CN109588713B - 一种岩藻黄醇-蛋白微粒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品领域，具体公开了一种岩藻黄醇‑蛋白微粒及其制备方法和应用。所述岩藻黄醇‑蛋白微粒的制备方法包括：(1)将岩藻黄素溶于缓冲液中，加入胆固醇酯酶，混匀，充入氮气，避光反应，纯化，将所得岩藻黄醇用含氢氧化钠的助溶剂溶解，加入脂肪酸混匀，得岩藻黄醇分散液；(2)将蛋白粉末溶于水中，pH值调节至10～12，加入脂肪酸混匀，超声分散，得蛋白质溶液；(3)将岩藻黄醇分散液与蛋白质溶液混匀并反应，pH值调回至7～8.5；(4)将步骤(3)所得溶液进行喷雾干燥或冷冻干燥。采用本发明提供的方法所得岩藻黄醇‑蛋白微粒兼具了微胶囊与纳米乳液的优点，具有稳定性强、吸收效果好、生产工艺简单、无化学残留的特点。
Description
技术领域
本发明属于食品领域，具体公开了一种岩藻黄醇-蛋白微粒及其制备方法和应用。
背景技术
岩藻黄醇是岩藻黄素去乙酰化的产物，具有与岩藻黄素相似的结构特性。越来越多的研究表明，岩藻黄醇具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、减肥等多种生物活性。而且研究发现，岩藻黄醇在抗肿瘤等方面表现出比岩藻黄素更好的生物活性。因此，岩藻黄醇在食品与生物医药领域具有巨大的应用价值。然而，目前规模化制备岩藻黄醇的技术较少。虽然专利申请CN104789611A提出了一种利用脂肪酶水解岩藻黄素制备岩藻黄醇的方法，但是，脂肪酶对岩藻黄素的专一性较差，酶使用量大、效果较差。因此，有必要采用更高效的方法制备岩藻黄醇。
与此同时，岩藻黄醇与岩藻黄素类似，存在难溶于水、吸收率低、稳定性差等问题，还极易受到光照、高温、氧气等条件的破坏，限制了其在食品与生物医药领域的开发应用。目前，用于提高类胡萝卜素等脂溶性活性物质的水溶性、稳定性及吸收性的技术主要是微胶囊技术和纳米乳化包埋技术。但是，微胶囊技术虽然强调了对类胡萝卜素的包载量、溶解性与稳定性的改善，却忽视了人体的吸收效果，违背了营养强化的初衷。新近发展起来的纳米乳化包埋技术能够进一步降低体系的粒径，从而达到提高稳定性与吸收效果的目的。但是，纳米乳包埋技术通常要使用高压均质(压力大于100MPa)、高速剪切等生产工艺，导致设备要求与生产成本较高；纳米乳溶液与固态粉体相比，不便于包装运输，稳定性较差，难以满足食品货架期的长时间保质要求；与此同时，乳化包埋过程通常还会使用国家食品添加剂目录规定以外的或对使用量有严格限制的乳化剂，如乙酸乙酯、吐温60(80)，存在一定的食品安全隐患，产业化应用受到限制。
发明内容
本发明针对岩藻黄醇因难溶于水、稳定性差、吸收率低导致的加工适性差、难以应用的难题，通过对现有加工方法的改进，提供了一种水溶性好、稳定性强、吸收率高的岩藻黄醇-蛋白微粒及其制备方法和应用，该制备方法成本低，所制备的岩藻黄醇-蛋白微粒安全性高，可广泛用于食品体系中。
具体地，本发明提供了一种岩藻黄醇-蛋白微粒的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)将岩藻黄素溶于含亲水性乳化剂的缓冲液中，加入胆固醇酯酶，混匀，充入氮气，在避光30～40℃环境下反应0.5h～12h，之后将所得反应产物进行纯化，得到岩藻黄醇；将所述岩藻黄醇用含氢氧化钠的助溶剂溶解，加入脂肪酸混匀，得到岩藻黄醇分散液；
(2)将蛋白粉末溶于水中，并将pH值调节至10～12，以打开蛋白质疏水内腔，然后加入脂肪酸混匀，超声分散，得到内腔富含脂肪酸的蛋白质溶液；
(3)将所述岩藻黄醇分散液与所述内腔富含脂肪酸的蛋白质溶液混匀并进行内腔重组反应，之后将所得反应产物的pH值调回至7～8.5，以封闭蛋白质内腔，得到澄清的岩藻黄醇-蛋白微粒水溶液；
(4)将所述岩藻黄醇-蛋白微粒水溶液直接喷雾干燥，或经减压浓缩后冷冻干燥，得到岩藻黄醇-蛋白微粒干粉。
优选地，步骤(1)中，所述亲水性乳化剂选自大豆磷脂、卵磷脂、胆汁酸盐、吐温、蔗糖脂肪酸酯和牛磺酸中的至少一种。
优选地，步骤(1)中，所述含亲水性乳化剂的缓冲液中亲水性乳化剂的浓度为0.1～2wt％。
优选地，步骤(1)中，所述缓冲液的pH值为6～8。
优选地，步骤(1)中，所述胆固醇酯酶与岩藻黄素的质量比为1:(100～1000)。
优选地，步骤(1)中，所述助溶剂选自乙醇、丙二醇、聚乙二醇和甘油中的至少一种。
优选地，步骤(1)中，所述含氢氧化钠的助溶剂中氢氧化钠的浓度为0.1～1wt％。
优选地，步骤(1)中，所述岩藻黄醇与含氢氧化钠的助溶剂的质量用量比为5g:(100～300)μL。
优选地，步骤(1)中，所述纯化的方法为将所得反应产物采用硅胶柱层析纯化，在采用硅胶柱层析纯化的洗脱过程中，先用去离子水淋洗以去除杂质，之后用体积比为(10～14):1的氯仿-丙酮混合有机液进行洗脱，洗脱液经减压浓缩、真空干燥后得到岩藻黄醇。
优选地，步骤(1)中，所述岩藻黄醇与脂肪酸的质量比为1:(3～5)。
优选地，步骤(2)中，所述脂肪酸与蛋白粉末的质量比为1:(4～10)。
优选地，步骤(1)和步骤(2)所述的脂肪酸各自独立地选自油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸和二十二碳六烯酸中的至少一种。
优选地，步骤(2)中，所述蛋白粉末选自牛血清白蛋白、乳清蛋白、玉米醇溶蛋白、酪蛋白酸钠和大豆蛋白中的至少一种。
优选地，步骤(2)中，所述蛋白粉末和水的用量使所得蛋白溶液的浓度为1～8wt％。
优选地，步骤(3)中，所述岩藻黄醇分散液与所述内腔富含脂肪酸的蛋白质溶液中蛋白质的质量比为1:(3～5)。
优选地，步骤(3)中，所述内腔重组反应的条件包括温度为室温，时间为1～5小时。
优选地，步骤(3)中，将所得反应产物的pH值调回至7～8.5所采用的试剂为酸味剂，所述酸味剂选自醋酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、苹果酸和葡萄糖酸内酯中的至少一种。
本发明还提供了由上述方法制备得到的岩藻黄醇-蛋白微粒。
优选地，所述岩藻黄醇-蛋白微粒粉末在常温下放置12个月不会出现絮凝或分层现象且岩藻黄醇的保留率为95％以上，在常温下放置36个月岩藻黄醇的保留率为90％以上；所述岩藻黄醇-蛋白微粒复溶于水后的平均粒径为150～500nm，在660nm处的透光率为95％以上。
优选地，所述岩藻黄醇-蛋白微粒在水体系中能够将岩藻黄醇的吸收率提高0.68倍～3.96倍。
优选地，所述岩藻黄醇-蛋白微粒的包埋率为90％以上。
所述岩藻黄醇-蛋白微粒粉末便于储存运输，吸收效果好，营养效价高，可作为营养强化剂广泛用于饮料、烘焙食品、糖果、奶制品、雪糕等食品体系中。相应地，本发明还提供了所述岩藻黄素-蛋白微粒作为食品营养强化剂的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明选用专一性强的胆固醇酯酶作为工具酶，大幅降低了酶制剂用量，提高了制备岩藻黄醇的效率；采用本发明提供的方法得到的岩藻黄素-蛋白微粒兼具了微胶囊和纳米乳液的优点，具有稳定性强、吸收效果好、生产工艺简单、无化学残留的特点。本发明充分利用了疏水分子相似相容、蛋白质结构在pH循环条件下的可逆变化性质，使岩藻黄醇的包埋率达到90％以上；本发明选用分子量较小、能和蛋白疏水内腔重组的游离脂肪酸作为介质，使得岩藻黄醇-蛋白微粒的平均粒径在150～500nm，远远小于微胶囊化的粒径，从而大幅提高了产品在水体系中的吸收效率，吸收效率可提高0.68倍～3.96倍；所制备的岩藻黄醇-蛋白微粒为粉末状，稳定性好，不仅便于储存运输，还具有比纳米乳液更稳定的优势，在常温下存放36个月，岩藻黄醇的保留率可达到90％以上；所制备的岩藻黄醇-蛋白微粒的复水性好，能在水溶液中形成澄清透明的液体，在660nm处的透光率可达95％以上，扩大了产品的应用范围，使其在食品与生物医药领域具有广泛的用途；制备方法路线简单、不需要高压均质以及高速剪切加工，具有生产成本低的优势，适合产业化生产；此外，在制备藻黄醇-蛋白微粒的过程中，所用蛋白、酸味剂等原材料在食品中无任何添加限制，不存在有毒有害物质残留，产品安全性高，符合食品安全要求。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
(1)称取5.0g岩藻黄素并溶于pH为6.0的含2wt％大豆磷脂的磷酸缓冲液中，加入50mg胆固醇酯酶，混匀后转入带塞试管中，充入氮气，密封，在避光37℃环境下反应0.5h后，之后将所得产物采用硅胶柱层析纯化，在采用硅胶柱层析纯化的洗脱过程中，先用去离子水淋洗以去除胆酸、胆固醇酯酶、磷酸缓冲盐等杂质，然后用体积比为12:1的氯仿-丙酮混合有机液洗脱，洗脱液经减压浓缩、真空干燥后得到岩藻黄醇；称取1.0g的岩藻黄醇，用300μL的0.1wt％氢氧化钠乙醇溶液充分溶解，然后加入3.0g的油酸，搅拌均匀，得到岩藻黄醇分散液；
(2)称取1.0g的牛血清白蛋白，加入去离子水充分搅拌溶解，用氢氧化钠水溶液调节pH值至10，并定容到100mL，然后加入0.1g的油酸，搅拌均匀后，超声处理30分钟，得到内腔富含脂肪酸的蛋白质溶液；
(3)将0.25g的所述岩藻黄醇分散液加入到步骤(2)所得的全部内腔富含脂肪酸的蛋白质溶液中(pH值为10)，然后搅拌均匀，反应2小时，之后用醋酸将混合溶液的pH值调回至7.0，得到澄清的岩藻黄醇-蛋白微粒水溶液(岩藻黄醇包埋率为95.4％)；
(4)将所述澄清的岩藻黄醇-蛋白微粒水溶液进行喷雾干燥，或经减压浓缩后进行冷冻干燥，得到岩藻黄醇-蛋白微粒干粉。
考察该岩藻黄醇-蛋白微粒干粉的物化特性与吸收效果，具体地：将其复溶于去离子水后，形成澄清透明的溶液，平均粒径为150nm，在660nm处的透光率为98％，在常温下储藏12个月不会出现絮凝或分层现象且岩藻黄醇的保留率为95.7％，在常温下储藏36个月岩藻黄醇的保留率为90.9％；将该岩藻黄醇-蛋白微粒干粉溶于去离子水后(0.2μmol/mL)(处理组)，灌胃小鼠，以未与蛋白结合的岩藻黄醇作为对照(对照组)，4小时后，分析小鼠血浆中的岩藻黄醇含量，与对照组相比(93.4pmol/mL)，处理组小鼠血浆中的岩藻黄醇含量达到463.3pmol/mL，提高了3.96倍。
实施例2
(1)称取5.0g岩藻黄素并溶于pH为7.0的含1wt％卵磷脂的磷酸缓冲液中，加入25mg胆固醇酯酶，混匀后转入带塞试管中，充入氮气，密封，在避光37℃环境下反应1h后，之后将所得产物采用硅胶柱层析纯化，在采用硅胶柱层析纯化的洗脱过程中，先用去离子水淋洗以去除胆酸、胆固醇酯酶、磷酸缓冲盐等杂质，然后用体积比为12:1的氯仿-丙酮混合有机液洗脱，洗脱液经减压浓缩、真空干燥后得到岩藻黄醇；称取1.0g的岩藻黄醇，用200μL的0.5wt％氢氧化钠丙二醇溶液充分溶解，然后加入4.0g的亚油酸，搅拌均匀，得到岩藻黄醇分散液；
(2)称取4.0g的牛血清白蛋白，加入去离子水充分搅拌溶解，用氢氧化钠水溶液调节pH值至11，并定容到100mL，然后加入0.5g的亚油酸，搅拌均匀后，超声处理30分钟，得到内腔富含脂肪酸的蛋白质溶液；
(3)将1.0g的所述岩藻黄醇分散液加入到步骤(2)所得的全部内腔富含脂肪酸的蛋白质溶液中(pH值为11)，然后搅拌均匀，反应2小时，之后用柠檬酸将混合溶液的pH值调回至7.5，得到澄清的岩藻黄醇-蛋白微粒水溶液(岩藻黄醇包埋率为93.6％)；
(4)将所述澄清的岩藻黄醇-蛋白微粒水溶液进行喷雾干燥，或经减压浓缩后进行冷冻干燥，得到岩藻黄醇-蛋白微粒干粉。
考察该岩藻黄醇-蛋白微粒干粉的物化特性与吸收效果，具体地：将其复溶于去离子水后，形成澄清透明的溶液，平均粒径为194nm，在660nm处的透光率为98％，在常温下储藏12个月不会出现絮凝或分层现象且岩藻黄醇的保留率为96.1％，在常温下储藏36个月岩藻黄醇的保留率为94.1％；将该岩藻黄醇-蛋白微粒干粉溶于去离子水后(0.2μmol/mL)(处理组)，灌胃小鼠，以未与蛋白结合的岩藻黄醇作为对照(对照组)，4小时后，分析小鼠血浆中的岩藻黄醇含量，与对照组相比(93.4pmol/mL)，处理组小鼠血浆中的岩藻黄醇含量达到424.0pmol/mL，提高了3.54倍。
实施例3
(1)称取5.0g岩藻黄素并溶于pH为8.0的含0.5wt％蔗糖脂肪酸酯的磷酸缓冲液中，加入10mg胆固醇酯酶，混匀后转入带塞试管中，充入氮气，密封，在避光37℃环境下反应2h后，之后将所得产物采用硅胶柱层析纯化，在采用硅胶柱层析纯化的洗脱过程中，先用去离子水淋洗以去除胆酸、胆固醇酯酶、磷酸缓冲盐等杂质，然后用体积比为12:1的氯仿-丙酮混合有机液洗脱，洗脱液经减压浓缩、真空干燥后得到岩藻黄醇；称取1.0g的岩藻黄醇，用100μL的1.0wt％氢氧化钠乙醇溶液充分溶解，然后加入5.0g的亚麻酸，搅拌均匀，得到岩藻黄醇分散液；
(2)称取8.0g的牛血清白蛋白，加入去离子水充分搅拌溶解，用氢氧化钠水溶液调节pH值至12，并定容到100mL，然后加入1.6g的棕榈酸，搅拌均匀后，超声处理30分钟，得到内腔富含脂肪酸的蛋白质溶液；
(3)将2.0g的所述岩藻黄醇分散液加入到步骤(2)所得的全部内腔富含脂肪酸的蛋白质溶液中(pH值为12)，然后搅拌均匀，反应2小时，之后用乳酸将混合溶液的pH值调回至7.0，得到澄清的岩藻黄醇-蛋白微粒水溶液(岩藻黄醇包埋率为90.3％)；
(4)将所述澄清的岩藻黄醇-蛋白微粒水溶液进行喷雾干燥，或经减压浓缩后进行冷冻干燥，得到岩藻黄醇-蛋白微粒干粉。
考察该岩藻黄醇-蛋白微粒干粉的物化特性与吸收效果，具体地：将其复溶于去离子水后，形成澄清透明的溶液，平均粒径为281nm，在660nm处的透光率为98％，在常温下储藏12个月不会出现絮凝或分层现象且岩藻黄醇的保留率为96.6％，在常温下储藏36个月岩藻黄醇的保留率为94.7％；将该岩藻黄醇-蛋白微粒干粉溶于去离子水后(0.2μmol/mL)(处理组)，灌胃小鼠，以未与蛋白结合的岩藻黄醇作为对照(对照组)，4小时后，分析小鼠血浆中的岩藻黄醇含量，与对照组相比(93.4pmol/mL)，处理组小鼠血浆中的岩藻黄醇含量达到348.4pmol/mL，提高了2.73倍。
实施例4
(1)称取5.0g岩藻黄素并溶于pH为7.0的1.5wt％胆酸盐的磷酸缓冲液中，加入5mg胆固醇酯酶，混匀后转入带塞试管中，充入氮气，密封，在避光37℃环境下反应4h后，之后将所得产物采用硅胶柱层析纯化，在采用硅胶柱层析纯化的洗脱过程中，先用去离子水淋洗以去除胆酸、胆固醇酯酶、磷酸缓冲盐等杂质，然后用体积比为12:1的氯仿-丙酮混合有机液洗脱，洗脱液经减压浓缩、真空干燥后得到岩藻黄醇；称取1.0g的岩藻黄醇，用300μL的0.1wt％氢氧化钠聚乙二醇溶液充分溶解，然后加入3.0g的花生四烯酸，搅拌均匀，得到岩藻黄醇分散液；
(2)称取1.0g的玉米醇溶蛋白，加入去离子水充分搅拌溶解，用氢氧化钠水溶液调节pH值至11，并定容到100mL，然后加入0.1g的花生四烯酸，搅拌均匀后，超声处理30分钟，得到内腔富含脂肪酸的蛋白质溶液；
(3)将0.25g的所述岩藻黄醇分散液加入到步骤(2)所得的全部内腔富含脂肪酸的蛋白质溶液中(pH值为11)，然后搅拌均匀，反应2小时，之后用酒石酸将混合溶液的pH值调回至8.5，得到澄清的岩藻黄醇-蛋白微粒水溶液(岩藻黄醇包埋率为92.2％)；
(4)将所述澄清的岩藻黄醇-蛋白微粒水溶液进行喷雾干燥，或经减压浓缩后进行冷冻干燥，得到岩藻黄醇-蛋白微粒干粉。
考察该岩藻黄醇-蛋白微粒干粉的物化特性与吸收效果，具体地：将其复溶于去离子水后，形成澄清透明的溶液，平均粒径为295nm，在660nm处的透光率为96％，在常温下储藏12个月不会出现絮凝或分层现象且岩藻黄醇的保留率为95.4％，在常温下储藏36个月岩藻黄醇的保留率为91.5％；将该岩藻黄醇-蛋白微粒干粉溶于去离子水后(0.2μmol/mL)(处理组)，灌胃小鼠，以未与蛋白结合的岩藻黄醇作为对照(对照组)，4小时后，分析小鼠血浆中的岩藻黄醇含量，与对照组相比(93.4pmol/mL)，处理组小鼠血浆中的岩藻黄醇含量达到272.7pmol/mL，提高了1.92倍。
实施例5
(1)称取5.0g岩藻黄素并溶于pH为7.0的含0.1wt％吐温的磷酸缓冲液中，加入10mg胆固醇酯酶，混匀后转入带塞试管中，充入氮气，密封，在避光37℃环境下反应6h后，之后将所得产物采用硅胶柱层析纯化，在采用硅胶柱层析纯化的洗脱过程中，先用去离子水淋洗以去除胆酸、胆固醇酯酶、磷酸缓冲盐等杂质，然后用体积比为12:1的氯仿-丙酮混合有机液洗脱，洗脱液经减压浓缩、真空干燥后得到岩藻黄醇；称取1.0g的岩藻黄醇，用300μL的0.1wt％氢氧化钠甘油溶液充分溶解，然后加入4.0g的二十二碳六烯酸，搅拌均匀，得到岩藻黄醇分散液；
(2)称取4.0g的酪蛋白酸钠，加入去离子水充分搅拌溶解，用氢氧化钠水溶液调节pH值至11，并定容到100mL，然后加入0.5g的二十二碳六烯酸，搅拌均匀后，超声处理30分钟，得到内腔富含脂肪酸的蛋白质溶液；
(3)将1.0g的所述岩藻黄醇分散液加入到步骤(2)所得的全部内腔富含脂肪酸的蛋白质溶液中(pH值为11)，然后搅拌均匀，反应2小时，之后用苹果酸将混合溶液的pH值调回至8.5，得到澄清的岩藻黄醇-蛋白微粒水溶液(岩藻黄醇包埋率为91.2％)；
(4)将所述澄清的岩藻黄醇-蛋白微粒水溶液进行喷雾干燥，或经减压浓缩后进行冷冻干燥，得到岩藻黄醇-蛋白微粒干粉。
考察该岩藻黄醇-蛋白微粒干粉的物化特性与吸收效果，具体地：将其复溶于去离子水后，形成澄清透明的溶液，平均粒径为500nm，在660nm处的透光率为95％，在常温下储藏12个月不会出现絮凝或分层现象且岩藻黄醇的保留率为95.2％，在常温下储藏36个月岩藻黄醇的保留率为91.3％；将该岩藻黄醇-蛋白微粒干粉溶于去离子水后(0.2μmol/mL)(处理组)，灌胃小鼠，以未与蛋白结合的岩藻黄醇作为对照(对照组)，4小时后，分析小鼠血浆中的岩藻黄醇含量，与对照组相比(93.4pmol/mL)，处理组小鼠血浆中的岩藻黄醇含量达到156.9pmol/mL，提高了0.68倍。
实施例6
(1)称取5.0g岩藻黄素并溶于pH为7.0的含0.5wt％牛磺酸的磷酸缓冲液中，加入10mg胆固醇酯酶，混匀后转入带塞试管中，充入氮气，密封，在避光37℃环境下反应8h后，之后将所得产物采用硅胶柱层析纯化，在采用硅胶柱层析纯化的洗脱过程中，先用去离子水淋洗以去除胆酸、胆固醇酯酶、磷酸缓冲盐等杂质，然后用体积比为12:1的氯仿-丙酮混合有机液洗脱，洗脱液经减压浓缩、真空干燥后得到岩藻黄醇；称取1.0g的岩藻黄醇，用300μL的0.1wt％氢氧化钠乙醇溶液充分溶解，然后加入5.0g的油酸与亚油酸混合物(质量比1:1)，搅拌均匀，得到岩藻黄醇分散液；
(2)称取8.0g的乳清蛋白，加入去离子水充分搅拌溶解，用氢氧化钠水溶液调节pH值至11，并定容到100mL，然后加入1.6g的油酸与亚油酸混合物(质量比1:1)，搅拌均匀后，超声处理30分钟，得到内腔富含脂肪酸的蛋白质溶液；
(3)将2.0g的所述岩藻黄醇分散液加入到步骤(2)所得的全部内腔富含脂肪酸的蛋白质溶液中(pH值为11)，然后搅拌均匀，反应2小时，之后用葡萄糖酸内酯将混合溶液的pH值调回至7.5，得到澄清的岩藻黄醇-蛋白微粒水溶液(岩藻黄醇包埋率为90.3％)；
(4)将所述澄清的岩藻黄醇-蛋白微粒水溶液进行喷雾干燥，或经减压浓缩后进行冷冻干燥，得到岩藻黄醇-蛋白微粒干粉。
考察该岩藻黄醇-蛋白微粒干粉的物化特性与吸收效果，具体地：将其复溶于去离子水后，形成澄清透明的溶液，平均粒径为472nm，在660nm处的透光率为95％，在常温下储藏12个月不会出现絮凝或分层现象且岩藻黄醇的保留率为96.1％，在常温下储藏36个月岩藻黄醇的保留率为92.4％；将该岩藻黄醇-蛋白微粒干粉溶于去离子水后(0.2μmol/mL)(处理组)，灌胃小鼠，以未与蛋白结合的岩藻黄醇作为对照(对照组)，4小时后，分析小鼠血浆中的岩藻黄醇含量，与对照组相比(93.4pmol/mL)，处理组小鼠血浆中的岩藻黄醇含量达到165.3pmol/mL，提高了0.77倍。
实施例7
(1)称取5.0g岩藻黄素并溶于pH为7.0的含1.0wt％胆酸盐的磷酸缓冲液中，加入10mg胆固醇酯酶，混匀后转入带塞试管中，充入氮气，密封，在避光37℃环境下反应10h后，之后将所得产物采用硅胶柱层析纯化，在采用硅胶柱层析纯化的洗脱过程中，先用去离子水淋洗以去除胆酸、胆固醇酯酶、磷酸缓冲盐等杂质，然后用体积比为12:1的氯仿-丙酮混合有机液洗脱，洗脱液经减压浓缩、真空干燥后得到岩藻黄醇；称取1.0g的岩藻黄醇，用300μL的0.1质量％氢氧化钠乙醇溶液充分溶解，然后加入3.0g的脂肪酸混合物(油酸、亚油酸与亚麻酸的质量比为1:1:1，步骤(2)同)，搅拌均匀，得到岩藻黄醇分散液；
(2)称取1.0g的大豆蛋白，加入去离子水充分搅拌溶解，用氢氧化钠水溶液调节pH值至11，并定容到100mL，然后加入0.1g的脂肪酸混合物，搅拌均匀后，超声处理30分钟，得到内腔富含脂肪酸的蛋白质溶液；
(3)将0.25g的所述岩藻黄醇分散液加入到步骤(2)所得的全部内腔富含脂肪酸的蛋白质溶液中(pH值为11)，然后搅拌均匀，反应2小时，之后用葡萄糖酸内酯将混合溶液的pH值调回至7.0，得到澄清的岩藻黄醇-蛋白微粒水溶液(岩藻黄醇包埋率为92.5％)；
(4)将所述澄清的岩藻黄醇-蛋白微粒水溶液进行喷雾干燥，或经减压浓缩后进行冷冻干燥，得到岩藻黄醇-蛋白微粒干粉。
考察该岩藻黄醇-蛋白微粒干粉的物化特性与吸收效果，具体地：将其复溶于去离子水后，形成澄清透明的溶液，平均粒径为445nm，在660nm处的透光率为98％，在常温下储藏12个月不会出现絮凝或分层现象且岩藻黄醇的保留率为96.0％，在常温下储藏36个月岩藻黄醇的保留率为90.3％；将该岩藻黄醇-蛋白微粒干粉溶于去离子水后(0.2μmol/mL)(处理组)，灌胃小鼠，以未与蛋白结合的岩藻黄醇作为对照(对照组)，4小时后，分析小鼠血浆中的岩藻黄醇含量，与对照组相比(93.4pmol/mL)，处理组小鼠血浆中的岩藻黄醇含量达到210.2pmol/mL，提高了1.25倍。
实施例8
(1)称取5.0g岩藻黄素并溶于pH为6.5的含1wt％大豆磷脂的磷酸缓冲液中，加入10mg胆固醇酯酶，混匀后转入带塞试管中，充入氮气，密封，在避光37℃环境下反应12h后，之后将所得产物采用硅胶柱层析纯化，在采用硅胶柱层析纯化的洗脱过程中，先用去离子水淋洗以去除胆酸、胆固醇酯酶、磷酸缓冲盐等杂质，然后用体积比为12:1的氯仿-丙酮混合有机液洗脱，洗脱液经减压浓缩、真空干燥后得到岩藻黄醇；称取1.0g的岩藻黄醇，用200μL的0.5wt％氢氧化钠乙醇溶液充分溶解，然后加入4.0g的脂肪酸混合物(油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸与二十二碳六烯酸的质量比为1:1:1:1:1，步骤(1)同)，搅拌均匀，得到岩藻黄醇分散液；
(2)分别称取2.0g的酪蛋白酸钠和玉米醇溶蛋白，混匀后加入去离子水充分搅拌溶解，用氢氧化钠水溶液调节pH值至11，并定容到100mL，然后加入0.5g的脂肪酸混合物，搅拌均匀后，超声处理30分钟，得到内腔富含脂肪酸的蛋白质溶液；
(3)将1.0g的所述岩藻黄醇分散液加入到步骤(2)所得的全部内腔富含脂肪酸的蛋白质溶液中(pH值为11)，然后搅拌均匀，反应2小时，之后用葡萄糖酸内酯将混合溶液的pH值调回至8.5，得到澄清的岩藻黄醇-蛋白微粒水溶液(岩藻黄醇包埋率为92.5％)；
(4)将所述澄清的岩藻黄醇-蛋白微粒水溶液进行喷雾干燥，或经减压浓缩后进行冷冻干燥，得到岩藻黄醇-蛋白微粒干粉。
考察该岩藻黄醇-蛋白微粒干粉的物化特性与吸收效果，具体地：将其复溶于去离子水后，形成澄清透明的溶液，平均粒径为479nm，在660nm处的透光率为98％，在常温下储藏12个月不会出现絮凝或分层现象且岩藻黄醇的保留率为95.1％，在常温下储藏36个月岩藻黄醇的保留率为93.3％；将该岩藻黄醇-蛋白微粒干粉溶于去离子水后(0.2μmol/mL)(处理组)，灌胃小鼠，以未与蛋白结合的岩藻黄醇作为对照(对照组)，4小时后，分析小鼠血浆中的岩藻黄醇含量，与对照组相比(93.4pmol/mL)，处理组小鼠血浆中的岩藻黄醇含量达到235.4pmol/mL，提高了1.52倍。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.一种岩藻黄醇-蛋白微粒的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)将岩藻黄素溶于含亲水性乳化剂的缓冲液中，加入胆固醇酯酶，混匀，充入氮气，在避光30～40℃环境下反应0.5～12h，之后将所得反应产物进行纯化，得到岩藻黄醇；将所述岩藻黄醇用含氢氧化钠的助溶剂溶解，加入脂肪酸混匀，得到岩藻黄醇分散液；所述缓冲液的pH值为6～8；
(2)将蛋白粉末溶于水中，并将pH值调节至10～12，以打开蛋白质疏水内腔，然后加入脂肪酸混匀，超声分散，得到内腔富含脂肪酸的蛋白质溶液；所述蛋白粉末选自牛血清白蛋白、乳清蛋白、玉米醇溶蛋白、酪蛋白酸钠和大豆蛋白中的至少一种；
(3)将所述岩藻黄醇分散液与所述内腔富含脂肪酸的蛋白质溶液混匀并进行内腔重组反应，之后将所得反应产物的pH值调回至7～8.5，以封闭蛋白质内腔，得到澄清的岩藻黄醇-蛋白微粒水溶液；
(4)将所述岩藻黄醇-蛋白微粒水溶液直接喷雾干燥，或经减压浓缩后冷冻干燥，得到岩藻黄醇-蛋白微粒干粉。
2.根据权利要求1所述的岩藻黄醇-蛋白微粒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述亲水性乳化剂选自大豆磷脂、卵磷脂、胆汁酸盐、吐温、蔗糖脂肪酸酯和牛磺酸中的至少一种；所述含亲水性乳化剂的缓冲液中亲水性乳化剂的浓度为0.1～2wt％；所述胆固醇酯酶与岩藻黄素的质量比为1:(100～1000)；所述助溶剂选自乙醇、丙二醇、聚乙二醇和甘油中的至少一种；所述含氢氧化钠的助溶剂中氢氧化钠的浓度为0.1～1wt％；所述岩藻黄醇与含氢氧化钠的助溶剂的质量用量比为5g:(100～300)μL。
3.根据权利要求1所述的岩藻黄醇-蛋白微粒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述纯化的方法为将所得反应产物采用硅胶柱层析纯化，在采用硅胶柱层析纯化的洗脱过程中，先用去离子水淋洗以去除杂质，之后用体积比为(10～14):1的氯仿-丙酮混合有机液进行洗脱，洗脱液经减压浓缩、真空干燥后得到岩藻黄醇。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的岩藻黄醇-蛋白微粒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述岩藻黄醇与脂肪酸的质量比为1:(3～5)；步骤(2)中，所述脂肪酸与蛋白粉末的质量比为1:(4～10)；步骤(1)和步骤(2)所述的脂肪酸各自独立地选自油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸和二十二碳六烯酸中的至少一种。
5.根据权利要求1-3中任意一项所述的岩藻黄醇-蛋白微粒的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述蛋白粉末和水的用量使所得蛋白溶液的浓度为1～8wt％。
6.根据权利要求1-3中任意一项所述的岩藻黄醇-蛋白微粒的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述岩藻黄醇分散液与所述内腔富含脂肪酸的蛋白质溶液中蛋白质的质量比为1:(3～5)；所述内腔重组反应的条件包括温度为室温，时间为1～5小时；将所得反应产物的pH值调回至7～8.5所采用的试剂为酸味剂，所述酸味剂选自醋酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、苹果酸和葡萄糖酸内酯中的至少一种。
7.由权利要求1-6中任意一项所述的方法制备得到的岩藻黄醇-蛋白微粒。
8.根据权利要求7所述的岩藻黄醇-蛋白微粒，其特征在于，所述岩藻黄醇-蛋白微粒粉末在常温下放置12个月不会出现絮凝或分层现象且岩藻黄醇的保留率为95％以上，在常温下放置36个月岩藻黄醇的保留率为90％以上；所述岩藻黄醇-蛋白微粒复溶于水后的平均粒径为150～500nm，在660nm处的透光率为95％以上。
9.根据权利要求7所述的岩藻黄醇-蛋白微粒，其特征在于，所述岩藻黄醇-蛋白微粒在水体系中能够将岩藻黄醇的吸收率提高0.68倍～3.96倍；所述岩藻黄醇-蛋白微粒的包埋率为90％以上。
10.权利要求7-9中任意一项所述的岩藻黄素-蛋白微粒作为食品营养强化剂的应用。
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