CN105002245B - 金枪鱼暗色肉蛋白抗氧化铁螯合肽制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种金枪鱼暗色肉蛋白抗氧化铁螯合肽及其制备方法，该抗氧化铁螯合肽的氨基酸序列为Tyr‑Ile‑Val‑Tyr‑Trp，ESI‑MS检测分子量为742.84 Da，制备时以金枪鱼暗色肉作为原料，经过脱脂、中性蛋白酶酶解、超滤、凝胶过滤层析和反相高效液相纯化，得抗氧化铁螯合肽Tyr‑Ile‑Val‑Tyr‑Trp。

Description

金枪鱼暗色肉蛋白抗氧化铁螯合肽制备方法
技术领域
本发明涉及一种功能性肽的制备方法，尤其涉及金枪鱼暗色肉蛋白抗氧化铁螯合肽制备方法。
背景技术
金枪鱼为大洋性鱼类，广泛分布于太平洋、印度洋和大西洋的中低纬度的近海、外海和大洋中，属高度洄游鱼类种群，是世界远洋渔业发展的重点目标鱼种。金枪鱼肉味鲜美，营养丰富，具有红肌型肉质，加之常年生活于无污染的深海区，被视为绿色、安全、无污染食品，因而被国际营养学会推荐为世界三大营养鱼类之一。据联合国粮农组织统计，目前世界大洋性渔业总产量为850万吨，其中金枪鱼产量超过600万吨，占公海渔业总产量70%以上。在金枪鱼加工过程中产生约占总重量50%～70%的下脚料，其中暗色肉约占原料的11%，是制备活性多肽的优质原料，但并未得到有效利用。
申请人研究发现，以金枪鱼暗色肉为原料，利用酶解技术制备抗氧化铁螯合肽的工艺研究处于空白阶段，而以酶解产物为材料制备高活性抗氧化铁螯合肽更是未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种金枪鱼暗色肉蛋白抗氧化铁螯合肽的制备方法，该工艺科学合理、易操作，所得到的肽具有很好的抗氧化和铁螯合活性。
本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为：一种金枪鱼暗色肉蛋白抗氧化铁螯合肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）金枪鱼暗色肉的预处理：取金枪鱼暗色肉用高速组织捣碎机处理成匀浆，加热至95～100℃后保温10～15min，然后降至室温，按照料液比1g:3～5mL加入异丙醇，室温下脱脂20～24 h，然后于4℃、9 000 rpm离心25～30min除去异丙醇，收集脱脂金枪鱼暗色肉固形物，即为脱脂金枪鱼暗色肉蛋白；
2）脱脂金枪鱼暗色肉蛋白的酶解：以脱脂金枪鱼暗色肉蛋白作为原料，按固液比1g:20～25mL加入磷酸盐缓冲液（pH 6.5～7.5），得混合液；将混合液温度升至55～65 ℃预热5～10 min，按照脱脂金枪鱼暗色肉质量的1.5～2.0%加入蛋白酶，酶解温度为55～65℃，酶解3～5 h后，将溶液升温至90～95℃，并于此温度保持10～15min后，10 000g离心20～25 min，取上清液，即为酶解产物；
3）金枪鱼暗色肉蛋白抗氧化铁螯合肽的制备：将制备的酶解产物采用3 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解液，再将酶解液依次经凝胶过滤层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到抗氧化铁螯合肽。
作为优选，所述步骤1）中的金枪鱼为鲣鱼（Katsuwonus pelamis）。
作为优选，所述步骤2）中的蛋白酶为中性蛋白酶，酶活力≥1.0×105 U/g。
作为改进，所述步骤3）中的凝胶过滤层析和RP-HPLC纯化的具体过程为：
凝胶过滤层析：将上述超滤酶解液用pH 6.5～7.5磷酸盐缓冲液配成15～25 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-25柱层析（2.6 × 80 cm）分离，用pH 6.5～7.5磷酸盐缓冲液进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，自由基（DPPH 自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基）清除活性最高组分为凝胶层析酶解物。
纯化：将上述凝胶层析酶解物用超纯水配成80～100 μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据抗氧化活性得1个高活性抗氧化铁螯合肽Tyr-Ile-Val-Tyr-Trp（YIVYW），ESI-MS检测分子量为742.84 Da。
优选，所述RP-HPLC条件为：进样量15～20 μL；色谱柱Zorbax SB-C18（250 ×4.6mm，5 μm）；柱温为25～30 ℃；流动相：A含0.1%三氟乙酸的水，B乙腈；梯度洗脱：0-6 min为水，6 min以后乙腈浓度每分钟升高0.5%；洗脱速度0.8～1.0 mL/min；紫外检测波长220nm。
本发明所制备的金枪鱼暗色肉蛋白抗氧化铁螯合肽Tyr-Ile-Val-Tyr-Trp（YIVYW）对DPPH 自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时，Tyr-Ile-Val-Tyr-Trp（YIVYW）亦显示出显著的铁螯合作用。Tyr-Ile-Val-Tyr-Trp（YIVYW）具有安全无毒副作用、抗氧化铁螯合活性强、易于消化吸收等优点，可以应用于抗氧化和补铁相关的药品和功能产品。
附图说明
图1是本发明的超滤酶解液的葡聚糖凝胶G-25柱层析色谱图；
图2 是本发明的葡聚糖凝胶G-25制备酶解物（Fr.B2）的RP-HPLC色谱图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
一种金枪鱼暗色肉蛋白抗氧化铁螯合肽的制备方法，制备工艺流程如下：金枪鱼暗色肉"脱脂"酶解"超滤"凝胶过滤层析"高效液相色谱纯化"抗氧化铁螯合肽。
实施例：
1）金枪鱼暗色肉的预处理：取鲣鱼（Katsuwonus pelamis）暗色肉用高速组织捣碎机处理成匀浆，加热至95℃后保温15min，然后降至室温，按照料液比1g: 5 mL加入异丙醇，室温下脱脂24 h，然后于4℃、9 000 rpm离心30 min除去异丙醇，收集脱脂金枪鱼暗色肉固形物，即为脱脂金枪鱼暗色肉蛋白；
2）脱脂金枪鱼暗色肉蛋白的酶解：以脱脂金枪鱼暗色肉蛋白作为原料，按固液比1g: 25mL加入磷酸盐缓冲液（pH 7.0），得混合液；将混合液温度升至60 ℃搅拌预热10 min，按照脱脂金枪鱼暗色肉质量的2.0%加入中性蛋白酶（1.0×105 U/g），酶解温度为60 ℃，酶解4 h后，将溶液升温至90℃，并于此温度保持10 min，10 000g离心20 min，取上清液，即为酶解产物；
3）金枪鱼暗色肉蛋白抗氧化铁螯合肽的制备：将制备的酶解产物采用3 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解液，再将酶解液依次经凝胶过滤层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到抗氧化铁螯合肽。
①凝胶过滤层析：将上述超滤酶解液用pH 7.0磷酸盐缓冲液配成20 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-25柱层析（2.6 × 80 cm）分离，用pH 7.0磷酸盐缓冲液进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，自由基（DPPH 自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基）清除活性最高组分为凝胶层析酶解物Fr.B2（见图1）。
②RP-HPLC纯化：将上述凝胶层析酶解物用超纯水配成100 μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化（条件为：进样量20 μL；色谱柱Zorbax SB-C18（250 × 4.6mm，5 μm）；柱温30℃；流动相：A含0.1%三氟乙酸的水，B乙腈；梯度洗脱0-6 min为水，6 min以后乙腈浓度每分钟升高0.5%；洗脱速度1.0 mL/min；紫外检测波长220 nm），根据抗氧化活性得1个高活性抗氧化铁螯合肽（见图2）。
③结构检测：收集抗氧化铁螯合活性最高的多肽经检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Tyr-Ile-Val-Tyr-Trp（YIVYW），ESI-MS检测分子量为742.84Da。
将上述制得的金枪鱼暗色肉蛋白抗氧化铁螯合肽Tyr-Ile-Val-Tyr-Trp（YIVYW）进行DPPH自由基清除实验、 羟基自由基清除实验和超氧阴离子自由基清除实验。实验结果表明：Tyr-Ile-Val-Tyr-Trp（YIVYW）对DPPH 自由基 (EC50 1.03 mg/mL)、羟基自由基（EC500.24 mg/mL）和超氧阴离子自由基（EC50 0.25 mg/mL）具有良好的清除作用。
采用邻菲罗啉比色法，测定该多肽对铁离子的螯合作用。测定结果表明：纯化得到的多肽Tyr-Ile-Val-Tyr-Trp（YIVYW）对铁离子的螯合能力为1.83 ± 0.14 nmol/μmol。
最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江海洋学院
<120> 金枪鱼暗色肉蛋白抗氧化铁螯合肽制备方法
<130> zjou-wb-201504-1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Tyr Ile Val Tyr Trp
1 5

Claims (4)

1.一种金枪鱼暗色肉蛋白抗氧化铁螯合肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）金枪鱼暗色肉的预处理：取金枪鱼暗色肉用高速组织捣碎机处理成匀浆，加热至95～100℃后保温10～15min，然后降至室温，按照料液比1g:3～5mL加入异丙醇，室温下脱脂20～24h，然后于4℃、9000rpm离心25～30min除去异丙醇，收集脱脂金枪鱼暗色肉固形物，即为脱脂金枪鱼暗色肉蛋白；2）脱脂金枪鱼暗色肉蛋白的酶解：以脱脂金枪鱼暗色肉蛋白作为原料，按固液比1g:20～25mL加入pH6.5～7.5的磷酸盐缓冲液，得混合液；将混合液温度升至55～65℃搅拌预热5～10min，按照脱脂金枪鱼暗色肉质量的1.5～2.0%加入蛋白酶，酶解温度为55～65℃，酶解时间3～5h后，将溶液升温至90～95℃，并于此温度保持10～15min，10000g离心20～25min，取上清液，即为酶解产物；3）金枪鱼暗色肉蛋白抗氧化铁螯合肽的制备：将制备的酶解产物采用3kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3kDa部分，得超滤酶解液，再将酶解液依次经凝胶过滤层析和反相高效液相色谱纯化，得到抗氧化铁螯合肽；
所述步骤3）的凝胶过滤层析和反相高效液相色谱纯化的具体过程为：凝胶过滤层析：将上述超滤酶解液用pH6.5～7.5磷酸盐缓冲液配成15～25mg/mL的溶液，经过规格为2.6×80cm的葡聚糖凝胶G-25柱层析分离，用pH6.5～7.5磷酸盐缓冲液进行洗脱，根据220nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，自由基清除活性最高组分为凝胶层析酶解物；所述的自由基包括DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基；RP-HPLC纯化：将上述凝胶层析酶解物用超纯水配成80～100μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，得1个高活性抗氧化铁螯合肽Tyr-Ile-Val-Tyr-Trp，ESI-MS检测分子量为742.84Da。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤1）中的金枪鱼为鲣鱼，所述鲣鱼拉丁名为Katsuwonus pelamis。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤2）中的蛋白酶为中性蛋白酶，酶活力≥1.0×105U/g。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述反相高效液相色谱条件为：进样量15～20μL；色谱柱为Zorbax SB-C18，规格为250×4.6mm，5μm；柱温为25～30℃；流动相：A含0.1%三氟乙酸的水，B乙腈；梯度洗脱：0-6min为水，6min以后乙腈浓度每分钟升高0.5%；洗脱速度0.8～1.0 mL/min；紫外检测波长220nm。
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