CN109511772B - 一种促溶、增效难溶生物活性物质的蛋白基纳米颗粒的制备方法 - Google Patents

一种促溶、增效难溶生物活性物质的蛋白基纳米颗粒的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于功能食品制备技术领域,公开了一种促溶、增效难溶生物活性物质的蛋白基纳米颗粒的制备方法。将蛋白质粉末加入水中,搅拌分散后水化,得到蛋白溶液;将难溶活性物质溶解于极性有机溶剂中,然后加入所得蛋白溶液搅拌分散均匀,得到混合液;将混合液透析去除极性有机溶剂,离心去除不溶物,得到蛋白基纳米颗粒溶液。本发明方法工艺简单,所得纳米制品可有效增强难溶活性物质的水溶性和物理化学稳定性,并能有效增强活性物质的生物效价,在食品、保健品、日化用品、药品行业具有广阔的应用空间。

Description

一种促溶、增效难溶生物活性物质的蛋白基纳米颗粒的制备 方法
技术领域
本发明属于功能食品制备技术领域,特别涉及一种促溶、增效难溶生物活性物质的蛋白基纳米颗粒的制备方法。
背景技术
多项研究证实,合理的补充一些具有特定功能性的生物因子,可以预防和延缓肿瘤和心血管疾病的发生,因此,开发一些功能食品是发展健康产业的内在需求。功能食品的开发需打破功能因子溶解性、稳定性及生物吸收率低的桎梏。多篇专利利用乳液(201510169051.1)、颗粒(201610178852.9)、脂质体(201310413928.8)、胶束(201010120171.X)等体系用于提高难溶物质的生物有效性,但在制备上述载体体系的过程中,存在大量表面活性剂、交联剂和有毒试剂的使用,制备成本高且易造成食品安全等问题。
近年来,开发蛋白基(纳米)颗粒作为营养物质(尤其是难溶生物活性物质)的高效载体,在食品和制药领域引起了越来越多的兴趣。食品蛋白基纳米颗粒作为输送载体具有无毒性、可降解性以及生物相容性等优点,被公认为最有希望改善难溶活性物质的水溶性、稳定性和生物利用度的纳米载体之一。生物活性物质的包封效率和装载量很大程度上取决于纳米颗粒的制备方法。然而,现有的蛋白基纳米载体制备方法(纳米复合、乳化-蒸发、共价交联等)仍存在荷载量低、交联剂使用、药物突释等问题,因此,寻找一种工艺简便、成本低、载药量高、稳定性好、生物毒性小的载体制备方法,是目前食品和药品领域最迫切解决的问题。
发明内容
针对以上现有技术存在的缺点和不足之处,本发明的首要目的在于提供一种促溶、增效难溶生物活性物质的蛋白基纳米颗粒的制备方法。该方法是利用极性有机溶剂改变球蛋白的天然构象,使蛋白表面暴露出更多的疏水和氢键位点,在透析去除有机溶剂过程中,牵引着疏水物质富集于蛋白自组装颗粒内核。由本发明方法制备的自组装蛋白质纳米载体,可有效增强难溶物质的水溶性和物理化学稳定性,并能有效增强活性物质的生物效价。
本发明的另一目的在于提供一种通过上述方法制备得到的促溶、增效难溶生物活性物质的蛋白基纳米颗粒。
本发明目的通过以下技术方案实现:
一种促溶、增效难溶生物活性物质的蛋白基纳米颗粒的制备方法,包括如下制备步骤:
(1)将蛋白质粉末加入水中,搅拌分散后水化,得到蛋白溶液;
(2)将难溶活性物质溶解于极性有机溶剂中,然后加入步骤(1)中所得蛋白溶液,搅拌分散均匀,得到混合液;
(3)将步骤(2)的混合液透析去除极性有机溶剂,离心去除不溶物,得到促溶、增效难溶生物活性物质的蛋白基纳米颗粒溶液。
优选地,步骤(1)中所述蛋白质为豆类7S蛋白、豆类11S蛋白、大豆分离蛋白、乳清蛋白、牛血清蛋白、芸豆蛋白、卵清蛋白中的至少一种。
优选地,步骤(1)中所述蛋白质粉末加入水中的质量浓度为0.2%~10%。
优选地,步骤(2)中所述难溶活性物质为多酚类化合物、甾类化合物、黄酮类化合物及疏水活性肽中的至少一种。
优选地,步骤(2)和步骤(3)中所述的极性有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮中的至少一种。
优选地,步骤(2)中所述混合液中极性有机溶剂的体积百分含量为30%~70%。
优选地,步骤(2)中所述难溶活性物质的加入量与蛋白溶液中所含蛋白质的质量比为(0.5~5):10。
优选地,步骤(2)中所述混合液中蛋白浓度为2~20mg/mL。
优选地,步骤(3)中所述透析使用透析液为pH=7.0的磷酸盐缓冲液,透析时间为24~48h,每8h换一次透析液。
一种促溶、增效难溶生物活性物质的蛋白基纳米颗粒,通过上述方法制备得到。
本发明的原理为:在极性有机试剂作用下,天然蛋白质的二级、三级和四级结构构象会发生重大变化,蛋白质结构展开,从而将埋藏于蛋白质内部的疏水位点暴露于表面。极性有机溶剂的使用除了使蛋白质变性外,其次是可作为疏水物质的溶剂,将难溶物质均匀的分散于蛋白溶液中。在透析去除极性有机溶剂的过程中,暴露的蛋白疏水位点牵引着疏水物质富集于蛋白自组装载体内核,从而大大提高了难溶物质的溶解度及稳定性。
本发明的制备方法及所得到的产物具有如下优点及有益效果:
(1)本发明使用极性有机溶剂诱导蛋白质变性,暴露出的疏水物质结合位点,牵引着疏水物质富集于蛋白自组装体内核,该自组装产物具有良好的生物相容性。
(2)本发明形成的蛋白载体不仅提高了蛋白质的荷载量,而且大大提高了疏水物质的水溶性。
(3)本发明制备的自组装产物具有一定的药物缓释效果,一定程度上可以降低活性物质溶出速率。
(4)本发明的制备方法工艺简单、安全、成本低、能耗低,操作可控,适合大规模工业化生产与加工,在食品、保健品、日化用品、药品行业具有广阔的应用空间。
附图说明
图1是本发明实施例1在大豆7S蛋白质量浓度均为1wt%,乙醇体积分数为30%~70%时,所得大豆7S蛋白-姜黄素组装体纳米颗粒溶液外观图。
图2是本发明实施例1在大豆7S蛋白质量浓度均为1wt%,乙醇体积分数为30%~70%时,所得变性大豆7S蛋白对姜黄素的荷载量结果图。
图3是本发明实施例1在大豆7S蛋白质量浓度均为1wt%,乙醇体积分数为30%~70%时,形成的组装体纳米颗粒的透射电镜微观示意图(图中a~e分别对应乙醇体积分数为30%、40%、50%、60%、70%)。
图4是本发明实施例1在大豆7S蛋白质量浓度均为1wt%,乙醇体积分数为30%~70%时,形成的组装体纳米颗粒的机理图。
图5是本发明实施例1在大豆7S蛋白质量浓度均为1wt%,乙醇体积分数为30%~70%时,组装体纳米颗粒中被包埋的姜黄素和游离姜黄素的贮藏稳定性结果图。
图6是本发明实施例1在大豆7S蛋白质量浓度均为1wt%,乙醇体积分数为30%~70%时,组装体纳米颗粒中被包埋的姜黄素和游离姜黄素的体外消化特性结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)准确称取5g大豆7S蛋白粉末,将其分散于100g蒸馏水中,并于室温连续搅拌2h,后置于4℃冰箱过夜水化(放置前向蛋白溶液中添加1滴质量浓度为0.08%的叠氮化钠,防止微生物的生长),获得质量浓度为5wt%的原始大豆7S蛋白贮存液。
(2)分别量取3mL、4mL、5mL、6mL、7mL无水乙醇于10mL血清瓶中,标记为1、2、3、4、5号样品,称取15mg姜黄素粉末分别添加到5个样品中,避光搅拌1h,得到姜黄素乙醇溶液。
(3)分别向1、2、3、4、5号样品中添加5mL、4mL、3mL、2mL、1mL去离子水,搅拌均匀,配成8mL不同乙醇体积分数的姜黄素乙醇/水溶液。
(4)向步骤(3)样品中,各加入2mL原始大豆7S蛋白贮存液,分散均匀,使最终体系中蛋白浓度为10mg/mL,乙醇体积分数分别为30%、40%、50%、60%和70%,姜黄素浓度为1.5mg/mL。
(5)将步骤(4)中的反应液放于4℃冰箱中透析24h,以去除无水乙醇,实现7S蛋白和姜黄素的共组装过程,透析液为pH=7.0的磷酸盐缓冲液,8h更换一次透析液,最后离心(5000g,10min)去除不溶物,得到大豆7S蛋白-姜黄素组装体纳米颗粒溶液。
本实施例考察了大豆7S蛋白浓度为1wt%、乙醇体积分数为30%~70%条件下,变性大豆7S蛋白与姜黄素颗粒共组装的情况。大豆7S蛋白-姜黄素组装体纳米颗粒溶液外观图如图1所示,乙醇体积分数为30%~50%时,组装体纳米颗粒溶液呈黄色透明状,而乙醇体积分数为60%~70%时,组装体纳米颗粒溶液呈黄色不透明状。由透射电镜观察其微观结构(图3),发现不同乙醇体积分数形成的组装体结构不同。在30~50%乙醇体积下蛋白与蛋白间的作用力小于蛋白和姜黄素的作用力,因此,会形成以姜黄素为晶核,蛋白为外壳的组装体结构。而更高乙醇浓度处理的蛋白则由于蛋白颗粒间的强吸引力导致蛋白首先形成聚集体,而姜黄素与聚集体界面形成复合物,机理如图4所示。大豆7S蛋白包埋姜黄素的能力与乙醇添加体积具有明显关系,40%乙醇浓度处理的7S具有最高的荷载量,每克大豆7S蛋白可荷载137mg姜黄素,包封率高达91.3%(图2)。本实施例中大豆7S蛋白-姜黄素组装颗粒溶液中的姜黄素及游离姜黄素的贮藏稳定性如图5所示(其中游离姜黄素指用去离子水将2mg/mL的姜黄素乙醇溶液稀释至0.2mg/mL)。由图5可见,所得7S蛋白-姜黄素组装体纳米颗粒溶液中的姜黄素相较于游离姜黄素均表现出很高的稳定性,其中40%乙醇浓度处理的样品具有最高稳定性。本实施例在大豆7S蛋白质量浓度均为1wt%,乙醇体积分数为30%~70%时,组装体中被包埋的姜黄素和游离姜黄素的体外消化特性结果图如图6所示(采用含有蛋白消化酶和不存在蛋白消化酶两种情况考察姜黄素的消化特性)。由图6可知,对于游离态的姜黄素,在不添加消化酶(胃蛋白酶和胰酶)的情况下,整个过程中仅有3%的姜黄素转移到了水相中。而对于在乙醇诱导下制备的组装体颗粒,姜黄素在水相中的含量则均高于50%。这说明,乙醇诱导的7S蛋白对姜黄素具有很好的增溶效果。在消化酶存在的情况下,游离姜黄素的生物利用率提高到25%,由50%、60%,70%乙醇制备的β-CG-姜黄素胶体颗粒中的姜黄素,其生物利用率也获得了较大幅度的提升,这主要是因为在消化酶的存在下能够增加姜黄素在消化液中的溶解度。非常有意思的是,分别由30%和40%乙醇制备的姜黄素胶体颗粒,其姜黄素的生物利用率在有消化酶存在的条件下出现了完全相反的结果,添加消化酶后,30%和40%酒精下制备的姜黄素胶体颗粒中姜黄素的生物利用率则分别下降至58%和43%。这一现象应归因于消化过程中消化酶对大豆7S的降解作用。由于大豆7S被降解成了蛋白片段,蛋白结构被破坏,从而导致姜黄素被释放出来。释放出的姜黄素因溶解性较差,自身发生聚集和沉淀,从而降低了姜黄素的生物利用率。
实施例2
按照实施例1所述方法,制备乳清蛋白-姜黄素组装体纳米颗粒溶液。除大豆7S蛋白换作乳清蛋白冻干样品,蛋白分散液过夜水化后需离心(8000g,20min)外,其他操作同实施例1。待乳清蛋白-姜黄素组装体颗粒溶液制备完成,取0.1mL样品于3mL乙酸乙酯中,涡旋60秒,静置30min,取上清液按照乙酸乙酯-姜黄素标准曲线测其包封率,本实施例中,50%的乙醇处理的乳清蛋白具有最高的包封率,可达86.3%,即每克乳清蛋白可埋129毫克姜黄素。
实施例3
按照实施例1所述方法,制备牛血清蛋白-姜黄素组装体纳米颗粒溶液。除大豆7S蛋白换作牛血清蛋白样品外,其他操作同实施例1。待牛血清蛋白-姜黄素组装体颗粒溶液制备完成,取0.1mL样品测其包封率,本实施例中,40%的乙醇处理的牛血清蛋白具有最高的包封率,可达95.1%,即每克牛血清蛋白可包埋143毫克姜黄素,牛血清蛋白之所以具有这么高的包封率是因为牛血清蛋白中含有大量的二硫键,乙醇使牛血清蛋白变性,结构展开,二硫键随之被打开,当透析去除乙醇时,除了非共价键的牵引力外,更加有共价键(二硫键)作用力的牵引,因此,其形成的共组装体包封率极高。
以上实施例1~3分别考察了乙醇诱导不同蛋白质对包埋姜黄素的影响,以包封效率为评价指标,结果表明,牛血清蛋白包封效率最高,这说明包埋效率的高低与蛋白质内部结构有重大关系。
实施例4
(1)准确称取5g大豆7S蛋白粉末,将其分散于100g蒸馏水中,并于室温连续搅拌2h,后置于4℃冰箱过夜水化(放置前向蛋白溶液中添加1滴质量浓度为0.08%的叠氮化钠,防止微生物的生长),获得质量浓度为5wt%的原始大豆7S蛋白贮存液。
(2)分别量取3mL、4mL、5mL、6mL、7mL甲醇于10mL血清瓶中,标记为1、2、3、4、5号样品,称取15mg姜黄素粉末分别添加到5个样品中,避光搅拌1h,得到姜黄素甲醇溶液。
(3)分别向1、2、3、4、5号样品中添加5mL、4mL、3mL、2mL、1mL去离子水,搅拌均匀,配成不同甲醇体积分数的姜黄素乙醇/水溶液。
(4)向步骤(3)样品中,各加入2mL原始大豆7S蛋白贮存液,分散均匀,使最终体系中蛋白浓度为10mg/mL,甲醇体积分数分别为30%、40%、50%、60%和70%,姜黄素浓度为1.5mg/mL。
(5)将步骤(4)中的反应液放于4℃冰箱中透析24h,以去除无水甲醇,实现7S和姜黄素的共组装过程,透析液为pH=7.0的磷酸盐缓冲液,8h更换一次透析液,最后离心(5000g,10min)去除不溶物,得到大豆7S蛋白-姜黄素组装体纳米颗粒溶液。
本实施例考察了大豆7S蛋白浓度为1wt%、甲醇体积分数为30%~70%条件下,变性大豆7S蛋白与姜黄素颗粒共组装的情况。当甲醇浓度为40%时,大豆7S具有最高的包封率(81.5%),与乙醇诱导的7S蛋白自组装体相比,甲醇诱导的大豆7S蛋白荷载能力较差,这或许与有机溶剂的极性有关。
实施例5
按照实施例1所述方法,制备丙酮诱导的大豆7S蛋白-姜黄素组装体纳米颗粒溶液。除乙醇换作丙酮外,其他操作同实施例1。本实例考察了大豆7S蛋白浓度为1wt%、丙酮体积分数为30%~70%条件下,变性大豆7S蛋白与姜黄素颗粒共组装的情况。当丙酮浓度为40%时,大豆7S具有最高的包封率(92.6%),与乙醇诱导的7S蛋白自组装体相比,丙酮诱导的大豆7S蛋白荷载能力较高。
以上实施例1、4、5分别考察了不同极性有机试剂对大豆7S包埋姜黄素的影响,以包封效率为评价指标,结果表明,丙酮包封效率最高。
实施例6
(1)准确称取5g大豆7S蛋白粉末,将其分散于100g蒸馏水中,并于室温连续搅拌2h,后置于4℃冰箱过夜水化(放置前向蛋白溶液中添加1滴质量浓度为0.08%的叠氮化钠,防止微生物的生长),获得质量浓度为5wt%的原始大豆7S蛋白贮存液。
(2)分别量取3mL、4mL、5mL、6mL、7mL无水乙醇于10mL血清瓶中,标记为1、2、3、4、5号样品,称取30mg大豆苷元粉末分别添加到5个样品中,避光搅拌1h,得到大豆苷元乙醇溶液。
(3)分别向1、2、3、4、5号样品中添加5mL、4mL、3mL、2mL、1mL去离子水,搅拌均匀,配成不同乙醇体积分数的大豆苷元乙醇/水溶液。
(4)向步骤(3)样品中,各加入2mL原始大豆7S蛋白贮存液,分散均匀,使最终体系中蛋白浓度为10mg/mL,乙醇体积分数分别为30%、40%、50%、60%和70%,大豆苷元浓度为3mg/mL。
(5)将步骤(4)中的反应液放于4℃冰箱中透析24h,以去除无水乙醇,实现7S和大豆苷元的共组装过程,透析液为pH=7.0的磷酸盐缓冲液,8h更换一次透析液,最后离心(5000g,10min)去除不溶物,得到大豆7S蛋白-大豆苷元组装体纳米颗粒溶液。
本实施例考察了大豆7S蛋白浓度为1wt%、乙醇体积分数为30%~70%条件下,变性大豆7S蛋白与大豆苷元颗粒共组装的情况。当乙醇浓度为40%时,大豆7S具有最高的包封率(83.3%)。体外模拟消化实验表明,共组装行为可显著提高大豆苷元在消化液中的稳定性和生物利用率,经3h消化后,游离大豆苷元的保留率仅为13.7%,而共组装颗粒溶液中大豆苷元的保留率可达89.1%。此外共组装行为可显著提高大豆苷元的利用率,游离大豆苷元的生物利用率仅为11.3%,而共组装颗粒溶液中大豆苷元的生物利用率达到了79.6%,较高的生物利用率与大豆苷元的晶体性质有很大关系。
实施例7
(1)准确称取5g大豆7S蛋白粉末,将其分散于100g蒸馏水中,并于室温连续搅拌2h,后置于4℃冰箱过夜水化(放置前向蛋白溶液中添加1滴质量浓度为0.08%的叠氮化钠,防止微生物的生长),获得质量浓度为5wt%的原始大豆7S蛋白贮存液。
(2)分别量取3mL、4mL、5mL、6mL、7mL无水乙醇于10mL血清瓶中,标记为1、2、3、4、5号样品,称取50mg植物甾醇粉末分别添加到5个样品中,避光搅拌1h,得到植物甾醇乙醇溶液。
(3)分别向1、2、3、4、5号样品中添加5mL、4mL、3mL、2mL、1mL去离子水,搅拌均匀,配成不同乙醇体积分数的植物甾醇乙醇/水溶液。
(4)向步骤(3)样品中,各加入2mL原始大豆7S蛋白贮存液,分散均匀,使最终体系中蛋白浓度为10mg/mL,乙醇体积分数分别为30%、40%、50%、60%和70%,植物甾醇浓度为3mg/mL。
(5)将步骤(4)中的反应液放于4℃冰箱中透析24h,以去除无水乙醇,实现7S和植物甾醇的共组装过程,透析液为pH=7.0的磷酸盐缓冲液,8h更换一次透析液,最后离心(5000g,10min)去除不溶物,得到大豆7S蛋白-植物甾醇组装体纳米颗粒溶液。
本实施例考察了大豆7S蛋白浓度为1wt%、乙醇体积分数为30%~70%条件下,变性大豆7S蛋白与植物甾醇颗粒共组装的情况。当乙醇浓度为40%时,大豆7S具有最高的包封率(87.4%)。体外模拟消化实验表明,共组装行为可显著提高植物甾醇在消化液中的稳定性和生物利用率,经3h消化后,游离植物甾醇的保留率仅为9.2%,而共组装颗粒溶液中植物甾醇的保留率可达84.5%。此外共组装行为可显著提高植物甾醇的利用率,游离植物甾醇的生物利用率仅为13.7%,而共组装颗粒溶液中植物甾醇的生物利用率达到了82.6%。
以上实施例1、6、7分别考察了乙醇诱导大豆7S包埋不同活性物质的影响,以包封效率为评价指标,结果表明,共组装行为可显著提高难溶活性物质的物理化学稳定性和生物利用率。
实施例8
(1)准确称取100mg、500mg、1000mg大豆7S蛋白粉末,将其分散于10g蒸馏水中,标记为1、2、3号样品,并于室温连续搅拌2h,后置于4℃冰箱过夜水化(放置前向蛋白溶液中添加1滴质量浓度为0.08%的叠氮化钠,防止微生物的生长),获得质量浓度为1wt%、5wt%、10wt%的原始大豆7S蛋白贮存液。
(2)量取4mL无水乙醇于10mL血清瓶中,称取15mg姜黄素粉末分别添加到血清瓶中,避光搅拌1h,得到姜黄素乙醇溶液。
(3)向姜黄素乙醇溶液中添加4mL去离子水,搅拌均匀,配成40%乙醇体积分数的姜黄素乙醇/水溶液。
(4)向步骤(3)样品中,各加入2mL 1wt%、5wt%、10wt%的原始大豆7S蛋白贮存液,分散均匀,使最终体系中蛋白浓度为2mg/mL、10mg/mL、20mg/mL,姜黄素浓度为1.5mg/mL。
(5)将步骤(4)中的反应液放于4℃冰箱中透析24h,以去除无水乙醇,实现7S和姜黄素的共组装过程,透析液为pH=7.0的磷酸盐缓冲液,8h更换一次透析液,最后离心(5000g,10min)去除不溶物,得到大豆7S蛋白-姜黄素组装体纳米颗粒溶液。
本实施例考察了蛋白浓度对包埋姜黄素的影响。经测试最终体系中蛋白浓度为10mg/mL包埋效率最高,达91.3%。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种促溶、增效难溶生物活性物质的蛋白基纳米颗粒的制备方法,其特征在于包括如下制备步骤:
(1)将蛋白质粉末加入水中,搅拌分散后水化,得到蛋白溶液;
所述蛋白质为豆类7S蛋白、乳清蛋白和牛血清蛋白中的至少一种;所述蛋白质粉末加入水中的质量浓度为0.2%~10%;
(2)将难溶活性物质溶解于极性有机溶剂中,然后加入步骤(1)中所得蛋白溶液,搅拌分散均匀,得到混合液;所述混合液中极性有机溶剂的体积百分含量为30%~70%;所述的极性有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮中的至少一种;所述难溶活性物质为姜黄素、大豆苷元和植物甾醇中的至少一种;所述难溶活性物质的加入量与蛋白溶液中所含蛋白质的质量比为(0.5~5):10;所述混合液中蛋白浓度为2~20 mg/mL;
(3)将步骤(2)的混合液透析去除极性有机溶剂,离心去除不溶物,得到促溶、增效难溶生物活性物质的蛋白基纳米颗粒溶液。
2.根据权利要求1所述的一种促溶、增效难溶生物活性物质的蛋白基纳米颗粒的制备方法,其特征在于:步骤(3)中所述透析使用透析液为pH=7.0的磷酸盐缓冲液,透析时间为24~48h,每8h换一次透析液。
3.一种促溶、增效难溶生物活性物质的蛋白基纳米颗粒,其特征在于:通过权利要求1~2任一项所述的方法制备得到。
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