
制备浓度为2.0mmol/L的花色苷溶液，将其溶于水溶液中；
分离纯化马脾铁蛋白，制备浓度为2.0μmol/L的马脾铁蛋白溶液；
将制备的马脾铁蛋白溶液缓慢搅拌，调节pH至3.0，之后将制备的花色苷溶液缓慢滴加到马脾铁蛋白溶液中，滴加的速率为每10s滴加1滴(10μL)，使马脾铁蛋白与花色苷的摩尔比为1:1000；
搅拌30min，离心去除铁核。将上清液pH调至7.0，反应30min，过脱盐柱纯化，获得花色苷-马脾铁蛋白包埋物溶液。
马脾铁蛋白分离纯化的方法与实施例1相同。
在分光光度计上扫描花色苷-马脾铁蛋白包埋物在200～700nm波长下的紫外可见光谱，可以发现在280nm和600nm处有特征吸收峰，说明包埋物中铁蛋白与花色苷同时存在；通过透射电镜对包埋物进行表征，发现铁蛋白空腔已被占据，说明花色苷成功被包埋在铁蛋白内部空腔，如图3中的B图；
对花色苷-马脾铁蛋白包埋物进行肉眼观察，可见其深蓝色；
通过BCA蛋白浓度测定方法(博奥森BCA蛋白浓度测定试剂盒)和高效液相色谱法分别测定花色苷-马脾铁蛋白包埋物中马脾铁蛋白质和花色苷的摩尔浓度，其比例为1:(15.1±1.6)，说明平均每个铁蛋白分子可以包埋15个花色苷。同时，说明本实施例中的方法可以有效用于马脾铁蛋白对水溶性小分子的包埋。但是当pH为3时，由于铁蛋白解离率会受到影响，所以包埋率会有较实施例1所下降。
实施例3
虾青素-马脾铁蛋白包埋物的制备：
制备浓度为2.0mmol/L的虾青素溶液，将其溶于二甲基亚砜中；
分离纯化马脾铁蛋白，制备浓度为2.0μmol/L的马脾铁蛋白溶液；
将制备的马脾铁蛋白溶液缓慢搅拌，调节pH至2.0，之后将制备的虾青素溶液缓慢滴加到马脾铁蛋白溶液中，滴加的速率为每5s滴加1滴(10μL)，使马脾铁蛋白与虾青素的摩尔比为1:100；
搅拌30min，离心去除铁核。将上清液pH调至7.0，反应30min，过脱盐柱纯化，获得花色苷-马脾铁蛋白包埋物溶液。
马脾铁蛋白分离纯化的方法与实施例1相同。
在分光光度计上扫描虾青素-马脾铁蛋白包埋物在200～700nm波长下的紫外可见光谱，可以发现在280nm和450nm处有特征吸收峰，说明包埋物中铁蛋白与虾青素同时存在；通过透射电镜对包埋物进行表征，发现铁蛋白空腔已被占据，说明虾青素成功被包埋在铁蛋白内部空腔，结果如图3中的C图；
对虾青素-马脾铁蛋白包埋物进行肉眼观察，可见其暗红色；
通过BCA蛋白浓度测定方法(博奥森BCA蛋白浓度测定试剂盒)和高效液相色谱法分别测定虾青素-马脾铁蛋白包埋物马脾铁蛋白质和虾青素的摩尔浓度，其比例为1:(33.5±0.2)，说明平均每个铁蛋白分子可以包埋33个虾青素。同时，也说明该本实施例中的方法不仅可以包埋水溶性小分子，也可以包埋脂溶性小分子。
实施例4
花色苷-大豆铁蛋白包埋物的制备：
制备浓度为0.25mmol/L的花色苷溶液，将其溶于水溶液中；
分离纯化大豆铁蛋白，制备浓度为0.5μmol/L的大豆铁蛋白溶液；
将制备的大豆铁蛋白溶液缓慢搅拌，调节pH至2.0，之后将制备的花色苷溶液缓慢滴加到大豆铁蛋白溶液中，滴加的速率为每10s滴加1滴(10μL)，使大豆铁蛋白与花色苷的摩尔比为1:1000；
搅拌20min，离心去除铁核。将上清液pH调至7.0，反应30min，溶液过脱盐柱纯化，获得花色苷-大豆铁蛋白包埋物溶液。
大豆铁蛋白分离纯化的方法为：
把1kg大豆放入4℃蒸馏水中浸泡过夜，加入2倍体积含有1％PVP的50mM Tris-HCl(pH7.5)并用内切式匀浆机匀浆2分钟，200目滤网过滤。收集滤液在55℃下加热10分钟，5000g离心5分钟，取上清液。向上清液中加入终浓度为50mMMgCl2晶体后静置30分钟，再加入终浓度为70mM柠檬酸三钠晶体并静置过夜。当经过12000g离心20分钟后，收集沉淀。
加入15倍体积上清液冲洗沉淀中的淀粉和核糖体并10000g离心5分钟，弃上清，重复2次直至只有褐色沉淀。将沉淀溶于1.5倍体积蒸水中10000g离心5分钟，弃上清。重复两次用5倍体积蒸馏水溶解沉淀，12000g离心5分钟，收集并合并上清液。
将得到的上清液进行DEAE阴离子柱和凝胶柱纯化，储于冰箱待用，纯化步骤与实施例1中的马脾铁蛋白的步骤相同，再次不再赘述。
在分光光度计上扫描花色苷-大豆铁蛋白包埋物在200～700nm波长下的紫外可见光谱，可以发现在280nm和600nm处有特征吸收峰，说明包埋物中铁蛋白与花色苷同时存在；通过透射电镜对包埋物进行表征，发现铁蛋白空腔已被占据，说明花色苷成功被包埋在铁蛋白内部空腔，结果如图3中的D图所示；
对花色苷-大豆铁蛋白包埋物进行肉眼观察，可见其深蓝色；
通过BCA蛋白浓度测定方法(博奥森BCA蛋白浓度测定试剂盒)和高效液相色谱法分别测定花色苷-大豆铁蛋白包埋物中大豆铁蛋白质和花色苷的摩尔浓度，其比例为1:(15.7±2.1)，说明平均每个铁蛋白分子可以包埋15个花色苷。同时，说明本实施例中的方法方法可以有效用于植物铁蛋白对小分子的包埋。但是由于植物源铁蛋白水溶性较差，所以在包埋时需要调整铁蛋白的浓度参数。
对比例1
花色苷-马脾铁蛋白包埋物的制备：
制备浓度为2.0mmol/L的花色苷溶液，将其溶于水溶液中；
分离纯化马脾铁蛋白，制备浓度为2.0μmol/L的马脾铁蛋白溶液；
将制备的马脾铁蛋白溶液缓慢搅拌，将制备的花色苷溶液缓慢滴加到马脾铁蛋白溶液中，滴加的速率为每5s滴加1滴(10μL)，使马脾铁蛋白与花色苷的摩尔比为1:1000；
搅拌30min，离心。将上清液pH调至7.0，反应30min，溶液过脱盐柱纯化，获得花色苷-马脾铁蛋白包埋物溶液。
在分光光度计上扫描花色苷-马脾铁蛋白包埋物在200～700nm波长下的紫外可见光谱，可以发现在280nm处有特征吸收峰，但600nm处吸收峰不明显，说明产物中以铁蛋白为主，花色苷含量很少，结果如图3中的E所示；
对花色苷-马脾铁蛋白包埋物进行肉眼观察，可见其为无色透明；
通过透射电镜对包埋物进行表征，发现铁蛋白空腔中有明显的金属核，说明花色苷未被成功被包埋在铁蛋白内部空腔；
通过BCA蛋白浓度测定方法(博奥森BCA蛋白浓度测定试剂盒)和高效液相色谱法分别测定马脾铁蛋白质和花色苷的摩尔浓度，其比例为1:(4.1±1.7)，说明花色苷含量很少，可能是结合在铁蛋白表面。该对比例说明了通过调控pH来使铁蛋白亚基解离对小分子的成功包埋发挥着重要作用。
由以上实施例和对比例可以得出，采用本发明提供的方法能够在实现脱铁的同时加入小分子，使包埋可以在一步操作内完成，提高小分子-铁蛋白的包埋效率。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (3)

1.一种铁蛋白一步脱铁包埋小分子的方法，其特征在于，包括：将小分子溶液滴加到pH为2.0～3.0的铁蛋白溶液中，得到小分子铁蛋白混合溶液；
搅拌、离心所述小分子铁蛋白混合溶液，得上清液；所述上清液经静置和脱盐，得到小分子-铁蛋白包埋物溶液；所述搅拌的时间为20～30min；所述静置的时间为0.5～2h；
所述静置的pH为6.0～8.0；
所述铁蛋白为动物铁蛋白或植物铁蛋白；
所述动物铁蛋白为马脾铁蛋白；所述植物铁蛋白为大豆铁蛋白、豌豆铁蛋白或红小豆铁蛋白；
所述小分子溶液的浓度为0.25～3.0mmol/L，所述铁蛋白的浓度为0.5～20μmol/L；
所述小分子溶液滴加的速率为每1～10s滴加10μL；
所述小分子为花色苷或虾青素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述铁蛋白与所述小分子的摩尔比为1:100～1000。
3.权利要求1～2任一项所述方法制备得到的小分子-铁蛋白包埋物，其特征在于，所述铁蛋白和小分子的包埋摩尔比为1:10～50。
CN202111413990.8A 2021-11-25 2021-11-25 一种小分子-铁蛋白包埋物及铁蛋白一步脱铁包埋小分子的方法 Active CN114456251B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111413990.8A CN114456251B (zh) 2021-11-25 2021-11-25 一种小分子-铁蛋白包埋物及铁蛋白一步脱铁包埋小分子的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111413990.8A CN114456251B (zh) 2021-11-25 2021-11-25 一种小分子-铁蛋白包埋物及铁蛋白一步脱铁包埋小分子的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114456251A CN114456251A (zh) 2022-05-10
CN114456251B true CN114456251B (zh) 2022-10-14

Family

ID=81405375

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111413990.8A Active CN114456251B (zh) 2021-11-25 2021-11-25 一种小分子-铁蛋白包埋物及铁蛋白一步脱铁包埋小分子的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114456251B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115998708A (zh) * 2022-07-04 2023-04-25 大连工业大学 一种可逆自组装蛋白包埋活性分子的方法
CN115812896B (zh) * 2023-02-21 2023-05-09 中国农业大学 使花色苷变蓝的方法
CN117426465A (zh) * 2023-12-20 2024-01-23 中国农业大学 利用超高压技术调控笼型蛋白包埋并提高花色苷稳定性的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104096231A (zh) * 2014-07-15 2014-10-15 中国农业大学 一种靶向纳米声敏剂及其制备方法
CN106853249A (zh) * 2015-12-09 2017-06-16 天津科技大学 一种基于铁蛋白/壳聚糖的天然色素分子包埋物的制备方法
CN113367335A (zh) * 2021-06-24 2021-09-10 中国农业大学 一种提高虾青素水溶性且保护其免受Fe2+氧化降解的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104096231A (zh) * 2014-07-15 2014-10-15 中国农业大学 一种靶向纳米声敏剂及其制备方法
CN106853249A (zh) * 2015-12-09 2017-06-16 天津科技大学 一种基于铁蛋白/壳聚糖的天然色素分子包埋物的制备方法
CN113367335A (zh) * 2021-06-24 2021-09-10 中国农业大学 一种提高虾青素水溶性且保护其免受Fe2+氧化降解的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
植物铁蛋白钙复合物的制备;巩子路等;《江苏农业科学》;20131125;第41卷(第11期);全文 *
超声辅助法制备铁蛋白-虾青素包埋物;张晨曦等;《食品科学》;20200831;第42卷(第11期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114456251A (zh) 2022-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114456251B (zh) 一种小分子-铁蛋白包埋物及铁蛋白一步脱铁包埋小分子的方法
CN101928742B (zh) 一种具有抗氧化性活性的乳清蛋白活性肽及其制备方法
CN104311685B (zh) 一种螺旋藻多糖及其提取方法
CN113388133B (zh) 甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶的制备方法及应用
CN106632205A (zh) 一种从云南松树皮中提取原花青素的方法
CN111150063A (zh) 一种利用笼状植物铁蛋白同时提高疏水性及水溶性活性成分稳定性的方法和应用
CN107619411B (zh) 一种血红素提取方法
CN113647623A (zh) 提高花色苷稳定性的方法
CN114560927B (zh) 亚临界水提辅助鱼鳞生产胶原蛋白肽的方法及其应用
CN113956338B (zh) 一种从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法
CN107880147A (zh) 板栗抗癌活性多糖及其分离纯化方法
CN113637092A (zh) 一种莼菜多糖及其提取方法和应用
CN105037494B (zh) 一种金枪鱼暗色肉蛋白抗氧化铁螯合肽的用途
CN111018867A (zh) 从血红蛋白中的血红素的快速提取方法
CN107433194A (zh) 一种尿毒症毒素吸附剂的制备方法
CN110452286B (zh) 一种具有乳化活性与抗氧化活性的鸢乌贼蛋白肽及其制备方法与应用
CN106905553A (zh) 一种生物多糖层层自组装修饰的醋酸纤维素膜材料及其制备方法
JP2021138660A (ja) 鮭鼻軟骨からのプロテオグリカン抽出方法
CN112876581A (zh) 一种豆腐柴低酯果胶及其制备方法和应用
CN112029015A (zh) 一种高纯度低分子量肝素钠的生产纯化工艺
CN118005774B (zh) 血红蛋白亚铁螯合肽及其制备方法和用途
CN105037493B (zh) 金枪鱼暗色肉蛋白抗氧化铁螯合肽
RU2341286C1 (ru) Способ получения кровезаменителя и установка для осуществления способа
CN111493210A (zh) 一种金属离子肽营养补充剂的制备方法
CN105002245B (zh) 金枪鱼暗色肉蛋白抗氧化铁螯合肽制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant